DE10045047A1 - Arzneimittel enthaltend aktiviertes Antithrombin III - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft die Verwendung von in seiner Konformation verändertem Antithrombin III, hier aktiviertes Antithrombin III (IDAAT = immune defence activated antithrombin) genannt, als Arzneimittel.
Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung von in seiner Konformation
verändertem Antithrombin III, hier aktiviertes Antithrombin III (IDAAT =
immune defence activated antithrombin) genannt, als Arzneimittel.
Antithrombin III ist ein wichtiger physiologischer Gerinnungsinhibitor,
welcher, ohne dass es einer vorangehenden Aktivierung bedarf,
zirkulierende Serinproteasen inhibiert.
Nach Komplexbildung spaltet die Protease die Arginin 393-Serin 394-
Bindung, wodurch es zur Konformationsänderung von Antithrombin und zur
Protease-Inhibitor-Komplexbildung kommt. Heparin beschleunigt durch
Bindung im aminoterminalen Bereich von Antithrombin III die Antithrombin-
Protease-Komplexbildung wesentlich. Es wird angenommen, dass in vivo
Glykosaminoglykane, wie Heparansulfat an der Endotheloberfläche die Rolle
des Heparins übernehmen.
Antithrombin III gehört zu der über 100 Mitglieder umfassenden Familie der
Serinproteaseinhibitoren (Serpine) und ist ein Glykoprotein. Seine 432
Aminosäuren umfassende Polypeptidkette hat ein Molekulargewicht von
58 000. Das Protein enthält drei intramolekulare Disulfidbrücken und vier
Glykosilierungspositionen. In extrem hohen, unphysiologischen Dosen
verabreicht, reduziert Antithrombin III im Tierexperiment die Mortalität der
Sepsis (Dickneite and Paques, 1993). Bei an Sepsis erkrankten Menschen
konnte aber keine signifikante Verbesserung der Mortalität oder Morbidität
durch handelsübliche Antithrombin III-Präparate erreicht werden.
Neben der Serinproteasen-, insbesondere Thrombin-hemmenden Wirkung,
wurde eine Erhöhung der Prostacyclin-Synthese in humanen und bovinen
Endothelzellen durch Antithrombin III beobachtet (Yamauchi et al., 1989).
Diese Erhöhung führte zu einer Suppression von Leukozyten (Kainoh et al.,
1990) und wird durch Heparin beeinträchtigt (Uchiba et al., 1996), woraus
geschlossen wurde, dass diese Wirkung des Antithrombin III über seine
Bindung an Heparin-ähnliche Glycosaminoglykan-Rezeptoren vermittelt wird.
Stangl et al. 1999 beschrieben darüber hinaus eine leichte Steigerung (1.3-1.7fache)
der Freisetzung von Endothelin-1, bzw. Big-Endothelin 1 aus
Lungengewebe von Ratten durch Antithrombin III.
Antithrombin III wird durch Entzündungs-mediierte Prozesse in seiner Form
verändert. Die sogenannte "natürliche", "angeborene" oder "constitutive"
Immunabwehr ist die erste Verteidigungsstrategie gegen "Eindringlinge" wie
Bakterien, Viren, Parasiten etc. und ist im ganzen Tierreich verbreitet. Ein
wichtiger Teil dieser ersten Abwehr besteht darin, dass phagozytotische
Zellen, insbesondere Monozyten und PMNL (neutrophile Granulozyten), aber
auch Dendridische Zellen, Eosinophile, Blutplättchen und Mastzellen allein,
oder als Assoziate mit anderen Zellen zum Ort des Eindringens des
Pathogens wandern (Chemotaxis) und dabei durch Epithelien und Endothel
penetrieren (Diapedese).
Am Ort der Entzündung werden die "Fremdzellen/Eindringlinge" durch
Phagozytose neutralisiert. Die Entzündungszellen setzen dabei Proteasen,
wie z. B. Elastase und Cathepsin G und Metalloproteasen und Substanzen
frei, die eine Oxidation von Lipiden, Proteinen und Peptiden hervorrufen.
Zu diesen Substanzen gehören O2, Superoxid, Hydrogenperoxid,
Peroxynitrite, OH--Radikale, Hypochlorige Säure HOCl, Cl2-Gas, Chloramine.
Die Halogenierung (hauptsächlich Chlorierung) ist dabei ein wichtiger Weg,
Zellen abzutöten. Im Bereich der Entzündung wird der pH-Wert durch
Freisetzung von Milchsäure auf bis unter pH 4.0 erniedrigt.
Die Abwehrzellen setzen auch spezifische Proteine und Peptide zur Abwehr
frei, wie "bactericidal/permeability-increasing" (BPI) Protein aus
Thrombozyten und Granulozyten und Defensine aus Granulozyten.
Besteht eine Wunde oder sonstige Aktivierung der Hämostase, so entstehen
dabei Thrombin, Faktor Xa und andere Serinproteasen. Darüber hinaus
kommt es zur Aktivierung von Complement (alternativer Weg,
properdinpathway) und zur vermehrten Synthese und Freisetzung von
sogenannten "Akute Phase Proteinen" wie Fibrinogen, C-reaktivem Protein,
Mannose-Binding Protein (MBP), Produkten von sogenannten "immediate
early genes" wie Thrombospondin-1, und anderen. Aktivierte Mastzellen
setzen lösliches Heparin-Proteoglykan frei, welches an Antithrombin binden
kann (Linstedt et al., 1992). Antithrombin III wird durch diese Vorgänge
indirekt oder direkt verändert und erhält vollkommen neue Funktionen.
Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, dass Antithrombin III, welches
durch diese Vorgänge direkt oder indirekt verändert wird, vollkommen neue
Funktionen erhält.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde weiterhin festgestellt, dass
Antithrombin III auch in vitro in diese aktivierte Form überführt werden
kann, insbesondere durch Vorgänge wie Oxidation, Behandlung mit
Harnstoff und Guanidinhydrochlorid, proteolytische Spaltung, Erwärmung
auf 60°C, Erniedrigung des pH auf 4.0 oder Zusatz eines ATIII-Peptides,
das die Sequenz SEAAAS enthält. Eine kryptische Sequenz des
Antithrombin wird dabei freigelegt und erlaubt dem Protein die Interaktion
mit Proteinen wie Thrombospondin, Vitronectin, CD36, oxLDL, αvβ5-Integrin
und anderen.
Im Rahmen der Erfindung wurde weiter festgestellt, dass aktiviertes
Antithrombin III (IDAAT) durch Selbstassoziation polymerisiert. Diese
Polymere haben repetitive Bindungsstellen für die anhaftenden Proteine und
immobilisieren diese. Anhaftende Proteine erhalten dadurch Funktionen, die
sie als lösliche Proteine im Plasma, Serum oder anderen Körperflüssigkeiten
nicht haben und Membranproteine können dadurch zur Signaltransduktion
angeregt werden. Einer der wichtigsten Interaktionspartner für IDAAT ist
Thrombospondin-1 (TSP-1). TSP-1 ist ein aus multiplen Domänen
zusammengesetztes moduläres Glykoprotein, welches von vielen Zellen
freigesetzt und in die extrazelluläre Matrix eingebaut wird. Insbesondere
Blutplättchen enthalten hohe Konzentrationen an TSP-1 (Flicker und Kehrel,
1993) in ihren α-Granula und setzen es während ihrer Aktivierung frei.
Dabei steigt die lokale TSP-1-Konzentration um das mehr als 1000fache an
(Flicker und Kehrel, 1993). Auch Endothelzellen, glatte Muskelzellen,
Gliazellen und Leukozyten sezernieren TSP-1. TSP-1 ist Mitglied der
Thrombospondin-Familie, der zusätzlich TSP-2, TSP-3, TSP-4 und das
cartilage oligomeric matrix protein (COMP) angehören (Lawler et al., 1993).
TSP-1 und TSP-2 sind in einigen Bereichen identisch, sodaß einige TSP-1
Funktionen auch von TSP-2 übernommen werden können. TSP-1 und TSP-2
haben die gleiche Domänen-Struktur und können als Homo- und Heteromere
exprimiert werden (Bornstein et al., 1991). TSP-1 ist ein trimeres
Glykoprotein mit einer aparenten Masse von 420000 Da. Seine 3
Untereinheiten weisen im Lämmli SDS-PAGE System (Lawler and Hynes
1986) eine molare Masse von 180 000 Da auf. Elektronenmikroskopische
Bilder zeigen die trimäre Struktur, die wie eine Bola aussieht mit globulären
Enden an den Amino- und Carboxytermini der Polypeptidketten (Galvin et
al. 1985). In der Nähe der globulären Aminotermini sind die drei Ketten
durch Disulfidbrücken miteinander verbunden. Jede TSP-1-Untereinheit
enthält 69 Cysteinreste, so dass jede Kette mindestens eine freie SH-Gruppe
besitzt. TSP-1 und TSP-2 enthalten ähnliche funktionelle Domänen, wie die
N-terminale Region, eine Pro-Kollagen homologe Region, Typ 1 TSP
"repeats" (Wiederholungsbereiche), Typ 2 TSP "repeats", Typ 3 Calcium
bindende "repeats" und die Carboxy-terminale Region (Bornstein et al.,
1992).
Die stabförmigen Verbindungsregionen der TSP-1 Ketten zeigen eine
Calcium-Abhängigkeit der Struktur. In Gegenwart von Ca2+ besitzt diese
Struktur eine Länge von 16 bis 29.1 nm nach EDTA-Behandlung dagegen
von 38.3 nm (Lawler 1986).
Die Konformation von TSP-1 ist stark abhängig von der Ca2+-Konzentration
(Lawler et al. 1988) und von der Bindung an Interaktionspartner. So verleiht
die Bindung von TSP-1 an Fibronectin oder Heparin ihm eine Konformation
in Abwesenheit von Ca2+, die das Molekül in Gegenwart von Ca2+
einnehmen würde (Dardik and Lahav 1999).
Immobilisiertes TSP, adsorbiert an Oberflächen, vermittelt die Adhäsion von
Endothelzellen, glatten Muskelzellen und Monozyten. Diese Adhäsion ist
abhängig vom Ca2+-Konformationszustand des TSP-1. EDTA-Behandlung
inhibiert diesen Vorgang irreversibel (Lawler et al. 1988). Die Ca2+-Form des
TSP-1 ermöglicht die Bindung an Zellen RGD-vermittelt über Integrine. Auch
die Bindung an CD36 bewirkt eine Konformationsänderung im TSP-1-
Molekül (Leung et al. 1992). TSP-1 bindet an CD36 über einen zweistufigen
Mechanismus. Erst im zweiten Schritt bindet TSP-1 mit hoher Affinität an
CD36 über die "cell-binding site" im Properdin-ähnlichen "Type 1 repeat".
