DD290560A7 - Verfahren zur vergleichsweisen bestimmung der urspruenglichen funktionsfaehigkeit lebender biologischer, in einer elektrolytloesung suspendierter zellen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beurteilung der urspruenglichen Funktionsfaehigkeit lebender biologischer Zellen, die in einer Elektrolytloesung suspendiert sind. Damit lassen sich Eigenschaften und Merkmale dieser Zellen bestimmen und Rueckschluesse auf ihre Funktionsfaehigkeit und auf die Wirkung aeuszerer Faktoren physikalischen, chemischen und biologischen Ursprungs schlieszen. Das Merkmal der Erfindung besteht darin, dasz mit Hilfe einer elektrischen Beeinflussung dieser Zellen die Moeglichkeit geschaffen werden soll, morphologische Veraenderungen an und in ihnen zu erzeugen, wobei sich nach der Beeinflussung die Veraenderungen teilweise oder vollstaendig zurueckbilden. Aus diesen Veraenderungen und dem zeitlichen Verlauf der Rueckbildung erfolgt eine Aussage ueber die urspruengliche Funktionsfaehigkeit der lebenden biologischen Zellen.{Verfahren; biologische Zellen; Spannungsbeaufschlagung; Heilungsverlauf; Funktionsfaehigkeit; Vitalfunktion; Metabolitgehalt; Enzymgehalt; Enzymfreisetzung; Syntheseleistung; funktionelle Leistung}

Description

Hierzu 1 Seite Zeichnung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der ursprünglichen Funktionsfähigkeit lebender biologischer Zellen, die in einer Elektrolytlösung suspensiert sind, insbesondere auf dem Gebiet der Biologie und Medizin.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Das hier dargelegte Verfahren umfaßt sowohl das Gebiet der Spannungsbeaufschlagung lebender biologischer Zellen als auch

die Erfassung ihrer Meß- und Kenngrößen.

Die Spannungsbeaufschlagung stellt ein bekanntes Verfahren dar (Lit.: 1. U. Zimmermann u.a.: Zellen mit manipulierten Funktionen, aus: Angewandte Chemie 1981,93:332-351; 2: U. Zimmermann u.a.: A Novel Hybbridization Technique, aus: Advances in Biotechnologlcal Processes 4, Pages 79-150,1985 Alan R. Liss, Inc.). Ihre Anwendung umfaßt folgende Zielstellungen:

1. Herbeiführung einer Zellperforation zur Einleitung einer Zellfusion,

2. Herbeiführung einer reversiblen Zellperforation zur Schaffung eines Weges für hochmolekulare Stoffe in das Zellinnere,

3. Herbeiführung einer gezielten Zerstörung der Zelle zur Bestimmung der biologisch-chemischen Zusammensetzung des Zellinneren,

4. Herbeiführung einer gezielten Zerstörung der Zelle zur Bestimmung ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber elektrischer Belastung, und

5. die direkte Bestimmung des Zellvolumens über eine elektrische Strom-Spannungs-Messung ohne Zerstörung bzw. nennenswerte Schädigung der Zelle.

Bekannte Verfahren zur Bestimmunflbder Vitalfunktion lebender biologischer Zellen nutzen

1. meßbare physikalische, wie elektrische (Ortskurve, Strom-Sp- inung-Messung, Elektrophorese), optische (UV-Spektroskopie) und mechanische (Ultraschall-Spektroskopie) Größen,

2. durch Zählung der lebenden Zellen (trypanblau-Ausschluß-Verfahren) in einer Zellsuspension (z. B. Neibauer-Zählkammer) über einen Zeitraum von mehreren Stunden, um anhand der Lebensfähigkeit bzw. des Absterbeverhaltens der Zellen auf ihre Lebensfähigkeit zu schließen.

Während für unterschiedliche biologische Zellen die Spannungsbeaufschlagung für eine reversible Zellperforation genutzt wird (Lit.: H. Potter: Electroporatlon In Biology: Methods, Applications, and Instrumentation, aus: Analytical Biochemistry 174, 361-373 [1988]) erfolgt jedoch keine Beurteilung der Funktionsfähigkeit der Zellen anhand der Rückbildung dieser Perforation, obwohl in diesem Regenerierungsprozeß eine wichtige Aussage über die Funktionsfähigkeit der Zellen enthalten ist. Ferner liefern die bisher bekannten physikalischen Verfahren zwar aktuelle physikalische Größen von den Zellen bzw. der Zellsuspension, sie erlauben aber, genau wie das Trypanblau-Ausschluß-Verfahren, erst über einen längeren Zeitraum bis zu einigen Stunden Rückschlüsse auf die Funktionsfähigkeit der Zellen zu schließen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, mit Hilfe einer elektrischen Beeinflussung lebender biologischer Zellen, die Möglichkeit zu schaffen, Veränderungen an und in ihnen zu erzeugen, so daß die sich daraus ergebenden Meß- und Kenngrößen schneller und genauer als mit den bisher bekannten Verfahren eine Aussage über ihre Funktionsfähigkeit liefern.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zur Bestimmung der ursprünglichen Funktionsfähigkeit lebender biologischer Zellen, die in einer Elektrolytlösung suspendiert sind, zu schaffen. Dabei sollen die Eigenschaften und Merkmale dieser Zellen erfaßt und damit Rückschlüsse auf ihre ursprüngliche Funktionsfähigst und auf die Wirkung äußerer Faktoren physikalischen, chemischen und biologischen Ursprungs gezogen werden.

Merkmale der Erfindung

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß in einer Probenkammer lebende biologische Zellen, die in einer Elektrolytlösung suspendiert sind, mit einer über mindestens 2 Elektroden zugeführten Spannung u(t) definierter Größe und Zeitdauer ein- bzw. mehrmals beaufschlagt werden. Dabei sind Zellen einer Ausgangssuspension zu verwenden, deren Vitalfunktion durch Zuhilfenahme eines anderen Verfahrens bekannt ist. Die Parameter Spannungshöhe, Zeitdauer der Spannung und Häufigkeit der Beaufschlagung sind mindestens so groß zu wählen, daß sich daraus meßbare bzw. erkennbare morphologische Veränderungen (z. B. Membranperforation und/oder Ausstülpungen) an einzelnen bzw. dem überwiegenden Teil der Zellen ergeben. Zum anderen dürfen die Parameter nur so groß gewählt werden, daß an diesen Zellen nach der Beaufschlagung eine vollständige oder teilweise Rückbildung der Veränderungen erfolgt. Der anwendbare Bereich der Parameter hängt ab von dem gewählten Elektrolyt, der Art der Zellen und deren Konzentration im Elektrolyt. Jedoch ist erfahrungsgemäß die Spannung so zu wählen, daß die Suspension einer Feldstärke im kV/cm-Bereich ausgesetzt ist, die Einwirkzeit im ms-Bereich, und darunter liegt, und die Beaufschlagung nur einmal erfolgt. Die Größe der Veränderungen, die Zeitdauer deren Rückbildung als auch der Anteil der sich rückgebildeten Zellen bzw. der Anteil, der die Spannungsbeaufschlagung nicht überlebenden Zellen, dienen dann als Bezugswerte für weitere Untersuchungen an diesen oder anderen Zellen. Parallel dazu lassen sich, entsprechend der Fragestellung, vor der Spannungsbeaufschlagung und kontinuierlich oder diskontinuierlich nach der Spannungsbeaufschlagung die erforderlichen Meß- und Kennwerte physikalischer, chemischer und biologischer Art ermitteln und ebenfalls als Bezugswerte für weitere Untersuchungen verwenden.

Die Zellen einer zu untersuchenden Suspension werden mit gleichen oder ähnlichen Spannungsparametern beaufschlagt, und in gleicher Weise erfolgt, je nach Fragestellung, eine Ermittlung der Meß- und Kenngrößen. Direkt oder durch Vergleich mit den Bezugswerten der Ausgangszellsuspension erfolgt dann eine Beurteilung der Zellen hinsichtlich ihrer Funktionsfähigkeit.

