DD298267A5 - Verfahren zur immobilisierung von lipase, beta-galactosidase oder invertase - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Lipase, b-Galactosidase oder Invertase. Anwendungsgebiet ist die Biotechnologie. Erfindungsgemaesz werden Lipase, b-Galactosidase oder Invertase direkt oder ueber eine Ankersubstanz an ein schwerloesliches Traegermaterial gebunden, das mehrwertige Metallionen an der Oberflaeche enthaelt. Die Bindung erfolgt ueber heterobifunktionelle Verbindungen, in denen eine Gruppe direkt oder nach Aktivierung mit Lipase, b-Galactosidase oder Invertase oder gegebenenfalls einer Ankersubstanz und eine zweite Gruppe unter Chelatbildung mit den Metallionen des Traegermaterials reagiert. Durch eventuelle Nachbehandlung des Immobilisates mit anderen bifunktionellen Verbindungen wird die Oberflaeche weiterhin modifiziert.{Immobilisierung; Lipase, b-Galactosidase; Invertase; Traeger; Ankersubstanz; Metallionen; Chelatbildner; Reagenzien, bifunktionell; Nachbehandlung}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase an schwerlösliche Trägermaterialien. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Herstellung von Immobilisaten, die in der Biotechnologie (Stoffwandlung und Festphasendiagnostik) eingesetzt werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es ist bekannt, daß Biomakromoleküle an schwerlösliche Feststoffe durch Adsorption, Ionenaustausch oder kovalente Bindung immobilisiert werden. Die letztere Methode ist besonders gut zur Erzeugung stabiler Bindungen geeignet. Kovalente Bindung erfolgt nach einer chemischen Modifizierung (Aktivierung) des Feststoffes und/oder der zu immobilisierenden Verbindung. Als Feststoffe werden natürliche Stoffe (Mineralien, Chitin, Zellulose u.a.) und synthetische anorganische Stoffe (Glas, Silikate u. a.) oder organische Polymere eingesetzt. Für kontinuierliche technisch durchgeführte Prozesse werden anorganische Feststoffe als Trägermaterialien aufgrund ihrer guten mechanischen Eigenschaften bevorzugt. Sie erfordern jedoch als ersten Schritt der Immobilisierung in der Regel eine Funktionalisierung durch reaktionsfähige Überzüge.

Es sind Verfahren zum Aufbringen organischer Beschichtungen auf organische oder anorganische Feststoffe bekannt, die unter Verwendung von bifunktionellen Silanen zu einer Funktionalisierung führen. Dabei wird ein Silan der allgemeinen Formel (RiO)₃SiR₂ (mit Ri einem Alkyl-, Rj einem Vinyl-, γ-Aminopropyl-, Epoxi-, Alkyl-, SH- oder anderem Rest) in organischer oder waßrig-organischer Lösung eingesetzt und das Primäprodukt unter Bildung von C-O-Si, Metall-O-Si- und/oder Si-O-Si-Bindungen bei erhöhter Temperatur kondensiert. Beides, die Verwendung organischer Lösungsmittel und Kondensation bei erhöhter Temperatur sind relativ kostenaufwendig ebenso wie die Herstellung der Silane (U. Deschler, P. Kleinschmh* und P.Panster, Angew. Chem. 98 [1986] 237-253).

Die Immobilisierung von Biomakromolekülen an derart silanisierte Träger erfolgt durch direkte Kopplung (z. B. Reaktion von

Aminogruppen des Biomakromoleküls mit Epoxisilan), nach Modifizierung der Überzugsschicht (z. B. γ-Aminopropylsilan durch bifunktionelle Verbindungen wie Dialdehyde, Carbodiimide, Chinone u.a.) oder nach Modifizierung des Biomakromoleküls (z. B.

Perjodatoxidation von Qlycoproteinen zu aldehydhaltigen Proteinen, Einführung von polymerisierbaren Doppelbindungen

Nachteil dieses Verfahrens ist der mehrstufige Prozeß der Silanisierung und Kondensation.

Weiterhin sind seit einigen Jahren Verfahren zum Patent angemeldet worden, in denen die Silanisierung durch Anwendung heterobifunktioneller Verbindungen ersetzt wird (EP 218506, EP 273756). Diese heterobifunktionellen Verbindungen enthalten im Molekül mindestens eine reaktive Gruppe, die direkt oder nach Aktivierung mit Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase reagiert sowie eine oder mehrere phosphorhaltige Gruppen, die mit einem metallionenhaltigen Trägermaterial wenig dissoziierende Verbindungen ergeben (Chelate). Mit diesem Verfahren sind gute Immobilisierungsausbeuten erzielt worden. Die Auswaschstabilität der immobilisierten Lipase, ß-Gaiactosidase oder Invertase ist aber nicht ausreichend.

Darüber hinaus ist es gelungen (EP 273756), durch kurzkettige Phosphorsäurederivate einen nachträglichen Oberflächenschutz von oxidischen Oberflächen zu erzielen, der die Auflösung von Trägermaterialien bei niedrigen und hohen pH-Werten weitgehend unterdrückt.

Bei Chelatbildnern, die keinen Phosphor enthalten, ist bekannt, daß besonders stabile Komplexe entstehen, wenn die Bildung der Komplexe unter Ausbildung von 5- und 6-Ringstrukturen verläuft. Dieser Effekt wird in der Färberei genutzt, wo durch Nachbehandlung gefärbter Textilien mit Metallsalzen, vorwiegend Aluminiumsalzen, schwerlösliche und stabile „Farblacke" erzeugt werden. Zur Immobilisierung von Biokatalysatoren wurden derartige Verbindungen nicht eingesetzt.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Immobilisierung von Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase zu entwickeln, das zu wiederverwendbaren Biokatalysatoren mit hohen Fixierungsai/sbeuten und Auswaschstabilitäten führt.

