DD295025A5

DD295025A5 - Optisches rastermikroskop

Info

Publication number: DD295025A5
Application number: DD34142290A
Authority: DD
Inventors: John G Walker; Edward R Pike; Mario Bertero
Original assignee: The Secr. Of State F. Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The Unite,Gb
Priority date: 1989-06-07
Filing date: 1990-06-07
Publication date: 1991-10-17
Also published as: EP0475991A1; DE69013916T2; CA2059126A1; JPH04505971A; GB8913129D0; DE69013916D1; WO1990015352A1; EP0475991B1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Verbesserung des Auflösungsvermögens in einem konfokalen Rastermikroskop durch eine optische Signalverarbeitung vor dem Nachweis. Eine solche Verarbeitung wird durch ein Element 7, 39, 42 erreicht, das entweder eine Phasen- oder eine Amplitudengewichtung oder beides hat. Bei dem Mikroskop kann es sich um Durchstrahlungs-, Reflexions- oder Fluoreszensmikroskop handeln. Bei einem Durchstrahlungsmikroskop wird durch einen Laser 1 eine kleine Fläche einer Probe 3 beleuchtet. Das Licht von dieser kleinen Fläche wird auf ein optisches Verarbeitungselement 7 fokussiert. Das Ausbildungssignal des Elements 7 wird durch einen Detektor 11 über eine Lochblende 9 in einer Blendplatte 10 nachgewiesen. Die Phasengewichtung des Elements 7 kann durch ein rechteckiges Gitter 15 und die Amplitudengewichtung durch eine sinusförmige Änderung der Absorption gebildet werden. Eine optische Gewichtsfunktion m(x, y) ist cos(2Pi Nx/Lambda) - cos(2Pi Ny/Lambda), wobei N die numerische Apertur der Linsen 2,6 und Lambda die Wellenlänge ist. Eine alternative optische Gewichtsfunktion m(x, y) ist sign(cos(2PI Nx/Lambda)) - sign(cos(2Pi Ny/Lambda)).{Rastermikroskop; optische Signalverarbeitung; Phasen-/Amplitudenwicklung; Laser; optisches Verarbeitungselement; Detektor; Lochblende; Blendenplatte}

Description

13 S O IS 1

Optisches Rastermikroskop Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf optische Rastermikroskopzmit erhöhtem Auflösungsvermögen.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik:

Ein bekanntes optisches Rastermikroskop ist ein konfokales Rastermikroskop (SCM), das von Sheppard und Choudhury in Optica Acta, 24, 1051, 1977 und von Brakenhoff in J. of Microscopy, 117, 219, 1979 beschrieben wird.

In diesem SCM wird ein paralleler Laserlichtstrahl durch eine Leuchtlinse auf einen kleinen Abschnitt eines Objektes fokussiert. Das Licht von diesem kleinen Abschnitt wird durch eine Bildlinse über eine Lochblende, die in der Brennebene angeordnet ist, auf einem einzelnen Detektor abgebildet. Die Lochblende und der Mittelpunkt des Lichtstrahls sind konfokal ausgerichtet. Das Bild entsteht durch Abtastung des Objekts und Aufzeichnung des Detektorausgangssignals für jede Stellung des Objekts. Ein solches Mikroskop weist gegenüber herkömmlichen Mikroskopen ein erhöhtes Auflösungsvermögen auf.

In der GB-Patentschrift 2,113,501 wird eine über das konfokale Rastermikroskop hinausgehende Verbesserung beschrieben. Bei diesem Mikroskop werden die Lochblende und der einzelne Detektor durch eine Gruppe von Detektoren ersetzt. Die Ausgangssignale dieser Gruppe werden transforr ert, um zusätzliche Informationen zur Verfügung zu stellen und folglich ein verbessertes Auflösungsvermögen zu schaffen. Bei einem Durchstrahlungs- oder Reflexionskohärenzmikroskop ist eine Verbesserung des Auflösungsvermögens sowohl bei den Amplituden als auch bei den Phasenbildern zu verzeichnen. Bei einem Fluoreszensmikroskop ist das verbesserte Auflösungsvermögen im Intensitätsbild zu verzeichnen. Um die Transformierte zu erzeugen, ist bei den Kohärenzmikroskopen jedoch die komplexe Amplitude des auf jeden Detektor in der Gruppe fallenden Lichtfeldes erforderlich. Um dies zu ermöglichen, muß entweder eine Art Interferometer in das Mikroskop eingebaut werden, so daß auch ein Referenzstrahl auf die Detektorgruppe fällt, oder es muß ein anderes Hilfsmittel zur Phasenmessung eingesetzt werden. Für das Fluoreszensmikroskop ist eine zweidimensionale Detektorgruppe erforderlich.

