DD292023A5 - Verfahren zur erhoehung der expression rekombinanter gene in escherichia coli - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein verbessertes gentechnisch-mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von rekombinanten DNS-Produkten in E. coli-Zellen - und zwar ein Verfahren jenes Grundtyps, in dem die Gene fuer die gewaehlten Proteine mit Hilfe von Plasmidvektoren in die Produzentenstaemme eingeschleust werden. Sie verfolgt das Ziel, in ausgewaehlten E. coli-Wirts-Vektor-Systemen die Leistung bei der Expression vorwiegend heterologer rekombinanter Gene wesentlich zu steigern. Die dieser Zielstellung zugeordnete technische Aufgabe wird geloest, indem Zellen eines herangezogenen E. coli-Stammes zunaechst jeweils mit einem neuen Expressionsplasmid transformiert werden, in welchem das gewaehlte Strukturgen (beispielsweise ein Interferon-Gen) der Kontrolle einer aus dem E. coli-Tryptophan-Promotor sowie einer vorgeschalteten sog. E. coli-cap-Sequenz aufgebauten Expressionseinheit unterworfen ist, und fuer die so transformierten E. coli-Zellen anschlieszend eine Fermentation unter Glucose-Mangelbedingungen erfolgt. Die Effizienz der vorgeschlagenen Methode wird an mehreren Beispielen demonstriert, die sich unter anderem auch hinsichtlich der Fermentationsart unterscheiden (kontinuierliche Fermentation; fed batch-Fermentation), in welchem die oben charakterisierten Mangelbedingungen realisiert werden.{Herstellung von rekombinanten DNS-Produkten in E. coli; Expression rekombinanter Gene; E. coli-Wirts-Vektor-Systeme; cap-Sequenz; cap-modifizierter Tryptophan-Promotor; Expressionseinheit; Fermentation unter Glucose-Mangelbedingungen}

Description

Hierzu 4 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein gentechnisch-mikrobiologisches Verfahren zu effektiveren Herstellung homologer und/oder heterologer DNS-Produkte (Proteine) in Escherlchia coil, wobei die Gone für die zu exprimierenden Proteine jeweils mittels Plasmidvektoren in die einbezogenen Produzentenstämme eingebracht werden.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in jenen Industriezweigen einer Volkswirtschaft, welche einen Biotechnologie-Sektore aufweisen, in dem auch gentechnisch modifizierte E.coll-Produzentenstämme genutzt werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

In E. coli-Wirts-Vektor-Systemen zur Expression sowohl von homologen als auch von heterologen Genen finden zahlreiche E.coli-Promotoren Verwendung, zu denen unter anderem gehören

- derTryptophanpromotor(trpPO),

- der Tryptophanpromotor mit Leader-Region (trpPOL),

- derLactosepromotorUV5(lacUV5),

- der Rekombinationspromotor recA,

- derTetracyclinpromotor (tet),

- der Arabinosepromotor für dia Gene B, A und D (araBAD),

- ein Promotor für rRNS-Synthese (rrnAP₂) sowie

- der ß-Lactamasepromotor (bla) ' (s.a. M.HIRANO, K.SHIGESADAu. M.IMAI |1987],Gene, 57,89-99).

In diesen Konstruktionen erwies sich der Promotor trpPO als derjenige mit der höchsten Promotorstärke; in dieser Hinsicht übertraf trpPO sogar die aus dem E. coli-Lambda-Phagengenom isolierten Promotoren Lambda-P_L und Lambda-P_R. Mit dem Ziel, in E.coli-Systemen noch weiter erhöhte Expressionsleistungen zu erreichen, wurden inzwischen durch Austausch der -35-Region und der -10-Region von natürlichen E.coli-Promotoren weiterhin zahlreiche Hybridvektoren hergestellt (s.a. RUSSELL, D. R. und BENNETT, G. N. [1982], Gene, 20,231-243). Aus dem systematischen Vergleich der Promotorstärken solcher Hybridkonstrukte mit denen ausgewählter natürlicher Promotoren ergab sich folgende Relation:

trp::lac > trpPO > trp::tet > lacUV5 > tet::lac > tet > lac::tet(up) > tet::trp > lac::trp = lac::tet,

wobei zwischen den Promotoren trp: :lac und trpPO auch nur ein unwesentlicher Niveauunterschied hinsichtlich der Promotorstärke vorhanden ist.