Bindung an CD36 über Peptidsequenz 139-155 des CD36 ermöglicht eine
Konformationsänderung im TSP-1, welche die hochaffine Bindung an
Sequenz 93-110 erlaubt. In diesem Bereich liegt die Sequenz von CD36,
deren Bindungsfähigkeit durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung (Thr
92) reguliert wird (Asch et al., 1993). Constitutiv phosphoryliertes CD36
bindet Kollagen, durch Zellaktivierung dephosphoryliertes CD36 erhält die
Fähigkeit Thrombospondin zu binden. Die Konformation von TSP-1 reguliert
seine Funktionsfähigkeit.
Neben der Fähigkeit an Zellen über Integrine zu binden und Zelladhäsion zu
vermitteln, werden auch andere Fähigkeiten, wie z. B. die Fibrinolyse zu
modulieren, Elastase und Cathepsin G zu inhibieren, die Wundheilung zu
verbessern und das Auswachsen von Neuriten zu fördern, über die
Konformation des TSP gesteuert.
TSP-1 defiziente Mäuse entwickeln zwischen der 1. und 4. Lebenswoche
extensive akute und chronische organisierte bakterielle Lungenentzündungen
mit massiver Einwanderung von Neutrophilen und Makrophagen. Diffuse
alveolare Einblutungen wurden beobachtet. Zu einem späteren
Infektionszeitpunkt kommt es im Vergleich zu Kontrollmäusen des gleichen
Inzuchtstammes, die TSP-1 besitzen, zu einer Verdickung und Kräuselung
des Epithels der Luftwege (Lawler et al. 1998).
Diese Ergebnisse verdeutlichen die Bedeutung des TSP-1 für die Abwehr
von Infektionen. TSP-1 negative Mäuse produzierten signifikant weniger
Nachwuchs als Kontrolltiere. TSP-1 "knock outs" zeigen eine ausgeprägte
lordotische Curvatur der Wirbelsäule. Dies zeigt die Bedeutung des TSP-1
für die Entwicklung/Stabilisierung des Skeletts. TSP-1 defiziente Tiere hatten
eine hochsignifikante höhere Anzahl von Leukozyten, insbesondere
Monozyten und Eosinophile im periphären Blut.
TSP-1 ist ein multifunktionelles Protein. An Oberflächen immobilisiert fördert
es die Bildung von Plasmin (Silverstein et al. 1986) und schützt durch
Immobilisation gleichseitig das Plasmin vor Inaktivierung durch den alpha2
Plasmin-Inhibitor. Die hier beschriebene Erfindung, der Einsatz von IDAAT,
bewirkt eine Immobilisierung von TSP-1 an Zelloberflächen. Der Urokinase
Plasminogen Activator (uPA) und das "signal-chain" uPA (scuPA) binden an
immobilisiertes TSP-1 und bleiben dabei proteolytisch aktiv. Die Bindung an
immobilisiertes TSP schützt uPA vor der Inhibierung durch den Plasminogen
Activator Inhibitor Typ 1 (PAI-1) (Silverstein et al., 1990). Bindet scuPA an
seinen Rezeptor (scuPAR) so wird eine Bindungsstelle frei, welche die
Bindung an Zell-assoziiertes TSP-1 und Vitronectin (Vn) ermöglicht (Higazi
et al., 1996). So ermöglicht immobilisiertes TSP-1 proteolytische Prozesse
auch in einer Mikroumgebung, in der kein Fibrin vorhanden ist.
Zusammen mit Plasmin aktiviert immobilisiertes TSP-1 den "latent"
transforming growthfactor betal (TGF-β-1)auf der Makrophagenoberfläche
(Yehualaeshet et al., 1999).
Auch auf der Endotheloberfläche aktiviert TSP-1 das TGF-β (Schultz-Cherry
and Murphy-Ullrich, 1993, Schultz-Cherry et al., 1994). TGF-β inhibiert die
Proliferation von Endothelzellen und wirkt antiangiogenetisch. Inhibierung
der Angiogenese durch TSP-1 wurde vielfach beschrieben (Iruela-Arispe et
al., 1999, Jiminez et al., 2000). Auch eine Komplexbildung zwischen TSP
und FGF-β1 (basic fibroblast growth factor) ist an dieser Funktion beteiligt
(Murphy-Ullrich, 1993). Fehlen von TGF-β führt zu massiven Störungen der
Infektabwehr, welche zum Tode führt (Kulkarni et al., 1993, Shull et al.,
1992). Die TGF-β defizienten Tiere zeigten zusätzlich eine starke
Autoimmunreaktivität (Letterio et al., 1996) über Beeinflussung von MHC
class II Antigen-Expression (Geiser et al., 19931.
Da an Zelloberflächen immobilisiertes TSP-1 TGF-β aktivieren kann, liegt
nahe, dass TSP-1 über TGF-β an den beschriebenen Prozessen der
Infektabwehr und Autoimmunreaktivität beteiligt ist (Crawford et al., 1998).
Immobilisiertes TSP-1 reguliert zusammen mit TGF-β die Proliferation von
"Natural Killer"-Zellen (NK-Zellen) (Pierson et al., 1996). Die TSP-1
defizienten Tiere zeigen, wenn auch in schwächerer Ausprägung,
entsprechende Immundefekte. Da das in dieser Erfindung erstmals
beschriebene aktivierte Antithrombin, welches TSP-1 bindet, TSP an
Zelloberflächen immobilisieren kann, liegt nahe, dass IDAAT indirekt die
Aktivierung von TGF-β beeinflusst.
TSP-1 moduliert aber auch über andere Mechanismen immunologische
Abwehr-relevante Prozesse. So haften eine groß Anzahl von
Mikroorganismen, wie z. B. coagulase-negative Staphylococcen (Li et al.,
2000), Enterococcen und Porphyromonas gingivalis fimbriae (Nakamura et
al., 1999) an immobilisiertes TSP-1.
Mit dem Erreger der Malaria tropica befallene Erythrozyten haften an
immobilisiertes TSP-1 (Roberts et al., 1985) und an den TSP-1 Rezeptor
CD36.
Der Parasit selbst hat ein Membranprotein, welches TSP-1 homologe
Bereiche enthält. Über dieses in die Erythrozytenmembran transportierte
Protein TRAP (Thrombospondin-related-anonymus (adhesive)-protein) kann
der Parasit das Anheften der befallenen Erythrozyten an die Gefäßwand
vermitteln (Wegelnik et al., 1999, Kappe et al., 1999).
Auch andere Krankheitserreger, wie z. B. Cryptosporidium parvum oder
Eimeria tenella, haben TSP oder TSP-Rezeptor homologe Domänen, die sie
für die Zelladhäsion nutzen (Sulaiman et al., 1999).
Das HIV-1-Virus benutzt in seinem Oberflächenprotein GP 120 eine CD36
(TSP-Rezeptor)-Domäne, mit der der HIV Virus sowohl an TSP, als auch an
CD4 auf den Wirtszellen binden kann (Crombie et al., 1998).
Gereinigtes TSP-1 kann daher HIV-1 Infektionen inhibieren (Crombie et al.,
1998).
Mehrere Complement-Proteine, C9, C8 alpha und C8 beta, haben Module
mit hoher Homologie zu einem der "Repeat"-Module von Thrombospondin
(Patthy, 1988). Weitere TSP-homologe Domänen haben auch Antistasin,
Properdin und F-spondin. F-spondin ist, wie Thrombospondin selbst, eine
effektive Substanz zur Verbesserung von Läsionen des Nervensystems (US
5750502).
Indem es gleichzeitig an apoptotische neutrophile Granulozyten (PMNL) und
an Makrophagen bindet, kann TSP die Phagozytose von apoptotischen
PMNL mediieren. Für diesen Prozess ist die gleichzeitige Interaktion von TSP
mit seinen Rezeptoren αvβ3-Integrin, CD36 und CD47 verantwortlich (Savill
et al., 1992). Die Phagozytose von apoptotischen PMNL reguliert
Entzündungsreaktionen und verhindert ein unkontrolliertes Überschiessen.
Im Gegensatz zur Phagozytose von nekrotischen PMNL oder zuweit im
Abbau fortgeschrittenen PMNL erfolgt die TSP-1 vermittelte Phagozytose
von apoptotischen PMNL ohne Freisetzung von proinflammatorischen
Mediatoren (Stern et al., 1996).
Die rechtzeitige TSP-mediierte Phagozytose verhindert so eine
überschießende Entzündungsreaktion. Zusätzlich wird aktiv von
Makrophagen, welche apoptotische PMNL aufgenommen haben, die
Produktion von proinflammatorischen Cytokinen inhibiert (Fadok et al.,
1998). Die Quervernetzung vom TSP-Rezeptor CD47 auf Monozyten durch
TSP-1, wie durch die hier beschriebene Erfindung erreicht, führt zusätzlich
zu einer Inhibierung der Freisetzung von aktivem Interleukin 12 (IL-12)
(Armant et al., 1999, Demeure et al., 2000). Interleukin-12 ist ein wichtiger
Mediator der Sepsis (Steinhauser et al., 1999).
Die Immobilisierung von TSP-1 an apoptotische PMNL und an Monozyten
ist daher ein guter Weg, medikamentös Zustände mit persistierenden,
chronischen Entzündungen positiv zu beeinflussen. Zu diesen Erkrankungen
gehören auch alle, bei denen eine überschießende Entzündungsreaktion
einen Teil der Krankheit selbst darstellt, wie die verschiedenen
Reperfusionsschäden, Abstoßungsreaktionen bei Organtransplantationen
und Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises.
Nicht nur apoptische neutrophile Granulozyten werden TSP vermittelt
phagozytiert, sondern auch senescente Eosinophile (Stern et al., 1996).
Dies zeigt, dass TSP-Immobilisierung an Zelloberfläche, wie durch die hier
beschriebene Erfindung erreicht, auch ein Weg ist, die unerwünschte,
proinflammatorische Antwort bei Erkrankungen, die Eosinophil-mediiert sind,
wie Allergie, Asthma, parasitäre Erkrankungen, bestimmte Tumore und
Bindegewebserkrankungen, medikamentös zu bekämpfen. So wird
verhindert, dass hoch toxische Substanzen von den Eosinophilen freigesetzt
werden und das Gewebe schädigen, bzw. zerstören.
