DD286183A5 - Verfahren zur erhaltung der viabilitaet und gaeraktivitaet von suspendierten milchsaeurebakterien - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhaltung der Viabilitaet und Gaeraktivitaet von suspendierten Milchsaeurebakterien und kann bei Hochleistungsgaerungen zur Milchsaeureproduktion mit suspendierten Mikroorganismen angewandt werden. Durch das erfindungsgemaesze Verfahren ist es moeglich, hochaktive Bakteriensuspensionen vor ihrem Einsatz oder zwischen mehrfachen Einsaetzen bzw. bei Gaerunterbrechungen so zu lagern, dasz diese Gaerungen ohne zeitliche Verzoegerung und ohne wesentliche Produktivitaetsminderung einsetzen bzw. weitergefuehrt werden koennen. Voraussetzung hierfuer ist, dasz die Anzahl der viablen Zellen in der Suspension weitgehend auf dem urspruenglichen Niveau erhalten bleibt. Dies wird erfindungsgemaesz dadurch erreicht, dasz die Milchsaeurebakterien in der bei Beendigung bzw. Abbruch der Gaerung vorhandenen Gaerfluessigkeit, deren Milchsaeuregehalt mindestens 50 g/l betraegt, bei Temperaturen von 2 bis 8C gelagert werden.{Milchsaeure; Bakterien; Gaeraktivitaet; Gaerzeit; Zellagerung; Zellviabilitaet; Gaerfluessigkeit; Milchsaeuregehalt; Hochleistungsgaerung}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erf! dung betrifft das Gebiet der biotechnologischen Stoffwandlungen. Sie ist anwendbar bei Verfahren zur Milchsäui ^produktion und suspendierten Zellen.

Cr arakteristik der bekanntftn technischen Lösungen

Bei technischen Verfahren zur Herstellung von Milchsäure wirken gewöhnlich Nähr- oder Wirkstofflimitationen und Produktinhibierung - letztere bedingt durch die gebildete Milchsäure - gleichzeitig auf die Mikroorganismen ein, so daß die Lebensfähigkeit der Bakterien in der Gärflüssigkeit am Ende der diskontinuierlichen Prozesse sehr stark absinkt und oft Werte unter 1 % annimmt. Deshalb ist es üblich, jeden einzelnen Gäransatz mit jeweils neuangezüchtetem Zellmaterial anzuimp'en. Auf diese Weise beugt man auch einer möglichen Verdrängung der Produktionskultur durch Konkurrenzorganismen vor. Bekannt sind jedoch auch Verfahrens-veisen, bei denen zum Animpfen von unmittelbar aufeinander folgenden Gäransätzen ein Teil des Fermentorinhaltes direkt aus der jeweils vorangegangenen Gärung ohne Zwischenlagerung benutzt wird (JP 61-293387, EP 0190770). In beiden Fällen liegt die Anfangszellzahl unter 10* Zellen/ml und die Anfangsviabilität der Zellpopulation im Reaktor ist nur gering. Die Gärzeiten sind dementsprechend lang und betragen in der Regel mehr als 3 bis 4 Tage.

Für den Start und die Durchführung von Hochleistungsgärungen, die sich durch kurze Gärzeiten, die ihrerseits wieder nur mittels hoher Viabilität und Anfangszellzahlen zu erreichen sind, auszeichnen, sind die o.a. bekannten Verfahren aufgrund ihrer aufgeführten Nachteile nicht geeignet.

Bekannt ist lediglich, daß die Viabilität von Milchsäurebakterien über längere Zeit bewahrt werden kann, wenn deren Suspensionen einer Sprühgranulierung auf Roggenfeinschrot unterworfen (Hill, F. F., alimenta 3(1987), 73-80) oder sie gefriergetrocknet werden. Dabei soll die Viabilität bei biszu 80% der Zellen erhalten bleiben. Diese Verfahrensweisen eignen 3ich zwar zur Konservierung von Starterkulturen für die Sauerteigherstellung bzw. als Mittel zur Stammhaltung der dazu verwendeten Mikroorganismen, nicht jedoch für den Einsatz in Hochleistungsgärungen.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist eine Verfahrensweise zur Erhaltung der Viabilität und Gäraktivität von suspendierten Milchpäurebakterlen, die s ermöglicht, daß Hochleistungsgärungen ohne zeitliche Verzögerungen und ohne wesentliche Produktivitätsminderung einsetzen können.

