DE10012670A1

DE10012670A1 - Mikrodissektion von Fluoreszenz in situ hybridisierten chromosomalen Material (FISH-MD)

Info

Publication number: DE10012670A1
Application number: DE10012670A
Authority: DE
Inventors: Joerg Weimer
Original assignee: PD DR MARION KIECHLE UNIV FRAU; PD DR NORBERT ARNOLD UNIV FRAU
Current assignee: UNIVERSITAETSKLINIKUM SCHLESWIG-HOLSTEIN, 24105 KIE
Priority date: 2000-03-15
Filing date: 2000-03-15
Publication date: 2000-11-16
Anticipated expiration: 2020-03-16
Also published as: DE10012670B4

Abstract

Die Identifizierung der aus Metaphasen zu isolierenden Chromosomen erfolgt bei herkömmlichen Methoden durch chromosomenspezifische Bandenmusterfärbung. Das neue Verfahren soll eine hiervon unabhängige Identifizierung der Chromosomen bei Mikrodissektionsexperimenten ermöglichen. DOLLAR A Bei dem neuen Mikrodissektionsverfahren erfolgt die Chromosomenidentifizierung durch fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden, die zuvor auf die Chromosomen hybridisiert wurden. Die Hybridisierung dieser DNA-Sonden weicht in folgenden Punkten von gängigen, bekannten Verfahren ab: Nach erfolgter Hybridisierung auf einen geeigneten Objektträger wird das Objekt nicht mit einem Deckglas und entsprechenden Schutzlösungen überdeckt. Während des gesamten Verfahrens dürfen die Chromosomen keiner DNA-schädigenden Strahlung ausgesetzt werden. DOLLAR A Dieses vom klassischen Bandenmustern unabhängige Verfahren eignet sich zur Identifizierung bislang ununterscheidbarer Chromosomen. Die Isolierung einzelner mit herkömmlichen Methoden nicht differenzierbarer Chromosomen können als minderqualitative Fluoreszenz-DNA-Sonden für dieses neue Verfahren herangezogen werden, um derartige Chromosomen spezifisch zu erkennen und in entsprechend hoher Anzahl zu isolieren und somit qualitativ hochwertige chromosomenspezifische DNA-Sonden generieren zu können.

Description

Stand der Technik mit Fundstellen

Die Mikrodissektion ist ein bekanntes Verfahren zur Isolierung chromosomalen Materials aus Metaphasen (Zeitschrift: "Chromosoma" 1981, Band 82, Seite 205-216). Die Isolierung erfolgt mittels einer durch Mikromanipulator gesteuerten Glasnadel unter mikroskopisch, visueller Kontrolle. Die isolierte chromosomale DNA kann durch Klonierung oder enzymatischer Verfahren wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt werden (Zeitschrift: "Nature" 1989, Vol 338, Seite 348-350). Zur Differenzierung des zu mikrodissektierenden chromosomalen Materials werden häufig Anfärbungen der Metaphasechromosomen durch zytogenetische Bänderungstechniken durchgeführt (Zeitschrift "Human Genetics" 1990, Band 84, Seite 507-511).

Problem

Die Differenzierung des zu mikrodissektierenden chromo somalen Materials durch zytogenetische Bänderungstechniken erfordert allerdings zytogenetische Kenntnisse der charakteristischen Bandenabfolge verschiedener Chromosomen und ist abhängig von dem Kondensationsgrad der Chromosomen.

Lösung

Der im Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, die Differenzierung des zu mikro dissektierenden chromosomalen Materials unabhängig von zytogenetischen Bänderungstechniken und auch unabhängig vom Kondensationsgrad der Chromosomen zu gewährleisten.

Erreichte Vorteile

Dieses Problem wird durch das im Patentanspruch 1 aufgeführte Verfahren zur Isolierung chromosomalen Materials aus Metaphasen mittels chromosomaler Mikrodissektion, mit der Kennzeichnung, daß an die zu isolierenden chromosomalen Materialien detektierbare fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden hybridisiert sind, welche somit Sondenhomologien zu diesem chromosomalen DNA-Material aufzeigen, gelöst.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile liegen insbesondere darin, daß nunmehr zu mikrodissektierendes chromosomales Material durch hybridisierte, detektierbare Fluoreszens-DNA-Sonden differenziert werden kann. Dies läßt eine eindeutige, von klassischen Bänderungstechniken unabhängige Identifizierung der zu mikrodissektierenden chromosomalen Materialien zu und ist unabhängig vom Kondensationsgrad des chromosomalen Materials. Statt der bisher erforderlichen Kenntnis über die Bandenabfolgen der zu isolierenden chromosomalen Zielregion, reicht mit der im Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung die Erkennung von hybridisierten Fluoreszenz-DNA-Sonden für eine Differenzierung des zu mikrodissektierenden Materials aus. Somit lassen sich mittels der im Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung kommerziell verwertbare DNA- Sonden, unabhängig von Kenntnissen über artspezifische chromosomale Bandenmuster generieren.