TSP bindet Chemokine, wie RANTES, und verhindert so die Bindung des
Chemokins an seinen Rezeptor (Barnes et al., 1998). Auch über diesen Weg
moduliert TSP Entzündungsreaktionen und Immunabwehr.
Ein Medikament, welches TSP in seiner Funktion beeinflusst, indem es die
Konformation ändert, oder die Immobilisation an Zelloberflächen von
immunkompetenten Zellen fördert, limitiert die unerwünschte
Immunresponse bei Krankheiten, wie, aber nicht beschränkt auf,
Rheumatische Arthritis, Goodpasture Syndrom, Insulin-abhängiger Diabetes,
Pemphigus, Pemphigoid, primäre biliäre Cirrhose, Colitis ulcera, Lupus
erythematosus, Graft-versus-Host Erkrankung, Sepsis.
Immobilisierung von TSP an Zelloberflächen führt zur Quervernetzung seines
Rezeptors CD47. Diese Quervernetzung von CD47 auf chronisch
lymphatischen Leukämiezellen (CHL-Zellen) verursachtspezifisch den Zelltod
dieser Tumorzellen (Mateo et al., 1999).
Eine Substanz, die die Bindung von TSP an Leukämiezellen bewirkt, wäre
somit ein wirkungsvolles Medikament zur Bekämpfung der CHL, einer
tödlichen Erkrankung, gegen die es noch kein spezifisches wirksames
Medikament gibt.
Thrombospondin inhibiert nicht nur über seine Wirkung auf TGF-β die
Neoangiogenese, sondern auch über Immobilisierung und Bindung an und
Aktivierung von CD36.
Behandlung von Tumoren in Mäusen mit TSP-1 führt zu Inhibition der
Neoangiogenese und zur Apoptose von Endothelzellen (Jiminez et al.,
2000).
Inhibierung der Tumorangiogenese ist ein guter Weg, medikamentös das
Wachstum von Tumoren zu begrenzen (Roberts et al., 1996). Eine
Substanz, die die Bindung von TSP an Endothelzellen in Tumoren vermittelt,
gewinnt damit antiangiogenetische und somit Krebs-bekämpfende
Eigenschaften.
Neoangiogenese ist auch eine Ursache für Erblindung, z. B. bedingt durch
Diabetes mellitus (Kaplan et al., 1999, Shafiee et al., 2000), altersbedingte
Macular Degeneration oder Frühreife von Säuglingen. Auch zur Bekämpfung
dieser Neoangiogenese wäre eine Substanz, welche die Bindung von TSP
an Endothelzellen vermittelt, medikamentös einsetzbar.
Nach einer Verletzung steigen die Konzentrationen an TSP im Gewebe rund
um die verletzte Region signifikant an. Nach einer Balloon-Kathetisierung
z. B. kann schon 1 Stunde nach Verletzung auf den Oberflächen der Zellen
TSP detektiert werden (Watkins et al., 1990, Munjal et al., 1990). Das TSP
auf der Zelloberfläche nimmt noch in den darauffolgenden Tagen zu und
wird dann zunehmend auch in der Matrix angereichert.
Mit zunehmender Wundheilung verschwindet TSP wieder von den
Zellmembranen des verletzten Gewebes.
Eine der Aufgaben, die TSP in der Wunde wahrnimmt, ist die Verbesserung
der Wundheilung (US Patent 5,155,038). Eine Substanz, die TSP-1 in der
Wunde immobilisiert, müsste die Wundheilung verbessern.
TSP in der Wunde wird von den Gewebezellen exprimiert aber auch von
Blutplättchen, während deren Aktivierung freigesetzt.
Etwa 1% des gesamten Plättchenproteins und ca. ¼ des Proteingehalts der
Plättchen α-Granula ist Thrombospondin-1 (Kehrel, et al., 1996).
Freigesetztes Thrombospondin fördert die Kollagen-induzierte
Plättchenaggregation (Kehrel, et al., 1988). Im C-Terminus enthält TSP eine
Sequenz, RFYVVMWK, welche über CD47 Plättchen aktiviert (Chung et al.,
1999 und 1997). Lösliches TSP, dem Blut, Plättchensuspension oder
Plättchenreiches-Plasma zugesetzt wird, löst jedoch allein keine Aggregation
aus.
Während Plättchen in Suspension TSP nur in seiner Ca2+-Form binden
können, haften Plättchen sowohl an die "high " als auch "low"-Ca2+-Form
des an Matrix immobilisierten Thrombospondin.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Arzneimittel
bereitzustellen, welches die zuvor angesprochenen Funktionen ausüben und
damit die erwarteten Wirkungen erfüllen kann.
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Arzneimittel, enthaltend aktiviertes
Antithrombin III (IDAAT), IDAAT-Peptide, -Analoga oder -Mimetika.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist, wie oben bereits ausgeführt,
festgestellt worden, dass aktiviertes IDAAT über seine nun neu im Rahmen
der vorliegenden Erfindung festgestellten Eigenschaften und Funktionen eine
Vielzahl von Reaktionen im Körper auslöst oder vermittelt, welche sich zur
Behandlung von Krankheiten ausnutzen lassen. Diese Funktionen und
Eigenschaften werden im Folgenden weiter erläutert werden, ebenso wie die
damit zu behandelnden Krankheiten oder Krankheitszustände. Auch eine
Prophylaxe kann in vielen Fällen mit Hilfe von IDAAT stattfinden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann das Arzneimittel sowohl das
vollständige IDAAT enthalten, welches beispielsweise gemäß dem in den
Beispielen beschriebenen Verfahren hergestellt werden kann. Theoretisch
kann auch aus dem Körper nach Abwehrreaktion gebildetes IDAAT isoliert
werden. Des Weiteren ist es denkbar, IDAAT-Peptide zu verwenden, welche
die Interaktion mit Proteinen wie Thrombospondin, Vitronectin, CD36,
oxLDL, aIIbβ3-Integrin, αvβ3-Integrin und anderen vermitteln. Derartige
geeignete Peptide können leicht durch vorbereitende Versuche aufgefunden
werden, indem beispielsweise ihre Interaktion mit einem der oben genannten
Proteine getestet wird.
Auch Analoga von IDAAT sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung dann
geeignet, wenn sie ebenfalls die Interaktion mit den genannten Proteinen
vermitteln. Schließlich ist es auch möglich, IDAAT-Mimetika einzusetzen,
welche aufgrund ihrer Struktur oder/und funktioneller Gruppen gleiche
Wirkungen und Interaktionen wie IDAAT zeigen können.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, rekombinantes
IDAAT zu verwenden, wozu rekombinant hergestelltes Antithrombin III in
geeigneter Weise behandelt wird, um darauf aktiviertes Antithrombin III zu
erhalten (siehe Beispiele sowie diese Beschreibung). Auch Peptide oder
Analoga von IDAAT werden vorzugsweise in rekombinanter Form
synthetisiert und dann aktiviert.
Ein erfindungsgemäßes Arzneimittel kann selbstverständlich weitere
pharmazeutisch annehmbare Hilfs- oder/und Trägersubstanzen enthalten,
wobei das Arzneimittel zur lokalen, intradermalen, oberflächlichen,
intraperitonalen, intravenösen oder intramuskulären oder oralen
Verabreichung formuliert wird oder seine Verabreichung über Vesikel
ermöglicht wird. Das erfindungsgemäße Arzneimittel enthält daher
vorzugsweise solche Hilfs- und Trägersubstanzen, die die jeweilige
bevorzugte Applikationsart ermöglicht.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann neben dem IDAAT oder Teilen
oder Analoga oder Mimetika davon weitere Substanzen enthalten, wie
beispielsweise Antibiotika, Immunsuppressiva etc. Je nach zu behandelnder
Krankheit kann es von Vorteil sein, unterstützend mit bekannten
Arzneimitteln zu behandeln. Eine entsprechende Kombination dieses
Arzneimittels mit IDAAT oder seinen Analoga ist daher gegebenenfalls eine
bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Durch die im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellten Vorgänge
im Körper, welche durch aktiviertes Antithrombin III bewirkt werden, kann
das erfindungsgemäße Arzneimittel für eine Vielzahl von Indikationen
angewandt werden. Im Folgenden sollen Beispiele für neue Funktionen von
IDAAT aufgeführt werden, die Antithrombin-Präparate und insbesondere
handelsübliche Antithrombin-Präparate nicht aufweisen:
Während ohne Zusatz von gereinigtem TSP-1 und ohne Zusatz von IDAAT
nur ~ 1% der elutriierten humanen Monozyten durch einen Antikörper (Klon
P10), der TSP-1 auf der Zelloberfläche erkennt, im Durchflußzytometer
detektiert werden konnten, steigt die Anzahl durch Zusatz von 10 µg/ml
gereinigtem TSP-1 auf ca. 5%.
Zusatz von IDAAT (ohne Zusatz von gereinigtem TSP-1) vermittelt die TSP-1
Bindung von endogenem TSP an die Monozyten. Ca. 18% der Monozyten
wurden TSP-1 positiv.
Durch gleichzeitige Gabe von TSP und IDAAT wurden nahezu alle (< 90%)
der verwendeten periphären Blutmonozyten stark positiv für TSP (siehe
Abb. 1).
Durch Alterung (24 h Inkubation in Zellkulturmedium im Inkubator gemäß
Savill 1992) apoptotisch gemachte PMNL binden TSP. Dieser Vorgang wird
durch Zusatz von IDAAT dosisabhängig, spezifisch gesteigert (siehe
Abb. 2). Gleichzeitige Zugabe von gereinigtem TSP + IDAAT steigert
die Wirkung weiter.
Zusatz von TSP und IDAAT führt dosisabhängig zur Assoziation von
apoptotischen PMNL mit Monozyten (siehe Abb. 3).
Transmigrationsexperimente wurden, wie bei Kielbassa et al., 1998
beschrieben, durchgeführt. Die Zugabe von IDAAT zum Kulturmedium der
Monozyten während eines Transmigrationsversuchs fördert dosisabhängig
die Transmigration von Monozyten durch Endothel um das 2-3fache (siehe
Abb. 4).
Auch der Zusatz von gereinigtem TSP (25 µg/ml) fördert die Transmigration
der Monozyten. Zusatz von TSP + IDAAT führt bei geringen
Konzentrationen von TSP und IDAAT zu einer Steigerung der
Transmigration, die größer ist, als durch Zusatz der Einzelsubstanzen alleine.
