DD298658A5 - Verfahren zur praeparation von penicillinnaehrloesungen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Praeparation von partikelhaltigen, polymeren Stickstoffsubstraten, die als Sekundaerrohstoffe in der Lebensmittelindustrie anfallen, fuer mikrobiologische Hochleistungsprozesse, um mit vom Vermahlungsgrad der eingesetzten Schrote unabhaengigen, standardisierten Startbedingungen rasante, technisch relevante, primaere Wachstumsphasen zu erreichen. Erfindungsgemaesz wird die Aufgabe der Erfindung dadurch geloest, dasz eine proteolytische Mazeration von Schrotmaischen innerhalb oder auszerhalb eines mikrobiellen Hochleistungsprozesses durchgefuehrt wird, indem entsprechend zum notwendigen Aufschluszgrad der hochpolymeren und partikelhaltigen Stickstoffsubstrate Rohenzymgemische, saure, neutrale, alkalische oder/und temperaturstabile Proteasen den Schrotmaischen zugefuegt werden und so mit dieser Proteolyse nach Substratvervollstaendigung ein Medium vorliegt, das einen konstant leistungsstarken, robusten und gegenueber Steuerungsmasznahmen sensibilisierten mikrobiellen Wachstums- oder Produktbildungsprozesz ermoeglicht.{Praeparations-Verfahren; Penicillinnaehrloesungen; Stickstoffsubstrate, polymere; Mazeration, proteolytische; Schrotkorngroeszenverteilung; Hochleistungsprozesz, mikrobieller; Rohenzymgemische}
Description
Hierzu 1 Seite Zeichnung
Die Erfindung ist anwendbar bei der Standardisierung der Startbedingungen fermontativer Hochleistungsprozesse in der Biotechnologie. Sie findet insbesonde, e bei der fermentativen Herstellung von Benzylpenicillin ihre Anwendung. Da die Vermeidung von unproduktiven Verlustzeiten infolge verzögerter primärer Wachstumsphasen generell anzustreben ist, kann das Anwendungsgebiet der Erfindung auch auf großtechnische fermentative Prozesse mit anderen produktbildenden Mikroorganismen erweitert werden.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Aus ökonomischen Gründen werden für industrielle Fermentationsmedien komplexe organische Stickstoffquellen wie Extraktionsschrote aus Sojabohnen und Erdnüssen, Baumwollsamenmehl, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fischmehl und andere Sekundärrohstoffe verwendet. Für spezielle Hochleistungsprozesse mit genotypisch veränderten mikrobiellen Produzenten werden nachträglich veredelte, organische Stickstoffsubstrate wie z. B. Pharmamedia (Buckeye Cellulose Corporation, Memphis, Tennessee 38108, USA) eingesetzt, um die maximalen Verfahrensgrenzen einer mikrobiellen Fermentation langfristig zu garantieren. Die genannten komplexen Stickstoffsubstrate enthalten neben den Proteinen auch mineralische Komponenten, von denen das polymer gebundene Phosphor von besonderer Bedeutung ist (P. F. Stanbury, A.Whitaker, Principles of Fermentation Technology, Pergamon Press, 1986, Chapter 4: „Media for Industrial Fermentations"). Die Verwendung von nachträglich veredelten Sekundärrohstoffen aus der Lebensmittelindustrie mit garantierten Gütekriterien
wie ζ. B. Aminosäure-, Mineral- und Vitamingehalt (Pharmamedia) belasten natürlich die Kosten der großtechnischen Fermentation zusätzlich. Die Verfügbarkeit und die Kosten dieser Nährsubstrate sind aber limitierende Faktoren, die den Einsatz von gemahlenen Extraktionsschroten in der großtechnischen HochleistungsVermentation nach wie vor notwendig machen. Der ökonomische Gewinn auf dieser Basis hat aber seinen Preis durch die mangelnde Standardisierung infolge stark schwankender Korngrößenverteilungen und nicht konstanter Fraktionierungsgrade der löslichen Proteine solcher Extraktionsschrote von Sojabohnen und Erdnüssen. Die Korngrößenverteilung (Abb. 1), der Fraktionierungsgrad der Proteine und die Sterilisationsbddingungen bestimmen aber wesentlich die Mediumskonfiguration, die in ihrer Gesamtheit einmal für die konstante Geschwindigkeit des primären Wachstumsprozesses mit der Expression der Produktbildung und zum anderen für die Geschwindigkeit der erwarteten Sofortantworten aufgrund von Meßsignalen während der potentiellen Produktbnuungsphase verantwortlich ist.