Darlegung de« Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Bedingungen für dio Lagerung der suspendierten Milchsäurebakterien so zu • gestalten, daß Zellzahl und Viabilität der Milchsäurebakterien und damit auch die Gäraktivität weitgehend erhalten bleiben. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe so gelöst, daß die Milchsäurebakterien in der bei Beendigung bzw. Abbruch der Gärung vorhandenen Gärflüssigkeit, deren Milchsäuregehalt mindestens 50 g/l beträgt, bei Temperatur von 2 bis 8°C gelagert werden. Eine Konzentrierung der Zellsuspension mittels bekannter Methoden wie Membranfiltration vor der Lagerung ist möglich.

Da bekannt ist, daß Milchsäure sowohl in freier Form als auch als Laktat eine stark inhibierende Wirkung sowohl auf das Zellwachstum als auch auf dio Milchsäurebildung selbst ausübt ;ind da bei diskontinuierlichen Gärungen der Anteil viabler Zellen oberhalb von etwa 50g Milchsäure/l mit zunehmender Milchsäurekonzentration abnimmt, wäre zu erwarten, daß sich eino Lagerung der Zellen in Gärflüssigkeit mit einem hohen Milchsäuregehalt schädigend auf die Mikroorganismen auswirkt. Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, daß urner der 3edingung, daß der Milchsäuregehalt der zur Lagerung benutzten Gärflüssigkeit a 50g/l beträgt, eine gute Stabilisierung der Zellzahl, Viabilität und Gäraktivität möglich ist, wenn diese Milchsäurekonzentration durch Gärung unter Verwendung der suspendierten Zellen selbst und nicht durch nachträgliche Zugabe von Milchsäure erreicht wurde.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann in Abhängigkeit von den Lagerungsbedingungen (Zusammensetzung der Gärflüssigkeit, Lagertemperatur) und dem physiologischen Zustand der Zellen für einen Zeitraum von mindestens 14 Tagen bei praktisch unverminderter Gesamtzellzahl der Anteil der viablen Zellen auf einem Niveau von 50 bis 100%des Wertes vor der Lagerung gehalten werden. In günstigen Fällen beträgt selbst nach 28tägiger Lagerung die Zahl der viablen Zellen noch 70% des Wertes vor der Lagerung. Im Gegensatz dazu tritt nicht nur eine starke Abnahme der Zahl der viablen Zellen, sondern auch der Gesamtzellzahl ein, z.T. bereits nach < 7d, wenn die Milchsäurebakterien in einer Gärflüssigkeit mit einem MilchsäuregehaK < 30g/l oder nach Abtrennung und Resuspendierung in frischem Fermentationsmedium gelagert werden.

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Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfach durchführbar, da kein spezielles Lagermedium erforderlich ist, und bietet infolge der hohen Milchsäurekonzentration als weiteren Vorteil einen Schutz vor Infektionen. Das erfindungegemäße Verfahren ist anwendbar bei diskontinuierlichen Prozessen, bei denen Zellsuspensionen aus vorangegangenen Gärungen als Impfmaterial für nachfolgende Gärungen wieder eingesetzt werden sollen, wie auch bei technologisch oder störungsbedingten Unterbrechungen kontinuierlicher und diskontinuierlicher Prozesse. Aufgrund der weitgehenden Erhaltung der metallischen Aktivität der erfindungsgemäß gelagerten Zellsuspension können bei deren Einsäe Hochleistungsgärungen ohne ausgeprägte Lagphase beginnen, und im Falle von längeren Unterbrechungen der Fermemotionsprozesse ist es möglich, diese bei Wiederbeginn sofort stabil und ohne wesentliche Produktivitätsminderung weiterzuführen. Ist die Prozeßstörung mit einem Absterben der Kultur verbunden, kann die Gärung nach Beheben der technischen Ursache durch Zugabe von erfindungsgemäft gelagerter, evtl. aufkonzentrierter Zellsuspension aus einer vorangegangenen Gärung zu Ende gebracht werden.