IDAAT induziert dosisabhängig Ca2+-Flux in Monozyten. Die Ca2+-Messung
wurden nach Sorrani et al., 1993 durchgeführt. Elutriierte Monozyten
(5 × 106/ml) wurden bei Raumtemperatur mit Hepes-Tyrode Puffer pH 7.4
gewaschen und anschließend 15 Min mit 1 µM Fura2/AM bei 37°C
markiert, zweimal in Hepes-Tyrode Puffer ohne Ca2+ gewaschen und dann
in Hepes-Tyrode mit 1 mM Ca2+ aufgenommen.
Ca2+-Signale induziert durch IDAAT, TSP-Peptid RFYVVMWK, und als
positiv oder negativ Kontrollen wirksame Substanzen, wurden fluorimetrisch
im Hitachi F-2000 bestimmt.
IDAAT (100 µg/ml) aktiviert die Monozyten und ruft ein deutliches Ca2+-
Signal hervor (siehe Abb. 5).
IDAAT vermittelt die Anbindung von T-Zellen sezerniertem TSP und von
exogen zugesetztem TSP an humane T-Zellen (hier als Beispiel Jurkatzellen)
(siehe Abb. 6).
Die Induktion des oxidativen Burst wurde im wesentlichen gemäß
Arbeitsanleitung des Herstellers mit dem Phagotest/Burst-Test der Firma
Orpegen (Heidelberg) am Durchflußzytometer durchgeführt, jedoch zuerst
die PMNL mit dem Substrat DHR123 inkubiert und anschließend die PMNL
aktiviert.
IDAAT steigert dabei dosisabhängig die aktivierende Wirkung von fLMF auf
den oxidativen Burst. IDAAT und fLMF haben beide eine additive Wirkung.
IDAAT steigert nicht nur die aktivierende Wirkung von anderen Agonisten
auf den oxidativen Burst der PMNL, sondern löst ihn als selbständiger,
unabhängiger Agonist auch aus (siehe Abb. 7). Somit ist IDAAT ein
wertvolles Werkzeug zur Steigerung der Infektabwehr.
Aktives IL-12 spielt eine negative Schlüsselrolle bei Entzündungsreaktionen
und Sepsis. Mit Interferon γ (INF γ) und Staphylococcus aureus aktivierte
Monozyten produzieren IL-12 und setzen es frei.
Diese Reaktion konnte durch IDAAT dosisabhängig gehemmt werden. Die
Konzentration von aktivem IL-12 im Kulturmedium der Monozyten wurde
mittels ELISA bestimmt.
Durch Inkubation der Monozyten mit IDAAT wurde die IL-12 Freisetzung
vollständig inhibiert (siehe Abb. 8).
Im Gegensatz zur Sekretion von IL-12 wird die Sekretion von IL-10, welches
in der Sepsis schützende Wirkung hat, durch IDAAT dosisabhängig
gesteigert (siehe Abb. 9). Dies zeigt die Infekt-Abwehr modulierende
Wirkung von IDAAT und legt die Nützlichkeit von IDAAT bei septischen
Reaktionen nahe. Die Freisetzung eines weiteren "schädlichen" Interleukins,
des TNF α, wird durch IDAAT inhibiert (Abb. 10).
Im Ohr von Balb-C-Mäusen wurde durch lokale Injektion von anti-BSA zum
Zeitpunkt 0 und gleichzeitiger Injektion von FITC-gekoppeltem BSA ins
Peritoneum eine Arthus Reaktion ausgelöst. Kontrolltieren
(Negativkontrollen) wurde nur FITC (ohne BSA) ins Peritoneum injiziert.
Nach ca. 6 Stunden zeigte sich eine deutlich ausgeprägte
Entzündungsreaktion mit Anschwellung des Ohres (Oedem), FITC-
Einlagerung, Einwanderung von PMNL und petechialen Einblutungen ins
Gewebe bei den mit anti BSA- und BSA-FITC behandelten Tieren.
8 Mäusen wurde zusätzlich zum Zeitpunkt 0 und nach 0 + 3 Stunden je 50 µg
IDAAT in Puffer intraperitonal injiziert.
6 Kontrollmäusen erhielten zum Zeitpunkt 0 und 0 + 3 Stunden statt
IDAAT nur den Puffer, 50 mM Tris/HCl-Puffer mit 150 mM NaCl pH 7.4, in
dem IDAAT üblicherweise gelöst wird.
Die Arthus Reaktion wurde durch IDAAT fast vollständig verhindert. Mit
IDAAT behandelte Mäuse zeigten signifikant geringere FITC-Einlagerungen,
signifikant geringere Ohrdicken und fast keine Petechien im Vergleich zu
"Puffer" behandelten Tieren (siehe Abb. 11).
PHA-aktivierte PBMC wurden zusammen mit negativem humanen Serum
1 : 100 (Negativ-Kontrolle), mit neutralisierendem V3loop spezifischen
Antikörper (Positivkontrolle), mit IDAAT (150 µg/ml) und einem CCR5-
tropen HIV-1 Primärisolat (903) aus einem Patienten inkubiert und nach fünf
Tagen die Virus-Produktion mittels p24-ELISA untersucht.
Dazu wurden frisch PHA-aktivierte PBMC in RPMI 1640 Medium + 20%
FKS + 100 U/ml IL-2 in einer Zellkonzentration von 2 × 106 Zellen/ml
aufgenommen und mit jeweils 200 000 Zellenlwell/100 µl auf einer 96well-
Flachbodenplatte verteilt.
Auf Inhibition zu testende Substanzen,
Positivkontrolle: neutralisierender humaner anti V3loop Antikörper 1 : 100, Negativkontrolle: neg. humanes Serum 1 : 100 und
Verum: IDAAT (150 µg/ml),
wurden in RPMI-Medium den Zellen zugesetzt und für 30 Minuten bei 37°C/5% CO2 inkubiert. Anschließend wurde das HIV-1 Virus zu den Ansätzen gegeben: jeweils 10 µl/well aus HIV-1 Primärisolat 903-Überstand (CCR5-trop) mit 20 000 TCID50 (50% tissue culture infective dose)/ml ≅ 1000 TCID50/ml im well.
Positivkontrolle: neutralisierender humaner anti V3loop Antikörper 1 : 100, Negativkontrolle: neg. humanes Serum 1 : 100 und
Verum: IDAAT (150 µg/ml),
wurden in RPMI-Medium den Zellen zugesetzt und für 30 Minuten bei 37°C/5% CO2 inkubiert. Anschließend wurde das HIV-1 Virus zu den Ansätzen gegeben: jeweils 10 µl/well aus HIV-1 Primärisolat 903-Überstand (CCR5-trop) mit 20 000 TCID50 (50% tissue culture infective dose)/ml ≅ 1000 TCID50/ml im well.
Diese Ansätze wurden über Nacht bei 37°C/5%CO2 inkubiert. Am nächsten
Tag wurden die Zellen dreimal mit RPMI 1640 gewaschen und neues
Kulturmedium zugegeben. Am 5. Tag nach der Infektion wurden die p24-
ELISA-Untersuchungen durchgeführt.
Die verwendeten α-p24-Antikörper (11-G7 [Niedrig, Berlin] und D7320
[Biochrom]) erkennen das p24-Protein der verwendeten Primärisolatvariante
903. Maxi-Sorb-ELISA-Platten (Nunc) wurden mit diesen Antikörpern über
Nacht beschichtet. Der Virus-Überstand aus dem Inhibitionsversuch wurde
mit 1% Triton X-100 inaktiviert. Der inaktivierte Virus-Überstand und der
alkalische-Phosphatase-konjugierte Detektions-Antikörper (BC1071-AP
[Aalto]) wurden, nach Waschen der beschichteten Wells mit PBS,
gemeinsam in die Wells überführt und dort für 5 Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Wells wurden wieder mit PBS gewaschen, gelöstes Substrat
für die alkalische Phosphatase p-Nitrophenyl-Phosphat [Sigma] in die Wells
gegeben und die Farbentwicklung nach 20 Minutien bei 405 nm im ELISA-
Photometer gemessen. Die Parallelwerte in dem verwendeten p24-ELISA
schwankten bis zu 0.02 optische Dichte (oD) Einheiten um einen
gemeinsamen Mittelwert.
Während die oD 405 nm für die Negativkontrolle ≅ keine Inhibition bei 0.8
lag, reduzierte der neutralisierende Antikörper (Positivkontrolle) die oD auf
0.12. 150 µg/ml IDAAT reduzierte die oD auf 0.10.
Durch Zugabe von IDAAT konnte die HIV-1 Infektion der PBMCs effektiv
gehemmt werden.
Thrombozyten wurden mit einem Thrombozytenspezifischen Phycoerythrin
konjugierten anti GPIX Antikörper (Klon Beb 1) markiert. Bakterien
(verschiedene S. aureus Stämme) wurden mit Tris-gepufferte Salzlösungen
(TBS) auf eine Zahl von 250 000 Keime/µl eingestellt und mittels RNA-
Farbstoff Syto 13 [MoBiTec, Göttingen] in einer Konzentration von 2 µM
markiert. Markierte Bakterien und markierte Thrombozyten wurden im
Verhältnis von 10 : 1 für 10 Minuten koinkubiert.
Zellpopulationen wurden im Durchflußzytometer analysiert. Für beide
Fluorochrome positive Zellen wurden als Assoziate gewertet (siehe
Abb. 12a). Thrombin-Stimulierung und Freisetzung von TSP aus den
α-Granula der Plättchen erhöhte den prozentualen Anteil der
bakterientragenden Plättchen im Verhältnis zur Thrombozytengesamtzahl um
das 2.5fache. Diese Steigerung war nicht zu beobachten bei Verwendung
von Plättchen von 2 Patienten mit Gray-Platelet-Syndrom, deren Plättchen
das TSP fehlt (siehe Abb. 12b).
IDAAT förderte dosisabhängig die Bindung von S. aureus an Thrombozyten
(siehe Abb. 12c).
Da Thrombozyten ein sogenanntes "microbicidal protein" haben, welches
Bakterien vernichten kann, ist auch diese Funktion von IDAAT als wertvoller
Beitrag zur Infektabwehr zu werten.
Gereinigtes TSP-1 wurde mit FITC markiert und in einer Konzentration von
50 µg/ml gelfiltrierten Thrombozyten (50 000/µl) in Hepes-Tyrode Puffer mit
BSA zugesetzt. IDAAT wurde in steigenden Konzentrationen zugesetzt und
60 Minuten zusammen mit den Plättchen bei Raumtemperatur inkubiert.
Gebundenes TSP-FITC auf der Thrombozytenoberfläche wurde im
Durchflußzytometer quantifiziert. IDAAT vermittelte die Bindung von
Thrombospondin an Thrombozyten (siehe Abb. 13).