Beschreibung eines Ausführungsbeispiels

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in den Abbildungen dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben.

Es zeigen

Fig. 1 schematische Darstellung einer Mikrodissektion an gebänderten Chromosomen, wie es dem heutigen Stand der Technik im mikroskopischen Sichtbild bei einer 1000fachen Vergrößerung entspricht. Oben: Identifizierung des zu isolierenden chromosomalen Materials anhand zytogenetischer Bänderungstechniken der Chromosomen. Unten: erfolgte Isolierung des zu isolierenden chromosomalen Materials,

Fig. 2 schematische Darstellung einer Mikrodissektion an ungebänderten Chromosomen, wie es der im Patentanspruch 1 dargestellten Erfindung im mikroskopischen Sichtbild bei einer 1000fachen Vergrößerung entspricht. Oben: Identifizierung des zu isolierenden chromosomalen Materials anhand hybridisierter Fluoreszenz-DNA-Sonden im Fluoreszenz- Auflicht. Zweites Schema von oben: Vorbereitung der Mikrodissektion im Phasenkontrast. Drittes Schema von oben: erfolgte Isolierung des zu isolierenden chromosomalen Materials im Phasenkontrast. Unten: Metaphase nach erfolgter Isolierung des zu isolierenden chromosomalen Materials im Fluoreszenz-Auflicht. Die Lücke im Fluoreszenzsignal bestätigt das isolierte chromosomale Material,

Fig. 3 schematische Funktionsanordnung des Mikroskop, welche für das im Patentanspruch 1 genannte Verfahren erfüllt sein muß. Es entsprechen als optische Fluoreszenzfilter: 1 Emissionsfilter, 2 Anregungsfilter und 3 Strahlenteiler. Als Lichtwege sind dargestellt: gestrichelter Pfeil) Fluoreszenzanregung-Auflicht, durchgehender Pfeil) angeregtes Fluoreszenzlicht und als gepunkteter Pfeil) Phasenkontrast/Durchlicht,

Fig. 4 mikroskopische Schwarz-Weiß-Fotografie (1000fache Vergrößerung) einer Isolierung chromosomalen Materials aus drei unterschiedlich, durch Fluoreszenz-DNA-Sonden identifizierten Chromosomen mittels Mikrodissektion. a) zeigt die bearbeitete Metaphase im mikroskopischen Phasenkontrast vor Mikrodissektion. b) zeigt die selbe Metaphase im Fluoreszenzlicht vor Mikrodissektion. Rekombinierte Chromosomen sind durch heterogene Fluoreszenzsignale (Pfeil) zu identifizieren. c) zeigt die selbe Metaphase wieder im Phasenkontrast nach Mikrodissektion chromosomalen Materials (Pfeil). d) zeigt dieselbe Metaphase nach Mikrodissektion chromosomalen Materials im Fluoreszenzlicht. Die Signallücke (Pfeil) zeigt die Dissektion des isolierten chromosomalen Materials,

Fig. 5 zeigt die Schwarz-Weiß-Fotografie (1000fache Vergrößerung) einer Rückhybridisierung der vervielfältigten und mit Fluoreszenzfarbstoffen markierten, mikrodissektierten chromosomalen DNA auf Metaphasen gleicher Spezies. Die Fluoreszenzsignale (Pfeile) zeigen eine erfolgreiche Isolierung und Probengenerierung mittels der im Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung.

Es folgt die Erläuterung anhand der Abbildungen des Verfahrens und auch der Wirkungsweise der dargestellten Erfindung.