Für die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es gleichgültig, ob die Zellen bereits als freie Zellen in den Fermentor eingebracht wurden oder ob sie aus einem als Inokulum eingesetzten voll mit Zellen beladenen Gelimmobilisat ausgetreten sind und sich dann im Farmentor vermehrt haben. Auch für geflockte Milchsäurebakterien ist das erfindungsgemäße Verfahren analog anwendbar

In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1 In einem 0,51-Rührreaktor wurden 50 ml Impfsuspension eines Lactobacillus spec, mit 220 ml eines modifizierten MRS- Mediums (Glucosegehalt: 50 g/l) gemischt und bei einer Temperatur von 45°C und einem pH-Wert von 6,0 fermentiert. Die

pH-Regelung erfolgte mit 6η NaOH. Nach einem Laugeverbrauch von 20 und 30ml wurden dem Fermentorinhalt jeweilsrc me Glucose in einer Menge von 7,5g zugesetzt und die Gärung bis zu einer Milchsiui ekonzentration von 80g/l fortgeführt.

Bei Milchsäurekonzentrationen von 30,50 und 80g/l wurden dem Fermentor mehrere Probon untnommen, sofort schnell

abgekühlt und bei +4⁰C gelagert; (Der verbliebene Fermentorinhalt wurde nach Abkühlung unter weiterer pH-Regelungebenfalls bei +4⁰C gelagert). Jeweils eine Probe wurde sofort analysiert, die anderen nach Lagerzeiten von 7,14 und z.T.

auch nach 28 Tagen.

Die Untersuchungen ergaben folgendes: Bei der Lagerung In Gärflüssigkeit mit einem Milchsäuregehalt von 30g/l war nach 7d bei noch nahezu konstanter Gesamtzellzahl (3,8 · 10⁹ZmI) die Zahl der viablen Zellen auf die Hälfte abgesunken (8,2 10⁸ZmI gegenüber 1,6· 10⁹ZmI vor

der Lagerung}; nach 14 d betrug die Zahl derviablen Zellen nur noch 1,2 · 10⁷ZmI (0,3% des Wertes vor der Lagerung) und die

Gesamtzellzahl hatte auf 5· 10⁸ZmI abgenommen. Demgegenüber war bei der Lagerung in den Gärflüssigkeiten mit 50 bzw. 80g Milchsäure/l auch nach 14d die Zahl der

viablen Zellen unverändert, d. h. sie entsprach dem Wert der Sofortbestimmung vor der Lagerung (bei 5OgZI: 1,7 · 10⁹ZmI; bei8OgZI: 1,2 10⁹ZmI).

Nach 28d betrug die Zahl der viablen Zellen bei unveränderter Gesamtzellzahl noch 70% des ursprünglichen Wertes. Beispiel 2

Analog zu Beispiel 1 wurde eine Milchsäuregärung begonnen. Nach 24 h, bei einer Milchsäurekonzentration von 62 gZI, stieg durch eine Störung in der pH-Regelung der pH-Wert auf 12. Die Zahl der viablen Zellen, die vor dem pH-Schlag, bei 60g Milchsäure/l, 2,1 · 10⁹ZmI betragen hatte, sank auf < 10'Zml. Nach Behebung der technischen Störung sollte die Gärung durch Zugabe aktiver Zellen fortgeführt werden. Zu diesem Zweck wurde die Biomasse aus 250 ml des 14d gelagerten Fermentorinhalts aus Beispiel 1, der 80g Milchsäure/l und 1,2 · 10⁹ viablen Zellen/ml enthielt, abzentrifugiert und in den Fermentor eingetragen, wobei sich eine Konzentration an viablen Zeilen von 9 · 10Vml ergab. Die Gärung setzte ohne Verzögerung ein. Nach 30h betrug die Milchsäurekonzentration 8OgZI.

Claims (2)

1. Verfahren zur Erhaltung der Viabilität und Gäraktivität von suspendierten Milchsäurebakterien, gekennzeichnet dadurch, daß die Milchsäurebakterien in der bei Beendigung bzw. Abbruch der Gärung vorhandenen Gärflüssigkeit, deren Milchsäuregehalt mindestens 50g/l boträgt, bei Temperaturen von 2 bis 8°C gelagert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Zellsuspension vor der Lagerung in bekannter Weise auf konzentriert wird.