DE10023051A1 - Fluoresceinisothiocyanat-(FITC)-Sinistrin,seine Herstellung und Verwendung - Google Patents

Fluoresceinisothiocyanat-(FITC)-Sinistrin,seine Herstellung und Verwendung

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Abstract

Die Erfindung betrifft Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin (FITC-Sinistrin), ein Verfahren zu seiner Herstellung, seine Verwendung als Markensubstanz in einem Diagnostikum sowie ein entsprechendes Diagnostikum.

Description

Die Erfindung betrifft eine neue chemische Verbindung, die als Markersubstanz in der Nie­ rendiagnostik eingesetzt werden kann, ihre Herstellung und Verwendung sowie ein sie ent­ haltendes Nierendiagnostikum.
In der Nierendiagnostik, dort insbesondere bei der Bestimmung der glomerulären Filtrations­ rate (GFR) zur Nierenfunktionsprüfung, werden unter anderem Fructane als Markersubstan­ zen eingesetzt. Fructane, die auch als Polyfructosane bezeichnet werden, sind Oligo- und Po­ lysaccharide, die aus geraden oder verzweigten Fructoseketten aufgebaut sind, welche auf ein Grundmolekül Saccharose aufgepfropft sind. Je nach Grad der Verzweigung der Fructoseket­ ten und je nach Grad der Polymerisation können unterschiedliche Fructane unterschiedliche physikalische Eigenschaften aufweisen, beispielsweise unterschiedliche Wasserlöslichkeiten. Viele Fructane kommen in Pflanzen als Reservekohlenhydrate vor, beispielsweise in den un­ terirdischen Teilen von Compositen, Campanulaceen, Gräsern und Liliaceen.
In der Nierenfunktionsprüfung werden insbesondere die Fructane Inulin und Sinistrin als Markersubstanzen eingesetzt. Inulin und Sinistrin sind aus jeweils ca. 10 bis 40 Fructoseein­ heiten aufgebaut und weisen dementsprechend Molekulargewichte von ca. 1600 bis ca. 6500 auf. Sowohl Inulin als auch Sinistrin werden nach parenteraler Applikation weder durch den Stoffwechsel verändert noch im Organismus gespeichert, sondern durch die Nierenglomeruli ausfiltriert und in den Tubuli nicht wieder rückresorbiert.
Zur Beurteilung der Nierenfunktion wird üblicherweise der zeitliche Verlauf der Markersu­ stanzkonzentration im Blut nach parenteraler Gabe einer bestimmten Dosis der Markersub­ stanz bestimmt. Die Bestimmung der Konzentration der Markersubstanz im Blut kann bei­ spielsweise mittels enzymatischer Methoden erfolgen (vgl. z. B. H. F. Kuehnle et al., "Fully en­ zymatic inulin determination in small volume samples without deproteinization", Nephron 62 (1992), 104-107). Im Fall von Inulin als Markersubstanz wird unter anderem auch die Mög­ lichkeit beschrieben, mit einem Fluoreszenzmarker versehenes Inulin, beispielsweise Fluo­ resceinisothiocyanat-markiertes Inulin (FITC-Inulin), zu verwenden und die Konzentration der Markersubstanz mittels Fluoreszenzmessung zu bestimmen (vgl. z. B. M. Sohtell et al., "FITC-inulin as a kidney tubule marker in the rat", Acta Physiol. Scand. 119 (1983), 313-316; J. N. Lorenz & E. Gruenstein, "A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin", Am. J. Physiol. 276 (Renal Physiol. 45), (1999), F172-F177).
Inulin und FITC-Inulin haben für die klinische Alltagsroutine den Nachteil, daß sie in Wasser nur sehr gering löslich sind und in wässrigen Zubereitungen bei der Lagerung auskristallisie­ ren. Vor der Applikation müssen die inulinhaltigen Zubereitungen deshalb in der Regel er­ wärmt werden, um das Inulin oder FITC-Inulin wieder in Lösung zu bringen. Durch diese Maßnahme wird das Inulin jedoch je nach Dauer des Erhitzens hydrolytisch angegriffen und teilweise bis zur Fructose abgebaut. Zudem verbleiben bei unvollständigem Auflösen Reste von nicht gelösten Inulinteilchen in der Zubereitung, die nur schwer zu erkennen sind und die nach einer Injektion schwere Kreislaufkomplikationen zur Folge haben können. Die ge­ ringe Löslichkeit von Inulin oder FITC-Inulin führt dazu, daß eine definierte Konzentration der Markersubstanz in einer Injektionslösung nur schwer zu erreichen ist. Außerdem hat die Anwendung von Inulin oder FITC-Inulin nach der Injektion in das Versuchstier einen transi­ enten Blutdruckabfall zur Folge. Diese Kreislaufreaktion dauert in günstigen Fällen 5 Minu­ ten. Insbesondere wird durch den Kreislaufeinbruch gerade die zu bestimmende Nierenfunk­ tion gestört.