ld F015

Ziel der Erfindung:

Durch die vorliegende Erfindung wird das Auflösungsvermögen des Amplitudenbildes, das mit einem SCM erreicht werden kann, für ein Durchstrahlungs- oder Reflexionsmikroskop verbessert, ohne daß ein Referenzstrahl oder ein anderes Hilfsmittel zur Phasenmessung eingesetzt werden müssen, obwohl diese Verfahren demnach angewendet werden können, wenn auch ein Phasenbild mit hoher Auflösung gefordert wird. Für ein Fluoreszensmikroskop wird durch die vorliegende Erfindung die Anzahl der erforderlichen Detektoren auf zwei reduziert und die elektronische Signalverarbeitung vereinfacht.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Erfindungsgemäß wird das Auflösungsvermögen durch optische Signalverarbeitung vor dem Nachweis erhöht. Eine solche Verarbeitung wird durch ein oder mehrere Elemente erreicht, die entweder eine Phasen- oder eine Amplitudengewichtung oder beides aufweisen. Die Termini Licht und optisch werden hierin so definiert, daß sie Wellenlängen zu beiden Seiten der sichtbaren Wellenlängen umfassen. Die Toleranzen werden durch die Verfügbarkeit geeigneter Lichtquellen, beispielsweise Laser, und Detektoren bestimmt.

Nach vorliegender Erfindung umfaßt ein Rasterkonfokalmikroskop:

ein erstes Linsensystem zur Lichtbündelung, um einen kleinen Abschnitt eines Objekts zu beleuchten;

ein zweites Linsensystem zum Empfang des Lichts, bei dem es sich um ausgesendetes, reflektiertes oder fluoreszierendes Licht handeln kann, von den kleinen Abschnitten des Objekts, und zum Richten dieses empfangenen Lichts auf einen oder mehrere Detektoren;

Mittel für die Abtastung des Objekts im Hinblick auf das gebündelte Licht;

Mittel zur Speicherung der Ausgangssignale des oder der Detektoren, um eine oder mehrere Anzeigen des abgetasteten Objekts zu erzeugen;

Z950Z5 >

Es ist gekennzeichnet durch:

ein oder mehrere optische Verarbeitungselemente, die das Licht von dem zweiten Linsensystem empfangen und dieses Licht vor dem Nachweis durch den oder die Detektoren optisch verarbeiten.

Eine oder mehrere zusätzliche Linsen können zwischen dem oder den optischen Verarbeitungselementen und dem oder den Detektoren angeordnet sein. Andererseits können das oder die Elemente so angeordnet sein, daß deren Lichtausgangssignale ohne solche zusätzlichen Linsen auf den oder die Detektoren übertragen werden.

Ein solches optisches Verarbeitungselement hat eine optische Gewichtsfunktion m(x, y). Bei einem Durchstrahlungs- oder Reflexionsmikroskop mit rechteckigen Aperturen und idealen Linsen zum Beispiel ist die Gewichtsfunktion m(x, y) vorzugsweise gleich cos(2TT/Nx/A' ).οο5(2ΤΓ Ny/Λ. ), wobei N die numerische Apertur des ersten und zweiten Linsensystems und Λ die Wellenlänge ist. In diesem Beispiel v/eist das Element sowohl eine Phasen- als auch eine Amplitudengewichtung für das einfallende Licht auf. Die Phasengewichtung kann dadurch erreicht werden, daß Gitterfurchen in die Oberfläche einer Glasplatte geätzt werden, während die Amplitudengewichtung durch eine variable Dichte an lichtempfindlicher Emulsion auf der Oberfläche einer zweiten Glasplatte erzielt werden kann. Die beiden Glasplatten können ausgerichtet und miteinander verbunden werden, um ein optisches Verarbeitungselement zu bilden. Alternativ dazu können rechnererstellte holografische Platten verwendet werden, um den gleichen Effekt zu erzielen. Für Systeme mit einer Kreispupille hat das optische Element eine kreisförmige Symmetrie zu der Gewichtsfunktion, beispielsweise erscheint die Gewichtung in Form mehrerer konzentrischer Ringe.

Für Aperturen mit anderen Formen (beispielsweise kreisförmige) und nichtideale Linsen kann die bevorzugte Gewichtsfunktion berechnet werden, zum Beispiel durch Verfahren der singulären Systemanalyse (Optica Acta, 1984, Band 31, Nr. 8, S. 923 - 946). Das Mikroskop kann mit Licht arbeiten, das ein abgetastetes Objekt durchstrahlt, von diesem reflektiert wird oder aus diesem fluoresziert.