Bekannterweise können komplexe Stickstoffsubstrate durch saure Hydrolyse bis zu den Aminosäuren aufgeschlossen werden. Die saure Hydrolyse hat aber die Nachteile, das sie besonders säurefaste Behälter notwendig mncht und mit hohen lonenkonzentraiionen die Fermentation, die chemische Aufarbeitung und das Abwasser belastet.
Die Erfindung beinhaltet das Ziel, die Korngrößenverteilung von Schroten und den Fraktionierungsgrad der löslichen Proteine so zu verbessern, daß auch unter Verwendung von Sekundärrohstoffen aus der Lebensmittelindustrie leistungsstarke, konstante und auf Außensignale sensibilisierte mikrobielle Produktbildungsprozesse möglich werden. Ziel der Entwicklung ist es gleichermaßen, durch rasant ablaufende primäre Wachstumsprozesse bis zur vorausbestimmten Substratlimitation jede nur mögliche produktive Stunde der sich anschließenden hochpotenten Produktbildungsphase mit maximalen spezifischen Produktbildungsraten im technischen Fermentationsprozeß zu nutzen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, heterogene, chargenabhängige E*traktionsschrote durch gezielte proteolytische Mazeration so zu verbessern und zu standardisieren, daß damit ein konstant leistungsstarker, robuster, aber gegenüber Steuerungsmaßnahmen sensibilisieder mikrobieller Produktbildungsprozeß möglich wird. Erfindungsgemäß wird ausgehend von einem Histogramm der Korngrößenverteilung und/oder des Fraktionierungsgrades der Stickstoffanteile von Schroten, die als Sekundärrohstoff in der Lebensmittelindustrie anfallen, die Korngrößenverteilung und der Fraktionierungsgrad der proteolytischen Aktivität eines mikrobiologischen Wachstums- und Produktbildungsprozesses; ngepaßt. Die Korngrößenverteilung von Extraktionsschroten wird eliminiert. Damit wird eine Standardisierung der ausgewählten Stickstoffsubstrate für einen mikrobiellen Hochleistungsprozeß möglich.
Die polymere Proteirifraktion eines ausgewählten Stickstoffsubstrates wird zugunsten der oligomeren Proteinfraktion oder der monomeren Aminosäuren entsprechend der Verfahrensanforderung beseitigt, indem zum Beginn des Mediumansatzes innerhalb oder außerhalb eines mikrobiologischen Wachstums- oder/und Produktbildungsprozesses Rohenzymgemische, alkalische, saure, neutrale oder temperaturstabile Proteasen verwendet werden.
Das Histogramm der Korngrößenverteilung (Abb. 1) eines relativ gut vermahlenen Sojamehlschrotes zeigt, daß 46,5% der Vermahlung eine Korngröße = 0,60mm, 17,2% eine Korngröße von 0,60 bis 1,20 mm und 36,2% eine Korngröße 1,20mm besitzt. Während einer Entkontaminierung durch Temperatureinwirkung von t = 12O0CfUr 1 Stunde wird der Fraktionierungsgrad und die Korngrößenverteilung nicht wesentlich geändort. Lediglich durch den Zusatz von Maisquellwasser oder anderen Substraten mit höherem Anteil der proteinlöslichen Fraktionen kann der Fraktionierungsgrad der Stickstoffsubstrate im Medium gezielt beeinflußt werden. Dieser Zusatz wird aber durch den hohen Phosphatphosphorgehalt (30 bis 45 mg 'g Trockensubstanz) des Maisquellwassers limitiert.
