DD294970A5 - Verfahren zur Herstellung von rekombinanten p24-core-Proteinen des HIV-1aus Escherichia coli - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von rekombinanten p24-core-Proteinen des HIV-1aus Escherichia coliInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter p24-core-Proteine des HIV-1 aus E. coli unter Verwendung des pR-Promotors des Bakteriophagen Lambda. Mit Hilfe neu konstruierter Expressionsplasmide, welche aus dem p24-Subklon pASp24 (IMET 11465) hervorgehen, werden rp24-Proteine in loeslicher Form ohne hydrophoben C-terminalen Abschnitt aus induzierter Biomasse gewonnen, indem rp24-haltige Inklusionen isoliert, angereichert und durch De- und Renaturierung in eine loesliche Form ueberfuehrt werden. Das Anwendungsgebiet der Erfindung sind die Gentechnik und die medizinische Diagnostik.{HIV-1; Proteine; rekombinante p24-core-Proteine; E. coli; pR-Promotor; p24-Subklon pASp24 (IMET 11465); Expressionsplasmide; Inklusionen; Denaturierung; Renaturierung; Gentechnik; Medizin; Diagnostik}
Description
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Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten ρ 24-core-Proteinen des Humanen Immundefizenz-Virus Typ 1 (HIV-1) in gentechnologisch manipulierten Wirtsstämmen von Escherichia coli.
Unter dem Begriff „p24-Proteine von HIV-1" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindungsbeschreibung Derivate des authentischen ρ 24-core-Proteins von HIV-1 verstanden, welche 77% des natürlichen ρ 24 umfassen, die bekannten immunogenen Domänen beinhalten, in E.coli gut exprimierbar sind und wahlweise mit einem kurzen, 23 Aminosäure umfassenden, bakteriellen Fusionsanteil oder durch Ausnutzung des Translationskopplungseffektes als nicht mit bakteriellen Anteilen fusionierte rekombinante ρ 24-Antigene exprimiert werden können.
Die verfahrensgemäß herstellbaren Produkte werden für die Entwicklung von HIV-1-Diagnostika, speziell p24-Antigen- und anti-p24-Antikörperkonsumtionstesten, für die Untersuchung der immunmodulatorischen Eigenschaften von p24 sowie für die Erzeugung von anti-p 24 Hyperimmunseren und monoklonalen Antikörpern eingesetzt. Die Erfindung wird in der Gentechnologie und in der medizinischen Diagnostik angewendet.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Mit Zuordnung der humanen immunsuppressiven Viren HIV-1 und HIV-2 als ursächliche Faktoren des erworbenen Immunmangelsyndroms AIDS (aquired immunodeficiency syndrome) sind prinzipielle Möglichkeiten der diagnostischen Erfassung und Untersuchung von Virusträgern gegeben (Barre-Sinoussi, F.,et. al., Science 220 [1983] 868-870; Propovic, M., et al., Science 224 [1984] 479-480).
Die Hauptcore-Proteine von HIV-1 und HIV-2 weisen Strukturhomologien auf (Clavel, L, et al., Nature 324 [1986] 691-695). Kreuzreagierende Antikörper werden nach einer HIV-Infektion induziert. Damit ist über ein anti-p24 Antikörpernachweis sowohl die Erfassung einer Infektion mit HIV-1 als auch bedingt mit HIV-2 möglich (Zuger, A., et al., Ann. Intern. Med. [1986] 234-237). Größere Bedeutung hat ein anti-p24 Antikörpertest für die Prognose-Einschätzung der HIV-Infektion erlangt. Ein anti-p24 Antikörper-Abfall geht häufig der Entwicklung des Vollbildes von AIDS voraus (Paul. L-Z., J. Infect. Dis. 155 [1987] 626-629). Um die ρ 24-Antikörperantwort einschätzen zu können, sind in jüngster Zeit anti-p 24 Antikörperkonsumtionsteste entwickelt worden (Abbott laboratories). Eine Immunantwort gegen p24 läßt sich frühzeitig nach Infektion im Westernblot gegen p24 nachweisen, die Spezifität hinsichtlich HIV muß allerdings, z. B. durch Blockierungsversuche, abgeklärt werden (Goudsmit, et al., The Lancet Il [1986] 177-180). Des weiteren spielt der p24-Antigentest eine große Rolle zum Nachweis einer Frühphase der HIV-Infektion, der HIV-Infektion von Neugeborenen, wobei die Virusproduktion nach Kokultivierung von Patientenlymphozyten mit HIV-permissiven Zellinien oder Nabelschnurlymphozyten quantifiziert wird (Ho, D., et al., N. Engl. J. Med. 321 [1989] 1621-165). Dazu wird rekombinantes ρ 24 sowohl zur Erzeugung hochaffiner Antikörper als auch als Standard benötigt.