Ausführungsbeispiel:

Anhand von Beispielen wird die vorliegende Erfindung nun unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Durchstrahlungsrastermikroskops, Fig. 2 eine auseinandergezogene Darstellung eines Teils von Abbildung 1, Fig. 3 eine schematische Darstellung eines Reflexionsrastermikroskops, Fig. 4 eine schematische Darstellung eines Fluoreszenzrastermikroskops, Fig. 5 a eine graphische Darstellung der übertragungsfunktion eines herkömmlichen konfokalen Fluoreszensrastermikroskops, und

Fig. 5 b eine graphische Darstellung der übertragungsfunktion des in Fig. 4 dargestellten Fluoreszenzrastermikroskops.

Das Rastermikroskop von Fig. 1 umfaßt einen Laser 1, dessen paralleler Lichtausgang auf eine Leuchtlinse 2 gelenkt wird, die typischerweise eine lOOfache Vergrößerung hat. Der Laser 1 kann ein HeCd-Laser sein, der mit einer Wellenlänge von 0,325 pm arbeitet. Ein Objekt 3, das gemessen werden soll, wird im Brennpunkt der Objektlinse 2, d. h. der Objektebene, angeordnet und so eingefaßt, daß es durch einen Motor und Antrieb 5 über die optische Achse 4 des Mikroskops bewegt werden kann. Dies ermöglicht eine Abtastung in x-Richtung. Ein zweiter und dritter Motor und Antrieb (nicht dargestellt), die orthogonal zum ersten Motor angeordnet sind, ermöglichen eine Abtastung in der y- und z-Richtung. Eine Bildlinse 6 ist so angeordnet, daß sie das Licht von dem Objekt empfängt und es auf eine optische Verarbeitungsplatte 7 fokussiert, die in der Bildebene der Linse 6 angebracht ist. Von dieser Platte 7 wird das Licht durch eine weitere Linse 8 auf eine Lochblendenapertur 9 in einer Blendenplatte 10 fokussiert und durch einen Detektor 11, wie zum Beispiel einen Fotodiodendetektor, gemessen. Die Ausgangsinformation des Detektors 11 wird zu einem Speicher 12 geleitet, der ein Speichermedium, wie beispielsweise ein Videoband, für die nachfolgende Anzeige auf einem Fernsehmonitor 13 umfaßt. Die Objekt- und die Bildlinse 2, 6 weisen die gleiche numerische Apertur, gewöhnlich etwa 1,2, auf.

Abgesehen von dem optischen Verarbeitungselement 7 und der Linse B handelt es sich um ein Mikroskop, das den herkömmlichen konfokalen Rastermikroskopen (SCM) ähnlich ist. Mittels solcher Mikroskope wird das Bild von der Bildlinse auf die Lochblende 9 fokussiert.

Der Zweck der optischen Verarbeitungsplatte 7 besteht darin, die Bildebene mit einer vorgegebenen Funktion zu multiplizieren, um die am Detektor 11 erzielte Auflösung zu verbessern. Die optimale Gewichtsfunktion. m(x, y) für das Beispiel rechteckiger Aperturen und idealer Linsen ist gleich cos(2fT Nx/Λ·) cos(2 7T Ny/ A), wobei N die numerische Apertur der Linsen 2, 6 und Λ die Wellenlänge ist. Alternativ dazu kann eine einfache Phasengewichtsfunktion mit konstanter Amplitude, aber mit derselben Phase wie die obengenannte Kosinusfunktion, verwendet werden, d. h.

m(x, y) sign(co^2 TTNx/7^)).sign(cos(2"H

Es wird ersichtlich, wie später genauer beschrieben wird, daß das optische Ver arbeitungselement 7 entweder phasen- oder amplitudengewichtet oder sowohl phasen- als auch amplitudengewichtet ist. Einerseits wird dies durch die in Fig. 2 dargestellte Verbundplatte erreicht. Eine Phasenplatte 14 wird auf einer Oberfläche zu einem rechteckigen Gitter 15 geformt, dessen Teilung in der Bildebene doppelt so groß wie der Ra^ leighsche Abstand ist, der für eine Objektlinse mit lOOfacher Vergrößerung etwa 50 pm beträgt; und dessen Tiefe 7<- /2(n - 1) entspricht, wobei Ά. die Wellenlänge und η der Brechungsindex der Glasplatte 14 ist.

Eine Möglichkeit zur Erzeugung einer Phasengewichtung auf der Platte 14 besteht in der Verwendung eines rechnergesteuerten optischen Strahlschreibers zur Schaffung eines quadratischen Gitters (Ronchi) im Verhältnis 1 : 1 in Fotoresist auf der Glasplatte 14. Nach der Fotoresistentwicklung wird das Glas zur Bildung einer Maske bis auf eine Tiefe von Ά./2(η - 1) geätzt, und das übrige Fotoresist wird entfernt.