Gelfiltrierten Plättchen 50 000/µl in Hepes-Tyrode BSA Puffer oder mit
PPACK antikoaguliertes Plättchenreiches Plasma (50 000 µl) wurde FITC-
konjugiertes Fibrinogen (150 µg/ml) zugesetzt. Die Plättchensuspensionen
wurden mit meth. Kollagen Typ I, wie in Kehrel et al., 1998 beschrieben,
aktiviert. Ein Teil der Proben wurde mit IDAAT in aufsteigenden
Konzentrationen versetzt. Nach Inkubation für 30 Minuten bei
Raumtemperatur wurden die Plättchen fixiert, gewaschen und die
Fibrinogenanbindung im Durchflußzytometer quantitativ bestimmt. IDAAT
verstärkt die durch Kollagenaktivierung induzierte Fibrinogenanbindung an
Plättchen (siehe Abb. 14a).
Zusatz von gereinigtem Thrombospondin + IDAAT in steigenden
Konzentrationen hatte selbst eine Plättchen-aktivierende Eigenschaft und
führte zu Fibrinogenbindung an die Plättchenmembran (siehe Abb.
14b).
Die Adhäsion der Thrombozyten wurde nach Santoro et al., 1994
durchgeführt. Mikrotiterplatten (96 well) wurden mit Adhäsionsproteinen in
einer Konzentration von 25 µg/ml über Nacht bei 4°C "gecoatet" und die
Platten mit BSA geblockt. 100 µl gelfiltrierten Plättchen oder mit Hirudin
antikoaguliertes Plättchenreiches Plasma (300 000 Plt/µl) wurden bei
Raumtemperatur für 1 Stunde in einer feuchten Kammer in den Wells
inkubiert. Nicht adhärierte Thrombozyten wurden gründlich ausgewaschen.
Die Anzahl der adhärierten Plättchen wurde durch Lyse der Plättchen mit
Triton X-100 und Nachweis des lysosomalen Enzyms Hexosaminidase
bestimmt.
Zur Kalibrierung des Adhäsions-Assays wurde auf der Mikrotiterplatte ein
Eichreihe mit bekannter Anzahl ansteigender Plättchen gegeben und die
Extinktion des umgesetzten Substrates P-Nitrophenyl-N-Acetyl-β
-D-Glucosaminid im Verhältnis zur Plättchenzahl bestimmt. IDAAT steigerte
dosisabhängig die Adhäsion von Thrombozyten an die getesteten
Adhäsionsproteine (siehe Abb. 15a). Handelsübliche ATIII-Präparate
zeigten diese Wirkung nicht (siehe Abb. 15b).
Die Steigerung der Thrombozytenadhäsion durch IDAAT ist eine integrin
(αvβ3, αIIbβ3)-und CD36-vermittelte Reaktion (siehe Abb. 16 und 17).
Die IDAAT vermittelte Thrombozytenadhäsion ist nicht Thrombin-vermittelt
und findet daher auch im mit Hirudin antikoaguliertem Blut statt (siehe
Abb. 18).
Heparansulfat (0-10 µg/ml) und Sulfatid (0-20 µg/ml) hemmen die durch
IDAAT vermittelte Adhäsion nicht.
Die IDAAT vermittelte Thrombozytenadhäsion ist abhängig von
zweiwertigen Ionen. 5 mM EDTA hemmen diese Adhäsion an
Thrombospondin und an Kollagen vollständig (siehe Abb. 19). 20 µM
Mg2+, 1 mM Ca2+ oder andere zweiwertige Ionen steigern die IDAAT
vermittelte Thrombozytenadhäsion an Kollagen.
Lösliches TSP-1 hemmt die IDAAT vermittelte Adhäsion von Thrombozyten
an Kollagen oder immobilisiertes TSP-1 (siehe Abb. 20).
Zusatz von Monozyten zu den Thrombozyten steigert die Adhäsion der
Thrombozyten an Thrombospondin und an Kollagen, während der Zusatz
von Erythrozyten die Adhäsion von Thrombozyten an TSP und an Kollagen
hemmt (siehe Abb. 21).
Die IDAAT vermittelte Adhäsion von Thrombozyten an Thrombospondin
kann durch die PI-3-Kinase-Hemmer Wortmannin und LY294002 vollständig
gehemmt werden (siehe Abb. 22).
Gelfiltrierte Plättchen (200 000/µl) in Hepes-Tyrode Puffer pH 7.4 mit
Zusatz von Fibrinogen (100 µg/ml) wurden im Aggregometer nach Born
untersucht. Während gereinigtes Thrombospondin (25 µg/ml) allein keine
Aggregation auslöste, führte der Zusatz von IDAAT dosisabhängig zur
Aggregation, die durch gleichzeitige Gabe von TSP und IDAAT deutlich
verstärkt wurde (siehe Abb. 23).
Gelfiltrierte Plättchen wurden mit dem TSP-1 Peptid RFYVVMWK (40 µM)
aktiviert. Die Mikropartikelbildung wurde nach Markierung mit einem
Thrombozytenspezifischen anti GPIX Phycoerytrin konjugierten Antikörper
nach Dörmann et al., 1999, im Durchflußzytometer gemessen. Zusatz von
IDAAT führte dosisabhängig zur Mikropartikelbildung der aktivierten
Plättchen (siehe Abb. 24).
Zur durchflußzytometrischen Detektion der Plättchen-Leukozyten-Assoziate
wurden die Thrombozyten mit einem FITC-konjugierten monoklonalen
Antikörper gegen das Plättchen-spezifische Antigen GPIX (Klon Beb 1) und
die Monozyten mit einem PE-konjugierten monoklonalen Antikörper gegen
CD14 (Klon: MϕP9) in sättigenden Konzentrationen nach Zellaktivierung
und Zellfixierung markiert. Die Quantifizierung der Assoziate erfolgte durch
Detektion von CD14-und GPIX-positiven Partikeln. Der prozentuale Anteil
von Leukozyten, die mit Plättchen assoziiert vorlagen, wurde zur
Leukozytengesamtpopulation ins Verhältnis gesetzt. Thrombozyten
(25 000/µl) und Monozyten (3000/µl) wurden miteinander für 30 Minuten
inkubiert. Die Thrombozyten wurden zuvor für 30 Minuten mit IDAAT
vorinkubiert und anschließend gewaschen. IDAAT steigerte die
Assoziationsrate von 11.7% auf 17,3% (5 µg/ml IDAAT) bzw. 20.5% (10 mg/ml
IDAAT).
Humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HMEC-1) (3000/µl) in RPMI 1640
Medium wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit IDAAT oder TSP-1
(25 µg/ml) plus lDAAT inkubiert. Die Endothelzellen wurden fixiert,
gewaschen und TSP mit einem monoklonalen PE-konjugierten anti TSP-
Antikörper (Klon P10) im Durchflußzytometer detektiert. Der Median der
Fluoreszenz, der die Anbindung des anti TSP-Antikörpers widerspiegelt,
stieg von 79 (ohne IDAAT) auf 138 (5 µg/ml IDAAT). Zusatz von exogenem
TSP-1 (25 µg/ml) steigerte den Median der Fluoreszenz auf 268 bei
gleichzeitigem IDAAT-Zusatz (5 µg/ml) (siehe Abb. 25).
Latex Beads (3.2 µm) wurden über Nacht bei 4°C mit aktivem Vitronectin
(25 µg/ml) ummantelt und dann gewaschen. Vitronectin-tragende Beads
wurden mit gelfilrierten Thrombozyten (25 000/µl) in Abwesenheit und
Gegenwart von steigenden Konzentrationen an IDAAT für 1 Stunde bei
Raumtemperatur inkubiert.
Thrombozyten wurden mit anti GPIX (Klon Beb1) markiert und Assoziate
aus Vitronectin ummantelten Beads mit Thrombozyten im
Durchflußzytometer quantifiziert. IDAAT steigerte dosisabhängig die
Bindung von Thrombozyten an die Vitronectin ummantelten Beads (siehe
Abb. 26).
IDAAT, IDAAT-TSP-1-Aggregate, handelsübliches ATIII und handelsüliches
ATiII mit TSP-1-Zusatz wurden elektronenmikroskopisch mittels "Rotary-
Shadowing"-Verfahren nach Jander et al. (1984) dargestellt. IDAAT bestand
aus polymeren ATIII-Molekülen, während handelsübliche ATIII-Präparate
eine monomere Struktur aufwiesen (siehe Abb. 27a und b). Zusatz
von TSP-1 zu IDAAT führte zur Bildung von großen IDAAT-TSP-1-
Komplexen, während dies nicht mit handelsüblichem ATIII beobachtet
wurde (siehe Abb. 27c und d).
IDAAT bindet direkt an Proteine, an die nichtaktiviertes Antithrombin nicht
binden kann, wie CD4 (z. B. der T-Zellen) (Abb. 28), GP120 des HI-
Virus (Abb. 29), Thrombospondin (Abb. 30), aktives Vitronectin
(Abb. 31), CD36, αvβ3-lntegrin. Die Bindung von IDAAT an diese
Proteine wurde mittels ELISA an gereinigten oder rekombinanten Proteinen
durchgeführt. Die Reinigung von TSP-1, aktivem Vitronectin, αIIbβ3-Integrin
und CD36 erfolgte wie bei Kehrel et al. 1993, Yatohgo et al. 1988 und
Kronenberg, Grahl und Kehrel 1998, beschrieben.
Die Herstellung von IDAAT kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung
beispielsweise wie folgt erfolgen:
Handelsübliches Antithrombin III wird mit NaOCl oxidiert und über eine Sephadex-Säule gegeben (Beispiel 1). Vor der Oxidation kann Antithrombin III vorzugsweise noch mit neutrophiler Granulozyten-Elastase inkubiert werden (siehe Beispiel 2). Vor der Oxidation kann Antithrombin III auch mit Matrixmetalloproteinase gespalten werden (siehe Beispiel 3). Antithrombin III kann auch durch Reaktion mit Defensin 2 aktiviert werden (siehe Beispiel 4).
Handelsübliches Antithrombin III wird mit NaOCl oxidiert und über eine Sephadex-Säule gegeben (Beispiel 1). Vor der Oxidation kann Antithrombin III vorzugsweise noch mit neutrophiler Granulozyten-Elastase inkubiert werden (siehe Beispiel 2). Vor der Oxidation kann Antithrombin III auch mit Matrixmetalloproteinase gespalten werden (siehe Beispiel 3). Antithrombin III kann auch durch Reaktion mit Defensin 2 aktiviert werden (siehe Beispiel 4).