Darlegung dos Wesens der Erfindung

Auigabe der Erfindung ist es, die Auswaschbeständigkeit der immobilisierten Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase durch geeignete Kombination chelatbildender Gruppen im Kopplungsreagenz bei gleichzeitig hohen Immobilisierungsausbeulen zu verbessern. Erfindungsgemäß werden Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase oder gegebenenfalls eine Ankersubstanz zur nachträglichen Bindung des Enzyms, über heterobifi nktionelle Verbindungen an schwerlösliche Trägermaterialien gebunden, die an inneren oder äußeren Oberflächen Ionen mehrwertiger Metalle enthalten. Als heterobifunktionelle Verbindungen werden Verbindungen benutzt, bei denen eine funktioneile Gruppe, gegebenenfalls unter Verwendung eines Aktivierungsreagenz, mit der zu immobilisierenden Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase oder gegebenenfalls der Ankersubstanz und eine zweite Gruppierung mit den Metallionen der Matrix reagiert.

Gegebenenfalls wird die Oberfläche des Trägers durch Nachbehandlung mit einer weiteren bifunktionellen Verbindung modifiziert. Als Trägermaterialien werden anorganische Materialien, organische Materialion oder Composite aus beiden verwandt, bei denen sich an der äußeren Oberfläche und/oder an der Oberfläche von Poren im Innern des Materials, gegebenenfalls als nachträglich aufgebrachte Überzugsschicht, Ionen mehrwertiger Metalle befinden.

Metallionenhaltige Überzugsschichten auf dem Trägermaterial werden durch dessen Umsetzung mit einer metallorganischen Verbindung (z.B. Tetraethoxyzirkonat), einem Metallsalz (z.B. Ammoniummolybdat), einem Metallkomplex (z.B. Eisen-(lll)-hexacyanoferrat-(ll)), einem Metailhalogenid (z. B. Titantetrachlorid), einem Oxy- oder Hydroxysalz (z. B. Zirkonoxychlorid) erzeugt.

Anorganische Trägermaterialien sind schwer lösliche natürliche oder synthetisch hergestellte Oxide, Salze, Mineralien, Gläser oder Keramiken, die gegebenenfalls aus einem ferromagnetischen Material bestehen oder ferromagnetische Bereiche enthalten.

Als organische Trägermaterialien werden Polymere eingesetzt, die mit den beschriebenen Metallverbindungen unter Bildung einer metallionenhaltigen Überzugsschicht reagieren.

Bei Trägermaterialien aus anorganisch-organischen Compositen werden erstens Composite benutzt, bei denen die Eigenschaften der anorganischen Träger, wie Abriebfestigkeit oder \ erformbarkeit durch das organische Material verbessert werden, wobei dieses organische Material einen metallionenhaltigen Überzug zur Immobilisierung von Lipase, ß-Galactosidase oder Invertasen besitzt oder ein nicht reaktives Material ist, das lediglich als Füllstoff dient oder ein Material ist, in (Jem oder an dem nach bekannten Verfahren Enzyme oder andere Biomaterialien (z. B. Zellen, Proteine, Polysaccharide u.a.) immobilisiert

Als Trägermateriaüen werden zweitens anorganisch-organische Composite benutzt, in denen ein organisches Material einen Metallionenüberzug erhält, der zur Immobilisierung von Lipase, ß-Gahctosidase oder Invertase benutzt wird. Durch Zusatz der anorganischen Komponente wird der Composit in seinen Eigenschaften, zum Beispiel der Druckfestigkeit, verbessert.

Metallionen an der Oberfläche der Trägermaterialien sind Ionen von Elementen der zweiten bis fünften Haupt- oder der Nebengruppen des Periodensystems, einschließlich der Lanthaniden.

Das heterobifunktioneile Reagenz enthält als funktioneile Gruppe, die mit Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase oder der Ankersubstanz direkt reagiert, eine Säureazld-, eine Säurehalogenid-, eine Säureanhydrid-, eine Isocyanat-, eine Isothiocyanate eine aktivierte Ester-, eine Disulfid-, eine Aldehyd- oder eine Diazogruppe.

Das heterobifunktioneile Reagenz enthält als funktioneile Gruppe, die nach Reaktion mit einem Aktivierungsreagenz mit Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase oder gegebenenfalls der Ankersubstanz reagiert, eine Amino-, Hydrazino-, Säureamid-, hydrazid-, -halogenid-, -anhydrid-, -thioamid-, -imid-, Ester-, Lactam-, Lacton-, Carboxyl-, Carbonyl-, Nitril-, Oxim-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Halogen-, Alken-, Alkin- oder eine CH-acide Gruppe.

Das heterobifunktioneile Reagenz enthält als zweite funktionell Gruppierung eine cheiatbiidende Gruppierung, die aus einer oder mehreren Gruppen mit der Fähigkeit zur Bildung von Hauptvalenzbindungen und mindestens einer Gruppe mit der Fähigkeit zur Bildung von Nebenvalenzbindungen besteht. Derartige cheiatbiidende Gruppierungen enthalten Moiekülbereiche mit Strukturen nach Formel 1—XXII der folgenden Abbildung:

Y XZ XX Z / III Il Il

R-C-X R-N-Y R-C-Y R-C-C-Y R-C-C₁-C₂=Z

Y Y

(I) (ID (IU) (IV) (V)

X XY ZZ XXY

R-C-C₁-C₂=Zi-) R-C-C₁-C₂- .R₂-C-C-C-R₂ R-C-C₁-C-C₂-Co=

(VI) (VII) (VIII) (IX)

X YX Y YY

R-N R-N R-N⁺-X U-C-Y R-C-Co-C-Co-

X Y XY

(X) (XI) (XII) (XIII) (XIV)