ψ""- T⁷Tf-

Ein Element zur Amplitudengewichtung 16 kann auf Glas folgendermaßen gebildet werden. Auf das Glas wird eine Schicht 17 lichtempfindliche Emulsion aufgetragen und dem Licht eines optischen Strahlschreiber ausgesetzt. Dazu wird eine Graustufenskala verwendet, um nach der Entwicklung eine sinusförmige Durchstrahlungsamplitude zu kodieren. Diese Änderung der Absorption wird durch die Linie 18 angezeigt. Die Frequenz des Amplitudengitters ist doppelt so hoch wie die der Phasengewichtung 15 auf dem Phasenelement 14.

Nachdem sowohl das Phasen- als auch das Amplitudenelement 14, 16 gebildet wurden, werden diese mit kontaktierenden Gittern in einem parallelen Laserstrahl angeordnet, und ihre relativen Positionen werden eingestellt, bis zwei gleich helle Beugungspunkte erster Ordnung erscheinen, und sie werden dann unter Verwendung eines UV-härtenden Optikkitt entlang ihrer Kanten verklebt, um ein Einzelelement zu bilden.

Bei bestimmten Anwendungen können die Phasenplatte 14 und das Gitter 15 ohne die Platte 16 verwendet werden.

Zur Schaffung des optischen Verarbeitungselementes können andere Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann in die Oberflächen zweier Platten ein Profil geprägt werden. Alternativ dazu kann eine einzelne Oberfläche fotografisch bearbeitet werden, so daß sie zwei Schichten aufweist, von denen eine die Funktion der Phasengewirntung und die andere die der Amplitudengewichtung hat. Das optische Verarbeitungselement kann durch Verfahren hergestellt werden, die in der Herstellung von Hologrammen bekannt sind. Die Herstellung von Gittern durch lichtelektrische Auflösung (oder Fotodotierung) in Chalcogengläsern ist hinreichend dokumentiert. Siehe zum Beispiel A. E. Owens et al. "Photo Induced structures and Physico-chemical changes in Amorphous chalcogenide Semiconductors" ("Phioinduzierte Strukturen und physikalisch-chemische Veränderungen in amorphen Chalcogenhalbleitern"), Philosophical Magazine, B52, Nr. 3, S. 347 - 362, (1985); A. P. Firth et al., "Inorganic Resists Based on Photo-Doped As-S Films" ("Anorganische Fotoresists auf der Grundlage fotodotierter As-S-Filme"), SPIE Advances in Resist Technology and Processing 2, Band 539, S. 160 - 165, (1985). Holografische Verfahren auf der Grundlage der Interferenz zwischen zwei oder mehr Wellenfronten werden von M. I. Kostyshia et al. in "The use of light sensitive semiconductor-metal systems for holographic applications"

("Lichtempfindliche llalbleitermetallsysteme zur holografischen Verwendung"), Applications of Holography, Proc of the International Symposium of Holography, herausgegeben von J.-Ch. Vienot et al. (Univ. Desancon, Frankreich, 1970) paper 11.7·, S. A. Keneman, "Hologram storage in Arsenic Trisulphide Thin Films" ("Hologrammspeicherung in dünnen Arsentrisulfidfilmen"), App. Phys. Lett., Band 19, Nr. 6, S. 205 - 207 (1971) beschrieben.

Ein Objekt, das abgetastet werden soll, wird auf die übliche Weise hergestellt. Dazu gehört, daO es auf einem Objektträger plaziert und auf die erforderliche Dicke, beispielsweise 20 bis 100 pm, verdünnt wird. Der Objektträger wird dann der Darstellung entsprechend in der Objektebene angebracht und über die optische Weglänge rasterartig abgetastet, während der Detektor die Amplitude des Lichtes mißt, das von den einzelnen beleuchteten Punkten (Pixel) auf dem Objekt empfangen wird. Durch den Speicher wird jede Pixelinformation für die Bildwiedergabe auf dem Bildschirm 13 aufgezeichnet. Der Objektträger kann durch Indexierung in typischen Λ/4-Schritten rasterartig abgetastet oder gleichmäßig um jeweils eine Linie parallel verschoben werden. Die Zahl X/4 ist das Nyquistabtastintervall für die in der Gleichung 9 angegebene Punktstreuungsfunktion bei N = I.

