DE10012670B4 - Mikrodissektion von Fluoreszenz in situ hybridisierten chromosomalen Material (FISH-MD) - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur Isolierung chromosomalen Materials aus Metaphase-Chromosomen, gekennzeichnet durch
Hybridisieren lassen mindestens einer DNA-Fluoreszenz-Sonde an Metaphase-Chromosomen,
Waschen der Metaphase-Chromosomen,
Detektieren der mindestens einen an Metaphase-Chromosomen hybridisierten DNA- Fluoreszenz-Sonde und
Isolieren eines mit der DNA-Fluoreszenz-Sonde hybridisierten DNA-Abschnitts.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung chromosomalen Materials aus Metaphase-Chromosomen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung chromosomalen Materials durch Mikrodissektion.
  • Die Mikrodissektion (MD) ist ein bekanntes Verfahren zur Isolierung chromosomalen Materials aus Metaphasen. Die Isolierung erfolgt regelmäßig unter visueller Kontrolle durch ein Mikroskop mit einer durch einen Mikromanipulator gesteuerten Glasnadel. Dabei werden zur Identifizierung des zu dissektierenden chromosomalen Materials häufig Anfärbungen der Metaphase-Chromosomen durch zytogenetische Bänderungstechniken durchgeführt. Nach erfolgter Mikrodissektion kann die isolierte chromosomale DNA mittels Klonierung oder enzymatischer Verfahren wie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt und beispielsweise zur Herstellung von DNA-Sonde verwendet werden.
  • Ein derartiges Verfahren wird beispielsweise von den Autoren Weimer et al. in Chromosome Research 7: 355–362 (1999) beschrieben: die Metaphase-Chromosomen werden zunächst mit einem GTG-Bänderungsverfahren angefärbt und das aufgrund der Bänderung identifizierte Material wird dissektiert und isoliert. In einem weiteren Schritt wird das isolierte Material mittels PCR amplifziert, mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und als DNA-Sonde verwendet.
  • Der Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Anfärbung der Chromosomen mit Bänderungstechniken aufwändig und in hohem Maß vom Kondensationsgrad der Chromosomen abhängig ist. Außerdem sind zur Differenzierung zwischen den angefärbten Chromosomen bzw. der Identifikation des zu dissektierenden Materials zytogenetische Kenntnisse der charakteristischen Bandenabfolge verschiedener Chromosomen erforderlich, wobei die Identifikation mitunter sehr zeitaufwändig sein kann.
    •
  • Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Isolierung chromosomalen Materials aus Metaphase-Chromosomen zu schaffen, das eine gezielte, vom Kondensationsgrad der Chromosomen unabhängige und einfache Isolierung chromosomalen Materials erlaubt. Außerdem soll das Verfahren so angelegt sein, dass auf zytogenetische Kenntnisse der Bandenabfolge einzelner Chromosomen verzichtet werden kann, wodurch auch die vom Verfahren beanspruchte Zeit verringert werden könnte.
  • Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Isolierung chromosomalen Materials aus Metaphase-Chromosomen mit den Schritten Hybridisieren lassen mindestens einer DNA-Fluoreszenz-Sonde an Metaphase-Chromosomen, Waschen der Metaphase-Chromosomen, Detektieren der mindestens einen an Metaphase-Chromosomen hybridisierten DNA-Fluoreszenz-Sonde und Isolieren eines mit der DNA-Fluoreszenz-Sonde hybridisierten DNA-Abschnitts. Der einzige Unteranspruch gibt eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung an.
  • Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass das zu dissektierende chromosomale Material allein durch das Fluoreszenzsignal der mindestens einen an Metaphase-Chromosomen gebundenen DNA-Fluoreszenzsonde eindeutig identifiziert und dissektiert werden kann. Damit kann auch Personal, das keine tieferen zytogenetischen Kenntnisse über die Bandenabfolge einzelner Chromosomen besitzt, das Verfahren selbständig anzuwenden. Darüber hinaus ist die Markierung des zu dissektierenden chromosomalen Materials unabhängig vom Kondensationsgrad der Chromosomen und nicht so aufwändig wie mit klassischen Färbemethoden.
    •
  • Im Folgenden wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels mit Bezug auf die Zeichnungen näher beschrieben; es zeigen:
  • 1 eine schematische Darstellung der einzelnen Verfahrensschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens;
  • 2 Fotografien der Verfahrensschritte zur Isolierung chromsomalen Materials aus drei unterschiedlich, durch Fluoreszenz-DNA-Sonden markierten Chromosomen;
  • 3 eine negativ dargestellte Schwarz-Weiß-Fotografie des Ergebnisses einer Rückybridisierung der amplifizierten, dissektierten DNA auf Metaphasen gleicher Spezies.
  • 1 zeigt eine schematische Darstellung der einzelnen Verfahrensschritte. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Mikroskop mit einem Phasenkontrast-Durchlichtstrahlengang und einer Beleuchtungseinrichtung für Auflicht-Fluoreszenz, sowie den verwendeten Fluorochromfarbstoffen entsprechenden Fluoreszenzfiltern verwendet. Zunächst erfolgt in einem ersten Schritt die Hybridisierung der DNA-Fluoreszenz-Sonde an den Metaphase-Chromosomen nach bekannten Standardprotokollen. Dabei wird das Präparat nicht wie üblich mit fluorochromschützenden Agenzien („Anti-Fade-Lösungen") überschichtet und auch nicht mit Deckgläschen eingedeckt. Vor der Dissektion wird das markierte Präparat in einem zweiten Schritt etwa vier Minuten in einem Phosphatpuffer inkubiert, anschließend kurz mit destilliertem Wasser gespült und mit einem Gummiball trocken geblasen. Die zu bearbeitende Metaphase wird daraufhin zunächst im Phasenkontrast-Durchlicht 1 fokussiert. Die sich anschließende Identifizierung des zu dissektierenden chromosomalen Bereichs erfolgt dann durch Detektion der mindestens einen an Metaphase-Chromosomen hybridisierten Fluoreszenz-Sonde im Fluoreszenz-Auflicht 2 unter Berücksichtigung der dem Fluoreszenzfarbstoff entsprechenden optischen Fluoreszenzfilter. Daraufhin werden schließlich die übrigen Mikrodissektionsschritte zur Isolierung eines mit der DNA-Fluoreszenz-Sonde hybridisierten DNA-Abschnitts im Phasenkontrast-Durchlicht 3 durchgeführt. Eine der Mikrodissektion nachfolgende Betrachtung im Fluoreezenz-Auflicht 4 dient zur Kontrolle der Effektivität der Isolierung des chromosomalen Materials aus der Metaphase.
  • Prinzipiell ist darauf zu achten, dass die zu isolierende chromosomale DNA keiner schädigenden Strahlung, beispielsweise Licht mit Wellenlängen unter 400 nm (= UV-Licht), ausgesetzt wird, da derart energiereiches Licht die DNA bekannterweise photochemisch verändert. Um einen Verlust der Emissionsfähigkeit der Fluorochrome durch zu starke Lichtexposition (Photobleaching) zu vermeiden, sollte das Präparat möglichst wenig sowohl dem Durchlicht als auch dem Fluoreszenzlicht ausgesetzt werden. Enzymatische Amplifikationen der isolierten DNA nach Exposition von Anregungslicht mit Wellenlängen über 450 nm sind erfolgreich.
  • 2 zeigt Schwarz-Weiß-Fotografien bei 1.000-facher Vergrößerung der Verfahrensschritte zur Isolierung chromosomalen Materials aus drei unterschiedlich, durch Fluoreszenz-DNA-Sonden identifizierten Chromosomen mittels Mikrodissektion. Bild a) zeigt die bearbeitete Metaphase im mikroskopischen Phasenkontrast vor Mikrodissektion. Bild b) zeigt dieselbe Metaphase im Fluoreszenzlicht vor Mikrodissektion. Rekombinierte Chromosomen sind durch heterogene Fluorsezenzsignale (Pfeil) zu identifizieren. Bild c) zeigt dieselbe Metaphase wieder im Phasenkontrast nach Mikrodissektion chromosomalen Materials (Pfeil). Bild d) zeigt dieselbe Metaphase nach Mikrodissektion chromosomalen Materials im Fluoreszenzlicht. Die Signallücke (Pfeil) zeigt die Dissektion des isolierten chromosomalen Materials.
  • 3 zeigt eine Schwarz-Weiß-Fotografie im Negativ bei 1.000-facher Vergrößerung einer Rückhybridisierung der vervielfältigten und mit Fluoreszenzfarbstoffen markierten, mikrodissektierten chromosomalen DNA auf Metaphasen gleicher Spezies. Die Fluoreszenzsignale (Pfeile) zeigen eine erfolgreiche Isolierung und Probengenerierung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Claims (2)