Dieses Verfahren zur Herstellung von IDAAT ist ein weiterer Gegenstand der
vorliegenden Erfindung.
Wiederum ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die
Verwendung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, wobei die im
Folgenden genannten Krankheiten oder Krankheitszustände bei Menschen
oder Tieren behandelt werden können. Das erfindungsgemäße Arzneimittel
kann dabei sowohl zur Prophylaxe als auch als Heilmittel eingesetzt werden.
Indikationen sind akute Infektionen, insbesondere Infektionen mit Erregern,
die direkt oder indirekt an IDAAT oder einen Interaktionspartner binden,
ganz besonders: die Gruppe der HI-Viren, Parasiten wie Plasmodium
falciparum und Pneumocystis carinii, und Bakterien wie z. B. Staphylococcus
aureus; Verbesserung der Immunabwehr und als Mittel zur Prophylaxe der
Sepsis bei Patienten mit hohem Infektionsrisiko wie z. B. nach Operation mit
großer Infektionsgefahr, Polytraumen, Verbrennungen, Intoxikationen, unter
Chemotherapie, bei immunsupprimierten Patienten und Patienten mit
prädisponierter Abwehrschwäche; zur medikamentösen Beeinflussung von
akuten, chronischen oder allergischen Entzündungsreaktionen, insbesondere
zur Modulation von Entzündungsreaktionen, bei denen apoptotische PMNL
und Eosinophile Granulozyten unschädlich gemacht werden sollen; als
Heilmittel zur Bekämpfung von Tumorwachstum und -metastasieung; als
Angiogenesehemmer zur Bekämpfung von unerwünschter Neoangiogenese,
z. B. in Tumoren oder Patienten mit Retinopathie; als Heilmitfiel für Leukämie,
insbesondere chronisch lymphatische Leukämie; zur Verbesserung der
Wundheilung, insbesondere bei schlecht heilenden Wunden und in der
plastischen Chirurgie; zur Behandlung von Läsionen im Nervensystem,
insbesondere bei Erkrankungen, bei denen ein Auswachsen von Neuriten
erwünscht ist; zur Verbesserung der Blutstillung, insbesondere bei Patienten
mit angeborenen oder erworbenen Blutgerinnungsstörungen oder
angeborenen oder erworbenen Thrombozytopathien, unter
Antikoagulationstherapie, oder bei Operationen unter Herz-Lungenmaschine;
zur Verhinderung von entzündlich bedingten Gewebeschädigungen, z. B. bei
- a) Reperfusionen (z. B. Schlaganfall, Myokardinfarkt, Abschnürungen)
- b) Organtransplantationen (Verhinderung der Transplantatabstoßung)
und
- a) allergischen Reaktionen (incl. Neurodermitis, Asthma bronchiale).
Wenn das erfindungsgemäße Arzneimittel zur Prophylaxe von Erkrankungen
eingesetzt wird, kann es allein oder in Kombination mit Interaktionspartnern
oder anderen Medikamenten auch in Spülflüssigkeiten als Zusatz z. B. für
Mund, Vagina, Anus und Augen, als Zusatz zur Vorkehrung gegen
Übertragung von Infektionen bei sexuellen Kontakten (wie z. B. Kondomen,
Diaphragmen ete.) und in Lösungen, Pflastern und Wundauflagen zur
Wundpflege angewandt werden.
Die Anwendung des erfindungsgemäßen Arzneimittels ist lokal, intradermal,
oberflächlich, intraperitonal, intravenös, intramuskulär, oral oder über
Vesikel in einer der oben genannten Applikationsformen denkbar. Eventuelle
andere Applikationsarten sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung
umfasst.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden noch durch die Abbildungen
und die Beschreibungen dazu erläutert:
TSP-1 positive Monozyten wurden mit dem monoklonalen anti TSP
Antikörper Klon P10, der mit Phycoerythrin konjugiert war, markiert und die
Fluoreszenz der Monozyten im Durchflußzytometer gemessen
- a) 3000 gemessene Monozyten: Monozyten mit Hepes-Tyrode Puffer pH 7.4 30 min inkubiert; gewaschen und mit P10-PE markiert
- b) 3000 gemessene Monozyten: Monozyten mit TSP-1 (10 µg/ml) in Hepes-Tyrode Puffer pH7.4 30 min. RT inkubiert; gewaschen und mit P10-PE markiert
- c) 3000 gemessene Monozyten: Monozyten mit TSP-1 (10 µg/ml) und IDAAT (10 µg/ml) in Hepes-Tyrode Puffer pH7.4 30 min. RT inkubiert; gewaschen und mit P10-PE markiert
- d) Monozyten mit und ohne Zusatz von TSP-1 (10 µg/ml) mit IDAAT in steigenden Konzentrationen inkubiert (s. o.); IDAAT vermittelt die Bindung von exogen zugesetztem und endogen vorhandenem TSP-1
- a) PMNL wurden durch Inkubation in Zellkulturmedium für 24 Stunden im Inkubator nach Savill et al., 1992 apoptotisch gemacht. Apoptotische PMNL wurden mit Hepes-Tyrode Puffer pH7.4 30 min inkubiert, gewaschen, mit anti TSP AK P10-PE markiert und die Fluoreszenz von 3000 Zellen durchflußzytometrisch gemessen
- b) PMNL wurden durch Inkubation in Zellkulturmedium für 24 Stunden im Inkubator nach Savill et al., 1992 apoptotisch gemacht. Apoptotische PMNL wurden mit TSP-1 (5 µg/ml) und IDAAT (10 µg/ml) in Hepes-Tyrode Puffer pH7.4 30 min inkubiert, gewaschen, mit TSP AK P10-PE markiert und die Fluoreszenz von 3000 Zellen durchflußzytometrisch gemessen.
- c) Durchführung analog a und b: IDAAT in steigenden Konzentrationen eingesetzt. IDAAT vermittelt die Bindung von endogen vorhandenem und exogen zugesetztem (10 µg/ml) Thrombospondin.
Elutriierte PMNL und elutrüerte Monozyten wurden mit TSP und IDAAT in
unterschiedlichen Konzentrationen für 30 min bei RT miteinander inkubiert
und die Zellen fixiert. Die PMNL wurden mit einem monoklonalen FITC
konjugierten Antikörper gegen CD16b und die Monozyten mit anti CD14-PE
markiert. PE und FITC positive Assoziate wurden mit dem
Durchflußzytometer gemessen.
In "Transwell"-Zellkultur-Kammern (Costar, Bodenheim) wurde
je ein mit einer mikroporösen Polycarbonat-Membran bespannter
"Transwell"-Einsatz pro einer der 24-Vertiefungen plaziert. Die Polycarbonat-
Membran mit einer Porengröße von 5 µm wurde mit Fibronectin beschichtet
und darauf humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HMEC-1) bis zur
Konfluenz kultiviert.
Durch Dichtegradientenzentrifugation isolierte humane Monozyten (200 µl
mit 2 × 107 Zellen/ml in DMEM aus dem periphären Blut) wurden nach einem
Tag in Kultur in den oberen "Transwell"-Einsatz gegeben und für 4 Stunden
bei 37°C, 7% CO2 mit dem HMEC-1 Monolayer inkubiert. Als Maß für die
Transmigrationsrate wurde die Anzahl der Monozyten im unteren
"Transwell"-Kompartiment unter dem Transwell-Einsatz bestimmt.
Um den Einfluß von verschiedenen ATIII-Präparaten auf die
Transmigrationsrate der Monozyten zu untersuchen, wurden entweder
Monozyten, oder Endothelzellen für 10 min mit den Testsubstanzen
vorinkubiert und gewaschen oder die Testsubstanzen dem Medium in der
oberen "Transwell"-Kammer zugesetzt und die Testsubstanzen während des
kompletten Transmigrationsversuchs dort belassen. Hier ist der Zusatz zum
Medium während der Transmigration dargestellt.
Nach 4 Stunden Transmigrationsdauer wurden die Einsätze vorsichtig
entfernt, die Zellkulturplatte für 30 min zur Ablösung der adhärierten
Monozyten auf Eis gestellt und die Zahl der transmigrierten Monozyten
ausgezählt.
IDAAT aktiviert Monozyten und ruft ein Ca2+-Signal hervor.
Die angewandte Methodik wurde in der Beschreibung des Beispiels
detailliert dargestellt.
Kultivierte humane T-Zellen (Jurkatzellen) wurden für 1 Stunde bei RT mit
IDAAT oder IDAAT plus TSP-1 in den angegebenen Konzentrationen
inkubiert. An die T-Zellen gebundenes TSP-1 wurde durch den
monoklonalen PE-konjugierten anti TSP Antikörper (Klon P10) markiert und
im Durchflußzytometer gemessen. IDAAT vermittelt die Bindung von
endogen vorhandenem und exogen zugesetztem TSP an T-Zellen.
- a) ohne TSP-1 Zusatz; ohne IDAAT Zusatz; anti TSP-AK-PE-Markierung
- b) TSP-1 Zusatz (25 µg/ml); ohne IDAAT Zusatz; anti TSP-AK-PE- Markierung
- c) TSP-1 Zusatz (25 µg/ml); IDAAT Zusatz (1 µg/ml); anti TSP-AK-PE- Markierung
- d) TSP-1 Zusatz (25 µg/ml); IDAAT Zusatz (5 µg/ml); anti TSP-AK-PE- Markierung
- e) Plusminus TSP-1 (25 µg/ml); IDAAT in steigenden Konzentrationen; anti TSP-AK-PE-Markierung.
- a) fLMF löst dosisabhängig den oxidativen Burst der PMNL aus
- b) IDAAT steigert den durch fLMF ausgelösten oxidativen Burst und ist unabhängig von anderen Agonisten selbst in der Lage, den oxidativen Burst in PMNL zu induzieren.
Die angewandte Methodik wurde in der Beschreibung des Beispiels
detailliert dargestellt.
Die IL-10 Sekretion von mit S. aureus und Interferon γ
aktivierten Monozyten wird durch IDAAT gesteigert. Damit fördert IDAAT
die Sekretion eines Interleukins, welches im Tierexperiment vor LPS
induzierter Lethalität schützt. Die angewandte Methodik wurde analog
Abb. 8 durchgeführt. IL-10 wurde mittels ELISA bestimmt.