Das in Fig. 3 dargestellte Mikroskop ist dem von Fig. 1 ähnlich, arbeitet jedoch auf der Grundlage des von einem Objekt 21 reflektierten Lichts. Ein Laser 21 ist über eine Objektlinse 22 auf einen Reflexionsstrahlenteiler gerichtet. Von diesem Strahlenteiler 23 aus wird das Licht durch eine Bildlinse 24 auf das Objekt 20 fokussiert. Wie zuvor ist das Objekt 20 für das Abtasten mittels eines Motors 25 beweglich angeordnet. Das von dem Objekt reflektierte Licht wird durch die Bildlinse 24 über den Strahlenteiler 23 auf ein optisches Verarbeitungselement 7 zur Verarbeitung wie in Fig. 1 fokussiert. Das verarbeitete Licht wird mittels einer zusätzlichen Linse 26 durch eine Lochblendenapertur 27 in einer Blendenplatte 28 und auf einen Detektor 29 fokussiert. Die Ausgangsinformation des Detektors 29 wird zur Betrachtung auf einer Anzeige 31 zu einem Speicher übertragen. Die Arbeitsweise entspricht der Beschreibung für Fig. 1.

19S01S ⁸

Das in Fig. 4 dargestellte Mikroskop ist dem von Fig. 1 ähnlich, arbeitet jedoch auf der Grundlage von fluoreszierendem Licht von einem Objekt 34. Ein Laser 32 ist über eine Objektlinse 33 auf das Objekt 34 gerichtet. Wie zuvor kann das Objekt 34 mittels eines Motors 36 um die Linsenachse 35 bewegt werden. Das fluoreszierende Licht von dem Objekt 34 wird durch die Bildlinse 37 über den Strahlenteiler 30 fokussiert, um zwei Abbilder auf den optischen Verarbeitungselementen 39 und 40 zu bilden. Diese Elemente sind nur amplitudengewichtet und weisen unterschiedliche Gewichtungen auf. Beispielsweise wird das Element 39 als das positive Element und das Element 40 als das negative Element bezeichnet. Die gesamte vom Element 39 durchgelassene Lichtintensität wird auf den Detektor 41 und die gesamte vom Element 40 durchgelassene Lichtintensität auf den Detektor 42 gerichtet. Dazu können zusätzliche Linsen verwendet werden, die in der Darstellung nicht berücksichtigt wurden. Die Ausgangssignale der beiden Detektoren 41 und 42 werden zu einem Subtraktivfilter 43 geleitet. Das Ausgangssignal des Subtraktivfiltens43 ist das Eingangssignal vom Detektor 41 hinter dem positiven Element 39 minus dem Eingangssignal vom Detektor 42 hinter dem negativen Element 40. Das Ausgangssignal des Subtraktivfilter 43 wird zur Betrachtung auf einer Anzeige 45 zu einem Speicher 44 geleitet. Die Arbeitsweise entspricht der Beschreibung für Fig. 1, die Probenvorbereitung wird jedoch so durchgeführt, wie sie in der Fluoreszensmikroskopie üblich ist. In einer alternativen Anordnung wird das fluoreszierende Licht, das auf derselben Seite des Objekts entsteht, auf der auch die Beleuchtung erfolgt, unter Verwendung eines weiteren Strahlenteilers, der dem in Fig. 3 ähnlich ist, nachgewiesen.

In einer zu dem Strahlenteiler 38 und den Elementen 39 und 40 alternativen Anordnung wird ein einzelnes Element in der Brennebene, das sowohl über einen reflektierenden als auch einen durchlässigen Teil verfügt. Für den Fall kreisförmiger Pupillen würde dieses aus in Abständen angeordneten konzentrischen Ringen oder Ellipsen aus einem reflektierenden Material (zum Beispiel Silber) bestehen und so angebracht sein, daß das durchgelassene Licht auf den Detektor 39 und das reflektierte Licht auf den Detektor 40 fällt.

19 S OiS ⁹

Die theoretische Basis für das höhere Auflösungsvermögen der vorliegenden Erfindung ist folgende: Zur Vereinfachung der Darstellung wird die Analyse in einer räumlichen Dimension beschrieben; es ist eine unkomplizierte Erweiterung auf zwei- und dreidimensionale Fälle möglich. Die Theorie, die zuerst dargelegt werden soll, bezieht sich auf ein in Fig. 1 dargestelltes Durchstrahlungsmikroskop und kohärente Deieuchtung, kann aber auch auf das Reflexionsmikroskop von Fig. 3 angewendet werden. Wenn das Objekt im Verlauf der Abtastung \n der Position Λ χ in der Objektebene 3 zentriert ist, wird die komplexe Amplitude ο¹(χ) in der Ebene unmittelbar hinter dem Objekt durch

o'(x) = o(x - Δ χ).J_o(x) 1

angegeben, wobei o(x) die Objektform und J_n(x) die Forin der Amplitude im Brennpunkt der Objektlinse 2 ist. Die komplexe Amplitude in Position χ in der Bildebene unmittelbar vor dem Element 7 mit dem Objekt in Position Δ χ, die mit i(x, Δ x) bezeichnet wird, ist durch Anwendung der Gleichung für kohärente Abbildung für (1) gegeben, wobei die Vergrößerung und die Bildumkehrung vernachlässigt werden: ·