  1. Verfahren zur Isolierung chromosomalen Materials aus Metaphase-Chromosomen, gekennzeichnet durch Hybridisieren lassen mindestens einer DNA-Fluoreszenz-Sonde an Metaphase-Chromosomen, Waschen der Metaphase-Chromosomen, Detektieren der mindestens einen an Metaphase-Chromosomen hybridisierten DNA- Fluoreszenz-Sonde und Isolieren eines mit der DNA-Fluoreszenz-Sonde hybridisierten DNA-Abschnitts.
  2. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet durch Bestrahlen der mindestens einen an Metaphase-Chromosomen hybridisierten DNA-Fluoreszenz-Sonde mit Licht mit einer Wellenlänge größer oder gleich 400 nm.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO1996020288A1 (en) * 1994-12-23 1996-07-04 Ctrc Research Foundation Methods of human prostate cancer diagnosis

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO1996020288A1 (en) * 1994-12-23 1996-07-04 Ctrc Research Foundation Methods of human prostate cancer diagnosis

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
129: 63740u *
131:347166c *
AN 1998:150427, CAPLUS: Chromosome Res. 1998, 6 (1), S.25-33 *
AN 1999:373462, BIOSIS: Gytogenetics and Cell Genetics 1999, Vol.85, No. 1-2, S.40 ff. *
AN 2000:187854, CAPLUS: Cancer Genet. Cytogenet. 2000, 118 (1), S.28-34 *
AN 2000:341182, EMBASE: Gynaecology 2000, 14/4, 677-690 *
AN 2000:352781, CAPLUS: Cytogenet. Cell Genet. 2000, 88 (1-2), S.114-118 *
Chemical Abstracts: 133: 29237h *
Chromosome Res. 7, S. 355-362, 1999 *
Cytogenet. and Cell Genet. 85, S. 5-181, 1999, Ref. P 139 *

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