Es wurde überraschend gefunden, daß nach der proteolytischen Mazeration von Sojamehl- oder Erdnußschroten das Verhältnis von Phosphatphosphor zum polymer fixierten Phosphor, welches vorzugsweise 0,12 bis 0,29 beträgt, im genannten Stickstoffsubstrat unverändert bleibt. Von besonderer Bedeutung dabei ist das Verhältnis von löslichem Phosphor zum gebundenen Phosphor. Beide üben bei vielen Mikroorganismen eine negative Wirkung auf die Biosynthese von Sekundärmetaboliten aus (Übersicht: A.Torriani-Gorini, F.G.Rothman, S.Silver, A.Wright, E.Yagil, Phosphate Metabolism and Cellular Regulation in Microorganismus, American Society for Microbiology, Publication Sales, 1913, !.Street, N.W., Washington, DC 20006,1987).
Der frei und sofort verfügbare lösliche Phosphor wird während der primären Wachstumsphase im Medium metabolisiert, der Verbrauch des polymerfixierten Phosphoranteiles durch den produktbildenden Mikroorganismus kann durch ein bereits vorgeschlagenes Verfahren gezielt gesteuert werden. Die Korngrößenverteilung der verfügbaren pflanzlichen Schrote und Mehle, der Frakticnierungsgrad der löslichen Proteine, Oligopeptide und Aminosäure, die NH4-N und Zuckerkonzentration sowie die physiologische Kondition der benutzten Vorkulturen bestimmen die Geschwindigkeit der primären Wachstumsphase und eine technologisch handhabbare, auf eine Substratlimitationsgrenze auflaufende Konzentration der Biomasse. Die Ausnutzung der bis zum Zeitpunkt der Zucker- oder/und Phosphorlimitation exprimierten maximalen Biosynthesepotenz wird während einer Benzylpenicillinfermentatiop im wesentlichen durch eine dem physiologischen Status angepaßte Zuckerdosierrate, den retardierten Nachfluß von Aminosäuren und dem Verhältnis zwischen Aminosäure- und NH«-N-Aufnahme bestimmt. Da die maximale spezifische Produktbildungsrate eine Zeitfunktion ist (Optimum zwischen 20. und 100. Stunde), kommt es darauf an, die primäre Wachstumsphase und die Umschaltung in Richtung Sekundärmetabolitbildung während der Zuckerlimitation (sistierte spezifische Wachstumsrate) schnell und sicher ablaufen zu lassen. Die Zunahme der Geschwindigkeit des primären Wachstums- und Umschaltungsprozesses und die Standardisierung der Startbedingungen wurden durch eine proteolytische Mazeration des Sojamehls mit dem bekannten Histogramm der Korngrößenverteilung (Abb. 1) einem Maximum zugeführt. Mit dieser proteolytischen Mazeration der verfügbaren Schrote kann der Zusatz von
Substraten mit niedermolekularen Stickstoffanteilen zwecks Korrektur und Anpassung des gesamten Stickstofffraktionierungsgrades des Mediums an die Prozeßerfordernisse drastisch reduziert werden. Damit reduziert sich auch der zusätzliche Eintrag von löslichem Phosphatphosphor aus den niedermolekularen Stickstoffsubstraten (Maisquellwasser) in das Medium. Die Sojamehl- oder Erdnußmehlmaische wird in einem 3-m3-Fermentor separat vor der Komplettierung des Mediums oder in einem außerhalb des mikrowellen Prozesses stehender Ansatzrührbehälter mit einem Rohenzymgemisch oder mit einer sauren, neutralen, alkalischen und temperaturstabilen Protease aufgeschlossen. Im Prinzip ist für die präparative Standardisierung des Soja- oder Erdnußschrotes jedes Enzymrohgemisch (bevorzugte Konzentration 0,3 bis 2 g pro Liter Maische Einwirkungszelt 3 bis 15 Stunden) und