AusfOhrungsbelsplel

Verwendet wird eine nach Lit. (G. Letko u.a.: Pancreatic cells: characterization and application in physiologic and pathophysiologic studies, with special reference to acute pancreatitis, aus: Exp. Path. 1988; 34:10-22) hergestellte Ausgangszellsuspension vom Rattenpankreas mit einer mittleren Zellkonzentration von Z = 2Ox 10'Zellen/ml. Von dieser Ausgangszellsuspension werden nach dem Trypanblau-Ausschluß-Verfahren mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer die 4 Gruppen gezählt:

A: Normalzellen (glatte runde Zellen), nicht blau (intakte Membran) B: blaue Normalzellen (perforierte Membran) C: nicht blaue Blebs (Zellen mit Ausstülpungen und nichtperforierter Membran) und · D: blaue Blebs.

Anschließend erfolgt das blasenfreie Aufziehen derZellsuspenslon mit einer 2ml-Spritze mit Metallkolben und Metallspitzenkopf (Spritze UNI-REKORD vom VEB MLWINJECTA Steinach) auf ein Volumen von 0,52ml. Ein auf 2,4 kV aufgeladener 0,25pF-Konder.sator wird zwischen Kolben und Spitzenkopf entladen. Dies entspricht einer Feldstärke von 3kV/cm. Die Zellsuspension mit den beaufschlagten Zellen kommt in einen Probenbehälter und dieser in einen temperierten (37°C) Schüttelinkubator. Jeweils 1 min, 10min und 30min nach der Spannungsbeaufschlagung werden die Gruppen A, B, C und D ebenfalls in der Neugebauer-Zählkammer gezählt.

In gleicher Verfahrensweise erfolgt dann die Behandlung und das Auszählen der Zellen einer zu untersuchenden Zellsuspension. Die Summe

X = A + C (alle nichtblauen Zellen) gibt den zeitlichen Verlauf der Rückbildung der Membranperforation und Y = A + B (alle glatten runden Zellen) den der Ausstülpungen an. Die Größe der Werte X und Y und ihr zeitlicher Verlauf sind dann ein Maß für die ursprüngliche Vitalfunktion der vorgegebenen Zellen (Fig. 1, Kurve 1,2 und 3). Dabei zeigte es sich, daß bei Zellen, bei denen mit Hilfe des Trypanblau-Ausschluß-Verfahrens eine Überlebenszeit von über 4 Stunden ermittelt wurden, eine sehr gute Vitalfunktion besitzen. Analog dazu erhält man die Kurve 1 in Fig. 1. Des weiteren ergibt sich für Zellen mit kürzerer Überlebenszeit (3 bis 4 Stunden) in etwa die Kurve 2, und mit sehr kurzer Überlebenrzeit (< 2 Stunden) die Kurve 3 der Figur 1. Damit läßt sich die ursprüngliche Vitalfunktion der Zellen durch Vergleich der Kurve 2 und 3 mit der Kurve 1 beurteilen. Parallel oder in einem gesonderten Versuch lassen sich mit Hilfe entnommener Proben vor der Spannungsbeaufschlagung der Zellen und 1 min, 10min und 30min nach der Beaufschlagung nach bekannten Verfahren der Metabolitgehalt, z.B. der ATP-Gehalt (Lit.: G. Letko und U. Kuester: Möglichkeiten und Erfahrungen bei der Intaktheitsbeurteilung von Hepatozyten, aus: Wiss. Z. der HU zu Berlin, R. Med. 1988,37:81-83), der Enzymgehalt, z.B. die Lactat-dehydrogenase (Lit.: Berg, T. et al., Exp. Cell Res. 1972; 72:571-574), die Enzymfreisetzung, z.B. die Amylase-Bestimmung (Lit.: Singh, M.: Effect of glucagon on degistive enzyme synthesis, transport and secretion in mouse pancreatic acinar cells, aus: J. Physiol. 1980; 308:307-322) und die Syntheseleistung, ζ. B. die Proteinsynthese (Lit.: Amsterdam, Α.; Jamieson, J. D.: Stydies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells; aus: J. Cell. Biol. 1974; 63:1057-1073) bestimmen.