ZX XX XXX Y γ

HI Il I I I Il I

R-C-C₁-C-C₂- R-C-C₁-C₂- R-C-C-C- R-C-C₂-C₁-R₅-C₁-C₂-

(XV) (XVI) (XVII) (XVIII)

x Y ζζχ.γ

11---C₁=N- R-NH-N-C-R₅-C₁-C₂- R-C-C-NH-C- R-C-C-C-N

(XIX) (XX) (XXI) (XXII)

wobei R den Molekülteil darstellt, an dem sich über aliphatische, aromatische oder heterocyclische, gegebenenfalls substituierte oder Heteroatome enthaltende Gruppierungen gebunden, die zur kovalenten Enzymbindung notwendige funktionelle Gruppe befindet, und

X: -ORn-SRw-NR₁R₂, NO,-NR₁OH,-R₄OH,

Y: -COORI₁-R₄-COOR₁₁-O-R₄-COORW-NH-R₄-COOR₁₁-S-R₄-COORW-CONR₁R₂₁-CONHOH₁-PO₃H₂₁-R₄-PO₃H₂₁-NHOh, -SO₃^-OH₁-H,

Z: =0, =S, =NH, =NOH, =N-in einem heterocyclischen Ring, R₁: -H.einAlkylrest,

R₂: -H, -NH₂, ein Alkylrest, ein cyclischer Molekülrest, R₃: ein aromatischer oder heterocyclischen Molekülrest, R₄: einAlkylen-.Arylen-oderAralkylenrest, Re: eine-N=N-odereine-CH=N-Gruppeund C₁ 'jnd Cj Teile eines Kettenmoleküls, eines Ringes oder Ringsystems sein können.

Wesentlich Ist, daß als chelatbildende Gruppierungen Molekülstrukturen genutzt werden, bei denen die Ausbildung von Haupt- und Nebenvalenzen zwischen derchelatbildenden Gruppierung im heterobifunktionellen Reagenz, gegebenenfalls chelatbildender Gruppen im Enzymmolekül und Metaliionen des Trägers zu einer fünf- oder sechsgliedrigen Ringstruktur führt.

Bevorzugt werden als chelatbildende Gruppierungen eingesetzt: 1 -Hydroxy- oder 1 -Amino-1,1 -bisphosphonsäuren, Malonsäurederivate (I), Sideramine (II), Alphaketocarbonsäuren, Dithiocarbamate (III), 2-Hydroxy-, 2-Sulfhydryl- oder 2-Aminosäuren nach Formel (I), (IV), Diketone oder Bis-chinone, deren Mono- oder Dioxime (V), Alphahydroxyketone, -ketoxime, Heterocyclen mit zum Ringstickstoff benachbarten Hydroxylgruppen, z.B. 8-Hydroxychinolin (Vl), 2-Nitrosonaphtol, Salicylate, Sulfosalicylate, Aluminon, Eriochromcyanin R (VII), Acetessigester-, Acetylaceton- oder Malonesterderivate (VIU),

^otropsäure, Hydroxynaphtoesäure, Eriochromschwarz T (IX), Aminoalkohole (X: -R₄OH) (X), Iminoessigsäuren oder Iminobispliosphonsäuren (Xl), quartäre Ammoniumverbindungen (XiI), Tricarbon- oder Triphosphonsäurederivato, gegebenenfalls über Ether- oder Thioetherbrücken gebunden (XIII), aromatische Dicarbonsäuren, 2. B. 2-Nitro-4,3',5'-diphenylethertricarbonsäure (XIV), Alizarin S, Gallocyanin (XV), Brenzkatechin, -violett, Pyrogallol oder -rot (XVI), BAL- (Britisch Anti Lewisit) derivate (XVII), Benztriazol, 2-(o-Hydroxyphenyl)benzoxazol, o-substituierte Diazoverbindungen oder Schiffsche Basen (XVIII), Mercaptobenzthiazol, Mercaptophenylthiodiazolon oder Cyanursäurederivate (XiX), Formazane, Dithizon- oder Cyanessigsäurederivate (XX), p-Dimethylaminobenzylidenrhodanin (XXI) oder o-Hydroxybenzyliminodiessigsäurederivate (XXII).

Die Durchführung der Immobilisierung der Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase der gegebenenfalls einer Ankersubstanz erfolgt entweder in der Weise, daß das heterobifunktionelle Reagenz zunächst mi dem Träger reagiert und dann mit dem Enzym oder der Ankersubstanz zur Reaktion gebracht wird oder daß das heterobifunktionelle Reagenz zunächst an Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase oder die Ankersubstanz gebunden wird und anschließend durch Inberührungbringen des Trägers mit dem so modifizierten Enzym oder der Ankersubstanz die Immobilisierung vollzogen wird. Wenn zunächst Ankermoleküle an den Träger immobilisiert werden, lassen sich die Enzymmoleküle anschließend in bekannter Weise durch intermolekulare Wechselwirkungen oder kovalente Bindung an diese Ankermoleküle binden. Als Ankermoleküle für die Enzymbindung über intermolekulare Wechselwirkungen werden Moleküle von Substanzen benutzt, die in affinitätschromatographischen Trennprozessen, an Festphasen gebunden, zur Isolierung oder Reinigung von Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase eingesetzt werden.