Das Mikroskop, an dem die Mikrodissektion von fluoreszenzmarkierten, chromosomalen Material durch geführt wird muß neben einem Phasenkontrast- Durchlichtstrahlengang mit einer Beleuchtungseinrichtung für Auflicht-Fluoreszenz sowie den verwendeten Fluorochromfarbstoffen entsprechenden optischen Fluoreszenzfiltern zur Detektion ausgerüstet sein (Fig. 3). Die Hybridisierung von Fluoreszenz-DNA- Sonden auf Metaphasechromosomen erfolgt nach bekannten Standartprotokollen wie z. B. beschrieben in (Katalog "Current protocols in human genetik" seit 1994 ständig aktualisiert, Nachtrag 22, Kapitel 4.3.) oder (Zeitschrift "Cytogenetics and Cell Genetics" 1999, Band 84, Seite 156-160). Jedoch wird abschließend das Präparat mit den zu mikrodissektierenden Metaphasen nicht mit fluorochromschützenden Agenzien "Anti-Fade- Lösungen" überschichtet und nicht mit Deckgläschen eingedeckt. Vor der Mikrodissektion wird das Präparat etwa vier Minuten in einem Phosphatpuffer inkubiert und anschließend kurz in destilliertem Wasser gespült und mit einem Gummiball trocken geblasen. Die zu bearbeitende Metaphase wird zunächst im Phasenkontrast-Durchlicht fokussiert (Fig. 2 und Fig. 4a). Die Identifizierung des zu mikrodissektierenden chromosomalen Bereichs erfolgt dann im Fluoreszenz-Auflicht unter Berücksichtigung der dem Fluoreszenzfarbstoff entsprechenden optischen Fluoreszenzfiltern (Fig. 2 und Fig. 4b). Die übrigen Mikrodissektionsschritte werden im Phasenkontrast- Durchlicht durchgeführt und entsprechen der beschriebenen Art und Weise (Zeitschrift "Chromosome Research" 1999, Band 7, Seite 355-362). (Fig. 4c) zeigt die Metaphase im Phasenkontrast nach der Isolierung rekombinierten, chromosomalen Materials. Eine der Mikrodissektion nachfolgende Betrachtung im Fluoreszenz-Auflicht kontrolliert die Effektivität der Isolierung chromosomalen Materials aus der Metaphase (Fig. 2 und Fig. 4d). Es ist zu vermeiden, daß die zu isolierende chromosomale DNA schädigender Strahlung, wie Licht mit Wellenlängen kürzer als 400 nm (= UV- Licht) ausgesetzt wird, da derart energiereiches Licht bekannterweise photochemisch die DNA verändert. Um einen Verlust der Emissionsfähigkeit der Fluorochrome durch zu starke Lichtexposition (Photobleaching) zu vermeiden, sollte das Präparat möglichst wenig sowohl dem Durchlicht als auch dem Fluoreszenzlicht ausgesetzt werden. Enzymatische Amplifikationen der isolierten DNA nach Expositionen von Anregungslicht mit Wellenlängen über 450 nm sind erfolgreich. Fig. 5 bestätigt die erfolgreiche Generierung einer chromosomalen DNA-Sonde, ausgehend von fluoreszenzmarkierten chromosomalen Material, welches mittels Mikrodissektion aus Metaphasen isoliert wurde.

Anhand dieses im Patentanspruch 1 gekennzeichneten Verfahrens, können künftig chromosomale DNA-Sonden hergestellt werden, ohne deren als Matrize fungierenden chromosomalen Ursprung anhand zytogenetischer Bänderungstechniken identifizieren zu müssen.

Somit können künftig auch von jenen Chromosomen DNA- Sonden mittels Mikrodissektion und DNA- Amplifiziertung generiert werden, welche sich weder durch zytogenetische Bänderungstechniken noch durch Verfahren der Massenerkennung (z. B. Flow-sorting) differentieren lassen. Alle Arten von Fluoreszenz-DNA- Sonden, sofern ihre Detektion nicht die strukturelle Integrität der DNA beeinflußt, lassen sich zur Differenzierung der zu mikrodissektierenden chromosomalen Bereiche einer Metaphase heran ziehen.

Claims

erfahren zur Isolierung chromosomalen Materials aus Metaphasen mittels chromosomaler Mikrodissektion, dadurch gekennzeichnet, daß an die zu isolierenden chromosomalen Materialien detektierbare fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden hybridisiert sind, welche somit Sondenhomologien zu diesem chromosomalen DNA-Material aufzeigen.