jede Protease geeignet. Die Auswahl wird einmal durch die Verfügbarkeit, zum anderen durch das beabsichtigte Ergebnis des Aufschlußgrades bestimmt. Dabei werden die Bedingungen während der enzymatischem Mazeration durch die Bedingungen der maximalen Enzymaktivität (Temperatur, chT, Konzentration) diktiert. Die enzymatische Mazeration und die Proteolyse von Extraktlonsschroten werden vorzugsweise zwischen 2 und 15 Stunden bei einerTemperaturvon30°Cbi8 80°Cund einer Enzymaktivität in der Maische von 2 10~2pmol/mg · min bis 1(^mol/mg · min durchgeführt. Für die Benzylpenicillinfermentation wurde die proteolytische Mazeration soweit geführt, daß die Korngrößenverteilung entweder beseitigt oder die 0,60-mm-Partikelfraktion nahezu 100% beträgt. Gleichzeitig steigt der lösliche Proteinanteil und die oligomere Peptidfraktion im Medium an. Für die Beurteilung der Mediumspräparation wurden alle die in einer 80%igen Ethanollösung (1:6-Fraktion) löslichen Proteine und Aminosäuren zugrunde gelegt. Rohenzymgemische wie Brauereienzym, das Beta-Glucanase, neutrale Protease und Alpha-Amylase enthält, sind insofern besonders geeignet, da sie verfügbar, kostengünstig und neben der proteolytischen Mazeration die in den Schroten enthaltene Reststärke zu C-Substratmonomeren aufschließt. Vor der Enzymbehandlung wurde die Soja- oder Erdnußschrotmaische 1 Stunde bei 1000C nach dem Einstellen einer cH+ von pH = 8,0 vorgekocht, um durch Gefügelockerung der Partikel die Enzymwirkung zu erhöhen und damit Enzymsubetanz einzusparen. Chemisch-analytisch hat der Vorkochprozeß keine Konsequenz (Beispiel 2). Nach der proteolytischen Mazeration wird das Aufschlußmedium mit den anderen Substraten komplettiert und für 1 Stunde bei 12O0C mit Direkt- und Manteldampf sterilisiert. Dabei wird gleichzeitig das komplette Medium entaktiviert. Die Vorgehensweise soll an Beispielen näher erläutert werden.
Ausführungsbeispiele
76kg Sojamehl entsprechend dem Histogramm der Korngrößenverteilung werden in einem Kubikmeter Leitungswasser (= 40g Sojamehl/l Kulturlösung) in einem 3-m3-Fermentor eine Stunde bei 100°C nach dem Einstellen einer cH+ von pH = 8,0 vorgekocht. Für diese pH-Wertveränderung vom Start-pH = 6,5 werden 400 bis 500ml technische Natronlauge (30%) benötigt. Nach der Abkühlung (Mantelkühlung) auf 450C werden diesem Ansatz, der jetzt eine CH+ von pH = 7,5 besitzt, 1 kg ßrauei eienzym (1 g/l Maische, die 60 bis 80g Sojamehl enthält), das in 51 Leitungswasser mit einer Temperatur von 20 bis 3O0C gelöst wurde, zugefügt. Die Enzymbehandlung verläuft bei 45°C bis 5O0C und einer cH+ vor» oH = 7,5 unter Rührung (50min"1) ohne Belüftung für 4 Stunden, maximal 5 Stunden. Vor jeder Probenahme zwecks analytischer Prüfung oder Kontrolle wird 5 min bei 100 min"1 gerührt, danach die Probe gezogen und wieder die Ausgangsrührbedingung eingestellt. Nach der Enzymbehandlung erfolgt die Komplettierung des Mediums entsprechend der Rezeptur und die pH-Korrektur. Die Sterilisation des gesamten Mediumsansatzes erfolgt mit Direktdampf für 60min bei 12ü°C. Die Analytik des nach einer vierstündigen proteolytischen Mazeration partikelfreien Erstansatzes ist in der nachfolgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 1). Die Werte für den organischen Stickstoff repräsentieren gut die Aminosäureanalytik.