Bevorzugt werden Lektine für Glycoenzyme und hydrophobe Moleküle für Lipase eingesetzt. Weiterhin werden als Ankermoleküle natürliche oder synthetische Polymere eingesetzt, die gegebenenfalls durch Wechselwirkung mit Substraten oder dem Enzym die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen und/oder durch Wechselwirkung mit dem Reaktionsmedium zu einer bevorzugten Anreicherung des Biokatalysators in einer Phase flüssiger Mehrphasensysteme führen. Als bifunktionelle Verbindungen zur Nachbehandlung des Trägers werden Substanzen eingesetzt, die eine chelatbildende Gruppierung und eine Gruppierung enthalten, die die Löslichkeit des Trägers im Reaktionsmedium verringern, die das Verteilungsgleichgewicht feinverteilter Trägerpartikel in flüssigen Zweiphasensystemen beeinflussen und/oder durch Wechselwirkungen mit dem Enzym oder mit Substratmolekülen die Reaktionsgeschwindigkeit und/oder Selektivität des Biokatalysators beeinflussen. Derartige Gruppierungen sind aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffreste, heterocyclische Reste, ionenaustauschende Gruppen, chelatbildende Gruppen, optisch aktive Gruppen, Fettsäureester oder Kohlehydratreste.

Die erfindungsgemäß hergestellten Enzymimmobilisate werden in sehr guten Ausbeuten (bei eingesetzten Enzymmengen die unterhalb der Grenze für eine monomolekulare Belegung der zur Verfugung stehenden Trägeroberfläche liegen: 100%) und bei hoher Auswaschstabilität in den gebräuchlichen Substratlösungen (abhängig von der Komplexbildungskonstante zwischen Chelatgruppe und Metallion des Trägers) erhalten.

Sie werden in der präparativen Biotransformation, z. B. bei der Saccharose- und Lactosespaltung oder bei Umesterungen und in der Analytik, z. B. in Durchflußreaktoren zur Bestimmung von Disacchariden mit immobilisierter Invertase oder ß-Galactosidase eingesetzt

Nachfolgend soli die beanspruchte Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

10g einer makroporösen Zirkondioxid enthaltenden Keramik werden mit 50ml einer wäßrigen Lösung von 6-Amino-1-hydroxy-1,1-bis-phosphonsäure (5OmM, Formel I, Y: -PO₃H₂, X:-OH) 1 h in einem rotierenden Gefäß behandelt. Das Produkt wird solange mit Wasser gewaschen, bis die Leitfähigkeit in der Waschlösung konstant bleibt. Danach werden 20 ml einer 5%igen Glutaraldehydlösung in Natriumhydrogenkarbonatpuffer (pH = 7,5) zu dem abfiltrierten Träger gegeben und 48 h bei

Raumtemperatur (unter Rotation) gehalten. Der aktivierte Träger wird gründlich mit Wasser gewaschen und dann zu 30ml einer Lösung von Invertase (100IE/ml = 100 internationale Einheiten/ml) in Karbonatpuffer (pH = 7,5) gegeben. Nach 24stündiger Rotation wird das Produkt gewaschen und zur kontinuierlichen Rübenzuckerhydrolyse eingesetzt. Die Fixierungsausbeute beträgt 30%.

Technische Einzelheiten, wie sorgfältige Entgasung der Träger unter Vakuum, nach Möglichkeit im Ultraschallfeld, sowie Behandlungsschritte unter „Überkopfrotation" und intensive Waschvorgänge, d.h. mindestens 10 χ 20 min, gelten für alle Beispiele gemeinsam,

Beispiel 2

500mg Invertase werden in Acetatpuffer (50 mM, pH 4,5) mit Perjodat oxydiert (s. M. Marek et al., Biotech. Bioeng. 261223 (1 üd<l]) und dialysiert. Der Rückstand wird mit 20 mg Desferrioxamin B (Formel II, X: -OH₁Y: -COR₁, R enthält eine primäre Aminogruppe) versetzt und über 48h bei 4° zur Reaktion gebracht. Gleichzeitig wird aus äquimolaren Mengen von Eisen-Il- und Eisen-lll-sulfat in einer 1%igen Dextranlösung mit Ammoniaküberschuß ein magnetisches Eisenoxid (Fe₃O₄) gefällt, das durch Dextran als Schutzkolloid stabilisiert ist. Dieses Eisenoxidsol wird mit dem modifizierten Enzym versetzt und 1 h bei Zimmertemperatur gerührt. Nach mehreren Waschungen mit magnetischer Abtrennung wird das Produkt in einem wäßrigen 2-Phasensystem (Stärke-Polyethylenglycol) zur Zuckerhydrolyse eingesetzt, wobei sich der Katalysator in der Stärkelösung anreichert und die entstehenden Monosaccharide in beiden Phasen gleich verteilt sind und aus der PEG-Phase durch Ultrafiltration abgetrennt werden können.

Beispiel 3

500mg N-(4-Hydroxyphenyl)-dithiocarbamat (Formel III, X: -SH, Z: =S) werden in wäßriger Lösung mit 10g einer Eisen-lll-oxid enthaltenden Keramik geschüttelt. Das Produkt wird gewaschen und sorgfältig getrocknet. Anschließend wird es mit 30 ml einer 2%igen Lösung von Toluendiisocyanat in trockenem Toluen aktiviert und mit getrockneten Lösungsmitteln (Toluen, Aceton) reagenzienfrei gewaschen und getrocknet. Die abschließende Enzymkopplung erfolgt durch Eintragen des aktivierten Trägers in eine wäßrige Lösung von Lipase (3000IE/30 ml).

Beispiel 4

400mg 3,4-Epoxy-1,2-dihydroxybutan-1,1-bisphosphonsäure werden an 10g Aluminiumsilikat absorbiert und anschließend mit einer Lösung von ß-Galactosidase (300IE/50ml Karbonatpuffer, lOOmmol/l, pH: 8,5) umgesetzt. Nach 5h bei 4⁰C wird die Immobilisierung abgebrochen, das Produkt gewaschen und für die Lactosespaltung genutzt.