Mit anderen Worten: Nach wie vor erweist sich in E.coli der PromotortrpPO als solcher mit starker Expressionsleistung. Somit verwundert es nicht, daß im vergangenen Jahrzehnt

- dieser Promotor in sehr vielen Fällen mit homologen bzw. heterologen Genen zur Kombination trpPO-rDNS gekoppelt,

- diese Kombination trpPO-rDNS in Plasmidvektoren eingebaut und

- nach deren Transformation in Escherichla coil die Expression zur Herstellung der rekombinanten DNS-Produkte vorgenommen

worden ist (siehe hierzu u.a. DD-WP 250335; WINNACKER, E.L. 119851: Gene und Klone, VCH Winheim; ßUELL,

G. & PANAYOTATOS, N. [1986], in: Maximizing Gene Expression [Eds: REZNIKOFF, W. & GOLD, Ll, Butterworth; OLD,

R. W. & PRIMROSE, S. B. [1986), in: Principles of Gene Manipulation, Bl-.ckwell Sei, Publ.; GASSEN, H. G. et al [19881: Gentechnik, Fischer-Stuttgart). Hierbei erfolgte die Fermentation der transformierten E. coli-Zellen üblicherweise in diskontinuierlicher Kultur (batch-Verfahren; s.a. Patentschriften DD 159435, DD 2203J5, DD 240392, DE 3445517 und EP 170204).

Weiterhin ist aus der E.coll-Physiologie bekannt (PASTAN, I. & ADHYA, S. (1976), Bacteriol. Rev., 40, 527-551; ULl.MANN,

A. & DANCHIN, A. [19831,AdV-CyCLNuCl. Res., 15,1-53), daß unter Bedingungen von Glucosemangel cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) gebildet wird, welches mit dem Katabolit-Aktivator-Protein (CAP) in Wechselwirkung tritt. Der hierbei entstehende cAMP-CAP-Komplex bindet an die in der E. coli-DNS in der Umgebung von Promotoren ζ. Β. des Kohlehydrat- oder Zucker-Stoffwechsels vorhandene(n) sog. cap-Region(en) und stimuliert jeweils die Transkription (vgl.

NEIDHARDT, F.C, Editor in Chief, |1987|: Escherlchia coil and Salmonella typhlmurlum, Amer. Soc. for Microbiology, Washington D.C). Allerdings stellt sich diese Stimulationswirkung nur bei schwachen Promotoren der E.coll-DNS wie u.a. bei araBAD und lacPO, ein. Starke E. coli-Promotoren, z. B. ribosomale Promotoren oder der Promotor trpPo, weisen keine cap-Sequenzenauf.

Ziel der Erfindung _v

Die Erfindung verfolgt das Ziel, in ausgewählten Escherichta coll-Wirts-Vektor-Systemen bei der Expression von vorwiegend heterologen rekombinanten Genen wesentliche Leistungssteigerungen zu erreichen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gentechnisch-mikrobielles Verfahren zu beschreiben, mit dem in ausgewählten

E. coli-Wirts-Vektor-Systemen eine wesentliche Erhöhung der Expression von vorwiegend rekombinanten Genen erzielt werden

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug wie folgt gelöst:

Eingebettet in ein gentechnisch-mikrobiologisches Verfahren mit seinen an sich bekannten Teilschritten wie