ί(χ,Δ x) = j o'(x')J.(x - x')dx'

i(x, Δ χ) = j o(x' - Δ X)J₀(X¹^J₁(X - x')dx',

wobei J.(χ) die Amplitudenpunktstreuungsfunktion ist, die mit der Bildlinse zusammenhängt. Die Amplitude unmittelbar hinter dem Element 7 wird durch das Produkt aus i(x, Δ x) und dem effektiven Komplexamplitudendurchlässigkeitsgrad des Elements m(x) angegeben. Die Linse 8 und die Lochblende 9 sind so angeordnet, daß die Linse die Fourier-Transformierte der aus dem Element 7 hervorgehenden Amplitude bildet und sich die Lochblende in der Mitte dieser Transformierten befindet. Das Ergebnis dieser Anordnung besteht darin, daß die komplexe Amplitude des das Element 7 verlassenden Lichtes summiert oder integriert wird (durch Übernahme des Ausdrucks DC aus der Fourier-Transformierten). Folglich ist die komplexe Amplitude i ( Δ x) am Detektor durch

i_m(A x) = J i(x, Δ x).m(x)dx gegeben.

Z9ST0Z5 ¹⁰

Das Einsetzen der Gleichung (2) in (3) führt zu folgendem Ausdruck für die Amplitude am Detektor, wenn sich das Objekt in Position Λ χ befindet:

1_η(Δ χ) = JY o(x' - Δ X)J₀(X^J₁(X - x').m(x)dx'dx. 4

Wenn das Symbol χ zur Bezeichnung der Faltung verwendet wird, kann die Form der Amplitude am Detektor durch

i_(x) = o(x) © (J_n(X)₁(J₁O-X) Q m(x))) 5

III U J. -'

ausgedrückt werden.

Folglich ist die Amplitudenpunktstreuungsfunktion psf(x), die durch diese optische Anordnung erzielt wird, durch

psf(x) = J_n(x).(J.(x) Q m(x)) 6

gegeben.

An einem Beispiel soll nun gezeigt werden, daß diose Punktstreuungsfunktion ein erhöhtes Auflösungsvermögen aufweisen kann. Sind 2 und 6 identische Linsen mit der numerischen Apertur N ohne Abbildungsfehler, dann ist

0_o(x) = J₁(X) = sine (^p*). ' 7

Wenn eine einfache Fourier-Analyse durchgeführt wird, kann in diesem Fall die bevorzugte Form von m(x) wie folgt dargestellt werden:

m(x) = COs(^p*) 0

Wenn die Gleichungen (7) und (8) in (6) eingesetzt werden, ist die effektive Amplitudenpunktstreuungsfunktion, die durch die Verwendung eines Elementes mit diesem Durchlässigkeitsgrad erreicht wird, durch die Gleichung

psf(x) = _Si

gegeben, die ein besseres Auflösungsvermögen bietet (im Hinblick auf die verstärkte Wiedergabe höherer objekträumlicher Frequenzen.im Abbild) als ein

konventionelles Mikroskop mit einer Punktstreuungsfunktion von sinc( ) oder ein konfokales Hastermikroskop ohne ein optisches Verarbeitungselement, das eine Punktstreuungsfunktion von sine (—J—-) hat.

Diese zweite Analyse bezieht sich auf das in Fig. 4 dargestellte Fluoreszensmikroskop. Wenn f(y) die Verteilung der fluoreszierenden Mittelpunkte in der Brennebene ist und wenn S₁Cx), S„(x) die Punktstreuungsfunktionen der Leuchtbeziehungswbise Abbildungslinsen sind, dann ist die Intensitätsverteilung g(x) in der Bildebene

g(x) =JS₂(x - y)S₁(y)f(y)dy.