1:6-Fraktion: alle in einer 80%igen Ethanollösung löslichen Proteine und Aminosäuren. Vor Beginn der Analytik wurden alle Proben für dreimal eine Minute mit einem Ultraturrax behandelt.
Primäransatz: 76kg Sojamehl/1 m3 Leitungswasser, 1 kg Brauereienzym TGL 29166/01 Analytik: mg/ml
Original 1:6 | GN | NH4-N | Norg. | PO4-P | |
1. Sojamehl-Suspension (SM) 76g/l,pH = 8,0 ohne Enzym | Original 1:6 | 6,09 0,18 | 0,035 0,0 | 6,05 0,13 | 0,085 |
2. 1h 1000C SO0CO. h Enzymzufügung (Ezf.) pH = 7,5 | Original 1:8 | 5,38 1,34 | 0,065 0,015 | 5,32 1,32 | 0,090 |
3. 2 h nach Ezf. 5O0CpH = 7,5 | Original 1:6 | 5,38 1,53 | 0,065 0,020 | 5,32 1,50 | 0,090 |
4. 4 h nach Ezf. 5O0CpH = 7,5 | Original 1:6 | 5,38 1,56 | 0,065 0,020 | 5,32 1,54 | 0,090 |
5. 5 h nach Ezf. 5O0CpH = 7,5 | 5,98 1,56 | 0,060 0,015 | 5,82 1,54 | 0,090 | |
Ergebnis: Nach zweistündiger proteolytischer Mazeration liegen 24,8% des organischen Stickstoffs der zu diesem Zeitpunkt schon partikelfreien Präparation (Siebung £0,6mm) in der 80% Ethanolfraktion vor. Die weitere Behandlung bis zu 5 Stunden erhöht diesen Wert nur um 0,65%. Die PO«-P-Konzentration ist während der Behandlung bis zum Ende konstant.
Belsplnl 2
Dieser Primäransatz jrde in einem 80-l-Bruttovolumen-Sterilisator mit 2,8kg Sojamehl/491 Leitungswasser (57g SM/I Maische) mazeriert. Die Präparation wurde wieder mit einem Vorkochprozeß für 60min bei 1000C und einer cH+ von pH = 8,0 begonnen, nachdem der Start-pH-Wert von 6,2 mit 150ml 3 N NaOH auf pH = 8,0 eingestellt wurde. Die proteolytischa Mazeration wurde mit 0,5g Brauereienzym/I Maische durchgeführt. Die Bedingungen entsprechen denen im Beispiel 1. Die Analytik zu dieser Präparation ist wiederum in den nachfolgenden Tabellen dargestellt (Tabelle 2 und 3).
Ergebnis: Nach der 4-Stunden-Enzymbehandlung liegen 32,1 % des organischen Stickstoffs beziehungsweise 34,5% des Aminosäurestickstoffs (AS-N) der zu diesem Zeitpunkt partikelfreien Präparation in der 80% Ethanolfraktion vor. Die PO4-P-Konzentration ist bis zum Ende der proteolytischen Mazeration konsiant, damit ist auch die Relation polymer fixierter Phosphor
zu Phosphat-Phosphor konstant geblieben.