- Konstruktion von rekombinanten Stammaterial (einschließlich Konservierung),

- Kultivierung solchen Stammaterials (biologische Prozeßstufe),

- Produktaufarbeitung (hier aus der Biomasse) einschließlich eventueller Reindarstellung)

werden Zellen des jeweils herangezogenen E.coll-Stammes mit einem solchen neuen rekombinanten Expressionsplasmid transformiert, in welchem das Strukturgen des zu synthetisierenden Proteins der Kontrolle einer aus dem E.coli-Tryptophan-Promotor sowie einer vorgeschalteten sogenannten t.coli-cap-Sequenz aufgebauten Expressionseinheit (Kurzwort: cap-trpPO-EE) unterworfen ist (Schritt 1). Die auf diese Weise erhaltenen transformierten E. coli-Zellen werden anschließend unter Glucosamangelbedingungen fermentiert (Schritt 2).

In seiner weiteren Ausgestaltung ist das vorliegende Verfahren nun zusätzlich dadurch gekennzeichnet, daß in seinem Schritt 1 jeweils ein rekombinantes E.coli-Expressionsplasmid des oben skizzierten Grundaufbaus verwendet wird, welches in seiner captrpPO-EE stromauf vom Tryptophan-Promotor (Kurzwort: trpPO) die cap-Sequenz des E.coli-Lactosepromotors (Kurzwort: cap(lacPO), d.h. die DNS-Teilsequenz

5^f-TAATGTGAGTTAGCTCACTCA-3^I,

enthält. Vorzugsweise wird in diesem Teilschritt ein solches rekombinantes E.coli-Expressionsplasmid vom voranstehend skizzierten Grundaufbau verwendet, in welchem die obige cap(lacPO)-Sequenz ausschließlich in einem Abstand von 15 Nucleotiden stromauf der -35-Region ds trpPO angeordnet ist (Kurzwort für diese spezifische Anordnung: cap(lacPO)-trpPO-EE). Nach der Maßgabe dieser Vorschrift sind unter anderem mit einem gentechnologischen Handling, welches jeweils an sich bekannte Operationen wie Isolierung sowie Reinigung von DNS-Fragmenten, Ligation von DNS-Fragmenten, Plasmid-Isolierung usw. bis hin zur Sequenzierung der jeweils veränderten Vektor-Region umfaßt, die neuen Expressionsplasmide pDR72Joap, welches das E.coli-Galaktokinase-Gen (Kurzwort: galk-Gen) unter der Kontrolle der voranstehend als

Vorzugsvariante gekennzeichneten cap(lacPO)-trpPO-EE enthält, und

pHRWöOOcap, welches die Sequenz für natives humanes Interferon aipha 1 unter der Kontrolle der cap(lacPO)-trpPO-EE enthält, konstruiert worden (s. a. Abb. 1).

Mit diesen neuen Expression?plasmiden wird dann in an sich bokannter Weise jeweils eine Population des Wirtsstammes E.coli TG1 transformiert. Auf diese Weise wurden die neuen Wirts-Vektor-Systeme

E.coliTGI (pDR720cap)und E.coli TG1 (pHRW500cap)

erhalten; diese sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW, Beutenbergstraße 11, Jena, 6900 unter den Registrierzeichen

IMET 11421 für E.coli (pDR720cap) und IMET i1419fürE.coli (pHRW500cap)

deponiert worden. (Bei gleicher Gelegenheit sind der genannten Stelle auch biologisch reine Proben von E. coli TG1 Populationen, die mit den Ausgangsplasmiden pDR720 bzw. pHRW500 transformiert worden waren, hinterlegt worden; diese Stämme, die im vorliegenden Verfahren zu Vergleichszwecken benötigt werden, erhielten die Registrierzeichen

IMET 11420fürE.coliTG1[pDR720] und IMET 11418 für E, coli TG1 [pHRWüOOj.