Bei einer Translation entspricht ζ einem neuen Objekt, f(y + z), und es re sultiert ein neues Abbild, g(z, x)

g(z, x) = J S₂(x - y)S_x(y)f(y + z)dy. 11

Zum Zweck der Veranschaulichung betrachten wir das eindimensionale Problem detailliert. Für die zwei- und dreidimensionalen Probleme ist eine unkomplizierte numerische Erweiterung dieses Problems erforderlich. Wir setzen identische ideale Linsen voraus und vernachlässigen die geringe Veränderung der Wellenlänge der Fluoreszenz. Weiterhin wird vorausgesetzt, daß sowohl das Objekt als auch das Abbild Elemente von L (-οο,σο) sind. Unser Problem ist nun die Umkehrung der Gleichung

g = Af, 12

bei der der Integraloperator A durch

(Af) (x) = f sinc²(x - y) sinc²(y)f(y)dy 13

gegeben ist.

Es ist ausreichend, die Lösung der Gleichung (3) am Punkt y = 0 zu rekonstruieren.

Z.35-015 ¹²

Der durch die Gleichung (4) bestimmte Nullabstand N(A) des Operators ist nicht unbedeutend. Die Elemente von N(A) nennen wir unsichtbar. Ein beliebiges Objekt f(y) kann auf einzigartige Weise in eine Komponente N(A) und eine zu N(A) orthogonale Komponente, seine durchfallende Komponente zerlegt -werden. Die Bandbreite der durchfallenden Komponente ist auf 4 ΊΠΓ begrenzt. Der zugeordnete Operator A wird durch

2 ι 2

(A*g)(x) = sine (y) J sine (x - y)g(x)dx 14

definiert.

A ist ein Kompaktoperator, genauer ein Operator der Hilbert-Schmidt-Klasse. Er hat somit ein singuläres System, d. h. die Menge von Tripein (cC · u. , v. ). °? _n, die die gekoppelten homogenen Gleichungen

Au_k=<*_kv_k, ^A*^vk^=<Vk ¹⁵

lösen.

Die verallgemeinerte Lösung f (y) weist eine Erweiterung hinsichtlich singulärer f:

CO J-

V<9 V

Funktionen auf:

CO

. ¹⁶

2 wobei (g, v. ) das Skalarprodukt von L ist. Aus der Beziehung

(g, v_k) = (Af, v_k) = (f, A*v_k) = «_k(f, u_k) 17

erhalten wir nach der Abtastung

f⁺(z) = Jt(z - y)f(y)dy, 18

l< = O^u _k(O)u_k(y). 19

195015

t(y) ist die Punktstreuungsfunktion oder der Impulsfrequenzgang, die berechnet werden sollen. Dazu ist die Lösung des folgenden Problems erforderlich: von einem gegebenen beliebigen Objekt f(y) ist dessen unsichtbare Komponente zu bestimmen. N(A) enthält alle Funktionen, deren Fourier-Transformierte innerhalb' des Bandes £-4 TT , .4"TTJ gleich null ist. Diese Teilmenge soll mit N_Q(A) bezeichnet werden. Der interessante Teil des Nullraumes ist der Teilraum der Funktionen, die bei einer Bandbreite von 4 TT die Gleichung ΑΦ(ν) = 0 lösen. Diese Teilmenge soll mit N,(A) bezeichnet werden. Unter Verwendung der Definition von A in Gleichung (13) können wir wie folgt eine Gleichung für die Fourier-Transformierte ψ (w) von ^ (y) erhalten:

ψ(ίθ) = f^W <f>(v)dv ₊ y—- f" ( W - ν)[Φ(ν + 2TT) /Ιύ-2 Τ JtO -2ΤΓ

V-(M) =-2~ f Dfcv + 27Γ)) W -2 TT

dv = 20 Die ersten und zweiten Ableitungen von ψ (w) liegen vor und sind durch

21 ) LO _2 TT

beziehungsweise

ψ "(W ) = </>(cO + 2F) - 2ψθθ ) + f(W - 27Γ), 22

gegeben. N,(A) ist die Menge aller Funktionen, die

Ψ "(W ) = 0,/W/^L 2 Π" ; V⁷ '(0) = 0; f (0) = 0 22

genügen.

Zur vollständigen Bestimmung der unsichtbaren Komponente von f(y) müssen wir die Projektion auf N,(A) der Begrenzung der Fourier-Transformierten von f(y) auf das Intervall (-4ΤΓ, 4TT)bestimmen. Diese Bestimmung kann durch die Lösung der folgenden Variationsrechnung erfolgen

) - ^(W)/²dt0= Minimum. 24

-4ΤΓ

195015 ¹⁴

Die Lösung kann durch das Lagrangesche Multiplikatorverfahren erfolgen, durch das man

0>l0 > -2ΤΓ, 25 Φ ( CO ) = -ji- [4F( « +2T) + 3F( W ) + 2F( 6ύ - 2 TT ) + F( 60 - 4 Tf ) +λ- μ(3- ^

O^W^ 2ir. 26 erhält

Unter Verwendung der Gleichung (23) erhalten wir für A und μ

¹ '" + I₃ - I₂ - 3I₁) 27

μ = -j^ (7I₄ + 3I_{3 +} 3I_{2 +} 7I₁ - 3J₄ -J_{3 +} J_{2 +} 3J₁) 20

/"-4T J-HlT

wobei

-4T + 2

F(W)dÜ, j = I, 2, 3, 4 29

-4 7T₊ 2TT (J-]

-4 TT + 2 TT j

J, = I ^F(W )dU), j = I₁ 2, 3, 4 30

-4TT + 2 TT(j-l) . ·

ist.