Das core-Protein ρ24 von HIV bildet die Hülle der kegelförmigen Virus-core-Struktur (Gelderblom, H. R., et al.. Virology [1987] 171-176) und zählt neben den Hüllproteinen gp41 und gp120zu den diagnostischen relevanten Strukturproteinen. Obwohl Verfahren existieren, die eine Gewinnung von core-Proteinen aus HIV-1, insbesondere solcher mit nativen Eigenschaften auf natürlichem Wege aus Viruslysat mit nachfolgender Trennung und Reinigung der unterschiedlichen Virusproteine gestatten (EP 154499 [1984] US 584658; EP 181 374 [1984] US 602945, 635610, 643715), sind diese Verfahren für die o.g. Anwendungsgebiete nur bedingt, teilweise jedoch gar nicht geeignet (Hoxie et al., Human Immunology 18 [1987], 39-52; Chrystie,J.L.,&Almeida,J.J.Med. Virol. [1989] 188-195; EP 199301 [1986] US 725 b021; EP 185444 [1985] US 659339). Weitere wesentliche Nachteile der Gewinnung von HIV-1-Virusproteinen, und so auch von p24, auf der Grundlage von Virusisolationen, beispielsweise aus infizierten Zellkulturen, sind das Infektionsrisiko für Beschäftigte in Labor- und Produktionseinrichtungen, der vergleichsweise hohe Kostenaufwand für die Zellzucht sowie niedrige Ausbeuten der einzelnen Proteinspezies aus dem Virusisolat (EP 181150 [1985] US 667501; CDC Update, Münchner Med. Wochenschr. 36 [1987] 285-289). Diese Schwierigkeiten bei der Gewinnung von ρ 24 aus Viruslysaten werden durch Expression von ρ 24-kodierender DNA-Sequenzen in verschiedenen Wirtsorganismen vermieden (EP 173529[1985],US 643306,EP 187041 [1985],US 685272).Mittels gentechnologischer Verfahren ist es gelungen, rekombinante p24-Proteine, bzw. Derivate davon, d.h. Abschnitte von ρ24 oder Fusionsproteine von p24, mit bakteriellen, eukaryotischen oder HIV-1-Proteinanteilen in prokaryotischen (E.coli) (Windheuser, M.G., et al., J. Virol. 63 [1989] 4064-4068) und eukaryotischen (Hefe-, Insekten- und Säugerzellen) (Gheysen, D., et. al.. Cell 59 [1989] 103-112; Jacobs, E., et al., Gene 79 [1989] 71-81; Rautmann, G., et al., AIDS-Res. Hum. Retrovisuses 5 [1989] 147-157) zu exprimieren. Für die Gewinnung von p24-Antigen ist die Expression solcher HIV-1-Genabschnitte in eukaryotischen Wirtszellen keine zwingende Notwendigkeit. Im Unterschied zu den hochglykosylierten Hüllproteinen gp 120 und gp41 von HIV-1 tritt bei den Kernproteinen keine Glykosylierung auf. Weitere posttranslationale Modifizierungen, wie z. B. N-terminale Myristilierung, betreffen nur das Kernprotein p17 (Gowda, S. D., et al.. The J. of Biol. Chem. 264 [1989] 8459-8462). Eine Phosphorylierung von ρ 24 im Verlauf der Prozessierung des core-Präkursors ρ 55 wurde beschrieben (Laurent, A. G., et al., J. Virol. 63 [1989] 4074-4078), scheint aber für die immunologischen Eigenschaften von p24 nicht von Bedeutung zu sein.
Die Expression von p24 in genetisch manipulierten prokaryotischen Wirten wurde bereits mehrfach beschrieben (Mc Reedy, B. J., et al., J. Cell. Biochem. 282 [1989]; Lenz et al., Klin. Wochenschr. 68 [1987] 1042-1047; Motz; M., et al., AIFO 1 [1988] 10-17). Wesentliche Nachteile dabei sind, daß für die Darstellung solcher rekombinanter Antigene mit hohen, für preparative Isolation und Reinigung geeigneten Ausbeuten nur Fusionsvarianten beschrieben werden, in der Regel N-terminal mit bakteriellen Proteinsequenzen und C-terminal mit piS-Abschnitten von HIV-1 (Ellinger,S.,et al., J. Clin. Microbiol. 27 [1989] 971-976). DerpiS-Genbereich kodiert für die stark basischen HIV-1-Kernproteine ρ 7 und ρ 9, welche an der Bildung des ribonukleären Proteinkomplexes des reifen Viruspartikels beteiligt sind (Mervis, R. J., et al., J. of Virol. 62 [1988] 3642-3646). Entsprechende Hybridproteine mit ρ 15-Anteilen zeichnen sich durch einen allgemein basischen Charakter aus, was für die Isolierung und Reinigung solcher Antigene von Nachteil ist.