Sinistrin ist wie Inulin ein Fructan und kann durch Extraktion aus fructanhaltigen Pflanzen­ teilen gewonnen werden (vgl. z. B. EP-B 0 568 574). Die Verwendung von Sinistrin als Mark­ ersubstanz erfordert jedoch verhältnismäßig hohe Sinistrinkonzentrationen in den entspre­ chenden Zubereitungen, die im Bereich von 100 mg je kg Körpergewicht des zu untersuchen­ den Individuums liegen, da Sinistrin selbst nur in Blutproben bestimmt werden kann und die hierfür zur Verfügung stehenden Analysenmethoden verhältnismäßig unempfindlich sind. Zudem ist der Nachweis von Sinistrin nur mit einer mehrstufigen enzymatischen Reaktion möglich, bei der zunächst nach Entfernen der endogenen Glucose das Sinistrin in Glucose umgewandelt und die so erhaltene Glucose als Maß für das Sinistrin bestimmt wird. Erfah­ rungsgemäß sind solche mehrstufigen Reaktionen aufwendig und oft mit einem nicht uner­ heblichen Fehler behaftet.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen. Insbesondere ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Substanz bereit­ zustellen, die als Markersubstanz in der Nierenfunktionsprüfung eingesetzt werden kann und die gegenüber den im Stand der Technik bekannten Markersubstanzen, insbesondere Inulin, FITC-Inulin und Sinistrin, Vorteile aufweist.
Die Aufgabe wird durch den Gegenstand der Erfindung, wie er in den Patentansprüchen an­ gegeben ist, gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist mit Fluoresceinisothiocyanat gelabeltes Sinistrin, welches im Folgenden als FITC-Sinistrin bezeichnet werden soll.
Das FITC-Sinistrin der vorliegenden Erfindung ist erhältlich durch Umsetzung von Sinistrin mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC), wobei zunächst das Sinistrin in einem geeigneten Lö­ sungsmittel, beispielsweise Dimethylformamid (DMF), mit Natriumhydrid (NaH) zur Reak­ tion gebracht wird und anschließend FITC zur Reaktionsmischung gegeben wird. Das Pro­ dukt, FITC-Sinistrin, kann nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Versetzen mit wäßriger Ammoniumchloridlösung (NH4Cl), anschließender Extraktion mit Diethylether und Entfernen des Lösungsmittels, als Feststoff isoliert und gegebenenfalls durch Umkristalli­ sieren und/oder Gelfiltration gereinigt werden. Eine bevorzugte Darstellungsvorschrift für FITC-Sinistrin ist in Beispiel 1 angegeben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das oben beschriebene Herstellverfahren für FITC- Sinistrin.
Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung von FITC-Sinistrin als Bestandteil einer diagnostischen Zubereitung, die insbesondere für die Nierendiagnostik geeignet ist, so­ wie ein Diagnostikum, insbesondere eine diagnostische Zubereitung, das FITC-Sinistrin ent­ hält.
Das FITC-Sinistrin der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt als Bestandteil einer parente­ ral zu verabreichenden Zubereitung für die Nierenfunktionsprüfung verwendet. Zur Herstel­ lung des Diagnostikums wird FITC-Sinistrin in aqua ad inj. (Wasser für Injektionszwecke gemäß DAB 10) oder physiologischer Kochsalzlösung (isotonische Natriumchloridlösung) gelöst. Die Konzentration des FITC-Sinistrins in der diagnostischen Zubereitung liegt im Be­ reich von 25 bis 125 mg/ml. Neben FITC-Sinistrin kann das parenteral zu applizierende Dia­ gnostikum auch noch physiologisch verträgliche Puffersubstanzen enthalten.