Die Gleichungen (22) und (23) werden für die Fortsetzung im Bereich 475/W l'^1\ verwendet. Durch diese Formeln wird unser Problem vollständig gelöst und sie können zur Bestimmung der Impulsfrequenzgangfunktion t(y) verwendet werden. Die Impulsfrequenzgangfunktion ist die Projektion auf das orthogonale Komplement des Nullraumes von A der Funktion

f(y) = 4sinc(4y). 31

zssois ¹⁵

Aus dem Zerlegungssatz erhalten wir

t(y) = f(y) -<f>(y), 32

wobei.Φ die Projektion von f auf N(A) ist

Unter Berücksichtigung, daß F(W ) = 1, wenn /co It- 4 TT können die Gleichungen

4> (W ) = 1 +-jfp-[A. - μ(3 + 4^ )] , 0>t3? -2 TT 33a

^«j^.^Mn^I.O^ 2ΤΓ 33b und

I.. = 2T ; G₁ = -5 + 21Tj, j = 1, 2, 3, 4 34

abgeleitet werden

Es folgt, daß

'A-= 0; μ = 15/4 35

ist, und nach einer kurzen Weiterführung der Berechnung erhalten wir schließlich die Übertragungsfunktion T( \jJ), die Fourier-Transformierte yon t(y).

T(W ) =-^Ο-^ψ~^/)_ί /00 /4L 2 T 36a

T(CO)' = -| (7 -4^-⁷⁾> 2ΤΓ^/ω/^47Γ 36b

Die Überprüfung der Form dieser Übertragungsfunktion, die in Fig. 5b dargestellt ist, zeigt die höhere Auflösung (da das Band gleichmäßiger gefüllt ist) im Vergleich zur Übertragungsfunktion eines normalen konfokalen Fluoreszensrastermikroskops, die in Fig. 5a dargestellt ist.

Claims

13SOlS ¹⁶

Patentansprüche

1. Optisches Rastermikroskop, das umfaßt:

ein erstes Linsensystem zur Lichtfokussierung für die Beleuchtung eines kleinen Abschnitts eines Objekts,

ein zweites Linsensystem zum Empfang von Licht, bei dem es sich um durchgelassenes, reflektiertes oder fluoreszierendes Licht handeln kann, von einem kleinen Abschnitt des Objekts und zur Richtung dieses empfangenen Lichtes auf einen oder mehrere Detektoren,

Mittel zur Abtastung des Objekts mit dem fokussieren Licht,

Mittel zum Speichern des Ausgangssignals des oder der Detektoren, um eine Bildwiedergabe des abgetasteten Objekts zu schaffen, gekennzeichnet durch ein oder mehrere optische Verarbeitungselemente, die das Licht von dem zweiten Linsensystem empfangen und dieses dem Nachweis durch den oder die Detektoren optisch verarbeiten.

2. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daO das oder die optischen Verarbeitungselemente entweder eine Phasen- oder eine Amplitudengewichtung oder beides aufweisen.

3. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sich sowohl die Phasen- als auch die Amplitudengewichtung auf einer einteiligen optischen Verarbeitungsplatte befinden.

4. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Verarbeitungsplatte durch eine erste und eine zweite Platte gebildet wird, die miteinander verbunden sind, wobei die erste Platte eine Phasengewichtung und die zweite Platte eine Amplitudengewichtung hat.

5. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Verarbeitungsplatte eine optische Übertragungsfunktion m(x, y) hat, die gleich cos(27T Nx/ X).cos(2T Ny/A ) ist, wobei N die numerische Apertur des ersten und zweiten Linsensystems und 7v. die Wellenlänge ist.

6. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Verarbeitungsplatte eine optische übertragungsfunktion m(x, y) hat, die
gleich sign(cos(2 Jf Nx/ K )).sign(cos(21T Ny/ Λ·)) ist, wobei N die numerische Apertur des ersten und zweiten Linsensystems und Λ. die Wellenlänge ist.

7. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine zusätzliche Linse zwischen der optischen Verarbeitungsplatte und einer Lochblendenapertur angeordnet ist.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen