DD282241A5 - Verfahren und vorrichtung zur reinigung und isolierung von gibberellinsaeure - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung von Gibberellinen, insbesondere Gibberellinsaeure GA3. Das Kulturfiltrat, das die Gibberelline enthaelt, wird durch ein Plattenmodul mit einer Gesamtflaeche von 0,1 bis 2 m2 geleitet. Als Membranen werden sowohl Mikrofilter in Kombination mit getemperten und ungetemperten Ultrafiltern und/oder Umkehrosmosemembranen verwendet, die auf Basis * hergestellt wurden.{Celluloseacetat; Gibberellinsaeure; Kristallisation; Membrantrenntechnik; Mikrofiltration; Plattenmodul; Ultrafiltration; Umkehrosmose}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Reinigung und Isolierung von Gibberellinen, insbesondere Gibberellinsäure GA₃, die bei der Fermentation vor. Gibberellinbildnern entstehen.

Das vorliegende Verfahren kann sowohl in der Biotechnologie als auch allgemein zur Trennung, Reinigung und Isolierung von Wirkstoffen eingesetzt werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bei der großtechnischen Kultivierung der Gibberellinbildner werden den Mikroorganismen als Kohlenstoffquelle Kohlenhydrate oder Planzencle und als Nährstoffe Phosphor, Stickstoff und Spurenelemente in Form von Salzlösungen zugeführt.

Bei der Biosynthese der Gibberelline werden auch andere Stoffwechselprodukte, wie z. B. Farbstoffe, gebildet, die eine Färbung der Kulturlösung hervorrufen. Zur Gewinnung der Gibberelline sind eine Reihe von Reinigungsoperationen notwendig, die jedoch zur Erniedrigung der Ausbeute, zur Verringerung der GA-Aktivität und .lomit zur Verteuerung des Wirkstoffes führen. Die Abtrennung der Biomasse wird bekanntem^ ßen durch Filtration erreicht und ein klares, leicht gefärbtes Kulturfiltrat gewonnen.

Die bisher bekannten Verfahren zur Isolierung des Wirkstoffes ve. wenden z. B. mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel (DE AS 1088911) zur Extraktion des Wirkstoffes aus dem Kulturfiltrat. Das Verfahren hat den entscheidenden Nachteil, daß brennbare Lösungsmittel verwendet werden und gleichzeitig auch die im Kulturfiltrat befindlichen Farbstoffe und andere darin löslichen Stoffe extrahiert werden, die beim Abziehen des Extraktionsmittels ausfallen und den Wirkstoff verunreinigen.

In anderen Verfahren werden zur Gewinnung von Gibberellinsäure Ionenaustauscher (DE-AS 1288044, DE-AS 1085878) bzw. synthetische Adsorberharze (GB PS 1260329, SU 1080747) benutzt. Der Nachteil bei der Verwendung der Ionenaustauscher ist die teilweise Inaktivierung der Gibberellinsäure während des Trennprozesses. Ein weiterer Nachteil ist die gleichzeitige Desorption von Stoffwechselprodukten und Salzen, die eine Extraktion zur Reinigung und Isolierung des Wirkstoffes mit brennbaren Lösungsmitteln nach sich ziehen.

Auch bei der Verwendung von Adsorberharzen ist der entscheidende Nachteil die Verwendung von organischen Lösungsmitteln, die die gleichzeitige Desorption der Verunreinigungen bewirken.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, aus den gefärbten Fermentationsmedien bzw. Kulturfiltraten durch ein einfaches Verfahren ohne Verwendung von brennbaren organischen Lösungsmitteln weiße kristalline Gibberellinsäure zu gewinnen und deren Einsatzgebiet dadurch zu erweitern.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine einfache technische Lösung zu entwickeln, um aus den Fermentationsmedien der Gibberellinsäurebildner kristalline Gibbere'linsäuie, insbes. GA₃, mit hoher Reinheit, einem Schmelzpunkt von mindestens 218 bis 234⁰C und mit einer Ausbeute von mehrals70%zugewinnen.

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Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß nach einer Grobfiltration der Fermentationslösung das Kulturfiltrat über einen Plattenmodul mit Querstromfiltration in dem Mikrofilter, Ultrafiltrations- und/oder Umkehrosmose-Membranen auf Basis von Celluloseacetat und einer Porengröße von 1,2 bis 4nm, vorzugsweise 2,5-3,5 nm, in Reihe geschaltet sind und der Durchfluß durch Einschöbe und Zusammenführung der Filtratströme verändert werden kann mit einer Gesamtfläche von O,1-2m², einem Durchfluß von 0,2 bis 2l/mi ι und einem Arbeitsdruck von 0,3 bis 1 h,?a, vorzugsweise 0,5 bis 0,8MPa, gegeben wird. Der Filtratstrom kann die Membransysteme unterschiedlicher Leistung nacheinander passieren. Der Plattenmodul kann in seinem Aufbau und folglich in seiner Funktionsweise so verändert werden, daß sowohl zwei verschiedene als auch drei Membrantypen eingesetzt werden können.

Die verschiedenen Membranen unterscheiden sich hinsichtlich der Porosität und Selektivität. Die Struktur und Leistungsparameter der Membranen, speziell von UF-Membranen, können durch eine zusätzliche Temperung den jeweiligen Trennaufgaben angepaßt werden. Als Membranen werden vorzugsweise Mikrofilter auf Basis Cellulose-2,5-Acetat mit einer Porengröße von 0,45 bis 0,8 nm und einer Wasserdurchlässigkeit von 33600 l/m² eingesetzt, um die nach der Grobfiltration noch vorhandenen Proteine zurückzuhalten.

Die Ultrafiltrationsmembranen vom Typ UF 60 haben eins Ausschlußgrenze von 10000 Dalton und die vom Typ UF 40 eine von 3000 Dalton. Die Temperung der Membranen erfolgt in einem Wasserbad über 10min bei 85⁰C.

Die eingesetzten UF-Membranen weisen Porendurchmesser von 1,2 bis 4nm, vorzugsweise 2,5-3,5 nm, auf. Nach Beendigung der Fermentation der Gibberellinbildner wird die Biomasse durch Grobfiltration entfernt. Dem Kulturfiltrat werden Fällhilfsmittel zugesetzt. Die Fällung wird in der Regel in einem schwach sauren pH-Bereich in Gegenwart von Ca²*- oder Ba²' Ionen und/oder weiteren Fällhilfsmitteln, wie Kaolin, durchgeführt. Vorteilhaft ist es, zur Fällung eine Kombination CnCI₂/Kaolin einzusetzen und den pH-Wert auf etwa 6,1 bis 6,5 abzupuffern. Zur Fällung.von Sulfat und Phosphat wird die benötigte Ca-Menge in einem geringen Überschuß zugesetzt. Bei der Fällung entsteht ein voluminöser Niederschlag, der auch die ölhaltigen Bestandteile des Kulturfiltrates bindet und leicht abgetrennt werden kann. Zur weiteren Reinigung, Aufkonzentration und Isolierung der Gibberellinsäure wird die Lösung mit Hilfe der Membrantrenntechnik unter Verwendung des beschriebenen Plattenmoduls mit Mikrofiltern, UF- und/oder RO-Membranen aufgearbeitet. Beim anschließenden Abkühlen der konzentrierten Lösung fällt die Gibberellinsäure zu über 70% mit einer Reinheit von über 95% aus (Reinheitsprüfung mittels HPLC-Analyse). Die Mutterlauge enthält noch 20 bis 30% Gibberellinsäure und kann anderweitig verwendet werden. Mit diesem Verfahren ist es möglich, die Gibberellinsäure GA³ aus der wäßrigen Lösung ohne Verwendung organische* Lösungsmittel und frei von Fremdstoffen und Verunreinigungen aufzukonzentrieren und abzutrennen. Die ebenfalls im Kulturfiltrat befindlichen Stoffwechselprodukte und Feststoffe, wie Metabolite und Salze, werden durch die Membranfiltration gemeinsam mit dem Filtrat entfernt.

Ausfüluungsbelspiele

Die Erfindung soll nachstehend an einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1:

101 Kulturfiltrat, das auf beschriebene Weise vorgereinigt wurde und 500mg/l GAj enthält, wird einem Plattenmodul, der mit 3 Mikrofiltern und 10 UF-Membranen Typ UF 60 (getempert bei 85⁰C für 10min) belegt ist, zugeführt. Bei einem Druck von 0,6MPa und der Fließgeschwindigkeit von 1 l/min werden 0,550I Retentatlösung erhalten, aus der 4,25g GA₃ (95%ig nach HPLC-Analyse) bei 4⁰C auskristallisieren. Es wurde eine Aufkonzentrierung von 1:18 erreicht.