In der weiteren Verfahrensausgestaltung werden die beiden genannten E.coli-Wirts-Vektor-Systeme in einem Glucose-Mineralsalz-Medium unter Glucose-Mangelbedingungen fermentiert. Besonders vorteilhaft wird in diesem Schritt jenes Glucose-Mineralsalz-Medium mit den Komponenten

Kaliumdihydrogenphosphat, Diammoniumhydrogenphosphat,

Zitronensäure, AntaphronNM40,

Magnesiumsulfat,

Thiamin, Ampicillin,

Glucose sowie Spurenelementelösung,

ningesetzt, welches in Verbindung mit der Patentanmeldung zu einer früheren erfinderischen Lösung aus dem Zentralinstitut offenbart worden ist, (Die Spurenelementelösung enthält Kobaldchlorid, Manganchlorid, Kupferchlorid, Borsäure, Natrlummolybdat, Eisenzitrat und Zinkacetat)

Ein anderes Glucose-Mineralsatz-Medium bestand aus den Komponenten:

Kaliumhydrogenphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat,

Natriumchlorid, Ammoniumchlorid,

Natriumsulfat, Magnesiumchlorid,

Eisenchlorid, Manganchlorid,

Thiamin, Ampicilin, Glucose.

Die Fermentation jedes der o.g. E.coli-Wirts-Vektor-Systerne wird unter Glucose-Mangelbedingungen in einem Medium dieser Kennzeichnung hierbei sowohl in kontinuierlicher Kultur als auch in der fed-batch-Kultur durchgeführt. Erstere wird vorteilhaft in einer Chemostaten-Anordnung realisiert, in der die Verdünnungsrato D (in h"') als primärer Kontrollparameter der Relation 0 < D < Dc, vorzugsweise der Relation 0,08Cc < D < 0,5 D₀, folgt (Dc-sog. kritische Verdünnungsrate einer Chemostaten-Kultur, definiert gemäß W.CRUEGER, W. & CRUEGER, A., Biotechnologie-Lehrbuch d.angew. Mikrobiologie, München-Wien, 1989). Für die verfahrensgemäß bereitgestellten Wirts-Vektor-Systeme E.coli TG ί (pDR720cap) und E.coli TG1 (pHRW500cap) ergibt sich eine solche Relation von Rate D zu Rate Dc, daß sich der voranstellend offenbarte Bereich zu

0,03h"' <D<0,16h~'

konkretisiert (D_c = 0,32 h"¹). Unter Einhaltung dieser Vorschrift wird somit in einem Medium obiger Kennzeichnung mit Glucose als limitierender Kohlenstoffquelle die Chemostaten-Kultivierung durchgeführt.

Eine fed-batch-Kultivierung der genannten E.coli-Wirts-Vektor-Systeme wird in einem Nährmedium obiger Kennzeichnung nach anfänglich unlimitiertem Wachstum (d. h. bei einem Wachstum mit der spezifischen Wachstumsrate μ = μ_πΐχ) unter Glucose-Mangelbedingungen in solchen Regimes weitergeführt, in denen die spezifische Wachstumrate μ (in h'') als primärer Kontrollparameter der Relation 0 <μ < p_max, vorzugsweise der Relation

0,08μ_πιω<μ<0,5μ_π,,_)<,

folgt (μ™.,- sog. maximale spezifische Wachstumsrate einer fed-batch-Kultur, definiert gemäß STANBURY, P. F. & WHITAKER, A. [1984], Pergamon Press). Hierbei wird jeweils mit der anfänglich in das Nährmedium eingebrachten Glucose-Menge determiniert, wie lange der durch unlimitiertes Wachstum charakterisierte Startabschnitt in den einzelnen Fermentationsläufen beibehalten wird.

Für die vorliegenden Wirts-Vektor-Systeme TG1 (pDR720cap) und TG1 (pHRW500cap) nimmt die maximale spezifische Wachstumsrate im o.g. Glucose-Mineralsalz-Medium den Wert \i_mtx = 0,41 h"¹ an. Damit konkretisiert sich die Vorschrift für die Auswahl der spezifischen Wachstumsrate zu

0,03h-^l<M<0,21h-',

und der in den einzelnen konkreten Varianten dieser Verfahrensmodifikation jeweils einzustellende μ-Wert aus dieser Relation wird hierbei stets mit Hilfe des bei der Glucose-Zudosierung gewählte Regime realisiert.