Weiterhin tritt bei Verwendung von nicht vollständig regulierbaren Promotoren eine vorzeitige oder sogar konstitutive Expression der jeweiligen rekombinanten Produkte aus, die im Verlauf der Fermentierung der wirtsseitigen Proteolyse ausgesetzt sind und/oder das Wachstumsverhalten der transformierten Wirtszelle negativ beeinflussen.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung verfolgt das Ziel, rekombinante p24-Proteine von HIV-1 mit vorteilhaften immunogenen Eigenschaften in hohen Ausbeute und mit ökonomisch vertretbarem Aufwand aus E.coli zu gewinnen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gentechnisch mikrobiologisches Verfahren zu entwickeln, mit dem durch Konstruktion neuer Expressionsvektoren für E.coli rekombinante (r) p24-core-Proteine von HIV-1 mit sehr kurzen oder durch Ausnutzung des Translationskopplungseffektes ohne bakterielle Fusionsanteile exprimiert und nach Isolierung aus dem Expressionswirt in eine lösliche, für die chromatographische Reinigung geeignete Form überführt werden können.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß lösliche rp24-Proteine von HIV-1 mit den hauptimmunogenen Epitopen in hoher Ausbeute aus E. coli unter Verwendung eines transkriptionsstarken und effizient regulierbaren Promotors, vorzugsweise des pR-Promotors des Bakteriophagen Lambda, gewonnen werden, wobei unter wahlweiser Ausnutzung des Transkriptionskopplungseffektes rp24-Proteine ohne hydrophoben C-terminalen Abschnitt in ausgewählten E.coli-Wirten exprimiert werden.
Im Rahmen des vorliegenden Verfahrens entsprechen die für das p24-core-Protein kodierenden Sequenzen dem HIV-1-Provirusgenom HTLVIIIB (ВНЮ-КІоп) (Ratner, L. et al.. Nature 313 [1985] 277-284). Als p24-Subklon wird das Plasmid pASp24 konstruiert, welches den 565bp Pvull-Hindlll-Abschnitt von Nukleotid 677 bisNukleotid 1242 des gag-Gens umfaßt.
Weiterhin enthält diese Konstruktion am З'-Ende der p24-Sequenz einen aus dem Expressionsvektor pEX2 (Stanley, K. K., & Luyio, J. P., The EMBO-J. 3 [1984] 1429-134) stammenden Linker mit 3 Translationsstopkodonen in jeweils überlappenden Leserahmen. Diep24-Region ist so in den Polylinker des KlonierungsvektorspUC18 (Viera, J. & Messing, J., Gene 19 [1982] 259-263) eingefügt, daß die p24-Kassette durch unikale Restriktionsorte am 3'- und am 5'-Ende flankiert ist und dadurch zusammen und den Translationsstopsignalen vorteilhaft in andere Expressionsvektoren umgesetzt werden kann.
Für die Belange des vorliegenden Verfahrens wird dieser p24-Subklon aus den entsprechenden Transformanten des E. coli-Stammes DH 5 bereitgestellt (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166 [19831 557-580). Eine biologisch reine Probe des Stammes DH5:pASp24 ist in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, Beutenbergstraße 11, Jena 6900, DDR unter der Registriernummer IMET 11465 deponiert worden.
Das Plasmid pASp24 ermöglicht auch die Expression eines p24-Proteins unter Kontrolle des lac-Promotors des pUC-Ausgangsvektors. Dabei wird ein Hybridprotein mit einem berechneten Molekulargewicht von 22 kD gebildet, welches aus 5 N-terminalen Aminosäuren der ß-Galaktosidase, 13C-terminalen Aminosäuren des HIV-1 Kernproteins p17 und 177 Aminosäuren von ρ24 besteht.
Dieses rekombinante p24-Protein wird mit niedriger Syntheserate als zum Teil unlösliches Produkt in den mit IPTG (Isopropylthiogalaktosid) chemisch induzierten Wirtszellen gebildet.
Eine Erhöhung der Expressionsrate erfolgt durch Umsetzung der p24-Kassette in Expressionsvektoren, welche den transkriptionstarken und effizient regulierbaren pR-Promotor des Bakteriophagen Lambda enthalten.
Basierend auf dem p24-Subklon pASp 24 werden in einem weiteren Schritt der Erfindung unter Anwendung von Standardmethoden der DNA-Rekombinanten 3 Expressionsplasmide konstruiert, welche die Ausprägung der ρ 17-p24-Fusionssequenz unter Kontrolle des pR-Promotors in den transformierten Rezipientenstämmen ermöglichen. Als Ausgangsvektor für diese Kontruktionen dient der PR-Translationskopplungsvektor pTiS1 DT(Skiba et al., Biol. membr. 7 [1990] in press), welcher als Expressionskassette folgende Sequenzanordnung beinhaltet:
5' ++ cl857-Repressorgan ++ PR-Promotor-Operator-Region ++ ATG-Startkodon ++ kodierende Sequenz für 22 Aminosäuren des cro-Proteins von Lambda ++ Linker aus: TAA-Stopkoden, SD-Sequenz, einem zweiten ATG-Startkodon und dem Polylinkerbereich mit den unikalen Restriktionsorten EcoR I; Sst I; kpn I; Sma I; BamH I; Xba I; Sal I und Pstl ++ eine Tandemanordnung von zwei Transkriptionsterminatoren ++ 3'
Die p24-Kassette wird aus dem Plasmid pASp 24 als 610bp großes EcoRI-Xbal-Fragment in den Translationskopplungsvektor pTiS 1 DT Moniert und wird erfindungsgemäß ohne bakteriellen Fusionsanteil in den jeweils transformierten Wirtsstämmen exprimiert. Das konstruierte Plasmid pTXp24 wird mittels Plasmidanalyse und Expressionsstudie des rp24-Antigens charakterisiert. Die Transkription der künstlichen polycistronischen mRNA führt dazu, daß die Translation der natürlichen PR-cro-Anordnung nach 22 Aminosäuren von его terminiert und unmittelbar am zweiten ATG vor dem Polylinker reinitiiert wird. Erfindungsgemäß sind dadurch der p17-p24-Hybridsequenz N-terminal der N-Formyl-methionin-Rest sowie die durch den Polylinker kodierten Aminosäuren Asparagin und Alanin vorgelagert.
