DE10006887A1

DE10006887A1 - Verbindungen, die die Aktivität oder die Konzentration des Regulatorproteins RS1 verändern

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Publication number: DE10006887A1
Application number: DE10006887A
Authority: DE
Inventors: Hermann Koepsell; Thomas Korn; Thomas Kuehlkamp; Christina Track; Maike Veyhl
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-02-16
Filing date: 2000-02-16
Publication date: 2001-09-06

Abstract

Beschrieben werden Verbindungen, die die Aktivität oder Konzentration des Regulatorproteins RS1, das die Konzentration von Transportproteinen der Plasmamembran von Zellen und damit indirekt die Aufnahme von Nähr- oder Wirkstoffen beeinflußt, erniedrigen oder erhöhen können. Zu solchen Verbindungen zählen Antisense-RNAs oder Ribozyme, die zu der RS1 codierenden mRNA komplementär sind und die RS1-Expression hemmen können, anti-RS1-Antikörper, die die Aktivität von RS1 hemmen, RS1-Antagonisten und DNAs, die für RS1 bzw. den transkriptionsaktivierenden Teil davon codieren, und somit beispielsweise nach Verabreichung als Bestandteil eines Expressionsvektors zu einer Erhöhung der Konzentration von RS1 führen. Diese Verbindungen können zur Hemmung aber auch zur Erhöhung der Aufnahme bestimmter Nährstoffe und/oder Wirkstoffe durch die Zelle verwendet werden, was die therapeutische Verwendung bei Erkrankungen wie beispielsweise Diabetes mellitus oder Krebs beinhaltet.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, die die Aktivität oder Konzentration des Regulatorproteins RS1, das die Konzentration von Transportproteinen der Plasmamembran von Zellen und damit indirekt die Aufnahme von Nähr- oder Wirkstoffen beeinflußt, verändern. Die Veränderung beinhaltet je nach zugrundeliegender Indikation die Erniedrigung oder die Erhöhung des Regulatorproteins RS1.

Die Aufnahme von Nährstoffen und Medikamenten in Zellen erfolgt hauptsächlich durch Transportproteine und wird häufig über die Expression dieser Transportproteine gesteuert. So wird z. B. die Glukoseaufnahme in Fettzellen reguliert, indem der Glukosetransporter GLUT4 Insulin-abhängig in die Plasmamembran eingebaut wird (James et al., Journal Cell Biology 126: 1123-1126 (1994)). Beim Diabetes kommt es zur Erhöhung des Blutzuckers bei Patienten, weil dieser Mechanismus durch Insulinmangel gestört ist. Die Aufnahme von D-Glukose aus dem Darm, die durch zwei in Serie geschaltete Glukosetransporter in der luminalen und basolateralen Membran ermöglicht wird, wird dem Nahrungsangebot im Darm angepaßt, indem die Expression dieser Transporter reguliert wird (Hediger und Rhoads, Physiological Reviews 74: 993-1026 (1994), Ferraris und Diamond, Annual Reviews Physiology 51: 125-141 (1989)). Die Aufnahme von Arzneimitteln in Zellen erfolgt sehr häufig durch polyspezifische Transporter, deren Expression ebenfalls einer Regulation unterliegt (Koepsell, Annual Reviews Physiology 60: 243-266 (1998)). Es würde einen großen medizinischen Fortschritt darstellen, wenn man die Aktivität von Transportern, beispielsweise von Glukosetransportern, oder von für die Aufnahme von Arzneimitteln verantwortlichen Transportern gezielt beeinflussen könnte. So könnte beispielsweise die Erniedrigung/Hemmung der Aktivität/Konzentration des Glucosetransporters im Darm die Glucoseaufnahme verhindern oder drastisch erniedrigen, was bei Diabetikern wünschenswert wäre, da es den Bedarf an Insulin verringern und eine Lockerung der Diätvorschriften erlauben würde. Eine Erhöhung des polyspezifischen Kationentransports in der Niere dagegen würde die Ausscheidung vieler Medikamente verbessern. Das Wachstum von Zellen wird unter anderem durch die Regulation der Aufnahme von Nährstoffen, wie z. B. D-Glucose, über Transportproteine geregelt. Die Hemmung der Expression von Glucosetransportern sollte somit eine Möglichkeit darstellen, das Wachstum schnell wachsender Zellen, wie z. B. Tumorzellen, zu verlangsamen.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, Mittel bereitzustellen, die die Expression von Transportproteinen und damit deren Konzentration in der Plasmamembran erhöhen oder erniedrigen.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.

Es stellte sich heraus, daß durch Beeinflussung des membran assoziierten Regulatorproteins RS1 die Transkription von Transportproteine codierenden Genen verändert werden kann. Die Beeinflussung dieser Proteine kann durch die Erniedrigung oder Erhöhung der Konzentration des Regulatorproteins oder durch eine Hemmung des Regulatorproteins erfolgen. Die vorliegende Erfindung betrifft daher Verbindungen, die die Aktivität oder Konzentration des Regulatorproteins RS1, das die Konzentration von Transportproteinen der Plasmamembran von Zellen und damit indirekt die Aufnahme von Nähr- oder Wirkstoffen beeinflußt, verändern. Die Veränderung beinhaltet je nach zugrundeliegender Indikation die Erniedrigung oder die Erhöhung des Regulatorproteins RS1. Zu den RS1 hemmenden Verbindungen zählen beispielsweise Antisense-RNAs oder Ribozyme, die zu der RS1 codierenden mRNA komplementär sind und die RS1-Expression hemmen können; anti-RS1-Antikörper, die die Aktivität von RS1 hemmen oder RS1-Antagonisten, die das biologisch aktive RS1 ersetzen, jedoch selbst nicht biologisch aktiv sind. Zu den RS1 erhöhenden Verbindungen zählen DNAs, die für RS1 bzw. den transkriptionsaktivierenden Teil davon codieren, und somit beispielsweise nach Verabreichung als Bestandteil eines Expressionsvektors zu einer Erhöhung der Konzentration von RS1 führen.

Da RS1 die Expression von Transportproteinen hemmt, die z. B. für die Glucoseaufnahme in Zellen verantwortlich sind, wird als Ergebnis das Wachstum von Zellen durch Überexpression von RS1 gehemmt. Die Hemmung des Zellwachstums beruht dabei darauf, daß es den Zellen nach Überexpression von RS1 an Transportproteinen mangelt und die Zellen nicht mehr genügend ernährt werden und absterben. Somit stellt die Überexpression von RS1 in Tumorzellen eine attraktive Möglichkeit dar, um deren Wachstum zu hemmen. Aber auch bei Diabetes mellitus ist man an einer Verringerung der Transporter für Glucose interessiert, da damit weniger Glucose vom Körper aufgenommen wird und der Insulinbedarf eingeschränkt wird. Erreicht werden kann dies durch eine Förderung der Bildung von RS1. Umgekehrt führt eine Hemmung oder Reduzierung von RS1 zu einer vermehrten Bereitstellung von Transportproteinen/Transportern. Dies ist beispielsweise für einen vermehrten Medikamententransport gewünscht.

Je nach zugrundeliegender Indikation wählt man deshalb Verbindungen bzw. diese enthaltende Arzneimittel aus, die zur (teilweisen oder vollständigen) Hemmung oder aber zur Erhöhung von RS1 führen. Dadurch wird die Aufnahme bestimmter Nährstoffe und/oder Wirkstoffe durch die Zelle beeinflußt. Dies ermöglicht die therapeutische Anwendung bei Erkrankungen wie beispielsweise Diabetes mellitus oder Krebs.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen zur Regulation der Konzentration von Transportproteinen der Plasmamembran von Zellen, wobei die Verbindungen dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die Aktivität oder Konzentration des Regulatorproteins RS1 erniedrigen oder erhöhen können.

Durch Einsatz dieser Verbindungen kann die Konzentration von Transportproteinen je nach Indikation in der Zellmembran erniedrigt bzw. erhöht werden, wodurch die Aufnahme bestimmter Nährstoffe/Wirkstoffe reguliert werden kann, was beispielsweise bei den in der Einleitung beschriebenen Krankheitszuständen wünschenswert ist. Zu den RS1 hemmenden Verbindungen gehören beispielsweise Ribozyme oder Antisense- RNAs, die die Expression von RS1 erniedrigen oder hemmen, Antikörper, die an RS1 binden und somit dessen Wirkung blockieren oder Antagonisten, die das native RS1 verdrängen und an die Zielsequenz binden, ohne jedoch eine Transkriptionsaktivierung zu bewirken. Außerdem gehören zu diesen Verbindungen Enzyme und Proteine, welche die Funktion von RS1 an der Plasmamembran und im Zellkern modulieren. Dies können andere Transkriptionsfaktoren oder phosphorylierende bzw. dephosphorylierende Enzyme sein. Zu den RS1 erhöhenden Verbindungen gehören Vektoren, die die cDNA von RS1 oder von Funktionsdomänen von RS1 enthalten und mit denen RS1 überexprimiert werden kann. Die genauen Verbindungen können vom Fachmann durch Standardverfahren identifiziert und hergestellt werden. So können Ribozyme und antisense-RNAs nach Kenntnis der funktionell relevanten Domänen von RS1 unter Anwendung molekulargenetischer Standardmethoden erzeugt werden. Hier wird auf die dem Fachmann bekannte Literatur verwiesen, z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook (Bd. 1-3), Cold Spring Habor Lab, New York. Die funktionelle Wirkung dieser Substanzen kann mittels Transportanalysen in Zellkulturen nachgewiesen werden. In Kenntnis der Funktionsdomänen von RS1 können polyklonale oder monoklonale Antikörper hergestellt werden. Die Wirkung dieser Antikörper kann ebenfalls in der Zellkultur getestet werden. Die Kenntnis der Funktionsdomänen von RS1 ermöglicht die Erzeugung und Überexpression funktionell inaktiver RS1- Mutanten unter Anwendung molekularbiologischer Standardmethoden. Enzyme und Transkriptionsfaktoren, welche die Funktion von RS1 modulieren, können unter Anwendung zellbiologischer Routinemethoden identifiziert werden. Dabei können kultivierte Zellen (s. z. B. nachfolgende Beispiele 3-8, 10) oder das "Two-Hybrid-System" eingesetzt werden (s. nachfolgendes Beispiel 9).

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft somit (1) eine Antisense-RNA, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie zu der RS1 codierenden DNA-Sequenz oder einem Fragment davon komplementär ist und an die von dieser DNA-Sequenz transkribierte mRNA oder einen Teil davon spezifisch binden kann, wodurch die Synthese von RS1 verringert oder gehemmt wird und (2) ein Ribozym, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es zu der RS1 codierenden DNA-Sequenz bzw. einem Fragment davon komplementär ist und an die von dieser DNA-Sequenz transkribierte mRNA oder einen Teil davon spezifisch binden und diese spalten kann, wodurch die Synthese von RS1 ebenfalls verringert oder gehemmt wird. Vorzugsweise sind diese Antisense-RNAs und Ribozyme zu einer codierenden Region der mRNA komplementär. Besonders bevorzugt sind Antisense-RNAs bzw. Ribozyme, die an den Bereich der RS1-mRNA binden, der im wesentlichen für die transkriptionsaktivierende Domäne von RS1 codiert. Der Ausdruck "der Bereich der RS1- mRNA, der im wesentlichen für die transkriptionsaktivierende Domäne von RS1 codiert" betrifft eine Nucleinsäuresequenz, die die in Fig. 11 gezeigte Aminosäuresequenz (Aminosäuren 328- 445 des humanen RS1-Proteins) codiert oder eine sich von dieser Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Deletionen, Substitutionen und/oder Additionen unterscheidende Aminosäuresequenz, die jedoch noch transkriptionsaktivierend hinsichtlich des Zielgens ist.

Der Fachmann ist in der Lage, ausgehend von den veröffentlichten DNA-Sequenzen, geeignete Antisense-RNAs herzustellen und anzuwenden. Bekannt sind die Nukleinsäuren des Regulatorproteins RS1 aus Schwein (PCT/EP93/01343; Genbank X64315), Mensch (Genbank X82877), Kaninchen (Genbank X82876) und Maus (Genbank Y11917). Geeignete Vorgehensweisen zur Herstellung solcher Verbindungen sind beispielsweise in EB-B1 0 223 399 oder EP-A1-0 458 beschrieben. Ribozyme sind RNA- Enzyme und bestehen aus einem einzelnen RNA-Strang. Diese können andere RNAs intermolekular spalten, beispielsweise die von RS1-DNA-Sequenzen transkribierten mRNAs. Diese Ribozyme müssen prinzipiell über zwei Domänen verfügen: (1) über eine katalytische Domäne und (2) über eine Domäne, die zu der Ziel- RNA komplementär ist und an diese binden kann, was die Voraussetzung für eine Spaltung der Ziel-RNA ist. Ausgehend von in der Literatur beschriebenen Vorgehensweisen ist es inzwischen möglich, spezifische Ribozyme zu konstruieren, die eine gewünschte RNA an einer bestimmten, vorgewählten Stelle schneiden (siehe beispielsweise Tanner et al., in: Antisense Research and Applications, CRC Press, Inc. (1993), 415-426).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nucleinsäuren, die im wesentlichen für die transkriptionsaktivierende Domäne von RS1 codieren (hinsichtlich der Definition dieser Nucleinsäure siehe die vorstehende Definition der entsprechenden RS1-mRNA).

Die vorstehend beschriebenen Antisense-RNAs oder Ribozyme codierenden DNAs oder die für RS1 oder im wesentlichen für die transkriptionsaktivierende Domäne von RS1 codierende Nucleinsäure können auch in einen Vektor bzw. Expressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese DNA-Sequenzen enthaltenden Vektoren bzw. Expressionsvektoren. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (pUC18, pBR322, pBlueScript etc.), auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorstehend beschriebenen DNAs bzw. Nucleinsäuren im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die deren Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Geeignete Vektoren bzw. die einzelnen, vorstehend diskutierten Elemente der Vektoren sind dem Fachmann bekannt und dieser kann auch, entsprechend dem gewünschten spezifischen Zweck, besonders geeignete Vektoren oder Markergene etc. auswählen.

Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren verwendet werden (z. B. Wivel und Wilson, Hematology Ocol. Clin. North Am. 12, S. 483-501 (1998)). Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Ausubel und Frederick (1991), Current Protocols in Molecular Biology (J. Wiley & Sons, New York) beschrieben sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Expressionsvektor ein Virus, beispielsweise ein Vaccinia- Virus, Lentivirus oder Adenovirus. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Retroviren sind RNA-Viren, bei denen die viralen Gene von einem einzelsträngigen RNA-Molekül codiert werden. Nach Eintritt in die Wirtszelle wird die virale RNA über reverse Transkription in ein doppelsträngiges DNA-Molekül umgewandelt, im Anschluß daran gelangt diese DNA in den Nucleus und integriert sich in das Wirtsgenom als sogenanntes Provirus, das wiederum die Matritze für die Expression viraler Gene und die Synthese von Virion-RNA ist. Die viralen Genprodukte und die Virion-RNA lagern sich zu einem intakten Virion zusammen, das dann die Zelle wieder verlassen und neue Zellen infizieren kann. In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, daß es mittels Retroviren möglich ist, Fremd-DNA in einen gewünschten Organismus einzuschleusen und dort auch zur Expression zu bringen. Somit bieten sich Retroviren grundsätzlich als gutes Vehikel für eine Gentherapie an. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Vorzugsweise sind bei diesen Retroviren die einzelnen DNA-Sequenzen in den U3-Bereich des LTR des Retrovirus integriert. Die Retroviren mit Antisense-RNA von RS1 oder RS1-Ribozym können appliziert werden und damit zu einer bevorzugten Transfektion von Endothelzellen der Gefäße führen. Im Gehirn würde es dann zu einer vermehrten Expression von Nährstoff- und Arzneimitteltransportern kommen. Dadurch können Nährstoffe bzw. Arzneimittel ins Nervengewebe gelangen, die normalerweise die Blut-Hirnschranke nicht passieren können. Retroviren mit Nukleotiden, die funktionelles RS1- Protein kodieren, können in Tumoren appliziert werden, um die Expression von Glucosetransportern und damit das Tumorwachstum zu hemmen. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682). Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können auch mit Hilfe von verzweigten Polyethyleniminen, die stark positiv geladen sind, in die Zielzellen eingebracht werden (Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, S. 7297-7301 (1995), Ficher et al., Biotech. International 11, S. 8 (1999)). Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann außerdem zusätzlich ein Gen enthalten, das einen nachweisbaren phänotypischen Marker codiert, und somit die erfolgreiche Einschleusung in die Zielzelle nachgewiesen werden kann. Geeignete Markergene sind beispielsweise das Luciferase codierende Gen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Expressionsvektoren enthaltenden Zellen, die beispielsweise zur Vermehrung dieser Vektoren dienen können. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien (beispielsweise die E. coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG13009), Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae, Insektenzellen, vorzugsweise sf9-Zellen, und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293-, B16-, NIH 3T3-, L929-, DM13- und WI38-Zellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Bei den erfindungsgemäßen Zellen kann es sich darüber hinaus um Zellen handeln, bei denen das RS1 codierende Gen inaktiv ist oder fehlt ("knock out"-Zellen). Solche Zellen können vom Fachmann ebenfalls mittels gängiger Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch Austausch einer funktionellen Form des Gens gegen eine mutierte Form.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft anti-RS1-Antikörper oder Fragmente davon. Diese Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoclonalen Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Antikörpern um monoclonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei vorzugsweise RS1 oder ein synthetisches Peptidfragment davon als Immunogen dienen. Vorzugsweise wird zur Immunisierung ein Peptid als Immunogen verwendet, das der transkriptionsaktivierenden Domäne von RS1 entspricht. (Zur Definition dieses Bereichs siehe die vorstehende Definition der entsprechenden RS1-mRNA). Dadurch werden Antikörper enthalten, die an die transkriptionsaktivierende Domäne von RS1 binden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der genannte monoclonale Antikörper ein aus einem Tier (z. B. Maus) stammender Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon. Chimäre, menschlichen Antikörper ähnelnde oder humanisierte Antikörper besitzen eine herabgesetzte potentielle Antigenität, jedoch ist ihre Affinität gegenüber dem Ziel nicht herabgesetzt. Die Herstellung von chimären und humanisierten Antikörpern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde ausführlich beschrieben (siehe beispielsweise Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, und Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534). Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Akzeptor-Immunglobulin) und die Komplementarität der determinierenden Bereiche, die im wesentlichen von einem nicht-menschlichen Immunglobulin (z. B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Immunglobulin). Die (der) konstante(n) Bereich(e) stammt (stammen), falls vorhanden, auch im wesentlichen von einem menschlichen Immunglobulin. Bei der Verabreichung an menschliche Patienten bieten humanisierte (sowie die menschlichen) Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (a) das menschliche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörperantwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig fremden Maus-Antikörper oder einen partiell fremden chimären Antikörper; (b) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, interagiert er besser mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems, und (c) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, kleinere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridom, das den vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper erzeugt und auch die vorstehend beschriebenen Expressionsvektoren, die als Insertion eine exprimierbare DNA-Sequenz enthalten, die für die erfindungsgemäßen Antikörper oder die Fragmente davon codieren und deren Expression erlauben.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Antagonisten für RS1. Zu den als Antagonisten wirksamen Verbindungen zählen auch beispielsweise inaktive RS1-Moleküle. Inaktive RS1-Moleküle können hergestellt werden, indem Mutanten in der transkriptionsmodulierenden Domäne und anderen Funktionsdomänen von RS1 erzeugt werden. Eine andere Möglichkeit besteht in der Mutation von Phosphorylierungsstellen von RS1, welche für die Funktion notwendig sind. Außerdem können inaktive RS1-Mutanten erzeugt werden, indem die für die Assoziation von RS1 an der Plasmamembran verantwortliche Proteindomäne von RS1 verändert wird. Während die für den Transkriptionseffekt verantwortliche Proteindomäne von RS1 bereits identifiziert wurde (s. Beispiel 9) können die funktionell wichtigen Phosphorylierungsstellen von RS1 und die Assoziationsdomänen mit der Plasmamembran mit Hilfe von routinemäßig angewandten molekulargenetischen und zellbiologischen Methoden identifiziert werden. Wenn inaktive RS1-Moleküle bzw. -Peptide in ausreichend hoher Konzentration exprimiert bzw. verabreicht werden, führt dies zur Verdrängung der aktiven endogenen RS1-Moleküle und dadurch zur Inaktivierung der Funktion bzw. von Teilfunktionen von RS1.

Die vorliegende Erfindung erlaubt die Durchführung therapeutischer Maßnahmen bei Erkrankungen, bei denen durch die Beeinflussung der Aufnahme bestimmter Nährstoffe/Wirkstoffe durch die erfindungsgemäßen Verbindungen, z. B. Antisense-RNAs, Ribozyme, Antikörper, Antagonisten und Agonisten ein therapeutischer Zweck erreicht werden kann. Dazu zählen beispielsweise die Erniedrigung der Aufnahme von Glukose bei Diabetes mellitus und in Tumoren oder die Erhöhung der Aufnahme bestimmter, bei einer Therapie eingesetzten Arzneimittel, was die Gabe geringerer und/oder seltenerer Dosen bzw. die Reduktion von unerwünschten Nebenwirkungen ermöglicht. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimittel bzw. deren Verwendung zur Erniedrigung oder Hemmung der Aufnahme von Nährstoffen in Organgewebe oder Fettzellen sowie Arzneimittel zur Erniedrigung der Aufnahme und Ausscheidung von Nährstoffen und Arzneimitteln in Darm, Niere und Leber. Bei diesem Nährstoff kann es sich beispielsweise um D-Glukose handeln und bei der vorstehend beschriebenen Verwendung um die Behandlung von Diabetes mellitus. Bei diesen Verwendungen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt, bei denen die Konzentration der Plasma-Transportproteine erniedrigt, d. h. die Konzentration und/oder Aktivität des Regulatorproteins RS1 erhöht wird, also bevorzugt die RS1 codierende, vorzugsweise im wesentlichen den transkriptionsaktivierenden Bereich von RS1 codierende Nucleinsäuren. Andererseits betrifft die vorliegende Erfindung somit auch ein Arzneimittel bzw. dessen Verwendung zur Erhöhung der Aufnahme von Nährstoffen und/oder Wirkstoffen durch die Zelle. Bei diesen Verwendungen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt, bei denen die Konzentration der Plasma-Transportproteine erhöht, d. h. die Konzentration und/oder Aktivität des Regulatorproteins RS1 erniedrigt oder gehemmt wird, also bevorzugt die erfindungsgemäßen Ribozyme, Antisense-RNAs, Antikörper, Antagonisten oder Agonisten.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Art des Trägers hängt natürlich auch davon ab, um welche erfindungsgemäße Verbindung es sich handelt bzw. wie diese verabreicht werden soll. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Schweregrad der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc.

Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1 bis 12 sind in den nachstehenden Beispielen 1 bis 12 ausführlich beschrieben:

Fig. 1 Nachweis der Lokalisation von RS1 an der Bürstensaummembran

Fig. 2 Nachweis der Lokalisation von RS1 an der Membraninnenseite

Fig. 3 Nachweis, daß RS1 in den Zellkern wandern kann

Fig. 4 Expression von RS1 in RS1-antisense Zellinien

Fig. 5 Nachweis der Steigerung der Na⁺-D- Glukosekotransportaktivität in RS1-antisense Zellinien

Fig. 6 Expression von Protein des Na⁺-D- Glukosekotransporters SGLT1 in RS1-antisense Zellinien

Fig. 7 Northern Blot und Analyse von Plasmamembrantransporter in RS1-antisense Zellinien

Fig. 8 Vergleich der Stabilität der SGLT1 mRNA zwischen normalen LLC-PK1-Zellinien und RS1-antisense Zellinien

Fig. 9 Erniedrigung der Na⁺-D- Glucosekotransporteraktivität in stabil mit pRS1- cDNA transfizierten LLC-PK1-Zellinien

Fig. 10 Identifizierung einer Domäne von RS1 mit Transkriptionsaktivatoraktivität in der Hefe

Fig. 11 Ausschnitt aus RS1-Sequenz (besitzt Transkriptionsaktivatoraktivität)

Fig. 12 Expression unterschiedlicher Mengen an RS1-Protein in LLC-PK1-Zellen vor und nach Konfluenz ohne und mit Expression des Na⁺-D-Glucosekotransporters

Fig. 13 Menge von RS1 und SGLT1-Protein in Bürstensaummembranen von normalen und diabetischen Ratten

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Immunologischer Nachweis von RS1 an der Bürstensaummembran von Epithelzellen proximaler Nierentubuli

Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Aus der Nierenrinde vom Schwein wurden durch Differential zentrifugation zytosolische Proteine und luminale Membranen proximaler Nierentubuli gewonnen (Koepsell und Seibicke, Methods Enzymol. 191: 583-649 (1990)). 20 µg Protein der zytosolischen Fraktion (a) und der Bürstensaummembranen (b, c) wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese aufgetrennt, elektrisch auf Nitrozellulose übertragen und RS1-Protein wurde mit einem spezifischen Antikörper gegen RS1 nachgewiesen. Bei dem Antikörper gegen RS1 handelt es sich um einen polyclonalen Antikörper, der gegen in E. coli exprimiertes RS1 Protein erzeugt und affinitätsgereinigt worden war. Zum Spezifitätsnachweis wurde der Antikörper in (c) vor der Inkubation mit der Membran mit in E. coli exprimiertem RS1-Protein blockiert. Es zeigte sich, daß RS1 an der Bürstensaummembran lokalisiert ist.

Beispiel 2 Lokalisation von RS1 ist an der Innenseite der Plasmamembran

Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. RS1 wurde in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis exprimiert, indem RS1-mRNA vom Schwein (Veyhl et al., Journal of Biological Chemistry 268, S. 25041-25053 (1993)) oder zur Kontrolle Wasser injiziert wurde. Nach dreitägiger Inkubation wurden die Oozyten in einer Lösung inkubiert, die kovalent bindendes Biotin in wasserlöslicher Form (w-Biotin) oder fettlöslicher Form (l-Biotin) enthielt. Danach wurden die Plasmamembranen (P1) und die zytosolischen Proteine (S2) durch Differentialzentrifugation getrennt. Die Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese getrennt, und es wurde mit Hilfe von Westernblots und dem Antikörper gegen RS1 gezeigt, daß die P1- und S2-Fraktionen der mit lipidlöslichem Biotin (l-Biotin) und mit wasserlöslichem Biotin (w-Biotin) inkubierten Oozyten etwa gleiche Mengen an RS1-Protein enthielten. Mittels einer Streptavidin-Affinitätssäule wurden die biotinmarkierten Proteine aus den verschiedenen Fraktionen isoliert. Die biotinylierten Proteine wurden dann im Western- Blot mit einem Streptavidin-Peroxidase-Konjugat nachgewiesen (oberer Teil der Abbildung). Im unteren Teil der Abbildung wurde im Westernblot untersucht, ob die über Streptavidin gereinigten biotinylierten Proteine RS1 enthalten. Fig. 2 zeigt, daß dies nur der Fall ist, wenn die Biotinylierung mit dem membrangängigen Biotin (l-Biotin) erfolgte. Fig. 2 zeigt ferner, daß RS1 nur mit dem membrangängigen Biotin markiert werden kann. Es muß demnach auf der Membraninnenseite liegen.

Beispiel 3 Wanderung von RS1 in den Zellkern

Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Das grüne fluoreszierende Protein GFP oder eine Chimäre aus GFP und RS1 wurde stabil in LLC-PK₁ Zellen exprimiert. Plasmamembranen, zytosolische Proteine sowie Zellkerne wurden durch Differentialzentrifugation getrennt. 5 µg Protein aus jeder Fraktion wurden in einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, und GFP wurde in Westernblots mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers (Fa. Clontech) gegen GFP nachgewiesen. Die Abbildung zeigt, daß GFP allein hauptsächlich im Zytosol vorkommt. Die Chimäre aus GFP und RS1 konnte in der Plasmamembranfraktion, im Zytosol und im Zellkern nachgewiesen werden. RS1 dirigiert GFP also an die Plasmamembran und in den Zellkern.

Beispiel 4 Expression von deutlich weniger intaktem RS1- Protein in einer stabil mit antisense-RS1-cDNA transfizierten LLC-PK₁ Zellinie als in normalen LLC-PK₁ Zellen

Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Ein 5'-cDNA- Fragment von pRS1, das das Transkriptionsstartkodon ATG und einen unmittelbar angrenzenden Bereich der translatierten pRS1-Sequenz enthielt (Nukleotide 1-1481) (Veyhl et al., J. of Biol. Chem. 268, S. 25041-25053 (1993), wurde in verkehrter Orientierung ("antisense") downstream des Zytomegalovirus- Promotors in den eukaryotischen Expressionsvektor pRc/CMV (Fa. Invitrogen, Leek, Niederlande) eincloniert (RS1-antisense- Konstrukt). LLC-PK₁-Zellen wurden mittels der Lipofektin- Methode (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413- 7417 (1987)) entweder mit diesem RS1-antisense-Konstrukt (Linie 6 und Linie 8) oder mit dem leeren pRc/CMV-Vektor (Linie 3) stabil transfiziert. Die Selektion transfizierter Clone erfolgte über die zusammen mit dem Vektor übertragene Geneticin-Resistenz. Der obere Teil von Fig. 4 zeigt den Nachweis, daß die in die Zellen transfizierte RS1-antisense- cDNA in antisense-mRNA transkribiert wird. Durch ein RT-PCR- Experiment mit spezifischen Primern konnte nur aus der cDNA der Zellinien, die das RS1-antisense-Konstrukt in ihr Genom integriert hatten (Linie 6 und Linie 8), nicht aber bei den "leer transfizierten" Zellen (Linie 3) und auch nicht bei den nativen LLC-PK₁-Zellen ein Fragment mit der erwarteten Größe amplifiziert werden. Der untere Teil der Abbildung verdeutlicht, daß intaktes RS1-Protein in den RS1-antisense Zellen in deutlich geringerer Menge exprimiert wird als in der Kontrollzellinie 3. Plasmamembranfraktionen wurden durch differentielle Zentrifugation gewonnen. Jeweils 15 µg Gesamtprotein wurden in einem SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt und im Westernblot mit dem in Beispiel 1 beschriebenen affinitätsgereinigten polyclonalen Antikörper gegen pRS1 analysiert. Die Menge des intakten RS1- Proteins in der Plasmamembranfraktion der RS1-antisense-Zellen (Linie 6 und Linie 8, Spuren k, l) ist im Vergleich zu den Kontrollzellen (Linie 3, Spur i) deutlich reduziert. Das beweist, daß die Antisense-Strategie in LLC-PK₁-Zellen funktioniert. Das Auftreten von Proteinspaltprodukten (Linien 6 und 8) ist im Rahmen von Antisense-Strategien früher beschrieben worden (Hélène und Toulmé, Biochim. Biophys. Acta, 1049: 99-125 (1990)). Als Positivkontrolle zeigt der Westernblot Bürstensaummembranvesikel der Schweineniere (Spur g), als Negativkontrolle eine Sarkolemmpräparation (Spur h).

Beispiel 5 Expression von mehr Na⁺-D- Glukosekotransportaktivität in stabil mit PRS1 antisense-cDNA transfizierten LLC-PK₁ Zellinien als in normalen LLC-PK₁ Zellen

Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Die Zellen wurden trypsinfrei vom Kulturschalenboden abgelöst und in eine vorgewärmte Inkubationslösung (Dulbecco's phosphate buffered sahne; Fa. Sigma, München) zur "Tracerflux"-Messung gegeben.

Initiale Raten der ¹⁴[C]-αMethyl-Glukopyranosid (AMG)-Aufnahme wurden in 2,5-minütiger Inkubation der Zellen in Suspension bei 40 µM ¹⁴[C]-AMG in An- oder Abwesenheit von 80 µM Phlorizin ermittelt. Dargestellt sind in Fig. 5 jeweils die phlorizinhemmbaren AMG-Transportraten, wobei die Zellen bis 5 Tage nach Konfluenz, d. h. bis zu dem Zeitpunkt, zu dem die Messung erfolgte, entweder in Hoch-Glukose-Kulturmedium (25 mM, schraffierte Säulen) oder in Niedrig-Glukose-Kulturmedium (5 mM, offene Säulen) angezogen worden waren. Im oberen Bildabschnitt sind Zellinien mit normalem zellulären Gehalt an endogen exprimiertem RS1-Protein gezeigt (native LLC-PK₁-Zellen und leertransfizierte Kontrollzellen), im unteren Bildabschnitt sind die AMG-Aufnahmeraten von Zellinien mit durch RS1-antisense-Expression reduziertem Gehalt an RS1- Protein dargestellt. Fig. 5 verdeutlicht, daß die Reduktion von RS1 gravierende funktionelle Auswirkungen auf die zelluläre Expression der Na⁺/Glukose-Cotransportkapazität hat. Die Antisense-Zellinie 8 transportierte 3 mal soviel AMG wie die Kontrollzellen, wenn die Zellen vorher in Niedrig-Glukose- Medium kultiviert worden waren, und sogar 14 mal soviel, wenn im Wachstumsmedium 25 mM Glukose enthalten waren. Die in Fig. 5 dargestellten Ergebnisse belegen somit, daß RS1 als Inhibitor der zellulären Expression der Na⁺Glukose- Cotransportaktivität von Epithelzellen wirkt.

Beispiel 6 Expression von mehr Protein des Na⁺-D- Glukosekotransporters SGLT1 in stabil mit antisense-cDNA transfizierten LLC-PK₁ Zellinien als in normalen LLC-PK₁ Zellen

Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt. Plasmamembranen von LLC-PK₁-Zellen wurden durch differentielle Zentrifugation isoliert, in Laemmli-Puffer solubilisiert, im SDS- Polyacrylamidgel aufgetrennt und elektrophoretisch auf eine Nitrozellulosemembran geblottet. Pro Spur waren jeweils 10 µg Membranprotein geladen worden. Die Inkubation des Westernblots erfolgte zum Nachweis des Na⁺/Glukose-Cotransporters mit einem Peptidantikörper gegen pSGLT1 (AS 525-542 (Poppe et al., J. Neurochem. 69: 84-94 (1997)). Wegen der bei LLC-PK₁-Zellen bekannten Regulation des SGLT1-Proteins in Abhängigkeit von der Glukosekonzentration des Wachstumsmediums waren für jede Zellinie Plasmamembranen aus Hoch (25 G)- und Niedrig (5 G)- Glukose-Kultur aufgetragen worden. Die Expression des SGLT1- Proteins ist in den RS1-antisense-Zellinien im Vergleich zu den nativen LLC-PK₁-Zellen stark erhöht (vergleiche Spuren c und e mit der Spur a von Fig. 6 oder die Spuren d und f mit der Spur b). Eine semiquantitative Auswertung ergab ein Steigerung um bis zu 2 Größenordnungen. Der Unterschied im plasmamembranären Gehalt an SGLT1-Protein zwischen Hoch- und Niedrig-Glukose-Kultur ist bei den RS1-Zellinien nicht so ausgeprägt wie bei nativen LLC-PK₁-Zellen. Die Tatsache, daß die Reduktion der RS1-Konzentration in den RS1-antisense- Zellinien zu einer geringeren Steigerung der Na⁺-D- Glucosekotransporteraktivität als der SGLT1-Proteinmenge in der Plasmamembranfraktion führt, zeigt an, daß ein bestimmter Anteil der zusätzlich produzierten SGLT1-Moleküle entweder nicht richtig in die Membran inseriert oder nicht funktionell aktiv ist.

Beispiel 7 Vorhandensein von mehr mRNA für Plasmamembrantransporter in stabil mit antisense-cDNA transfizierten LLC-PK₁ Zellinien als in normalen LLC-PK₁ Zellen

Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt. Poly(A)⁺-RNA wurde aus RS1-antisense-Zellinien (Linie 6 und 8) und aus Kontrollzellen (native LLC-PK₁-Zellen (nativ) und leertransfizierten LLC-PK₁- Zellen (Linie 3)) isoliert. Die Präparation erfolgte bei jeder Zellinie nach Niedrig (5 G)- und Hoch-Glukose (25 G)-Kultur. Jeweils 5 µg wurden in einem denaturierenden DMSO/Glyoxalgel elektrophoretisch getrennt und per Kapillartransfer auf eine Nylonmembran geblottet. Die Northernhybridisierung erfolgte mit ³²P-markierten cDNA-Sonden, die links neben den einzelnen Blots angegeben sind. Die Wasch-Schritte vor der Exposition auf Röntgenfilm wurden bis zu einer Stringenz von 0,25X SSPE durchgeführt, wenn es sich um Sonden vom Schwein handelte (pSGLT1, pV2R, pRS1), und bis zu einer Stringenz von 1X SSPE, wenn humane cDNA-Sonden verwendet wurden (hGPDH, hGLUT1, hUbiquitin, hOCT2, hRPS9). Die Proben stammten von Schweine- pRS1 (Nukleotide 577 bis 1680; Veyhl et al., J. Biol. Chem. 268, S. 25041-25053 (1993)), Schweine-Na⁺-D- Glucosecotransporter pSGLT1 (Nukleotide 1546-1818; Ohta et al., Mol. Cell. Biol. 10, S. 6491-6499 (1990)), menschl. Natrium-unabhängigem Glucosetransporter hGLUT1 (Nukleotide 1 bis 2856; Mueckler et al., Cell 44, S. 629-637 (1986)), menschl. polyspezifischem Kationentransporter hOCT2 (Nukleotide 1 bis 1703; Gorboulev et al., DNA and Cell Biology 16, S. 871-881 (1997)), Schweine-Vasopressinrezeptor pV2R (Nukleotide 1 bis 1494; Gorboulev et al., Eur. J. Biochem. 215, S. 1-7 (1993)), menschl. Glyceraldehydphosphat dehydrogenase hGPDH (1,1 kb Fragment von Fa. Clontech, Heidelberg, Deutschland), menschl. Ubiquitin (260 bp Fragment von Fa. Clontech, Heidelberg) und menschl. ribosomalem Protein 59 (431 bp Fragment von Fa. Clontech, Heidelberg). Der Northernblot zeigt, daß die mRNA von SGLT1, GLUT1 und OCT2 bei funktioneller Ausschaltung von RS1 in LLC-PK₁-Zellen hochreguliert wird, während sich die mRNA von GPDH, Ubiquitin und des ribosomalen Proteins 59 ebensowenig verändert wie diejenige des Lysin-Vasopressin-Rezeptors (V2R). Dies bedeutet, daß RS1 nur auf eine bestimmte Gruppe zellulärer Proteine, die zu den Plasmamembran-transportern gehören, modulierenden Einfluß hat. Dieses Experiment impliziert weiterhin, daß der Angriffspunkt von RS1 transkriptional ist. Die in LLC-PK₁-Zellen bekannte Suppression bestimmter RNAs nach Kultivierung der Zellen in Hoch-Glukose-Kulturmedium, wird von RS1 nicht signifikant beeinflußt.

Beispiel 8 Unveränderte Stabilität der SGLT1 mRNA in mit antisense-RS1-cDNA transfizierten LLC-PK₁ Zellinien

Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt. In bestimmten Zeitintervallen nach Transkriptionsblockade durch Zugabe von 25 µg/ml des RNA-Polymeraseinhibitors 5,6-Dichloro-1-β-D- Ribofuranosylbenzimidazol (DRB) (Fa. Sigma, Deisenhofen, Deutschland) zum Kulturmedium wurde Poly(A)⁺-RNA aus der RS1- antisense-Zellinie 8 (⚫, ∎) und aus nativen LLC-PK₁-Zellen (○, ) im DMSO/Glyoxal-Gel elektrophoretisch getrennt und auf eine Nylonmembran geblottet. Anschließend wurden Northernhybridisierungen der geblotteten Poly(A)⁺-Zeitreihe mit ³²P-markierten cDNA-Sonden von pSGLT1 und hGPDH, auf die normalisiert wurde, durchgeführt. Der Autoradiographie-Film wurde getrennt für die beiden bekannten SGLT1-Transkripte (4,4 kb: Kreise; 2,4 kb: Quadrate) densitometrisch ausgewertet. Das in Fig. 8 dargestellte Experiment zeigt, daß sich die Abbaugeschwindigkeit der SGLT1-mRNA in RS1-antisense-Zellen nicht von derjenigen in nativen LLC-PK₁-Zellen unterscheidet. Dies belegt, daß RS1 keinen Einfluß auf die mRNA-Stabilität der regulierten Transporter nimmt, sondern deren Transkriptionsrate moduliert.

Beispiel 9 Erniedrigung der Na⁺-D-Glucosetransportaktivität in stabil mit pRS1 cDNA transfizierten LLC-PK₁-Zellinien

Die Ergebnisse sind in Fig. 9 dargestellt. Die cDNA von RS1 vom Schwein (Veyhl et al., J. of Biol. Chem. 268, S. 25041- 25051 (1993); Nukleotide 1-1869) wurde downstream des Zytomegalievirus-Promotors in den eukaryotischen Expressionsvektor pRc/CMV (Fa. Invitrogen, Leek, Niederlande) einkloniert (RS1-sense-Konstrukt). LLC-pK₁-Zellen wurden mittels der Lipofektin-Methode (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, S. 7413-7417 (1987)) mit diesem RS1-sense- Konstrukt stabil transfiziert (Linien 11, 12, 13). Die Selektion transfizierter Klone erfolgte über die zusammen mit dem Vektor übertragenen Geneticin-Resistenz. Die Linien 11, 12, 13 sowie native LLC-PK₁ Zellen wurden mit 5 mM D-Glucose in Kulturmedium kultiviert. Dabei benötigen die Linien 11, 12 und 13 fast die doppelte Zeit bis zum Erreichen der Konfluenz als native Zellen. 5 Tage nach Konfluenz wurden die Zellen trypsinfrei vom Kulturschalenboden abgelöst und in eine vorgewärmte Inkubationslösung (Dulbecco's phosphate buffered saline, Fa. Sigma, München) zur "Tracerflux"-Messung gegeben. Initiale Raten der [¹⁴C]-αMethyl-Glucopyranosid (AMG)-Aufnahme wurden bei 2,5-minütiger Inkubation der suspendierten Zellen bei 40 µM [¹⁴C]-AMG in An- oder Abwesenheit von 100 µM Phlorizin ermittelt. In Fig. 9 sind die auf den Transport der nativen Zellinie normalisierten Phlorizin-hemmbaren AMG- Transportraten aus zwei getrennten Versuchen aufgetragen.

Beispiel 10 Identifizierung der Domäne von RS1 mit Transkriptionsaktivatoraktivität im Hefesystem

Die Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt. Nukleotidsequenzen, welche die angegebenen Aminosäuresequenzen des humanen RS1-Proteins kodieren (Lambotte et al., DNA and Cell Biology 15: 769-777 (1996)), wurden in den Hefevektor pAS2-1 (Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg) als Fusionsproteine mit der DNA-Bindedomäne des Transaktivators GAL4 cloniert (Allen et al., TIBS 20: 511-516 (1995)). Diese Vektoren wurden zusammen mit dem pGAD10 Vektor (Clontech) in dem Hefestamm Y190 transformiert, welcher die Aminosäuren Tryptophan, Histidin und Leucin zum Wachstum benötigt. Die Transfektion der Hefezellen wurde durch Kultivierung auf Tryptophan-negativen (pAS2-1 Vektor) sowie Leucin-negativen (pGAD10 Vektor) Agarplatten kontrolliert (siehe T im oberen Teil von Fig. 10). Der pGAD10 Vektor codiert die Expression von β-Galaktosidase sowie ein Histidinreportergen unter Kontrolle des ADH1 Promotors, welcher vom kompletten GAL4- Protein aktiviert wird. Die Aktivierung der Transkription durch die mit der Bindungsdomäne des GAL4-Proteins fusionierten RS1-Fragmente wurde durch Kultivierung der Platten in Abwesenheit von Histidin (siehe T^-H^- im mittleren Teil von Fig. 10) oder durch Messung der β- Galaktosidaseaktivität nachgewiesen (siehe T^-X-Gal im unteren Teil von Fig. 10). Das in Fig. 11 gezeigte Proteinfragment gibt die Proteinsequenz des RS1-Fragmentes mit transkriptionsaktivierender Funktion wieder und entspricht den Aminosäuren 328-445 des humanen RS1-Proteins (Lambotte et al., DNA and Cell Biology 15: 769-777 (1996)).

Beispiel 11 Expression von mehr RS1-Protein in subkonfluenten LLC-PK₁ Zellen ohne Transportaktivität des Na⁺-D- Glukosekotransporters als in Zellen mit Transportaktivität

Die Ergebnisse sind in Fig. 12 dargestellt. LLC-PK₁ Zellen wurden mit 5 mM D-Glukose oder 25 mM D-Glukose im Medium kultiviert und kurz vor Erreichen der Konfluenz (Fig. 12; a, b) bzw. fünf Tage nach der Konfluenz (c, d) geerntet. Danach wurden die Plasmamembranen durch Differentialzentrifugation isoliert, und RS1-Protein wurde im Western-Blot mit einem affinitätsgereinigten Antikörper nachgewiesen. In e) ist eine Kontrollreaktion des Antikörpers mit Bürstensaummembranproteinen aus der Schweineniere gezeigt.

Beispiel 12 Reziprokes Verhältnis der Menge von RS1 und SGLT1 in Bürstensaummembranen von normalen und diabetischen Ratten

Die Ergebnisse sind in Fig. 13 dargestellt. Bei Ratten wurde Diabetes durch Gabe von Steptozotocin induziert. Aus Därmen von normalen Kontrolltieren und diabetischen Ratten wurden Bürstensaummembranen isoliert. Die Bürstensaummenbranen wurden in SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt (2 µg Protein pro Gelspur) und mit Hilfe von spezifischen Antikörpern in Western-Blots bezüglich der Menge an SGLT1-Protein oder RS1- Protein untersucht. Die Abbildung zeigt, daß die Menge an SGLT1-Protein im Dünndarm von Ratten beim Diabetes deutlich zunimmt, während die Menge an RS1-Protein in den diabetischen Tieren abnimmt.

Die in den Beispielen erzielten Ergebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden. Das membranassoziierte Protein RS1, welches u. a. mit dem Na⁺/D-Glukosekotransporter an der Membran in Wechselwirkung tritt, sitzt an der Innenseite der Zellmembran (Fig. 1 und 2). Es konnte in der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, daß das Regulatorprotein RS1 in den Zellkern wandern kann (Fig. 3). Dazu wurde eine renale Zellinie (LLC-PK₁) benutzt, die den Na⁺-D-Glukosekotransporter SGLT1 und das Regulatorprotein RS1 exprimiert und physiologische Regulationsphänomene zeigt (Moran et al., Journal Biological Chemistry 258: 15087-15090 (1983); Hediger und Rhoads, Physiological Reviews 74: 993-1026 (1994)). Die Expression des Na⁺-D-Glukosekotransporters wird in LLC-PK₁- Zellen nach der Konfluenz hochreguliert und durch hohe Konzentrationen an D-Glukose im Medium reduziert. In der vorliegenden Erfindung wurde eine Antisense-DNA gegen die mRNA des Regulatorproteins RS1 hergestellt und es konnte nachgewiesen werden, daß LLC-PK₁ Zellen nach Transfektion mit dieser RS1-Antisense-DNA deutlich weniger intaktes Regulatorprotein produzieren (Fig. 4). Die RS1-Antisense- Zellen zeigten dabei mehr Na⁺-D-Glukosekotransportaktivität als unbehandelte LLC-PK₁ Zellen (Fig. 5) und exprimierten sehr viel mehr Protein des Na⁺-D-Glukosekotransporters SGLT1 (Fig. 6). Eine Analyse der mRNA Menge des SGLT1 in den Antisense-Zellen und in Kontrollzellen zeigte, daß nach Ausschaltung des Regulatorproteins RS1 eine sehr viel höhere Konzentration an SGLT1-mRNA in den Zellen vorlag als in den Kontrollzellen (Fig. 7). Die mRNA-Analyse weiterer Plasmamembrantransporter und einiger anderer Proteine ergab, daß nach Ausschaltung des RS1-Proteins nicht nur die Konzentration der mRNA von SGLT1, sondern auch die des natriumunabhängigen Glukosetransporters GLUT1 (Bell et al., Journal Biological Chemistry 268: 19161- 10164 (1993)) und des polyspezifischen Kationentransporters hOCT2 (Gorboulev et al., DNA and Cell Biology 16: 871-881 (1997), Patent: P 42 18 669.2) erhöht war. Es zeigte sich, daß die Stabilität der mRNA von SGLT1 nach Ausschaltung des RS1 Regulatorproteins nicht verändert war (Fig. 8). Außerdem konnte gezeigt werden, daß eine Überexpression von RS1 in LLC- PK₁ Zellen zu einer drastischen Reduktion der Na⁺-D- Glucosekotransporteraktivität in diesen Zellen führte (Fig. 9). Dagegen konnte nachgewiesen werden, daß die stabile von einem CMV-Promotor gesteuerte Überexpression von SLGT1 in einer Zellinie ohne endogene Aktivität von SLGT1 durch gleichzeitige Überexpression von RS1 nicht gehemmt wurde. Damit war der Beweis erbracht, daß das Regulatorprotein RS1 die Transkription für Plasmamembrantransporter in LLC-PK₁ Zellen erniedrigt. Da RS1 in Epithelzellen an der Innenseite der Plasmamembran zu finden ist und nachgewiesen wurde, daß RS1 mit den Transportproteinen SGLT1 und OCT2 an der Membran in Wechselwirkung treten kann (Reinhardt et al., Biochim. Biophys. Acta 1417: 131-143 (1999)), kann davon ausgegangen werden, daß RS1 an der Plasmamembran aktiviert wird, dann in den Zellkern wandert und dort die Expression von Plasmamembrantransportern moduliert. In der vorliegenden Erfindung konnte nachgewiesen werden, daß RS1 auch in der Hefe als Transkriptionsfaktor wirkt. Allerdings ist RS1 hier ein Transkriptionsaktivator. Die transkriptionsaktivierende Domäne von humanem RS1 in der Hefe konnte auf die Aminosäuren 328 bis 445 eingegrenzt werden (Fig. 10, Fig. 11). Die unterschiedlichen Wirkungen von RS1 in der Hefe und in den LLC-PK₁ Zellen deuten auf die Beteiligung weiterer zellspezifischer oder speziesspezifischer Faktoren. Schließlich konnte in der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden, daß das Regulatorprotein RS1 an wichtigen biologischen Regulationen von Transportproteinen, insbesondere von Zuckertransportern, beteiligt ist. In Epithelzellinien werden Transportproteine in Plasmamembranen hochreguliert, wenn die Zellen konfluent werden und wie in vivo eine Zellbarriere ausbilden. Bei der Nierenzellinie (LLC-PK₁) wird die Expression des Na⁺-D-Glukosekotransporters SGLT1 z. B. deutlich erhöht, nachdem die Zellen konfluent geworden sind. Erst dann kann man in diesen Zellen Na⁺-D-Glukosekotransport nachweisen (Moran et al., Journal Biological Chemistry 258: 15087-15090 (1983)). Es konnte gezeigt werden, daß sich die Konzentration des Regulatorproteins RS1 an der Plasmamembran gegenläufig zur Expression des Na⁺-D-Glukosekotransporters SGLT1 verhält. Nach Konfluenz von LLC-PK₁-Zellen nimmt die Transkription von SGLT1 deutlich zu (siehe oben). Fig. 12 zeigt, daß die Menge des RS1-Proteins an der Plasmamembran nach Konfluenz der LLC-PK₁ Zellen dagegen stark abgenommen hat. Ferner wird in der vorliegenden Erfindung nachgewiesen, daß RS1 an Regulationsvorgängen des Zuckertransportes im Rahmen von Diabetes mellitus beteiligt ist. Bei Labortieren kann man durch Streptozotocin, welches die β-Zellen in den Inseln des Pankreas zerstört, Diabetes mellitus auslösen (Burant et al., Journal of Clinical Investigation 93: 578-585 (1994)). Dabei kommt es zur Erhöhung der D-Glukosekonzentration im Blut und zu gegenregulatorischen Phänomenen an Zuckertransportern, deren Folgen teilweise für die beim Diabetes auftretenden Schäden verantwortlich sind (Takeuchi et al., American Journal Physiology 268: F13-F19 (1995)). Es konnte in der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, daß Ratten nach Induktion einer Diabetes durch Streptozocin in den Bürstensaummembranen ihrer Dünndarmschleimhaut deutlich mehr SGLT1-Protein aber viel weniger RS1-Protein aufwiesen als Kontrolltiere (Fig. 12). Dieses Ergebnis ist ein Hinweis für die Beteiligung von RS1 an der Regulation von Zuckertransportern beim Diabetes mellitus.

Claims

1. Verbindung zur Regulation der Konzentration von Transportproteinen der Plasmamembran von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Aktivität oder Konzentration des Regulatorproteins RS1 beeinflußt.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Aktivität oder Konzentration des Regulatorproteins RS1 hemmt.

3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Verbindung ein Ribozym ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es zu der RS1 codierenden DNA-Sequenz oder einem Teil davon komplementär ist und an die von dieser DNA-Sequenz transkribierte mRNA oder einen Teil davon spezifisch binden und diese(n) spalten kann, wodurch die Synthese von RS1 verringert oder gehemmt wird.

4. Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Verbindung eine Antisense-RNA ist, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie zu der RS1 codierenden DNA-Sequenz oder einem Teil davon komplementär ist und an die von dieser DNA-Sequenz transkribierte mRNA oder einen Teil davon spezifisch binden kann, wodurch die Synthese von RS1 verringert oder gehemmt wird.

5. Verbindung nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Bindung an den Bereich der RS1-mRNA erfolgt, der im wesentlichen für die transkriptionsaktivierende Domäne von RS1 codiert.

6. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Aktivität oder Konzentration des Regulatorproteins RS1 erhöht.

7. Verbindung nach Anspruch 6, wobei die Verbindung eine Nukleinsäure ist, die für RS1 codiert bzw. Fragmente davon.

8. Verbindung nach Anspruch 7, wobei die Verbindung eine Nucleinsäure ist, die im wesentlichen für die transkriptionsaktivierende Domäne von RS1 codiert.

9. Verbindung nach Anspruch 2, die ein anti-RS1-Antikörper oder ein Fragment davon ist.

10. Verbindung nach Anspruch 9, die ein im wesentlichen an die transkriptionsaktivierende Domäne von RS1 bindender anti-RS1-Antikörper oder ein Fragment davon ist.

11. Verbindung nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.

12. Verbindung nach Anspruch 11, wobei der monoclonale Antikörper ein aus einem Tier stammender Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon ist.

13. Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Verbindung ein RS1- Antagonist ist.

14. Expressionsvektor, die für die Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis 5 oder für den Antikörper nach einem der Ansprüche 9 bis 12 oder das Fragment davon codierende DNA-Sequenz oder die Nucleinsäure nach Anspruch 7 oder 8 enthaltend.

15. Zelle, die den Expressionsvektor nach Anspruch 14 enthält oder bei der das RS1 codierende Gen inaktiv ist oder fehlt.

16. Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder des Expressionsvektors nach Anspruch 14 zur Erniedrigung oder Hemmung der Aufnahme von Nährstoffen und/oder Wirkstoffen durch die Zelle.

17. Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 5 und 9 bis 13 oder des Expressionsvektors nach Anspruch 14 zur Erhöhung der Aufnahme von Nährstoffen und/oder Wirkstoffen durch die Zelle.

18. Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Wirkstoff D- Glukose ist.

19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei diese bei der Behandlung von Diabetes oder Tumoren erfolgt.

20. Verwendung nach Anspruch 17, wobei der Wirkstoff ein vom Körper aufzunehmendes Arzneimittel ist.