Die TNF α-Sekretion von mit S. aureus und Interferon γ
aktivierten Monozyten wird durch das TSP-1 Peptid RFYVVMWK inhibiert
(10a). IDAAT steigert die inhibierende Wirkung des TSP-1 Peptids (25 µM)
(10b). TNF α wurde mittels ELISA bestimmt. Die angewandte Methodik
wurde analog Abb. 8 durchgeführt.
- a) Zweimal zum Zeitpunkt 0 und 0 + 3 Stunden je 50 µg IDAAT i. p. behandelte Maus. Arthus Reaktion im linken Ohr
- b) Zweimal Kontrollpuffer i. p. behandelte Maus. Arthus Reaktion im linken Ohr
- c) In den Ohren eingelagertes BSA-FITC als Maß für die Arthus Reaktion in mit IDAAT oder Kontrollpuffer behandelten Mäusen. Arthus Reaktion im linken Ohr.
- 1. A Thrombozyten markiert mit PE-konjugiertem anti GPIX Antikörper (Beb 1)
- 2. B Bakterien (S. aureus) markiert mit Syto 13
- 3. C Beide Fluoreszenzenemittierende Bakterien-Thrombozyten-Assoziate
Verwendung von Thrombozyten der Patienten A. P. und W. K. mit "Gray-
platelet-syndrom". Die Zunahme der Assoziatrate durch Aktivierung mit
Thrombin fehlt bei Verwendung von "Gray"-Plättchen, denen das
Thrombospondin-1 fehlt.
** p < 0.005
*** p < 0.0001
** p < 0.005
*** p < 0.0001
Gereinigtes Ca2+-haltiges TSP-1 aus humanen
Thrombozyten wurde mit FITC (TSP-1-FITC) konjugiert und zu gelfiltrierten
Plättchen gegeben. Dieser Ansatz wurde für 1 Stunde bei RT mit IDAAT (2 µg/ml
und 5 µg/ml) inkubiert und im Durchflußzytometer gemessen (5000
Thrombozyten).
- a) Gelfiltrierte humane Thrombozyten (50 000 µl) wurden mit 150 µ/ml FITC-konjugiertem Fibrinogen versetzt und mit Kollagen in aufsteigenden Konzentrationen in Abwesenheit oder Anwesenheit von IDAAT (5 µg/ml) inkubiert. Nach 30minütiger Inkubation wurden die Thrombozyten im Durchflußzytometer gemessen.
- b) Gelfiltrierte humane Thrombozyten (50 000/µl) wurden mit 150 µ/ml FITC-konjugiertem Fibrinogen versetzt und IDAAT ohne TSP oder mit TSP-1 (10 µg/ml) in aufsteigenden Konzentrationen zugesetzt. Nach 1stündiger Inkubation wurden die Thrombozyten im Durchflußzytometer gemessen.
- a) IDAAT steigert die Adhäsion von Thrombozyten an Adhäsionsproteine: Fibronectin, Vitronectin, Fibrinogen, Thrombospondin-1 und Kollagen
- b) Vergleich von IDAAT und handelsüblichen ATIII-Präparaten auf die Wirkung der Plättchenadhäsion. Die angewandte Methodik wurde in der Beschreibung des Beispiels detailliert dargestellt.
- a) Die IDAAT vermittelte Adhäsion von Thrombozyten an immobilisiertes Thrombospondin-1 wird durch lösliche Integrine αIIbβ3 (5 µg/ml) bzw. αvβ3 (5 µg/ml) komplett gehemmt. Die angewandte Methodik wurde in der Beschreibung des Beispiels detailliert dargestellt.
- b) Die IDAAT vermittelte Adhäsion von Thrombozyten an immobilisiertes Vitronectin wird teilweise durch lösliche Integrine αIIbβ3 (5 µg/ml) bzw. αvβ3 (5 µg/ml) gehemmt. Die angewandte Methodik wurde in der Beschreibung des Beispiels detailliert dargestellt.
Die IDAAT vermittelte Adhäsion von Thrombozyten an
immobilisiertes TSP-1 wird durch den CD36 spezifischen Antikörper Klon
37, bei gleichzeitiger Blockade des Fc-Rezeptors durch IV.3 vollständig
gehemmt. Alleinige Fc-Rezeptor-Blockade hat keinen Einfluß. Die
angewandte Methodik wurde in der Beschreibung des Beispiels detailliert
dargestellt.
Die IDAAT vermittelte Thrombozytenadhäsion wurde mit
Hirudin (20 U/ml) antikoaguliertem Plättchenreichen Plasma durchgeführt.
Die angewandte Methodik wurde in der Beschreibung des Beispiels
detailliert dargestellt.
Die IDAAT vermittelte Adhäsion von Thrombozyten an TSP-1
ist abhängig von zweiwertigen Ionen.
EDTA (5 mM) hemmt diese IDAAT-Wirkung vollständig. 1 mM Ca2+ steigert
diese IDAAT Wirkung deutlich. Die angewandte Methodik wurde in der
Beschreibung des Beispiels detailliert dargestellt.
Zusatz von löslichem TSP-1 hemmt die Adhäsion von
Thrombozyten an Kollagen dosisabhängig, während IDAAT, welches TSP-1
immobilisiert, die Adhäsion von Thrombozyten an Kollagen dosisabhängig
steigert. Die angewandte Methodik wurde in der Beschreibung des Beispiels
detailliert dargestellt.
Zusatz von Monozyten (100/µl) zu Thrombozyten
(300 000/µl) steigert die Adhäsion von Thrombozyten an TSP-1, während
Zusatz von Erythrozyten (20 000/µl) eine hemmende Wirkung hat. Die
angewandte Methodik wurde in der Beschreibung des Beispiels detailliert
dargestellt.
Die IDAAT induzierte Thrombozytenadhäsion wurde durch
Inhibitoren der PI-3-Kinase Wortmannin (20 nM) und LY294002 (50 µM)
gehemmt. Wortmannin und LY294002 wurden dazu für 10 min vor IDAAT-
Zusatz vorinkubiert.
Die Thrombozytenaggregation wurde nach Born 1962 durchgeführt. Zu
gelfiltrierten Plättchen (200 000/µl) in Hepes-Tyrode Puffer pH7.4 mit 100 µg/ml
Fibrinogen wurde in einer Aggregationsküvette TSP-1 (25 µg/ml)
pipettiert. Lösliches TSP-1 löste keine Aggregation aus. Zusatz von IDAAT
führte zu einer schwachen Aggregationsreaktion. Gleichzeitige Gabe von
IDAAT und löslichem TSP-1 führte zu einer starken Aggregatbildung.
Gelfiltrierte Plättchen (50 000/µl) wurden mit dem TSP-1 Peptid
RFYVVMWK (40 µM) aktiviert und IDAAT in steigenden Konzentrationen
zugesetzt. Nach 30 min Inkubation wurden Plättchen und aus Plättchen-
entstandenen Mikropartikel mit anti GPIX-PE markiert und die Zahl der
entstandenen Mikropartikel im Verhältnis zu 5000 gezählten Plättchen im
Durchflußzytometer gemessen.
Die Methodik wurde detailliert in der Beschreibung des Beispiels dargestellt.
IDAAT verstärkt die TSP-1 Bindung an Endothelzellen.
IDAAT steigert die Bindung von Thrombozyten an Vitronectin
ummantelte Latex-Beads. Die Methodik wurde detailliert in der Beschreibung
des Beispiels dargestellt.
- a) IDAAT besteht aus polymerem ATIII, dargestellt mit dem "Rotary- Shadowing"-Elektronenmikroskopieverfahren
- b) Handelsübliches ATIII besteht aus monomären globulären Molekülen; elektronenmikroskopische Aufnahme nach Rotationsbedampfung
- c) IDAAT (1 mg/ml) und TSP-1 (200 µg/ml) wurden 1 Stunde bei RT miteinander inkubiert. IDAAT und TSP-1 bilden zusammen große Assoziate; elektronenmikroskopische Aufnahme nach Rotationsbedampfung
- d) Handelsübliches ATIII (1 mg/ml) und TSP-1 (200 µg/ml) wurden 1 Stunde bei RT miteinander inkubiert. Handelsübliches AT III und TSP-1 reagierten nicht miteinander; elektronenmikroskopische Aufnahme nach Rotationsbedampfung.
Rekombinantes CD4 (1 µg/100 µl/well) wurde an den Boden einer ELISA-
Platte (Nung-Maxisorb) gebunden. Die Platte wurde mit PBS pH 7,4, 0,5%
Tween 20 gründlich gewaschen und freie Plätze auf der Plastikoberfläche
mit 3% BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Die Platte wurde
wieder gewaschen und anschließend IDAAT bzw. handelsübliches ATIII in
aufsteigenden Konzentrationen von 0-5 µg/ml für 1 Stunde bei RT
zugesetzt. Die ATIII-Lösungen wurden entfernt, die Platte gründlich
gewaschen und mit einem polyklonalen monospezifischen Antikörper gegen
ATIII aus dem Kaninchen DAKO, Hamburg) in einer Verdünnung von
1 : 15000 in PBS, 1% NGS (normal goat serum) inkubiert. Die Platte wurde
erneut gewaschen und anschließend mit einem affinitätsgereinigten
Antikörper aus der Ziege gegen Kaninchen IgG, der mit Peroxidase
konjugiert war (BIORAD, München) in einer Verdünnung von 1 : 3000
inkubiert. Die Platte wurde wieder mehrfach gewaschen und mit
Substratlösung (100 µl/well) (20 mg ortho-Phenyldiamin, 5% H2O2 in einem
Puffer aus 12,15 ml 0,1 M Zitronensäure und 12,85 m) 0,2 M Na2HPO4 plus
25 ml Aqua dest.) versetzt.
Die Extinktion bei 405 nm gemessen im ELISA-Photometer spiegelt die
Menge an gebundenem Antithrombin wieder. Die Reaktion wurde mit 50 µl/well
4N H2SO4 gestoppt und die Extinktion bei 490 nm gemessen. Die
Reaktion zeigt deutlich, dass IDAAT nicht nur TSP-1 vermittelt, sondern
auch direkt an CD4 binden kann.
Rekombinantes HIV-GP120 (1 µg/100 µl/well) wurde an den Boden einer
ELISA-Platte (Nung-Maxisorb) gebunden. Die Platte wurde mit PBS pH 7,4,
0,05% Tween 20 gründlich gewaschen und freie Plätze auf der
Plastikoberfläche mit 3% BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt.