Primäransatz: 2,8kg/49l Leitungswasser, 0,5g Brauereienzym/I Maische Analytik: mg/ml
Probe | Original 1:6 | GN | NH4-N | Norg. | AS-N | Phosphor gesamt | PCV-P (SUClj) | Glukose m. Hydro lyse | Glukose mil In vert a βθ | Glukose ohne Hydrolyse | Fruktose (Resorcin) |
1. Start vor dem Vorkoch prozeß | 3,89 0,13 | 0,060 0.028 | 3.83 0,097 | 3,10 0,058 | 0.40 | 0,026 | 4,20 | 1,90 | 0,10 | 4,41 | |
1h100'C pH = 8,0 nachdem Vorkochprozeß
Original 4,03 0,060 3,97 3,27 0,38 1:6 0,106 0,021 0,085 0,040
0,024
1,90
0,11
4,69
4 h Enzymbehandlung pH = 7,5 t = 50-650C
Original 3,93 0.120 3,81 3,22 0,40 1:6 1,25 0.021 1,23 1,07
0,028
1,90
0,18
4,88
1:6-Fraktion: alle in 80%lger Ethanollöeung löslichen Proteine und AminoaSuren (AS)
Primäransatz: 2,8kg Sojamehl/49I Leitungswasser, 0,5g Brauerelenzym/I Maische
Analytik: μς/ηηΙ Aminosäurechromatogramm (Amino Acid Analyzer T339M, Microtechna Praha)
Probe | AS-N | Aminosäuren (AS) pg/ml | His | Arg | Asp | Thr | Ser | GIu | Pro | G/y | A/a | VaI | Met | lieu Leu | Tyr | Phe |
mg/ml | Lys | 592 | 2090 | 2590 | 702 | 1040 | 4120 | 1080 | 950 | 945 | 1110 | 255 | 1 100 1 880 | 770 | 1190 | |
1. vor Sterili | 3,10 | 1520 | ||||||||||||||
sation | ||||||||||||||||
Original | 13 | 33 | 59 | 16 | 17 | 116 | A | 20 | 25 | 18 | A | 14 25 | 28 | 34 | ||
1:6,m.H. | 0,06 | 21 | X | χ | 3 | χ | χ | 7 | χ | A | 2 | 3 | χ | χ χ | χ | χ |
1:6,o.H. | A | X | 661 | 1900 | 2760 | 887 | 1210 | 5020 | 1280 | 994 | 978 | 1170 | 244 | 1110 2020 | 798 | 1200 |
2. 1h100cC | 3,27 | 1530 | ||||||||||||||
pH = 8,0 | ||||||||||||||||
Original | 10 | 23 | 42 | 9 | 10 | 88 | A | 12 | 17 | 8 | A | 6 10 | 16 | 28 | ||
1:6,m.H. | 0,04 | 15 | X | χ | 3 | χ | χ | 7 | χ | A | 2 | 3 | χ | χ χ | χ | χ |
1:6, o. H. | A | X | ||||||||||||||
3. 4 h Enzymbe | 663 | 2100 | 2650 | 634 | 1080 | 4410 | 1 160 | 982 | 991 | 1140 | 244 | 1 150 2 000 | 809 | 1250 | ||
handlung | 3,22 | 1580 | ||||||||||||||
Original | 183 | 458 | 1010 | 395 | 456 | 1470 | 477 | 350 | 420 | 448 | 43 | 424 767 | 373 | 522 | ||
1.6,m.H. | 1,07 | 392 | XX | XX | XX | XX | XX | XX | XX | XX | XX | XX | XX | XX XX | XX | XX |
1:6, o. H. | A | XX |
A: Andeutungen rn. H.: mit Hydrolyse o. H.: ohne Hydrolyse1:6-Fraktion: alle in 80%lger Ethanollösung löslichen Proteine und AS χ alle AS-peaks sind peptiduberlagert, deshalb ist eire AS-Auswertung schwer möglich xx sehr viele Peptide, kaum freie AS.
Die Bedingungen dieser Präparation das komplexen partikelhaitigen Stickstoffsubstrates (Abb. 1) enforechen denen im Beispiel 2. Anstelle des Rohenzymgemisches wurde eine alkalische Protease von Bacillus licheniformis als Granulat verwendet (Aktivität: 254,5 TU0,, · s~' bei pH - 10,0 und t = 25°C. Herkunft: Forschungszentrum für Biotechnologie, Berlin).