Da die Expressionsrate von der Effizienz der Translationskopplung beeinflußt wird, kann durch Variierung des Abstandes zwischen TAA-Stop und zweitem ATG-Startkodon eine Ausbeutesteigerung des rekombinanten p24-Antigens erzielt werden. Der Erfindung entsprechend wird eine Verschiebung im Leserahmen dadurch erreicht, daß der unikale BgI Il-Ort im Plasmid pTXp24nach Bglll-Linearisierung mittels Klenow-Enzym (Jacobson, H. et al., Eur. J. of Biochem.45 [1974] 623-627) und den Desoxynukleotiden (dATP, dTTP, dCTP und dGTP) aufgefüllt und nachfolgend durch Rezirkulation wieder geschlossen wird. Der Abstand zwischen dem TAA-Stop und dem ATG-Startkodon besteht in dem so konstruierten Plasmid nur noch aus 2 Basenpaaren:
5'... AAA GAT CGA TCT ATA AGG TTT TAA AT ATG...3' (Bglll/Klenow)
Bedingt durch die so entstandene Leserahmenverschiebung schließen sich den 21 Aminosäuren von его die 6 Aminosäuren Arginin, Serin, Isoleuzin, Arginin, Arginin und Phenylalanin an.
In einem weiteren Schritt der Erfindung wird durch Ausschalten des Translationskopplungseffektes eine direkte Fusion von его mit der ρ 17-p24-Hybridsequenz erreicht.
Eine Anpassung beider Genabschnitte im Leserahmen wird erfindungsgemäß dadurch erzielt, daß der unikale BgI Il-Ort des Plasmides pTXp 24 geöffnet und mit Klenow-Enzym sowie Desoxynukleotiden aufgefüllt wird. Gleichzeitig werden nach Spaltung mit EcoR I die 5'-überhängenden Enden mit S1 -Nuklease (Vogt, V. M., Methods Enyzmol. 65 [1980] 248-254) abverdaut.
Nach Rezirkulation durch blunt end-Ligation wird ein so konstruiertes Plasmid pTXp24cro durch immunologische Charakterisierung der Transformanten des Ligationsgemisches ermittelt und anschließend auf Expression eines cro-p24-Hybridproteins mit folgender Fusionsanordnung getestet:
GIu Gin Arg lie Thr Leu Lys Asp 5 ... ATG GAA CAA CGC ATA ACC CTG AAA GAT
CITO ~ ~~
Tyr AIa Met Arg Phe GIy GIn Thr Lys TAT GCA ATG CGC TTT GGG CAA ACC AAG
его
Thr Ala Lys Asp Asp
АСА GCT AAA GAT CCT GAC... 3'
его -- РІ7--
Nach Induktion des pp-Promotors wird in рТХрг^ісго-Тгапэ^ігтапіеп ein cro-p17-p24-Fusionsprotein mit einem berechneten Molekulargewicht von 23,8kD gebildet.
Die erfindungsgemäß konstruierten Plasmide pTXp24, pTXp24Bgl und pTXp24cro ermöglichen unter Kontrolle des pR-Promotors die Expression eines für 12 C-terminale Aminosäuren von ρ 17 sowie für 177 Aminosäuren von ρ24 kodierenden Abschnitts der HIV-1-gag-Region.
Die der Erfindung zugrunde liegende Klonierungsvariante schließt die Expression der vollständigen p24-Sequenz aus. Dies bewirkt, daß die 54 Aminosäuren des C-Terminus von p24bzw. die 68 C-terminalen Aminosäuren von p25 nicht mit in dem rekombinanten ρ 24-Antigen enthalten sind. Dieser C-terminale Bereich des natürlichen p24-core-Proteins von HIV-1 enthält hauptsächlich hydrophobe Aminosäurereste, was für die Exprimierbarkeit in E.coli allgemein von Nachteil sein kann.
Die rekombinanten Expressionsplasmide werden in dem vorliegenden Verfahren in verschiedene E.coli-Wirtsstämme, vorzugsweise in die Stämme DH5, TG1 (Focus 6 [1984] 4-7), LE (Shilhavy, T. J., et al., [1984] Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harb. Lab. N. Y. 156-165) und MC 1061 Lambda (Bottermann, J., &Zabeau, M., Nucl. Acid Res. 13 [1985] 3823-3829) transformiert. Die erhaltenen Transformanten werden auf die Synthese von entsprechenden rekombinanten p24-Proteinen untersucht. Von Vorteil ist dabei die plasmidale Kodierung des cl857-Repressorproteins, was den Erhalt dieser Plasmide unter reprimierten Bedingungen auch in nicht lysogenen E.coli-Stämmen garantiert.
Verfahrensgemäß wird dazu ein jeweils transformierter E.coli-Stamm in einem Vollmedium mit Antibiotikazusatz zunächst bei einer Temperatur von 28°C, unter möglichst optimalen physiologischen Wachstumsbedingungen bis zum Erreichen einer mittleren Zelldichte, vorzugsweise bis zur Mitte der logarithmischen Wachstumsphase kultiviert. Nachfolgend wird erfindungsgemäß durch rasche Erhöhung der Kultivierungstemperatur auf 42°C eine Inaktivierung derthermolabilen el 857-Repressormoleküle und bedingt dadurch eine Induktion der pR-Promotor-gesteuerten Expression der p24-Proteine erreicht.
Infolge der schnellen Synthese und/oder durch physikochemische Eigenschaften der rp24-Proteine bedingt, kommt es im Verlauf der Induktion zu einer Akkumulation der Expressionsprodukte in Form von unlöslichen rp24-Aggregaten in den Wirtszellen, wahrscheinlich als Einschlußkörper (Inklusionen).
Im Ergebnis dieses Verhaltens der Expressionsprodukte wird in der vorliegenden Erfindung eine schnelle und einfache Anreicherung des jeweiligen rekombinanten Produktes ermöglicht.
Dazu wird erfindungsgemäß nach zweimaliger Induktionszeit von je 90 Minuten bei 42°C und nachfolgend bei 370C die Kultivierung durch Abkühlen auf 00C abgebrochen. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert, in isotonem Puffer gewaschen und mittels an sich bekannter Zellaufschlußverfahren, vorzugsweise durch Verwendung von Lysozym und durch Ultraschallbehandlung, aufgeschlossen.
Die Isolierung und Anreicherung der unlöslichen rp24-Aggregate aus dem Zellysat erfolgt in einem weiteren Verfahrensschritt durch Zentrifugation der lysierten Biomasse. Anschließend erfolgt eine vollständige Denaturierung des so erhaltenen Pellets, vorzugsweise mittels 8M Harnstoff. Durch Ultrazentrifugation der Harnstofflösung, vorzugsweise für 30 Minuten bei 50000U/ min, werden E.coli-Zellproteinaggregate abgetrennt. Die Renaturierung der rp24-haltigen Harnstofflösung wird durch schrittweise Dialyse, vorzugsweise gegen einen Phosphat-, EDTA-, NaCI-Puffer, erreicht. Mit dieser der Erfindung zugrunde liegenden De- und Renaturierungsmethode kann lösliches rp24-Antigen erhalten und im Falle der Konstruktion pTXp24cro auf 14% und im Falle der Konstruktion pTXp24Bgl auf 4,7% angereichert werden. Die erfindungsgemäß angereicherten löslichen rp24-Proteine sind immunologisch reaktiv mit den anti-p24-Maus-monoklonalen Antikörpern „411/F6" und „13/5" (Grunow, R., et al., Z. KNn. Med. 45 [1990] 367-369) sowie mit anti-HIV-1-antikörperhaltigem Humanserum.
Erfindungsgemäß werden für die Erzeugung der so aufzuarbeitenden Biomasse Transformanten von lon- und htpr-mutierten E.coli-Stämme (Mizusawa, S., Gottesmann, S.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 [1983] 558-562), vorzugsweise der Stamm AG 29 eingesetzt. Solche E.coli-Wirtsstämme sind durch einen erniedrigten Gehalt an temperaturinduzierbaren Proteasen gekennzeichnet, vor allem an der Protease La (David,T., et al.,The J. Biol. Chem. 263 [1988] 11718-11728), welche auch bevorzugt heterologe und damit rekombinante Expressionsprodukte proteolytisch abbaut.
Die mit den beschriebenen Verfahrensschritten erhaltenen rp24-Proteine sind in löslicher Form stabil und können nachfolgend chromatographischen Reinigungsverfahren unterzogen werden.
Ausf Uhrungsbeispiele
In den folgenden Ausführungsbeispielen werden bekannte und bereits einschlägig beschriebene gentechnologische Methoden, wie Isolation und Reinigung von Plasmid-DNA, Spaltung von DNA-Molekülen mit Restriktionsendonukleasen und Separierung von DNA-Fragmenten mittels Agaroseelektrophorese, Verknüpfung von DNA-Fragmenten mit T4-Ligase und Transformation von Ligationsgemischen oder Plasmid-DNA in kompetente E. coli-Zellen sowie Schaffung von glatten Enden durch Auffüllen mit Klenow-Enzym oder durch Abverdauung mit SVNuklease nach MANIATIS et al., (Maniatis, T.; Fritsch, E.F., und Sambrook, J., [1982], „Molecular cloning". Cold Spring Harbour Laboratory, New York), durchgeführt.
Konstruktion des p24-Subklones pASp24:
Aus dem HIV-1 Provirusgenom des BH10-Klons (Ratner, L., et al.. Nature 313 Ц985] 277-284) wurde eine 564bp großes Pvull-Hind Ill-Fragment (Nukleotid 677 bis Nukleotid 1242) isoliert und zusammen mit dem 60bp großen Hindlll-Xbal-Linkerfragment des Expressionsvektores pEX2 (Stanley, K. K., & Lucia, J. P., The EMBO J. 3 [1984] 1429-134) sowie dem linearisierten Vektor pUC 18 (Viera, J., & Messing, J., Gene 19 [1982] 259-263) ligiert, welcher zuvor mit EcoR I linearisiert, mit Klenow-Enzym und Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTPs) aufgefüllt und mitXbal gespalten wurde (Abb.1). Die Transformation des Ligationsgemisches erfolgte in den E.coli-Stamm DH 5. Auf Grund der Ligation zwischen den blunt-Enden von EcoRI/Klenow und Pvull rekonstituiert sich ein EcoRI-Ortam 5'-Ende derp24-Kassette. Ein rekombinanter Klon mit der Bezeichnung pASp24 (IMET 11465) wurde mittels Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA identifiziert. Weiterhin wurde durch Induktion einer Kultur von DH5:pASp24 mit 0,2 mM Isopropylthiogalaktosid (IPTG) eine Expression der Fusionsanordnung von 5 Aminosäuren (AS) ß-Galaktosidase, 13AS von ρ 17 und 177AS ρ 24 erreicht. Im Immunoblot mit dem anti-p24 Maus monoklonalen Antikörper „ 13/5"-POD-Konjugat war sowohl in den löslichen wie auch in der unlöslichen Zellenaufschlußfraktion bei 22 KD ein immunologisch reaktives rp24-Protein nachweisbar (Abb.2).
Konstruktion des Expressionsplasmides pTXp24:
Aus dem p24-Subklon pASp24 wurde die 620bp große EcoRI-Xbal-Kassette der p24-Sequenz isoliert und in den ebenfalls EcoR l-Xbal-gespaltenen Vektor pTiS1 DT(Skiba et al., Biol. membr. 7 [1990] in press.) ligiert und in den Stamm DH 5 transformiert. Die Identifizierung eines rekombinanten Klones pTXp24 erfolgte über Plasmidanalyse.
Die Expression der 22KD großen N-Formyl-Methionin-Asparagin-Alanin-p17-p24-Hybridsequenz erfolgte nach Induktion des pR-Promotors mit niedriger Syntheserate.
Konstruktion des Expressionsplasmides pTXp24Bgl:
Das Expressionsplasmid pTXp24 wird nach Linearisierung mit BgI Il und Auffüllen der überhängenden Enden mit Klenow-Enzym und dNTPs wieder rezirkularisiert und in den Stamm DH 5 transformiert. Ein rekombinanter Klon mit der Bezeichnung pTXp 24 BgI wurde durch Restriktionsanalyse und immunchemische Analyse der Expressionsprodukte identifiziert. Auf Grund der so erzielten Leserasterverschiebung liegt das TAA-Stopkodon von его in einem Abstand von 2 bp vor dem ATG-Startkodon der ρ 24 Sequenz. Dadurch wurde eine nachweisbare Erhöhung der Expressionsrate erreicht. Nach Induktion des pR-Promotors wird ein immunologisch reaktives Protein bei 21 KD gebildet (Abb.3).
Konstruktion des Expressionsplasmides pTXp24cro:
Die DNA von pTXp24/Bgl Il/Klenow wurde weiterhin mit EcoR I gespalten, anschließend mit S1 -Nuklease behandelt, durch blunt end Ligation rezirkularisiert und in den Stamm DH5 transformiert. Mittels immunologischer Charakterisierung der Transformanten konnte ein rekombinanter Klon pTXp24cro identifiziert werden. Nach Induktion des pR-Promotors war ein rp24-Expressionsprodukt bei 24KD mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Immunoblot nachweisbar (Abb.3 und Abb. 4).
Herstellung induzierter Biomasse mit rp24-lnklusionen:
Die Expressionsplasmide pTXp24Bgl und pTXp24cro wurden in den htpr-lon-mutierten E.coli-Stamm AG29 transformiert und als Glycerolkonserven (750μΙ einer stationären Kultur mit 250μΙ Glycerol gemischt) bei -70°C gelagert. 0,5L NS-Medium (12g bactotryptone. Difco; 24g yeast extract; Difco in 900 ml A.dest mit 2,3g KH2PO4; 12,5g K2HPO4Jn 100 ml A.dest und 4ml Glycerin) mit 100μg/ml Ampicillin wurden in 1 ml einer Giycerolkonserve angeimpft und im Schüttelkolben bei 28°C bis zum Erreichen einer optischen Dichte von OD550 =1,5 (ca. 14 Stunden) kultiviert. Die Induktion der PR-Promotor gesteuerte Genexpression erfolgte durch Zugabe von 0,5L LB-Medium (5g bactotryptone, 10g yeast extract, 10g NaCI in 1 L A.dest) mit 100цд/тІ Ampicillin, was zuvor auf 55°C erwärmt wurde, unter induzierten Bedingungen für 90 Minuten bei 42°C und anschließend für 90 Minuten bei37°C.
Nach Abkühlen auf 00C und Zentrifugation für 45 Minuten bei 3500rpm (K80mlw, DDR) wurde das Zellpellet bei -200C eingefroren. Nach wiederauftauen wurden die Zellen in 50ml TES-Puffer (5OmM Tris/HCL pH7,4; 2mM EDTA; 1 % Glukose) mit 60mg Lysozym, 50μ11 M MgCI2; 1 mg DNase und 200μΙ 0,5M PMSF suspendiert und unter vorsichtigem Rühren für 30 Minuten im Eisbad inkubiert. Anschließend erfolgte eine Ultraschallbehandlung für 3mal 30 Sekunden bei 40 W mit je 90 Sekunden Pause unter Eiskühlung. Die rp24haltigen Inklusionen wurden aus dem Zellysat durch Zentrifugation für eine Stunde bei 20000rpm (CentrikonT-124, Kontron Instruments) abgetrennt. Das Pellet wurde anschließend in 10ml PBS (0,01 M Natriumphosphatpuffer pH7,2; 15OmM NaCI) resuspendiert und in Fraktionen von 1 ml bei —20°C eingefroren. Zur Denaturierung des unlöslichen Proteingemisches wurde 1 ml der Suspension mit 480 mg Harnstoff versetzt und bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Rühren gelöst. Eine Abtrennung von unlöslichen, hauptsächlich E.coli-Proteinen einer Größe von 40 bis 50KD wurde durch Ultrazentrifugationfür30 Minuten bei 50000rpm (TL 100, Beckmann USA) erzielt. Anschließend erfolgte unter Rührung die Zugabe von 9ml eines Dialyse-Puffers (5OmM Natriumphosphat pH7,5; 1OmM; EDTA; 30OmM NaCI). Eine weitere Renaturierung und vollständige Abtrennung des Harnstoffs wurde durch Dialyse bei 40C gegen Dialyse-Puffer erreicht. Das Dialysat wurde anschließend für 30 Minuten bei 50000rpm (TL100) zentrifugiert. Lösliche
rp24-Proteine wurden im Fall der pTXp24Bgl-Transformante auf 55pg/ml (= 4,7% des Gesamtproteins) und im Falle der pTXp24cro-Transformante auf 200мд/тІ (= 14% des Gesamtproteins) angereichert (Abb.4). Die p24-Antigenkonzentration wurde anhand eines p24-Antigenassay wie folgt bestimmt:
Ein gereinigter (Reinheit 95%) muriner monoklonaler anti-p24 Antikörper der Epitopspezifität ETINEEAAETDRVHP wurde als Festphasenantikörper in die wells von Polystyrenmikrotestplatten inkubiert. Die Adsorbtion erfolgte bei Raumtemperatur in einer Konzentration von 10mg/l eines 0,1 mol/l Carbonatpuffers, pH9,5. Das Reaktionsvolumen pro Well betrug 100μΙ. Nach 17-20 Stunden wurden die Mikrotestplatten dreimal mit PST (0,01 mol/l Phosphatpuffer, pH7,4; 0,3mol/l NaCI; 0,1 % (V/V) Tween 20) gewaschen. Die zu bestimmenden Proben und ein im Test mitgeführter kommerzieller p24-Standard (Du Pont, USA) wurden mit einem Inkubationspuffer (PST, 10% [V/V] Schafserum) seriell verdünnt und jeweils 50μΙ pro well eingeführt. Zur simultanen Inkubation wurden 50μΙ eines POD-markierten murinen monoklonalen Antikörpers der Epitopspezifität PFRDYVDRFYK hinzugegeben. Die finale Konjugatkonzentration betrug 1,25mg/l. Die Inkubation des Reaktionsansatzes dauerte 4 Stunden bei 37°C. Danach wurden nichtgebundene Reaktanten durch fünfmaliges Waschen mit PST entfernt. Die sich anschließende Substratreaktion erfolgte durch Zugabe von 100μΙ 8,5mol/l oPD und 5,5mol/l H2O2 in 0,1 mol/l Citratpuffer pH 5,0 und wurde nach 30 Minuten durch Zugabe von 100μΙ 2 mol/l H2SO* mit 0,05 mol/l Natriumsulfit terminiert. Die Absorptionswerte wurden als Differenzbestimmung bei 492nm und 690nm in einem Vertikalphotometer (Labsystems, Helsinki, Finnland) gemessen. Die Quantifizierung des ρ 24 in den Probenverdünnungen erfolgte anhand der Eichkurve, welche aus den Absorptionswerten der Standardbestimmung resultierte.
Abbildungen:
19ЧЗЮ
О 1 2 3 U 5 6 7 8 9 10 kb
/ ι / ιιι ι ι\ίιΐ
Ps Hi
Xb Sq Ps Hi
| pASp2<V | 3,3 kb |
5;^AÄGATCTA]1^GGAGGTnTAAA|ÄTG|AATTC...3' ^_^
BgII SO Aha! EcoRI | pTXp24 |3,8kb]
BgII/ Klenow
Ps Hi
XbSaPs
pTXp2^cro 3,8 kb
Abb. l: Konstruktionsschema der Expressionsplasmide pASp24, OR/pR w pTXp24, pTXp24Bgl und pTXp24cro. cr0
1^= Pft-Promotor-Operatorregion; D = 6 bis 9 5'-terminale Kodone von его; £23 = lacZ-Genabschnitt; LJ= HIV-I Genabschnitt;
m—m = Polylinker; -лл/^л^^ Tandemanordnung von Transkriptionsterminatoren, / 3 TGA-Stopkodone; Ba = BamHI; Bg = BgIII; Ec EcoRI; Hi = Hindll: Kp = Kpnl; Ps = Pstl; Pv = PvuII; Sa = Sail; Ss = Sstl; Xb = Xbal; SD = Shine-Dalgarno-Sequenz;
134-910
α b
AbD. 2: Westernblot von DH5:pASp24, induziert mit 0,2 mM IPTG (a): unlösliche Zelltrümmer (ZT)-(b): lösliche Uberstand(UST)-Fraktion mit dem anti-p24 Maus monoklonalem Antikörper "13/5"-POD-Konjugat [0,5 /jg/ml]
Q b
KD
30
21 14
Wesiernblot von induzierter Biomasse aus
f. a ι und (с): DH5 :pTXp2 4Bgl(Ь) und (d): DH5:pTXp24cro mit den POD-Konjugaten der anti-p24 Maus monoklonalen Antikörper "13/5" i(a) und (b)] und "411/F6" Uc) und (ei) ] , je 0,5 /ug/ml.
Abb. 4: SDS-Folyamidgradientengel (10-15%; von Dialysat aus Biomasse AG29:pTXp24cro
!Die Bande bei 14 kD entspricht dem während der Aufarbeitung zugegebenen Lysozym)
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten (r) ρ 24 core-Proteinen des Humanen ImmundefizienzvirusTyp 1 (HIV-1) aus Escherichia coli unter Verwendung eines transkriptionsstarken und effizient regulierbaren Promotors, vorzugsweise des pR-Promotors des Bakteriophagen Lambda, dadurch gekennzeichnet, daß unter wahlweiser Ausnutzung des Translationskopplungseffektes mit Hilfe von neu konstruierten Expressionsplasmiden rp24-Proteine ohne hydrophoben C-terminalen Abschnitt in damit transformierten E. coli-Wirten exprimiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung der Expressionsplasmide ein p24-Subklon pASp24 (IMET 11465) derart konstruiert wird, daß ein 565bp großer Pvu Il-Hind III-Abschnittvon Nukleotid 677 bisNukleotid 1242 des gag-Genes zusammen mit einer Linkersequenz, bestehend aus drei Translationsstopkodonen, als EcoR I-Xba I-Fragment in den Polylinker eines pUC-Klonierungsvektors eingefügt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Expressionsplasmid der Bezeichnung pTXp 24 derart konstruiert wird, daß aus dem p24-Subklon pASp24ein610bp großes EcoR I-Xba I-Fragment mit der kodierenden Sequenz für 13 Aminosäuren von ρ 17 und 177 Aminosäuren von ρ 24 der HIV-1-Kernproteine in den Polylinker des Expressinsvektors pTiSi DT eingefügt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Expressionsplasmid pTXp24 durch eine Leserrasterverschiebung im cro-Abschnitt das Expressionsplasmid pTXp24Bgl mit einer auf 2 Basenpaare (bp) verkürzte Translationskopplungssequenz entsteht, indem nach Spaltung des unikalen Bglll-Ortes von pTXp24 dieser mit Klenow-Enzym und Desoxynukleotiden aufgefüllt und durch blunt end-Ligation wieder rezirkularisiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Expressionsplasmid pTXp24 durch Leserrasterfusion zwischen dem его- und dem p24-Abschnitt das Expressionsplasmid pTXp24cro dadurch entsteht, daß nach Spaltung des Plasmides mit den Enzym EcoRI eine S1-Nuklease-Behandlung erfolgt und anschließend wiederum mit BgIII gespalten, mit Klenow-Enzym aufgefüllt und durch blunt end-Ligation rezirkularisiert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionsplasmide pTXp24, pTXp24Bgl und pTXp24cro in einen lon- und hptr-doppelmutierten E.coli-Stamm AG29 transformiert und daraus entsprechende Produzentenstämme für Kultivierung und Fermentation gewonnen werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Biomasse aus den kultivierten Produzentenstämmen nach Induktion der durch den pR-Promotor gesteuerten rp24-Expression für 90 Minuten bei 42°C und nachfolgend für 90 Minuten bei 37°C gewonnen wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Biomasse rp24-haltige Inklusionen nach Zellaufschluß aus dem Zellysat isoliert und von den löslichen E.coli-Proteinen mittels Zentrifugation abgetrennt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 1, 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß aus den Inklusionen lösliche rp24-Proteine durch Denaturierung in 8molarer Harnstofflösung und nachfolgender Renaturierung mittels Dialyseschritte gegen Phosphatpuffer mit hoher NaCI-Konzentration sowie Abzentrifugation von unlöslichen E.coli-Proteinen angereichert werden.
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