Die vorgeschlagene Verfallronserfindung wurde am Bespiel der in der weiteren Ausgestaltung dieser technischen Lösung verfügbar gewordenen neuen E.coli-Stämme TG1 (pDR720cap) und TG1 (pHRW500cap) umfassend erprobt, wobei beide Grundmodifikationen der biologischen Prozeßstufe - hier Glucose-Iimitierte Chemostaten-Kultivierung, dort fed-batch-Kultivierung mit Glucose-Dosierung - eingezogen worden sind.

Anhand der spezifischen Galaktokinase-Aktivität des cap-modifizierten Stammes E.coli TG1 (pDR720cap) wird in Abb.2 hierbei die Steigerung in der Expressionsleistung in Relation zum Vergleichsstamm. E.coli TG1 (pDR720) für den Fall einer Glucoselimitie-ten Chemostaten-Kultur ausgewiesen.

Ein entsprechender Beleg für die gesteigerte Human-Interferonalpha 1 -Bildung von Stamm E. coll TG1 (pHRW500cap) im Vergleich zu Stamm E.coli TG1 (pHRWSOO) wurde in Abb.3 (für den FaIi der Glucose-Iimitierten Chemostaten-Kultur) sowie in Abb.4 (für den Fall einer fed-batch-Kultivierung mit Glucose-Dosierung) geführt. Wie diesen Abbildungen zu entnehmen ist, kann mit dem beschriebenen Verfahren eine Erhöhung in der Expression um mehr als 100% erreicht werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Vergleichende Kultivierung des Ausgangsstammes E.coli TG1 (pDR720) und des cap-modifizierten Stammes E.coli TG1 (pDR 720cap) im Glucose-Iimitierten Chemostaten

Abschwemmungen von Schrägagarkulturen von Stamm TG1 (pDR720cap) und Stamm TG1 (pDR720) dienten zur Beimpfung von 100 ml Glukose-Mineralsalz-Medium mit Zusatz von Thiamin (1pg · ml"¹) und Ampicillin (100pg · ml"') in 500ml-Rundkolben, die bei 28⁰C auf einem Schütteltisch geschüttelt werden. Derartige Vorkulturen wurden in der exponentiellen Wachstumsphase zur Hauptkultivierung in den Chemostaten übertragen. Nach Abfüllen mit gleicher Nährlösung auf das Arbeitsvolumen V (ml) der Chemostaten von 180ml und Erreichen einer Extinktion der wachsenden Kulturlösungen von E^1cm470nm = 1.9 - 2,1 Skt begann die Zudosierung von gleicher Nährlösung. Diese Glucose-Iimitierte Nährlösung hatte folgende Zusammensetzung:

KH2PO4:	2,72 g-l"'
Na2HPO4 x 2H2O:	v 3,55 g · Γ1
NaCI:	4,67 g-r'
NH4CL:	0,535g · I"1
Na2SO4:	1,065g-r'
MgCI2 x 6H2O:	40,6 mg · Γ1
FeCI3 x 6H2O:	5,4 mg · Γ1
MnCI2 x 4H2O:	3,96 mg-r1
Thiamin:	1,0 mg · I"1
Ampicillin:	0,1 g · I"1
Glucose:	0,8 gl-';

Durch Einstellung der Zuflußrate F (ml h"¹ konnte die Verdünnungsrate D = F-V ' (h"') determiniert werden (BERGTER, F., 1972). Wachstum von Mikroorganismen. Experimente und Modelle, VEB Gustav Fischer Verlag Jena). Nach 6 bis 10 Volumenwechsel der Kulturlösung wurden die Kulturen zur Bestimmung der Aktivität der Galaktokinaso und zur Messung der Extinktion gewonnen. Zur Ermittlung der Abhängigkeit der spezifischen Aktivität der Galaktokinase von der Verdünnungsrate D wurde für jedes „D" ein neuer Zyklus (Schrägagarkultur, Vorkultur im Rundkolben, Hauptkultur im Chemostaten für 8 bis 10 Volumenwechsel) durchlaufen.

Der Bestimmung der spezifischen Aktivität der Galaktokinase lag die von McKENNEY und Mitarbeiter beschriebene Methode zugrunde (McKENNEY, K., SHIMATAKEW, H., COURT, D., SCHMEISSNER, U., BRADY, C. und ROSENBERGER, M., 1981), In: Gene Amplification and analysis. Vol. 2. (Editors J. G. Chirikjian and T. S. Papas), Elsevier/North Holland). Aus Abb. 2 ist deutlich ersichtlich, daß im Bereich 0,03 h"¹ < D < 0,32 h"' die spezifische Galaktokinaseaktivität des capmodifizierten Wirts-Vektor-Systems TG1 (pDR 720cap) größer ist als die des nicht-modifizierten Ausgangssystems TG1 (pDR720). Besonders ausgeprägt ist die höhere spezifische Galaktokinase-Aktivität von TG1 (pDR720cap) gegenüber TG1 (pDR720) bei kleinen Verdünnungsraten D < 0,15h"¹.

Beispiel 2

Kultivierung des Ausgangsstarr.nes E.coli TG1 (pHRW500) und des cap-modifizierten Stammes E.coli TG1 (pHRWöOOcap) im Glucose-Iimitierten Chemostaten

Die Anzucht und Kultivierung der Stämme wurde vorgenommen wie in Beispiel 1. Die Bestimmung von Interferon erfolgte nach einem Ultraschallaufschluß der Zellen entsprechend einem üblichen ELISA-Test.

Die Ergebnisse sind in Abb. 3 dargestellt. Im gesamten Bereich der untersuchten Verdünnungsraten 0 < D < 0,32 h"' ist die spezifische Interferonkonzentration in E. coll TG1 (pHRW500cap) größer als die in E. coll TG1 (pHRW500), wobei wie in Beispiel 1 mit abnehmender Verdünnungsrate die spezifische IFN-Konzentration ansteigt. Der Anstieg ist besonders drastisch im Bereich kleiner Verdünnungsraten für D <0,12h~'.

Beispiel 3

Fed-batch-Kultivierung des Ausgangsstammes E. coll TG1 (pHRW500) und des cap-modifizierten Stammes E. coll TG1 (pHRW500cap)

Die Fermentation erfolgte in einem Rührkesselfermentor mit Belüftung unter Verwendung von 151 eines definierten Mediums mit Glucose als Kohlenstoffquelle zu Kultivierungsbeginn. Das zu beimpfende Medium hatte folgende Zusammensetzung:

KH₂PO₄ (7,61 g/l), (NH₄I₂HPO₄(2,33g/l), MgSO₄ · H₂O (2,2g/l), Zitronensäure (1,61 g/l), Eisenzitrat (36,5mg/l), CoCI₂ · 6H₂O (2,67mg/l), MnCI₂ · 4H₂O (16mg/l), CuCI₂ · 2H₂O (1,51 mg/l), H₃BO₃ (3,33mg/l), Na₂MoO₄ · 2H₂O (2,67mg/l), Zn(CH₃COO)₂ · 2H₂O (8,4mg/l), Thiamin (2,67mg/l), EDTA (4,96mg/l), Antaphron NM40 (0,33ml/l), Ampicillin (100mg/l) und Glucose (25g/l).

Nach Beimpfung wurden die Zellen bei 28⁰C, einem pH-Wert von 6,9, einer Belüftungsrate von 1 vvm und einem Druck von 70KPa kultiviert. Zur Konstanthaltung des pH diente die automatisch kontrollierte Dosierung von 25%v/v- NH₃. Der pO₂-Wert wurde nach dem Absinken von 100% des Sättigungswertes auf den Regelwert von 20% konstant gehalten. Die Kulturen wachsen nach einer sehr kurzen lag-Phase exponentiell mit in dem vorgelegten Medium maximal möglicher spezifischer Wachstumsrate von p_max = 0,415h"¹ im Falle von TG1 (pHRW500) und 0,411 h"¹ im Falle von TG1 (pHRW500cap) (s. Abb.4) bis zum Verbrauch der zu Anfang eingebrachten Glucose. Nach vollständigem Glucoseverbrauch wurde die Zufütterung von Glucose in der Weise vorgenommen, daß die Kulturen nur noch mit verringerter spezifischer Wachstumsrate wachsen konnte. Die durchschnittlichen spezifischen Wachstumsraten in der Glucose-Feedingphase betrugen für TG1 (pHRW500)0,114h"'undfürTG1 (pHRW500cap) 0,119 h"¹. Beide Kulturen waren somit aufgrund des nicht signifikant verschiedenen μ vergleichbar.

Aus Abb.4 ist trotz Schwankungen der Meßdaten deutlich ersichtlich, daß die spezifischen Interferonmengen von beiden Stämmen bei Wachstum mit \x_mix einander entsprechen. Dagegen konnte bei Glucose-Iimitiertem Wachstum in der Dosierungsphase eine wesentlich höhere spezifische Interferonmenge in dem cap-modiiizierten Stamm TG1 (pHRW 500cap) als in dem Ausgangsstamm TG1 (pHRW500) festgestellt werden.

Legenden 2u den Abbildungen

Abb. 1: Darstellung der Plasmidpaare pDR720 und pDR720cap bzw. pHRWSOO und pHRW500cap.

Abb. 2: Abhängigkeit der spezifischen Aktivität der Galaktokinase von der Verdünnungsrate 0 bei E. coli TG1 (pDR720) und E. coli TG1 (pDR720cap) in Glucose-Iimitierten Chemostaten-Kulturen.

Abb.3: Abhängigkeit der spezifischen Humaninterferon-alpha 1-Aktivität von der Verdünnungsrate D bei E. coli TG1 (pHRW500) und E. coli TG1 (pHRW500cap) in Gluiose-Iimltierten Chemostaten-Kulturen.

Abb.4: Kinetiken von Wachstum und Interferonbildung von E. coli TG1 (pHRW500) (4 A) und von E. coli TG1 (pHRW400cap) (4 B) bei fed-batch-Kultivierung.mit Glucose-Dosierung.

Es bedeuten: X = Biotrockenmassekonzentration ing I"¹ IFN = spezifische Konzentration von Human-

Interferon-alphai in IE · g"¹ μ = spezifische Wachstumsrate in h~'

Claims (14)

1. Verfahren zur Erhöhung der Expression rekombinanter Gene in Escherichia coli auf gentechnischmikrobiologischem Wege unter Rückgriff auf rekombinanta Plasmide als Expressionsvektoren, gekennzeichnet dadurch, daß man

- Zellen eines E.coli-Stammes jeweils mit einem Expressionsplasmid transformiert, in welchem das gewählte Strukturgen der Kontrolle einer aus dem E.coli-Tryptophan-Promotor sowie einer vorgeschalteten sog. E.coli-cap-Sequenz aufgebauten Expressionseinheit (Kurzwort: captrpPO-EE) unterworfen ist, (Schritt 1) und

- die erhaltenen transformierten E.coli-Zellen unter Glucosemangelbedingungen fermentiert (Schritt 2).