Belsplel5

10g einer porösen Keramik mit 20% Nickeloxid werden mit 200ml einer Lösung von 20mmol/l Cyclohexan-1,2-diondioxim-4-essigsäure (Formel V, Z: =NOH) in Citratpuffer (lOmmol/l, pH: 6,0) 1 h geschüttelt. Danach werden 3000IE ß-Galactosidase in 50ml salzsaure Natriumchloridlösung (0,1 mol/l, pH: 4,5) zu dem abfiltrierten Träger gegeben. Nach 24 h werden 200mg N-Ethyl-N'-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid zugegeben und 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Produkt wird zur Spaltung von Lactose in Enzymreaktoren eingesetzt.

Beispiele

5ml Invertase in einer Glycerol-Acetatpuffermischung (20% Glycerol, 0,1 mol/1 Acetatpuffer, pH: 4,5) werden mit 30ml einer wäßrigen Lösung von 5-Diazo-8-hydroxychinolin (10mmo!/l) umgesetzt und der Reagenzüberschuß in einer Epidexsäule abgetrennt. 10g makroporöses Aluminiumoxidpulver werden mit dem aktivierten Enzym 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt, abfiltriert und gewaschen. Dann werden 2g Bäckerhefe in 20ml 3%iger Natriumalginatlösung suspendiert, mit dem feuchten Trägermaterial versetzt und die Mischung tropfenweise in eine Calciumchloridlösung gepreßt. Die entstehenden Kugeln werden vorsichtig getrocknet und anschließend in einem Säulenreaktor zur kontinuierlichen Vergärung von Saccharose eingesetzt.

Beispiel 7

10g Schaumbeton werden nacheinander mit Lösungen von Eisen-lll-hexacyanoferrat und Eisen-ll-ammoniumsulfat (jeweils 20mmol/l, pH: 6,5) behandelt. Das tiefblaue Produkt wird gewaschen und anschließend mit 30ml einer Lösung von 3-Hydroxy-4-carboxy-benzoesäureazid (10mg/ml, pH: 4,0, Formel VII, Y: -COOH, X: -OH) 10min bei O⁰C geschüttelt und anschließend sofort mit einer Lösung von ß-Galactosidase in Acetatpuffer (3000IE Enzym, lonenstärke: 0,1 mol/l, pH: 4,5) versetzt. Nach 2h wird der Träger gewaschen und bis zur Verwendung in o.g. Puffer aufbewahrt.

Beispiele

10g Schaumglas werden mit einer 5%igen Lösung von Acrylamid-Methylenbisacrylamid-Riboflavin (zur Gelherstellung) getränkt und durch UV-Bestrahlung mit einem Überzug von Polyacrylamid versehen. Das getrocknete Produkt wird mit einer Lösung von Titantetrachlorid in Tetrachlorkohlenstoff 2 h geschüttelt, mit Aceton und Wasser gewaschen und anschließend mit einer Lösung von 50mg N-(2-Hydroxyethyl)aminoma!onsäure (Formel VIII, Z: =0, R₂: -OH) in 30ml Wasser versetzt. Nach 2stündiger Rotation der Mischur g wird der funktionalisiei e Träger mit Wasser gewaschen, unter Vakuum getrocknet und mit Chlorameisensäurenorbornylester in bekannter Weise die endständige Hydroxylgruppe in den aktivierten Ester überführt. Abschließend wird die Kopplung von Lipase (3000IE in Karbonatpuffer, 50mmol/l, pH: 8,0) durch Zugabe von 30ml Enzymlösung zu dem getrockneten Träger vollzogen. Das Produkt wird in Durchflußreaktoren eingesetzt.

Beispiel 9

300mg Invertase und 50mg 1,8-Dihydroxynaphtalin-3,6-disulfonsäure werden bei pH8,5 in Karbonatpuffer mit 25mg Bisdiazobenzidinhydrochlorid versetzt und unter schwacher Rührung 1 h bei Raumtemperatur gehalten. Das entstehende Enzymderivat (Formel IX, X: -OH, Y: -N=N-) wird mit 5ml 10%iger Polyacrylsäure und 3g fein verteiltem Eisen-ll,lll-oxid versetzt und in eine Lösung von 2g Chromammoniumalaun in 30 ml Wasser getropft. Das Produkt wird getrocknet und bei 4°C bis zur Verwendung aufbewahrt.

Beispiel 10

10g Poly-vinylalkohol-divinylbenzen (98:2) werden mit einer wäßrigen Lösung von Zirkonoxychlorid (2 g in 50ml, pH: 3,5) 1 h auf 6O⁰C erwärmt, anschließend gründlich gewaschen und mit einer Lösung von 200mg Triethanolamin in 50 ml Wasser weitere 3 h auf 60°C orwärmt. Das Produkt (Formel X, R = X: -CH₁-CHr-OH) wird mit Cyanurchlorid (50ml, 2mmol/l, Karbonatpuffer, 50mmol/l, pH8) und anschließend mit überschüssiger Glucose in schwach alkalischer Lösung als Ankersubstanz umgesetzt (4h, 2O⁰C, Rotation), gewaschen und zur Immobilisierung von ß-Galactosidaso eingesetzt, die an den modifizierten Träger ohne weitere Reagentien koppelt.

Beispielen

10g poröses Gias („Trisoperl") werden 5h unter Rückfluß in einer Ammoniummolybdatlösung (IOmmol/1, pH = 5,0) gekocht. Danach wird abfiltriert und mit 100ml einer 1%igen Lösung von 2-(N,N-diethylphosphonsäure)-aminoacetaldehyd (R: -CH: -CHO, Y: -CH₂-CHj-PO₃H₂, Formel Xl) in Karbonatpuffei (pH = 7,5) versetzt. Nach 1 h wird abfiltriert und gewaschen. Der Träger wird dann mit 30ml einer Lösung von Invertase (100IE/ml) in Acetatpuffer (10mmol/l, pH = 5,6) 24h bei Raumtemperatur behandelt, anschließend gewaschen und in Acetatpuffer aufbewahrt.