Die Anwesenheit der Fluoresceinisothiocyanat-Gruppe in FITC-Sinistrin ermöglicht die Be­ stimmung von FITC-Sinistrin anhand von Fluoreszenzmessungen. Diese können in vitro durchgeführt werden, beispielsweise in Blutproben. Für die Fluoreszenzmessung von FITC- Sinistrin, in beispielsweise Blutproben, ist keine enzymatische Vorbehandlung der Blutprobe notwendig. Zudem bietet die Fluoreszenzmessung den Vorteil hoher Empfindlichkeit und Schnelligkeit der Messung. Die Messung kann mit üblichen Standardgeräten durchgeführt werden. Der Einsatz des erfindungsgemäßen FITC-Sinistrins als Markersubstanz in der Nie­ rendiagnostik erlaubt auch nicht-invasive Nachweismethoden für FITC-Sinistrin. Nicht- invasive Nachweismethoden sind im hier benutzten Sprachgebrauch Methoden, die den Nachweis einer Substanz, hier von FITC-Sinistrin, in Gewebe oder Körperflüssigkeiten ohne vorherige Probennahme, beispielsweise durch Blutabnahme nach einer Venenpunktion oder durch Gewinnung von Kapillarblut aus der Fingerbeere oder dem Ohrläppchen, erlauben.
Vorzugsweise wird als nicht-invasives Verfahren zur Bestimmung von FITC-Sinistrin im Ge­ webe oder in Körperflüssigkeiten ein Fluoreszenzmessverfahren eingesetzt, bei dem Licht zur Anregung der Fluoreszenz in die Haut des zu untersuchenden Individuums eingestrahlt wird und das aus der Haut austretende Fluoreszenzlicht detektiert wird. Vorteilhafterweise kann dies mit Hilfe eines nicht-invasiven Messkopfes geschehen, bei dem eine Lichtquelle, bei­ spielsweise ein im UV-Bereich emittierender Laser, über eine Glasfaseroptik die Haut be­ leuchtet und die darin enthaltenen FITC-Sinistrinmoleküle zur Fluoreszenz anregt. Das Fluo­ reszenzlicht wird mit einer Glasfaseroptik aufgenommen und mit einem entsprechenden De­ tektor, beispielsweise einem CCD-Spektrographen, gemessen. Die Lichtquelle und/oder der Detektor kann dabei in den Messkopf integriert oder außerhalb des Meßkopfes angeordnet sein. Der Meßkopf wird mit einem transparenten Kleber, beispielsweise einer transparenten Klebefolie, auf die Haut des zu untersuchenden Individuums aufgeklebt und verbleibt dort für die gesamte Meßzeit.
Da die Bestimmung von FITC-Sinistrin mit Hilfe empfindlicher Fluoreszenzmessungen mög­ lich ist, kann die FITC-Sinistrin-Menge, die dem zu untersuchenden Individuum verabreicht wird, deutlich niedriger sein, als dies mit (underivatisiertem) Sinistrin der Fall ist. Während für Sinistrin Dosen von 100 mg Substanz je kg Körpergewicht des zu untersuchenden Indivi­ duums notwendig sind, kann FITC-Sinistrin ausreichend sensitiv bereits bei Dosen von 5 bis 50 mg, vorzugsweise sogar schon bei Dosen von 5 bis 20 mg Substanz je kg Körpergewicht des zu untersuchenden Individuums nachgewiesen werden. Durch die niedrige Dosierung wird eine Belastung des zu untersuchenden Organismus' im Vergleich zu Sinistrin deutlich ver­ mindert.
Zudem ist eine nicht-invasive Detektion von FITC-Sinistrin möglich. Dies trägt ebenfalls zur Reduzierung der körperlichen Beeinträchtigung des zu untersuchenden Individuums bei, da keine Blutproben für die Untersuchung und Bestimmung von FITC-Sinistrin genommen werden müssen.
Die nicht-invasive Messung des FITC-Sinistringehalts kann kontinuierlich über einen länge­ ren Zeitraum, beispielsweise über die klinisch relevante Meßzeit von 180 min für die Nieren­ funktionskontrolle (gFR), erfolgen. Dies trägt zu einer präzisen Diagnostik bei.