Primäransatz: 2,8kg Sojamehl/491 Leitungswasser, 0,1 g alkalische Protease/I Maische Analytik: mg/ml
Probe | Original 1:6 | GN | NH4-N | Norg. | PO4-P |
Nach 1h bei 1000C vorkochen pH = 8,0 ohne Enzym | Original 1:6 | 4,35 0,16 | 0,027 0,003 | 4,32 0,16 | 0,024 0,003 |
1. 1h nach Enzym zugabe t=50°C pH = 9,0 | Original 1:6 | 4,57 1,18 | 0,025 0,005 | 4,54 1,18 | 0,026 0,005 |
2. 2 h 50°C, pH = 9,0 | Original 1:6 | 4,79 107 | 0,043 0,004 | 4,75 1,07 | 0,026 0,004 |
3. 3 h 500C pH = 9,0 | Original 1:6 | 4,57 1,25 | 0,025 0,006 | 4,54 1,24 | 0,026 0,006 |
4. 4 h 500C pH = 9,0 | 4,64 1,25 | 0,033 0,003 | 4,61 1,25 | 0,026 0,003 | |
Ergebnis: Nach einer dreistündigen enzymatlschen Mazeration mit 0,1 g alkalische Protease (56g Sojamehl/l) liegen 28,7% des organischen Stickstoffe eic Peptide und Proteine In der 80%lgen Ethanolfraktion (1:6) gelöst vor. Zu diesem Zeitpunkt Ist der Ansatz partikelfrei.
Die Bedingungen dieser Präparation des komplexen partikelhaitigen Stickstoffsubstrates entsprechen bis auf die folgenden Abänderungen denen im Beispiel 3. Anstelle von Sojamehl wurde Erdnußmehl verwendet, auf die thermische Gefügelockerung durch Vorkochen wurde verzichtet. Zum Einsatz kamen 0,1 und 0,08g alkalische Protease entsprechend Beispiel 3. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 5 und 6 dargestellt.
Primäransatz: 2,8kg Erdnußmehl/49I (57 g/l), 0,1 g alk. Proteass/I Maische Analytik: mg/ml
Probe | Original 1:6 | GN | NH4-N | Norg. | PO4-P |
1. Vor Enzymzu gabe pH =9,0 | Original 1:6 | 4,50 0,34 | 0,023 0,0 | 4,48 0,34 | 0,018 |
2. 1 h nach En- zymzugabo pH = 9,0 5O0C | Original 1:6 | 4,65 0,99 | 0,032 0,005 | 4,63 0,98 | 0,016 |
3. 2h pH = 9,0 50°C | Original 1:6 | 4,50 0,99 | 0,026 0,003 | 4,47 0,99 | 0,021 |
4. 3hpH = 9,0 5O0C | Original 1:6 | 4,94 0,96 | 0,023 0,0 | 5,13 0,96 | 0,019 |
5. 4hpH = 9,0 50°C | Original 1:6 | 4,94 0,82 | 0,026 0,006 | 4,91 0,82 | 0,021 |
6. 4 hund Hoch heizen auf 12O0CfUr 15min. | 4,79 0,87 | 0,022 0,017 | 4,77 0,85 | ||
Ergebnis: Nach einer dreistündigen enzymatischen Mazeration mit 0,1 g alkalische Protease (57g Erdnußmehl/I) liegen 21,4% des organischen Stickstoffs in der 80%igen Ethanolfraktion vor. Der Ansatz ist zu diesem Zeitpunkt partikelfrei.