Beispiel 12

10g eines Composites aus 8g Ton und 2g Polyethylen werden mit 50ml einer neutralen wäßrigen Lösung von 500mg Cetyltrimethylammoniumbromid (Formel XII, X: -CH₃) 48h unter Rotation bei 45⁰C inkubiert. Die Cetylkette wirkt als Ankersubstanz für hydrophobe Enzyme. Die Immobilisierung von Lipase erfolgt durch Behandlung des Trägers mit einer neutralen Lösung von 3000IE Pankreaslipase in verdünntem Karbonatpuffer (1 mmol/l, pH: 8,0) bei 30⁰C über 48 h sowie nachfolgenden Waschschritten.

Beispiel 13

10g poröses Titandioxid werden mit 20ml einer Lösung von 1OmM N,N',N"-Trie-(2-phosphonatoethylamino)-acetaldehyd (Formel XIII, Y: -N-CHr-CH₂-PO₃Hj) in destilliertem Wasser 1 h rotiert, gewaschen und in die Lösung von 3 000IE Lipase in 30ml Karbonatpuffer (0,1 mol/l, pH: 8,0) gebracht. Nach 2stündiger Rotation ist die Immobilisierung beendet und das Produkt wird abfiltriert, in Hexan überführt und in dieser Lösung zur Hydrolyse von Fettsäureestern eingesetzt.

Beispiel 14

10g poröse Pericellulose werden 4h mit einer alkoholischen Lösung von Zirkontetraethylat (2g in 50ml) unter Rückfluß auf Siedetemperatur erhitzt, anschließend mit Ethanol und Wasser gewaschen. Zu dem feuchten Träger werden 200 mg 2-Aminodiphenylether-4,3', 5'-tricarbonsäure (Formel XIV, Y: -COOH) in neutraler wäßriger Lösung gegeben und unter Rotation im Verlauf einer Stunde absorbiert. 50mg Linsenlektin als Ankersubstanz werden wie in Beispiel 2 mit Perjodat oxidiert und anschließend bei pH7,0 (neutralisiert mit Hydrogenkarbonat) an den funktionalisierten Träger gebunden. Abschließend werden 30mg Invertase in 20ml Wasser gelöst und zu dem Lektinimmobilisat gegeben. Nach den üblichen Waschschritten ist das Produkt zum Einsatz in analytischen Enzymreaktoren geeignet.

Beispiel 15

10g Aluminiumsilikat werden mit einer Lösung von 2g Alizarin S in 30ml Natronlauge (1 mmol/l) 2 h unter Rotation umgesetzt, der Träger gewaschen und getrocknet. Zu dem trockenen Träger wird eine Mischung von 20mmol Terephtaloylchlorid und 20mmol Pyridin in 30ml Toluen gegeben und innerhalb von 2h bei 50⁰C die ß-OH-Gruppe des Alizarins verestert. Der funktionalisierte Träger wird mit Toluen, Aceton und Wassergewaschen und sofort danach mit 3000IE Lipase in Karbonatpuffer (10mmol/l, pH: 8,0) versetzt.

Nach 3h ist die Immobilisierung beendet.

Beispiel 16

p-Galactosidase (3000IE) wird in Karbonatpuffer (s.o.) mit 20ml o-Chinon (3mmol/l) und nach 4h mit 10ml Hydrazinsulfat (10mmol/l, pH6,5) umgesetzt, wobei ein Brenzkatechinderivat (Formel XVI, X: -OH) entsteht. 10g poröses Aluminiumoxid werden 4h mit der Reaktionslösung behandelt, gewaschen und zur Spaltung von Lactose eingesetzt.

Beispiel 17

10g poröses Nickeloxid werden mit einem Überschuß von 2,3-Dimercaptopropanol in Form einer 2%igen wäßrigen Lösung umgesetzt (Formel XVII, X: -SH, -OH). Nach Auswaschen des Überschusses werden 30ml einer Lösung von Dipyridin-2,2'-disulfid (3mmol/l) in Wasser zugegeben und damit ein Teil der SH-Gruppen am Träger in Disulfidgruppen umgewandelt. Nach Entfernen des Reagenzüberschusses wird der aktivierte Träger mit der Lösung von 500mg ß-Galactosidase in 30ml Karbonatpuffer nach Beispiel 154h behandelt und abschließend gewaschen. Das Produkt wird in der Analytik eingesetzt.

Beispiel 18

lOOmmol o-Phenylenbisdiazoniumchlorid werden bei pH9,0 mit 200mmol p-Aminophenol gekuppelt up.·' das Produkt (Formel XVIII, Y: -OH, R₆: -N=N-C₆H₄-N=N-) wird erneut diazotiert, danach an 10g poröses Aluminiumsilikat absorbiert und sofort mit einer Lösung von 3000IE Invertase in o.g. Karbonatpuffer umgesetzt.

Beispiel 19

500mg Lipase aus Candida Cylindracea werden mit einer Lösung von 20mmol Cyanursäurechlorid in 3ml Aceion umgesetzt, danach wird das Produkt getrocknet und in Wasser aufgenommen. Die restlichen Chloridatome werden in Karbonatpuffer abhydrolysiert und das Produkt (Formel XIX, X: -OH) wird an 10g eines porösen Titansilikates adsorbiert. Der entstandene Katalysator wird zur Fettsynthese eingesetzt.