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt 1 jeweils ein E.coli-Expressionsplasmid verwendet, welches in seiner cap-troPO-EE die cap-Sequenz des E. coli-Lactosepromotors (Kurzwort: cap[lacPO])

5'-TAATGTAGTTAGCTCACTCa-S'

enthält.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt 1 jeweils ein Expressionsplasmid verwendet, in welchem die cap(lacPO)-Sequenz in einem Abstand von 18 Nucleotiden stromauf der -35-Region des trpPO angeordnet ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man Zellen des Stammes E. coli TG1 mit dem Expressionsplasmid pDR720cap, in dem da& E.coli-Galactokinase-Gen (Kurzwort: galK-Gen) der Kontrolle dercap-trpPO-EE obiger Kennzeichnung unterworfen ist, transformiert.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt 1 Zellen des Stammes E.coli TG1 mit dem Expressionsplasmid PHRW500cap, in dem das humane Interferonalpha 1-Gen (Kurzwort: hlFN 1-Gen) der Kontrolle der cap-trpPO-EE obiger Kennzeichnung unterworfen ist, transformiert.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß man das jeweils erhaltene E.coli-Wirts-Vektor-System in einem Glucose-Minerdsalz-Medium unter Glucosemangelbedingungen fermentiert.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6, gekonnzeichnet dadurch, daß man das jeweils erhaltene E.coli-Wirts-Vektor-System in Schritt 2 in einem Glucose-Mineralsalz-Medium unter Mangelbedingungen obiger Kennzeichnung in kontinuierlicher Kultur mit einer Verdünnungsrate D (in h~¹) im Bereich 0 < D < D_u fermentiert (D_c — kritische Verdünnungsrate).

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, gekennzeichnet dadurch, daß man das jeweils erhaltene E. coli-Wirts-Vektor-System in einem Glucose-Mineralsalz-Medium unter Mangelbedingungen obiger Kennzeichnung mit einer Verdünnungsrate im Bereich 0,08 D_c < D < 0,5 D_c fermentiert.

9. Verfahren gemäß 4,6 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß man das Wirts-Vektor-System E.coli TG1 (pDR720cap) in einem Glucose-Mineralsalz-Medium unter Mangelbedingungen obiger Kennzeichnung mit einer Verdünnungsrate im Bereich 0,03h~¹ < D < 0,16h"¹ fermentiert.

10. Verfahren gemäß Anspruch 5, 6 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß man das Wirts-Vektor-System E.cüii TG1 (pHRW500cap) in einem Glucose-Mineralsalz-Medium unter Mangelbedingungen obiger Kennzeichnung mit einer Verdünnungsrate im Bereich 0,03h~¹ < D < 0,16h~¹ fermentiert.

11. Verfahren pemäß Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß man das jeweils erhaltene E.coli-Wirts-Vektor-System in SchriU 2 in einem Glucose-Minoralsalz-Medium in fed batch-Kultur nach anfänglich unlimitiertem Wachstum mit der spezifischen Wachstumsrate μ = \i_mm sodann unter Mangelbedingungun obiger Kennzeichnung mit einer spezifischen Wachstumsrate (in h"¹) im Bereich 0 y μ < p_max fermentiert.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, gekennzeichnet dadurch, daß man das jeweils erhaltene E. coli-Wirts-Vektor-System in einem Glucose-Mineralsalz-Medium nach anfänglich unlimitiertem Wachstum unter Mangelbedingungen obiger Kennzeichnung mit einer spezifischen Wachstumsrate im Bereich 0,08μ^χ < μ < 0,5 μ^χ fermentiert.

13. Verfahren gemäß Anspruch 4,6 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß man das Wirts-Vektor-System E.coli TG1 (pDR72Dcap) in einem Glucose-Mineralsalz-Medium nach anfänglich unlimitiertem Wachstum mit Mmax = 0,41 h~¹ unter Zudosierung von Glucosemiteinerspezifischen Wachstumsrate im Bereich 0,03 h~¹ < μ < 0,21 h~^ fermentiert.

14. Verfahren gemäß Anspruch 5,6 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß man das Wirts-Vektor-System E.coli TG1 (pHRW500cap) in einem Glucose-Mineralsalz-Medium nach anfänglich unlimitiertem Wachstum mit Pmax = 0,41 h~¹ unter Zudosierung von Glucose mit einer spezifischen Wachstumsrate im Bereich 0,03h~¹ < μ < 0,21 h~¹ fermentiert.