Tabelle β
Primäransatz: 2,4kg Erdnußmehl/481 (50g/l), 0,08g alkalische Protease/I Maische Analytik: mg/ml
Probe | Original 1:6 | GN | NH4-N | Norg. | PO4-P |
1. Vor Enzym behandlung pH = 9,0 | Original 1:6 | 4,48 0,13 | 0,037 0,002 | 4,44 0,13 | 0,022 |
2. 1 h nach Enzym- behandlung pH = 9,0, EO0C | Original 1:6 | 4,40 0,84 | 0,031 0,0 | 4,37 0,84 | 0,025 |
3. 2hpH = 9,0 5O0C | Oiginal 1:6 | 3,06 0,83 | 0,017 0,0 | 3,94 0,83 | 0,022 |
3 h nach Enzym behandlung 15 min 12O0C | 3,50 0,89 | 0,049 0,0 | 3,45 0,83 | 0,023 | |
Ergebnis: Nach einer dreistündigen enzymatischen Mazeration mit 0,08g alkalische Protease (50g Erdnußmehl/I) liegen 18,7% des organischen Stickstoffe In der 80%igen Ethanolfraktion vor. Die PG<-O-Konzentration bleibt unverändert, der Ansatz ist zu diesem Zeitpunkt partikelfrei.
Claims (8)
1. Verfahren zur Präparation von Penicillinnährlösungen, dadurch gekennzeichnet, daß ausgehend von einem Histogramm der Korngrößenverteilung und des Fraktionierungsgrades der Stickstoffanteile von Schroten die Korngrößenverteilung und der Fraktionierungsgrad der proteolytischen Aktivität eines mikrobiologischen Wachstums- und Produktbildungsprozesses angepaßt wird, daß die Korngrößenverteilung von Extraktionsschroten eliminiert wird, daß die polymere Proteinfraktion eines ausgewählten Stickstoffsubstrates beseitigt wird, indem zu Beginn des Mediumansatzes innerhalb eines mikrobiologischen Wachstums- und Produktbildungsprozesses Rohenzymgemische, alkalische, saure, neutrale und temperaturstabile Proteason verwendet werden
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ausgehend von einem Histogramm der Korngrößenverteilung von Schroten die Korngrößenverteilung und der Fraktionierungsgrad der proteolytischen Aktivität eines mikrobiologischen Wachstums- und Produktbildungsprozesses angepaßt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekannzeichnet, daß ausgehend von einem Histogramm des Fraktionierungsgrades der Stickstoffanteile von Schroten der Fraktionisrungsgrad der proteolytischen Aktivität eines mikrobiologischen Wachstums- und Produktbildungsprozesses angepaßt wird.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die polymere Proteinfraktion eines ausgewählten Stickstoffsubstrates beseitigt wird, indem zu Beginn des Mediumansatzes außerhalb eines mikrobiologischen Wachstums- und Produktbildungsprozesses Rohenzymgemische alkalische, saure, neutrale und temperaturstabile Proteasen verwendet werden.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kontrolle und analytischen Definition der proteolytischen Mazeration und der Proteolyse von Schroten und polymeren Stickstoffsubstraten eine ethanolische Lösung verwendet wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatisch^ Mozeration und die Proteolyse von Extraktionsschroten zwischen 2 und 15 Stunden bei einer Temperatur von 3O0C bis 8O0C und einer Enzymaktivität in der Maische von 2 · 10~2Mmol/mg · min bis ΙΟμιτιοΙ/ mg · min (Tyr) durchgeführt wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzte Rohenzymkonzentration 0,3g bis 2g pro Liter Maische und die Einwirkungszeit 3 bis 15 Stunden beträgt.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Phosphatphosphor zu dem polymer fixierten Phosphor 0,12 bis 0,29 beträgt und in diesem Bereich unverändert bleibt.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DD32396288A DD298658A5 (de) | 1988-12-27 | 1988-12-27 | Verfahren zur praeparation von penicillinnaehrloesungen |
Applications Claiming Priority (1)
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DD298658A5 true DD298658A5 (de) | 1992-03-05 |
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Family Applications (1)
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DD32396288A DD298658A5 (de) | 1988-12-27 | 1988-12-27 | Verfahren zur praeparation von penicillinnaehrloesungen |
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