Bislang wurden bei der Verwendung von FITC-Sinistrin als Markersubstanz für die Nieren­ funktionsprüfung keine unerwünschten Kreislaufreaktionen bei den untersuchten Individuen festgestellt. Die glomeruläre Filtrationsrate kann somit ohne sekundären Einfluss auf die Nie­ re bestimmt werden. Dies ist ein deutlicher Vorteil gegenüber der bekannten Verwendung von FITC-Inulin oder Inulin.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1
Herstellung von Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin
Sinistrin (500 mg, 3,1 mmol, Fresenius Kabi, Linz, Österreich) wurde unter N2-Atmosphäre zu 17 ml trockenem Dimethylformamid (DMF) gegeben und 15 min bei 40-43°C gerührt. Es wurde im Eisbad abgekühlt und mit Natriumhydrid (500 mg einer 60-prozentigen Suspensi­ on in Öl, 12,5 mmol, Fluka, Buchs, Schweiz) versetzt. Es wurde 5 min bei Raumtemperatur und 30 min bei 40-45°C gerührt, wobei die Reaktionsmischung zunehmend viskos wurde, jedoch noch rührbar blieb. Fluoresceinisothiocyanat (FITC, 350 mg, 0,9 mmol, Sigma, Isomer I) wurde als Feststoff zugegeben. Dabei sank sofort die Viskosität der Reaktionsmischung. Nach 18 h Rühren bei 40-45°C wurde auf 0°C gekühlt und vorsichtig mit einer Lösung von Ammoniumchlorid (NH4Cl, 696 mg, 13 mmol) in 10 ml Wasser versetzt. Nach der Zugabe von weiteren 20 ml Wasser wurde die trübe Lösung zum Entfernen des Weißöls zweimal mit Diethylether extrahiert. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer bei einer Badtem­ peratur von unter 40°C weitestgehend entfernt und der Rückstand im Hochvakuum getrock­ net. Der Rückstand wurde in 30 ml einer 1 : 1-Mischung von Ethanol und Wasser aufgenom­ men und erst mit Ethanol, dann mit Aceton bis zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml ge­ fällt. Der Niederschlag wurde sedimentiert und abzentrifugiert.
Nach einer Gelfiltration (BioRad Biogel, P-2 extra fine, Säule 2,5.35 cm, Eluens VE-Wasser) konnte durch erneute Fällung 340 mg FITC-Sinistrin als gelbes Pulver erhalten werden.
Bezogen auf 1 mol Sinistrin enthielt das Produkt ca. 0,14 mol FITC.
Fig. 1 zeigt ein UV/VIS-Spektrum von FITC-Sinistrin, bei dem die Absorption A gegen die Wellenlänge in λ nm aufgetragen ist.
Beispiel 2 Nicht-invasive Messung von FITC-Sinistrin im Tierversuch a) Einsatz des nicht-invasiven Meßkopfes
Der nicht-invasive Meßkopf hatte die Aufgabe, Licht zur Anregung der Fluoreszenz in die Haut einzustrahlen und Fluoreszenzlicht aus der Haut aufzunehmen. Der Meßkopf war als faseroptischer Messkopf gestaltet, bei dem eine externe Lichtquelle (UV-Laser) über eine Glasfaser die Haut beleuchtete und die darin enthaltenen FITC-Sinistrin-Moleküle anregte. Das Fluoreszenzlicht (520 nm Wellenlänge) wurde wiederum mit Glasfasern aufgenommen und in einem externen Detektor (CCD-Spektrograph) gemessen.
Der Meßkopf wurde mit einer transparenten Klebefolie auf die Haut des Versuchstieres auf­ geklebt und verblieb dort für die gesamte Meßzeit.
b) Durchführung der Tierexperimente
Das Versuchstier (Kaninchen) wurde fachgerecht anästhesiert und mit einem zentralarteriel­ len Katheter versehen. Der Katheter diente lediglich zum Überwachen des arteriellen Blut­ drucks und zur Entnahme von Referenzblutproben.