Ausführungsbeispiel Verwendet wird die unter dem 1 .Ausführungsbeispiel benutzte Zellsuspension mit der gleichen Zellkonzentration Z = 20 χ 10^β

Zellen/ml.

0,5ml dieser Zellsuspension wird mit 1,5ml gleicher Suspension verdünnt und, nach dem in der Lit. (U. Cobet: Untersuchungender dynamischen Strukturen des Blutes mittels Ultraschall, aus: Wiss. Z. der MLU Halle-Wittenberg 37 [1988]; H.5,135-141)beschriebenen Veifahren an ihr bei einer Sch^'frequenz von f = 10MHz der Ultraschall-Streukoeffizient k_o gemessen. Mit0,52 ml der Zellsuspension erfolgt, wie im ¹ ,Ausführungsbeispiel beschrieben, das blasenfreie Aufziehen der Zellsuspensionund die Spannungsbeaufschlagung. N ..oh der Verdünnung mit 1,66ml Suspension wird nach dem gleichen Verfahren der

Ultraschall-Streukoeffizient ku gemessen. Derzeitliche Verlauf von ku, sowie die sich daraus ergebene Differenz K~ K, sind ein Maß für die Beurteilung der ursprünglichen Vitalfunktion der Zellen.

Claims (4)

1. Verfahren zur vergleichsweisen Bestimmung der ursprünglichen Funktionsfähigkeit lebender biologischer, in einer Elektrolytlösung suspendierter Zellen mittels ein- oder mehrmaliger Anlage einer elektrischen Spannung bis einer maximalen Feldstärke von 5kV/cm und einer Zeitdauer von maximal 1 ms, gekennzeichnet dadurch, daß dir .,ich daraus ergebenden meßbaren oder erkennbaren morphologischen Veränderungen an und in den Zellen, wie Zellperforationen und Zolldeformationen, die ursächlich mit der Spannungsbeaufschlagung im Zusammenhang stehen, nach der Beaufschlagung vollständig oder teilweise zurückbilden, woboi damit verbundene Veränderungen und deren zeitlicher Verlauf für die Beurteilung der ursprünglichen Funktionsfähigkeit, die da sino ursprüngliche Vitalfunktion, ursprüngliche Intaktheit und ursprüngliche funktioneile Leistung, und die dabei ermittelten Meß- und Kenngrößen physikalischer, chemischer und biologischer Art als Bezugswerte für zu untersuchende Zellen verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Meß- bzw. Kenngrößen bei einer wie unter Anspruch 1 mit gleichen oder ähnlichen Spannungsparametern behandelten Zellen einer Suspension, deren meßbaren oder erkennbaren morphologischen Veränderungen an und in den Zellen und ihr zeitlicher Verlauf ursächlich mit dieser Spannungsbeaufschlagung im Zusammenhang stehen, erfaßt und durch Vergleich mit den unter Anspruch 1 ermittelten Veränderungen und/oder Bezugswerten für die Beurteilung der ursprünglichen Vitalfunktion der vorgegebenen Zellen benutzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß bei einer wie unter Anspruch 1 mit gleichen oder ähnlichen Spannungsparametern behandelten Zellen einer Suspension vor und nach der Spannungsbeaufschlagung der Metabolitgehalt und/oder Enzymgehalt (z. B. ATP-Gehalt oder Lactat-dehydrogenase) gemessen und die Ergebnisse direkt oder durch Vergleich mit den unter Anspruch 1 ermittelten Veränderungen und/oder Bezugswerten als Maß für die ursprüngliche Intaktheit der vorgegebenen lebenden biologischen Zellen verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß bei einer wie unter Anspruch 1 mit

' gleichen oder ähnlichen Spannungsparametern behandelten Zellen einer Suspension vor und nach der Spannungsbeaufschlagung die hormonstimulierte Enzymfreisetzung (z. B. Amylase) und/oder Syntheseleistung gemessen und die Ergebnisse direkt oder im Vergleich mit den unter Anspruch 1 ermittelten Veränderungen und/oder Bezugswerten als Maß für die ursprüngliche funktioneile Leistung der vorgegeben Zellen verwendet werden.