Beispiel 20

Aus o-Hydrazinobenzoesäure und p-Chlormethylbenzaldehyd wird ein Formazan hergestellt (Formel XX, R₆: -N= N-, Y: -COOH), an ein Eisen-lll-silikat adsorbiert und das Chlor durch NH4OH in eine Aminogruppe überführt. Der Träger wird dann durch Behandlung mit einem Überschuß von Benzochinon in Karbonatpuffer (3mmol/l) aktiviert. Die abschließende Enzymimmobilisierung erfolgt durch Zugabe von 3000IE ß-Galactosidase in 25ml Acetatpuffer, pH: 5.6.

Beispiel 21

e-Chlorchinolin-S-carbonsäuremethylester wird mit Glycin zu der N-substituiertin Aminoessigsäure umgesetzt und anschließend mit Hydrazin und Nitrit in das Azid überführt. 0,1 g dieser Verbindung (Formel XXI, Z: =N- im Ring, =0) werden mit 1 g ß-Galactosidase bei pH8,0 in Karbonatpuffer umgesetzt und anschließend an 10g Zirkondioxid absorbiert.

Beispiel 22

200mg N-(2-Hydroxy-5-aminobenzyl)iminodiessigsäure (Formel XXII, X: -OH, Y: -CHr-COOH) werden diazotiert und nach Neutralisation zu einer Mischung aus invertase und Glucoseoxidase (jeweils 3000IE) in 20ml Karbonatpuffer pH: 8,0 gegeben. Nach 4h bei 0°C ist die Kopplung beendet und das Produkt wird mit 10g Eisen-ll.lll-oxid versetzt. Unter Rotation werden die modifizierten Enzyme adsorbiert (12 h), das Produkt wird gewaschen und magnetisch abgetrennt. Der Katalysator wird mit 10 ml einer 10%igen Polyvinylalkohollösung vermischt uno auf einer Glasplatte zu einer Membran ausgestrichen. Nach Trocknung wird die Membran vor die Platinspitze einer amperometrischen Elektrode gespannt. Die entstehende Enzymelektrode ist zur Bestimmung von Glucose und Saccharose einsetzbar.

Claims (21)

1. Verfahren zur Immobilisierung von Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase an schwerlösliche Trägermaterialien, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung der Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase, gegebenenfalls über eine Ankersubstanz, an Trägermaterialien erfolgt, die an inneren oder äußeren Oberflächen Ionen mehrwertiger Metalle enthalten, wobei die Bindung der Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase oder gegebenenfalls der Ankersubstanz, mittels heterobifunktioneller Reagenzien erfolgt, in denen eine funktioneile Gruppe, gegebenenfalls unter Verwendung eines Aktivierungsreagenz, mit der zu immobilisierenden Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase oder gegebenenfalls der Ankersubstanz und die zweite Gruppierung mit den Metallionen der Matrix reagiert und daß gegebenenfalls die Oberfläche des Trägers durch abschließende Nachbehandlung mit einer weiteren bifunktionellen Verbindung modifiziert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Trägermaterialien anorganische Materialien, organische Materialien oderComposite aus beiden sind, bei denen sich an der äußeren Oberfläche und/oder an der Oberfläche von Poren im Innern des Materials, gegebenenfalls als ^chträglich aufgebrachte Überzugsschicht, Ionen mehrwertiger Metalle befinden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die metallionenhaltige Überzugsschicht auf dem Trägermaterial durch dessen Umsetzung mit einer metallorganischen Verbindung, einem Metaiisaiz, einem Metallkomplex, einem Metallhalogenid, einem Oxy- oder Hydroxysalz erzeugt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die anorganischen Trägermaterialien schwer lösliche natürliche oder synthetisch hergestellte Oxide, Salze, Mineralien, Gläser oder Keramiken sind.

5. Verfahren nach Anspruch 1,2 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial ein ferromagnetisches Material ist oder ferromagnetische Bereiche enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als organischeTrägermaterialien Polymere eingesetzt werden, die mit Metallverbindungen nach Anspruch 3 unter Bildung einer metailionenhaltigen Überzugsschicht reagieren.

7. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermaterialien anorganisch-organische Composite sind, in denen die Eigenschaften der anorganischen Träger, wie Abriebfestigkeit oder Verformbarkeit durch das organische Material, insbesondere durch Polymere verbessert werden, wobei dieses organische Material ein Trägermaterial nach Anspruch 6 oder ein nicht reaktives Material oder ein Material ist, in dem oder an dem nach bekannten Verfahren Enzyme oder andere Biomaterialien immobilisiert sind.

8. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermaterialien anorganisch-organische Composite sind, in denen ein organisches Trägermaterial nach Anspruch 6 durch Zusätze von anorganischem Material in seinen Eigenschaften, wie zum Beispiel Druckfestigkeit verbessert wird, wobei das organische Material nach Anspruch 6 zur Immobilisierung von Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase genutzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die mehrwertigen Metallionen an der Oberfläche der Träger Ionen von Elementen der zweiten bis fünften Haupt- oder der Nebengruppen des Periodensystems, einschließlich der Lanthaniden sind.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein heterobifunktionelles Reagenz verwendet wird, das als eine funktioneile Gruppe, die mit der Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase oder der Ankersubstanz direkt reagiert, eine Säureazid-, eine Säureiialogenid-, eine Säureanhydrid-, eine Isocyanat-, eine Isothiocyanat-, eine aktivierte Ester-, eine Disulfid-, eine Aldehyd- oder eine Diazogruppe enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein heterobifunktionelles Reagenz verwendet wird, das als eine funktioneile Gruppe, die nach Reaktion mit einem Aktivierungsreagenz mit der Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase oder gegebenenfalls der Ankersubstanz reagiert, eine Amino-, Hydrazino-, Säureamid-, hydrazid-, -halogenid-, -anhydrid-, -thioamid-, -imid-, Ester-, Lactam-, Lacton-, Carboxyl-, Carbonyl-, Nitril-, Oxim-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Halogen-, Alken-, Alkin- oder eine CH-acide Gruppe enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein heterobifuktionelles Reagenz verwendet wird, das als zweite funktionelle Gruppierung eine chelatbildende Gruppierung enthält, die aus einer oder mehreren Gruppen mit der Fähigkeit zur Bildung von Hauptvalenzbindungen und mindestens einer Gruppe mit der Fähigkeit zur Bildung von Nebenvalenzbindungen besteht.