Beispiel 2:

20I Kulturfiltrat mit einem GA₃-Gehaltvon760mg/I werden einem Plaitenmodul, der mit 3 Mikrofiltern und 10 UF-Membranen vom Typ UF 60 ungetempert belegt ist, zugeführt. Bei einem Druck von 0,3 MPa und der Fließgesehwindigkeit von 1,4 l/min wird das Kulturfiltrat durch den Modul gedrückt und nach etwa 15min 2I Retentatlösung erhalten mit einem GA₃-Gehalt von 6,08g/l. Es wurde eine Aufkonzentrierung der Lösung von 1:10, aber nur eine Aufkonzentrierung der GA₃ von 1:8 erreicht. Aus der Lösung kristallisieren bei 4°C etwa 9g GA₃ aus mit einer Reinheit von 80%.

Beispiel 3:

1001 Kulturfiltrat mit einem GA₃-Gehalt von 970mg/l werden mit einem Modul, der mit 3 Mikrofiltern, 5 UF-Membranen, Typ 60 getempert und 5 RO-Membranen bestückt ist, aufgearbeitet. Bei einem Druck von 0,8MPa und einer Fließgesehwindigkeit von 1 l/min werden 51 Retentatlösung mit einem GA₃-Gehalt von 18,4 g/l erhalten. Bei 4°C kristallisieren rund 77g GA₃ (95%ig) aus. Die Mutterl jge wurde auf 20I verdünnt und hatte einen GA₃-Gehalt von etwa 700mg/l. Diese Lösung wurde wie im Beispiel 1 angegeben aufgearbeitet. Durch Kristallisation wurden 11,9g GA₃ (96%ig) gewonnen.

Beispiel 4:

501 Kulturfiltrat mit einem GA₃-Gehalt von 850 mg/l werden mit einem Plattenmodul, der mit 3 Mikrofiltern und 5 UF Membranen Typ UF 40 ungetempert ausgestattet wurde, aufgearbeitet. Bei einem Druck von 0,8MPa und einer Fließgesehwindigkeit von 1,5l/min wurden 2I Retentat mit 17,8g/) GA₃ erhalten. Aus dieser Lösung kristallisierten bei 4°C sehr langsam 17,3g GA₃ (70%ig) aus. Die Mutterlauge wurde auf 20I verdünnt und enthält 0,91 g/l GA₃. Diese Lösung wurde, wie im Beispeil 1 angegeben, aufgearbeitet, und durch Abkühlen auf 4°C kristallisierten rund 15g GA₃ (93%ig) aus.

Beispiel 5:

101 Kulturfiltrat mit einem Gehalt von 0,76g/l GA₃ wurden mit dem Druck von 0,8MPa und einer Fließgesehwindigkeit von 200ml/min durch einen Plattenmodul gefördert, der mit 3 Mikrofiltern und 5 UF-Membranen des Typs UF 40 getempert ausgelegt worden war. Es wird 11 Retentatlösung erhalten, aus der langsam bei 4°C rund 3 g GA₃ (75%ig) auskristallisieren. Die Mutterlauge wird auf 101 verdünnt und nach Beispiel 1 aufgearbeitet. Nach Abkühlen auf 4°C werden 3,9GA₃ (95%ig) kristallin gewonnen.

Claims (4)

1. Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Gibberellinen aus Kulturlösungen durch Filtration nach Abtrennung der Biomasse durch Grobfiltration mit gleichzeitiger oder nachgeschalteter Fällung mit einer Kombination CaCI₂/Kaolin im schwach sauren pH-Bereich und Abtrennung des Niederschlages, gekennzeichnet dadurch, daß die grobfiltrierte Kulturlösung anschließend über Mikrofilter, getemperte und/oder ungetemperte Ultrafiltrations- und/oder Umkehrosmosemembranen auf der Basis von Celluloseacetat mit einer Porengröße von 1,2 bis 4nm, einem Durchfluß von 0,2 bis 2l/min, der durch Zusammenführung der Filtratströme veränderlich ist, bei einem Arbeitsdruck von 0,3 bis 1 MPa gereinigt und durch Kristallisation die Gibberelline isoliert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Filtration bei einer Porengröße der UF-Membranen von 2,5 bis 3,5nm erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß der Arbeitsdruck 0,5 bis 0,8 MPa beträgt.

4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß diese aus einem Plattenmodul mit Querström besteht, der eine Kombination von in Reihe geschalteten Mikrofilter- und/oder Ultrafiltrations- und/oder Umkehrosmosemembranen mit einer Gesamtfläche von 0,1 bis 2 m² darstellt.