Der nicht-invasive Meßkopf wurde im Bereich des Brustkorbes des Versuchstieres auf einer rasierten Hautstelle aufgeklebt. Die Testsubstanz FITC-Sinistrin wurde in einer Standarddosis von 30 mg/kg intravenös appliziert. Die gesamte, klinisch relevante Messzeit für die Nieren­ funktionsprüfung (gFR) betrug 180 min.
c) Ergebnis der Tierexperimente
In Fig. 2 ist ein Vergleich zwischen einer nicht-invasiven, durch Fluoreszenzmessung von FITC-Sinistrin erhaltenen Clearance-Kurve (1) mit einer FITC-Clearance-Kurve (2), deren Werte durch Fluoreszenzmessung in Blutproben des Versuchstieres gewonnen wurden, dar­ gestellt. Dabei ist die normierte Signalintensität I logarithmisch gegen die Zeit t in min aufge­ tragen.
Die Übereinstimmung der Abfalldynamik der beiden Kurven, die sich auch durch die ähnli­ chen Halbwertszeiten für die Clearance ausdrückt, zeigt die Gleichwertigkeit der beiden Me­ thoden. Die Halbwertszeit für die nicht-invasive Methode betrug in diesem Beispiel 38 min; für die invasive Referenzmethode wurden 43 min gefunden.
Beispiel 3 Vergleich der invasiven mit der nicht-invasiven Messmethode für Sinistrin und Inulin
Das Tierexperiment aus Beispiel 2 wurde für FITC-Sinistrin 10 mal in identischer Weise wie­ derholt. Die Halbwertszeiten (in Minuten) für die Clearancekurven, die aus den invasiven Messungen gewonnen wurden (t 1/2 inv.), wurden gegen die aus den nicht-invasiven Mes­ sungen erhaltenen Halbwertszeiten (t 1/2 n. i.) aufgetragen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Der Korrelationskoeffizient betrug 89,9%.
Zum Vergleich wurde das Tierexperiment aus Beispiel 2 für FITC-Inulin (erhältlich bei Sigma (Aldrich)) 20 mal in identischer Weise wiederholt. Die Halbwertszeiten (in Minuten) für die Clearancekurven, die aus den invasiven Messungen gewonnen wurden (t 1/2 inv.), wurden gegen die aus den nicht-invasiven Messungen erhaltenen Halbwertszeiten (t 1/2 n. i.) aufge­ tragen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Der Korrelationskoeffizient betrug in die­ sem Fall nur 49,2%.
Während bei der Verwendung des erfindungsgemäßen FITC-Sinistrins eine sehr gute Korre­ lation zwischen invasiver und nicht-invasiver Messung gefunden wurde, ist für FITC-Inulin praktisch keine Korrelation zu erkennen. Möglicherweise ist die geringe Übereinstimmung im Fall von FITC-Inulin darauf zurückzuführen, dass durch FITC-Inulin die Physiologie des Versuchstieres so gestört wird, dass keine vernünftige Messung möglich ist. Mit dem erfin­ dungsgemäßen FITC-Sinistrin tritt dieses Problem nicht auf.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung von Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin (FITC-Sinistrin), wobei
  • a) zunächst das Sinistrin in einem geeigneten Lösungsmittel mit Natriumhydrid zur Reaktion gebracht wird;
  • b) anschließend FITC zur Reaktionsmischung gegeben wird, und
  • c) das FITC-Sinistrin als Feststoff isoliert wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Lösungsmittel in Schritt i) trockenes Dimethylformamid ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei Schritt iii) das Versetzen der Reaktionsmischung mit wäßriger Ammoniumchloridlösung, die anschließende Extraktion mit Diethylether und das Entfernen des Lösungsmittels umfaßt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei iv) der Feststoff aus Schritt iii) durch Umkristallisieren und/oder Gelfiltration gereinigt wird.
5. Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin (FITC-Sinistrin), erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
6. Verwendung von Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin (FITC-Sinistrin) gemäß Anspruch 5 als Bestandteil einer diagnostischen Zubereitung für die Nierendiagnostik.
7. Diagnostische Zubereitung, enthaltend Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin (FITC- Sinistrin).
8. Nicht-invasives Verfahren zur Messung der Nierenfunktion, umfassend das Einstrahlen von Licht auf die Haut eines zu untersuchenden Individuums und das Erfassen des Fluoreszenzlichts aus der Haut, welches durch Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin (FITC- Sinistrin) gemäß Anspruch 5 oder die diagnostische Zubereitung gemäß Anspruch 7 er­ zeugt wird.
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