13. Verfahren nach Anspruch 1 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß die chelatbildende Gruppierung Molekülbereiche mit Strukturen nach Formel I—XXII im heterobifunktionellen Reagenz besitzt,

Y XZ XX Z / I II Il Il

R-C-X R-N-Y R-C-Y R-C-CY RCC₁-C₂=Z

Y Y

(1) (ID (III) ' (IV) (V)

X XY ZZ X XY

/ / / I I I II II/ I I I I

R-C-C₁-C₂=Zi-) R-C-C₁-C₂ R₂-C-C-C-R₂ R-C-C₁-C-C₂-C₂=

(VI) (VII) (VIII) (IX)

X Y X γ γ γ

/ / / / iii

H-N R-N R-N^1--X R-C-Y R-C-C₂-C-Co-

X Y X Y

(X) (XI) (XlI) (XIII) (XIV)

Z X XX XXX Y γ

ι/ι. / / iii Ii ι

R-C-C₁ C-C₂- R-C C₁ C₂- R-C-C-C- R-C-C₂-Ci-Rc-C₁-Cc-

(XV) (XVI) (XVlI) (XVIII)

χ- . υ ζ ζ χ γ

R C₁=N- R-NH-N-C-R₅-C₁-C₂- R-C-C-NH-C- R-C-C-C-N

Y (XIX) (XX) (XXI) (XXII)

wobei R den Molekülteil darstellt, an dem sich über aliphatische, aromatische oder heterocyclische, gegebenenfalls substituierte oder Heteroatome enthaltende Gruppierungen gebunden, die zur kovalenten Enzymbindung notwendige funktionelle Gruppe befindet, und

X: -OR₁,-SRn-NR₁R₂,-NO₁-NR₁O^-R₄OH,

Y: -COOR^-R₄-COORV-O-R₄-COORv-NH-R₄-COORn-S-R₄-COORn-CONR₁R₂,

-CONHOH₁-PO₃H₂,-R₄-PO₃H₂,-NHOH,-SO₃H,-OH,-H, Z: =0, =S, =NH, =NOH, =N-in einem heterocyclischen Ring, R₁: "H,einAlkylrest,

R₂: -H,-NH₂, ein Alkylrest, ein cyclischer Molekülrest,
R₃: ein aromatischer oder heterocyclischer Molekülrest, R₄: ein Alkylen-, Arylen- oder Aralkylenrest,
R₅: eine-N=N-odereine-CH=N-Gruppeund
C₁ und C₂ Teile eines Kettenmoleküls, eines Ringes oder Ringsystems sein können.

14. Verfahren nach Anspruch 1,12 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß als chelatbildende Gruppierungen Molekülstrukturen genutzt werden, bei denen die Ausbildung von Haupt- und Nebenvalenzen zwischen der chelatbildenden Gruppierung und Metallionen des Trägers zu einer fünf-oder sechsgliedrigen Ringstruktur führt.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das heterobifunktionelle Reagenz zunächst über die Chelatbildung mit dem Träger reagiert und dann mit der Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase zur Reaktion gebracht wird.

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das heterobifunktionelle Reagenz zunächst an die Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase gebunden wird und anschließend durch Inberührung bringen des Trägers mit der so modifizierten Lipase, ß-üaiactosidase oder Invertase die Immobilisierung vollzogen wird.

17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst Ankermoleküle an den Träger immobilisiert werden und daß die Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase anschließend in bekannter Weise durch intermolekulare Wechselwirkungen oder kovalente Bindung an diese Ankermoleküle gebunden wird.

18. Verfahren nach Anspruch 1 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß als Ankermolekül Moleküle von Substanzen benutzt werden, die in affinitätschromatographischen Trennprozessen an Festphasen gebunden zur Isolierung oder Reinigung von Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase eingesetzt werden.

19. Verfahren nach Anspruch 1 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß als Ankermoleküle natürliche oder synthetische Polymere eingesetzt werden,.an die in bekannter Weise das Enzym gebunden wird, die gegebenenfalls durch Wechselwirkung mit Substraten oder dem Enzym die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen und/oder durch Wechselwirkung mit dem Reaktionsmedium zu einer bevorzugten Anreicherung des Biokatalysators in einer Phase flüssiger Mehrphasensysteme führen.

20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bifunktionelle Verbindung zur Nachbehandlung des Trägers eine chelatbildende Gruppierung nach Anspruch 12-14 und eine Gruppierung enthält, die die Löslichkeit des Trägers im Reaktionsmedium verringert, die das Verteilungsgleichgewicht feinverteilter Trägerpartikel in flüssigen Zweiphasensystemen beeinflußt und/oder durch Wechselwirkungen mit dem Enzym oder mit Substratmolekülen die Reaktionsgeschwindigkeit und/oder Selektivität des Biokatalysators beeinflußt.

21. Verfahren nach Anspruch 1 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß die bifunktionelle Verbindung zur Nachbehandlung des Trägers neben derChelatgruppe nach Anspruch 12-14 einen aliphatischen oder einen aromatischen Kohlenwasserstoffrest, einen heterocyclischen Rest, eine ionenaustauschende Gruppe, eine chelatbildende Gruppe, eine optisch aktive Gruppe, eine Gruppe, die Cofaktoren binden, reduzieren oder oxydieren kann, einen Kohlehydratrest, eine Ester- oder Amidgruppt enthält.