Die Platte wurde wieder gewaschen und anschließend IDAAT bzw.
handelsübliches ATIiI in aufsteigenden Konzentrationen von 0-5 µg/ml für
1 Stunde bei RT zugesetzt. Die ATIII-Lösungen wurden entfernt, die Platte
gründlich gewaschen und mit einem polyklonalen monospezifischen
Antikörper gegen ATIII aus dem Kaninchen (DAKO, Hamburg) in einer
Verdünnung von 1 : 15000 in PBS, 1% NGS (normal goat serum) inkubiert.
Die Platte wurde erneut gewaschen und anschließend mit einem
affinitätsgereinigten Antikörper aus der Ziege gegen Kaninchen IgG, der mit
Peroxidase konjugiert war (BIORAD, München), in einer Verdünnung von 1 : 3000
inkubiert. Die Platte wurde wieder mehrfach gewaschen und mit
Substratlösung (100 µl/well) (20 mg ortho-Phenyldiamin, 5% H2O2 in einem
Puffer aus 12,15 ml 0.1 M Zitronensäure und 12,85 ml 0.2 M Na2HPO4 plus
25 ml Aqua dest.) versetzt.
Die Extinktion bie 405 nm gemessen im ELISA-Photometer spiegelt die
Menge an gebundenem Antithrombin wieder. Die Reaktion wurde mit 50 µl/well
4 N H2SO4 gestoppt und die Extinktion bei 490 nm gemessen. Die
Reaktion zeigt deutlich, dass IDAAT nicht nur TSP-1 vermittelt, sondern
auch direkt an HIV-GP120 binden kann.
Gereinigtes Thrombospandin-1 (1 µg/100 µl/well) wurde an den Boden einer
ELISA-Platte (Nung-Maxisorb) gebunden. Die Platte wurde mit PBS pH 7,4,
0,05% Tween 20 gründlich gewaschen und freie Plätze auf der
Plastikoberfläche mit 3% BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt.
Die Platte wurde wieder gewaschen und anschließend IDAAT bzw.
handelsübliches ATIII in aufsteigenden Konzentrationen von 0-5 µg/ml für
1 Stunde bei RT zugesetzt. Die ATIII-Lösungen wurden entfernt, die Platte
gründlich gewaschen und mit einem polyklonalen monospezifischen
Antikörper gegen ATIII aus dem Kaninchen (DAKO, Hamburg) in einer
Verdünnung von 1 : 15000 in PBS, 1% NGS (normal goat serum) inkubiert.
Die Platte wurde erneut gewaschen und anschließend mit einem
affinitätsgereinigten Antikörper aus der Ziege gegen Kaninchen IgG, der mit
Peroxidase konjugiert war (BIORAD, München), in einer Verdünnung von 1 : 3000
inkubiert. Die Platte wurde wieder mehrfach gewaschen und mit
Substratlösung (100 µl/well) (20 mg ortho-Phenyldiamin, 5% H2O2 in einem
Puffer aus 12,15 ml 0.1 M Zitronensäure und 12,85 ml 0.2 M Na2HPO4 plus
25 ml Aqua dest.) versetzt.
Die Extinktion bei 405 nm gemessen im ELISA-Photometer spiegelt die
Menge an gebundenem Antithrombin wieder. Die Reaktion wurde mit 50 µl/well
4 N H2SO4 gestoppt und die Extinktion bei 490 nm gemessen. Die
Reaktion zeigt deutlich, dass IDAAT direkt an TSP-1 binden kann.
Vitronectin (1 µg/100 µl/well) wurde an den Boden einer ELISA-Platte
(Nung-Maxisorb) gebunden. Die Platte wurde mit PBS pH 7,4, 0,05%
Tween 20 gründlich gewaschen und freie Plätze auf der Plastikoberfläche
mit 3% BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Die Platte wurde
wieder gewaschen und anschließend IDAAT bzw. handelsübliches ATIII in
aufsteigenden Konzentrationen von 0-5 µg/ml für 1 Stunde bei RT
zugesetzt. Die ATIII-Lösungen wurden entfernt, die Platte gründlich
gewaschen und mit einem polyklonalen monospezifischen Antikörper gegen
ATIII aus dem Kaninchen (DAKO, Hamburg) in einer Verdünnung von 1 : 15 000
in PBS, 1% NGS (normal goat serum) inkubiert. Die Platte wurde
erneut gewaschen und anschließend mit einem affinitätsgereinigten
Antikörper aus der Ziege gegen Kaninchen IgG, der mit Peroxidase
konjugiert war (BIORAD, München), in einer Verdünnung von 1 : 3000
inkubiert. Die Platte uwrde wieder mehrfach gewaschen und mit
Substratlösung (100 µl/well) (20 mg ortho-Phenyldiamin, 5% H2O2 in einem
Puffer aus 12,15 ml 0,1 M Zitronensäure und 12,85 ml 0.2 M Na2HPO4 plus
25 ml Aqua dest.) versetzt. Die Extinktion bei 405 nm gemessen im ELISA-
Photometer spiegelt die Menge an gebundenem Antithrombin wieder. Die
Reaktion wurde mit 50 µl/well 4 N H2SO4 gestoppt und die Extinktion bei
490 nm gemessen. Die Reaktion zeigt deutlich, dass IDAAT direkt an
aktives Vitronectin binden kann.
Im beschriebenen Sinne nicht funktionsfähiges, nicht aktiviertes
Antithrombin III wurde entweder von Calbiochem, Sigma, Enzyme Research
Laboratories, Pharmacia & Upjohn, Aventis, Baxter oder Grifols bezogen
oder aus humanem Plasma gereinigt. Die Antithrombin-Präparate wurden
gegen Phosphat-gepufferte Saline (PBS) pH 7,4 umgepuffert. 348 µg reines
Antithrombin wurde mit PBS pH 7,4 und 0,1 mM EDTA auf ein Volumen
von 1 ml gebracht und die Lösung auf Eis gekühlt. Kaltes NaOCl (832 µg)
wurde in einem Volumen von 10 pl zugesetzt und der Ansatz für 10
Minuten auf Eis inkubiert. Die Reaktion wurde durch sofortige Gelfiltration
bei 4°C über Sephadex G25 (PD10-Säulen) terminiert.
Handelsübliches, nicht aktiviertes Antithrombin III wurde gegen PBS pH 8,0
umgepuffert. 500 µg reines Antithrombin III wurde mit 50 µg Neutrophile
Granulozyten-Elastase (HNE) (human, gelöst in 50 ph Puffer) versetzt und
der Ansatz (500 ph Volumen) für 16 Stunden bei 37°C inkubiert. Die
Reaktion wurde mit 1 mM (Endkonzentration) Phenylmethylsulfonylfluorid
(PMSF) gestoppt und das Antithrombin III mit dem Centricon-Verfahren
gegen PBS/0,1 mM EDTA pH 7,4 umgepuffert. Anschließend erfolgte eine
Oxidation mit NaOCl wie im Beispiel 1 beschrieben.
Handelsübliches, nicht aktiviertes Antithrombin III wurde gegen PBS pH 8,0
umgepuffert. 500 µg reines Antithrombin III wurde mit 12,4 µg
Matrixmetalloproteinase-2 (MMP-2) (gelöst in 0,9% NaCl) in 25 mM
Tris/HCl/30 mM NaCl/10 mM Ca2+-Puffer angesetzt. Um die MMP-2 zu
aktivieren, wurde sie für 2 Stunden bei RT mit 1 mM APMA (4-amino
phenylmercuric acetate) vorbehandelt. Der Ansatz (500 µl Volumen) wurde
für 16 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Antithrombin III wurde mit dem
Centricon-Verfahren gegen PBS pH 7,4 umgepuffert.
Handelsübliches, nicht aktiviertes Antithrombin III wurde gegen PBS pH 8,0
umgepuffert. 200 µg reines Antithrombin III wurde mit Defensin 2 (HNP-2,
gelöst in 0,9% NaCl, Endkonzentration 10 µM) in PBS pH 8,0 für 1 Stunde
bei RT inkubiert.
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Claims (13)
1. Arzneimittel, enthaltend aktiviertes Antithrombin III (IDAAT), IDAAT-
Peptide, -Analoga oder -Mimetika.
2. Arzneimittel nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
dass es rekombinantes IDAAT oder Peptide oder Analoga davon
enthält.
3. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass es weitere pharmazeutisch akzeptable Hilfs- oder/und
Trägersubstanzen enthält.
4. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass es zur lokalen, intradermalen, oberflächlichen, intraperitonalen,
intravenösen, orale oder intramuskulären Verabreichung formuliert ist,
oder über Vesikel verabreicht wird.
5. Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass es weitere Substanzen wie z. B. Antibiotika, oder
Interaktionspartner des IDAAT im Körper enthält.
6. Verfahren zur Herstellung von aktiviertem Antithrombin III (IDAAT),
dadurch gekennzeichnet,
dass man Antithrombin III oxidiert, spaltet und oxidiert, spaltet,
denaturiert, Peptide, wie z. B. Defensin 2, daran koppelt oder
Antithrombin III anderweitig polymerisiert.
7. Verwendung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1 bis 5
zur Prophylaxe oder Therapie von akuten Infektionen, Sepsis, akuten,
chronischen und/oder allergischen Entzündungsreaktionen, von
Tumorwachstum und -metastasierung, zur Bekämpfung von
unerwünschter Neoangiogenese, für Leukämie, zur Verbesserung der
Wundheilung, zur Behandlung von Läsionen im Nervensystem, zur
Verbesserung der Blutstillung sowie zur Verhinderung von
entzündlich bedingten Gewebeschädigungen, sowie zur allgemeinen
Steigerung der Immunabwehr und zur Inhibition von
Entzündungsreaktionen.
8. Verwendung nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass als akute Infektion eine HIV-Infektion behandelt wird.
9. Verwendung nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass insbesondere chronisch lymphatische Leukämie behandelt wird.
10. Verwendung nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass es bei Patienten mit hohem Infektionsrisiko, wie nach
Operationen mit großer Infektionsgefahr, Polytraumen,
Verbrennungen, Intoxikationen unter Chemotherapie, bei
immunsupprimierten Patienten und Patienten mit prädisponierter
Abwehrschwäche eingesetzt wird.
11. Verwendung nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass es zur Blutstillung, inbesondere bei Patienten mit angeborenen
oder erworbenen Blutgerinnungsstörungen oder angeborenen oder
erworbenen Thrombozytopathien, unter Antikoagulationstherapie
oder bei Operationen unter Herzlungenmaschine eingesetzt wird.
12. Verwendung nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass es bei Reperfusionen, Organtransplantationen oder allergischen
Reaktionen eingesetzt wird.
13. Verwendung nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass parasitäre Erkrankungen, insbesondere Malaria tropica,
behandelt werden.
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