DD276814A1 - Verfahren zur herstellung einer affinitaetsmatrix fuer die trennung biologischer substanzen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Heparinmatrix fuer die Affinitaetschromatografie zwecks Auftrennung von Gemischen biologischer Substanzen, vor allem von Proteingemischen, die durch Gewebe- oder Zellhomogenisation, Zell-Lysierung oder in Zellkulturueberstaenden bzw. Druesentaetigkeit entstehen. Das Verfahren ist in der biotechnologischen Produktion der interessierenden, sich durch unterschiedliche Affinitaet zum Heparinliganden auszeichnenden Proteine bzw. biologische Substanzen anwendbar. Das Ziel der Erfindung besteht darin, erheblich groessere Mengen an kovalent gekoppeltem Heparin/ml Gelmatrix, eine mechanische Beanspruchbarkeit durch die Wahl der Gelmatrix und eine hoehere Stabilitaet und damit Gebrauchseignung durch die Art der Kopplungsbindung des Heparins an die Matrix zu erreichen im Vergleich zu ueblichen Verfahren. Erfindungsgemaess wird Polyacrylhydrazid als geeignete Gelmatrix zur Kopplung von Heparin verwendet. Polyacrylhydrazid eignet sich erfindungsgemaess dann gut zur Kopplung von Heparin, wenn in einem gepufferten Medium mit einem p H-Wert unter 3,8 die kovalente Kopplungsreaktion durchgefuehrt wird. Die Menge des erfindungsgemaessen Kopplungsprodukts bzw. die Heparinkapazitaet der Polyacrylamidderivat-Heparin-Matrix betraegt mindestens 65 Mol Heparin/ml Feuchtgel.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Herstellung einer Affinitäts-Matrix als stationäre Phase bei der Chromatografie (im Säulen- oder Rührbecherverfahren), zwecks Auftrennung von Gemischen biologischer Substanzen, vor allem Proteine, die hinsichtlich ihrer Affinität, d. h. sich an Heparin als Liganden zu binden, fraktionierbar sind.

Das Verfahren ist insbesondere im Rahmen der Herstellung von Enzymen und enzymähnlichen Proteinen anwendbar. Die Proteine können in Gewebehomcgenaten, Zell-Lysaten oder Zeil- bzw. Gewebekulturüberständen vorkommen und mit Batch- oder säulenchromatografischer Technik durch die Heparinligandenbindung extrahiert oder konzentriert werden, wobei die hohe Heparinkopplungskapazität je ml Feuchtgel eine hohe Sorptionsrate ermöglicht.

Das Verfahren ist auch für die Trennung größerer Stoffgemischmengen anwendbar, die entweder gering- oder hochkonzentriert vorliegen und somit für die biotechnologische Produktion von Bedeutung.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Affinitätschromatografieverfahren mit einer stationären Phase, an die Heparin kovalent gebunden ist, sind seit einigen Jahren bekannt.

Sie erleichtern im erheblichen Maße die Extraktion von Proteinen aus einem Gemisch biologischer Substanzen, das durch Homogenisierung von Geweben und Zellverbänden oder durch Lysaterzeugung von Mikroorganismen oder eukaryontischen Zellen entsteht, die die herzustellende biologische Substanz, insbesondere die interessierenden Proteine, erzeugen.

Die unterschiedliche Affinität der Proteine zu matrixgekoppeltem Heparin führt durch schrittweise oder stetige Veränderung des pH-Wertes und/oder der Salzkonzentration in einem Puffer (Stufen- oder Gradientenelution) zur Ablösung von Liganden je nach Bindungsintensität, so daß auf diese Weise eine Fraktionierung erfolgt.

Ein derartiges Vorgehen hat den Vorteil, daß die herzustellenden Proteine auch aus gering konzentrierten Gemischen sowie mit größerer Ausbeute, schonender und schneller im Vergleich zu herkömmlichen älteren Verfahren erhalten werden, die ausschließlich Kombinationen hinsichtlich Auftrennungen infolge Löslichkeitsunterschiede in verschiedenen Salzkonzentrationen, lonenaustauscheigenschaften, Molekülgrößen (Gelfiltrations- und Flotationseffekte), Verhalten im elektrischen Feld und bei Zentrifugation Wanderung im Dichtegradiei ten darstellen.

Die Heparinkopplung an eine stationäre Phase wurde bisher nur für Polysaccharidmatrizen, die als Füll- bzw. Trägermaterial für chromatografische Zwecke verwendet werden, beschrieben. Als Polysaccharidmatrix kommen vor allem Zellulose und Zellulosederivate und kugelähnliche Agarosepartikel verschiedener Größe, unter dem Handelsnahmen Sepharose bekannt, oder Partikel aus Dextran bz8w. Dextranabkömmlingen zur Anwendung.

Die Polysaccharide werden überwiegend mit Bromcyan (CNBr) aktiviert. Nach der Aktivierung erfolgt dann die Bindung des Liganden an das reaktionaaktive Polysaccharidderivat. Die Heparinkopplung an das aktivierte Polysaccharid ist oft wenig effizient. Bei bokannten Methoden wird ein Kopplungserfolg von 0,5-0,6mg/ml CNBr-aktivierte Sepharose 4B aus einer 1,2-1,5mg-ml-Hoparinlösung angegeben (L. Slobin, M. Möller Methods in Enzym V-, I97S, 685-703; J. Goldstein, B.Safer Methods in Enzym LX, 1979,657-676).

Wird die Heparinkopplung üblicherweise über die CNBr-Aktivierung von Agaroso (Sepharose) durchgeführt, sind die Ligandonkonjugato nicht völlig stabil, so daß es zu Auswaschungsverlusten kommt. Die Verwendungshäufigkeit der Hoparinsepharose ist deshalb auf 5-6 Wiederholungen beschränkt (J. Goldstein, B. Safer Methods in Enzym LX, 1979,657-676).

Auch ist es möglich, daß unspezifische Adsorptionen auftreten (M. Wilchek, T. Miron, J. Kohn Methods in Enzym 104,1984,3-55).

Rolysaccharidgele bzw. -partikel sind gegen bakterielle oder pilzliche Verdauung bzw. polysaccharidspaltende Enzyme naturgemäß anfällig. Agarosopartikel haben den weiteren Nachteil, daß sie gegenüber mechanischer Beanspruchung wenig widerstandsfähig sind.

Würde man andere, dem bisherigen Schrifttum entnohmbare Verfahren zur Erzeugung einer geeigneten aktivierten Gelmatrix verwenden, die zur Ligandenkopplung fähig ist und möglicherweise verbesserte Gebrauchseigenschaften aufweisen konnte, so würden sich die Schritte bei der Herstellung sowie der Material- und Zeitaufwand beträchtlich erhöhen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat zum Ziel, an eine stationär» Phase Heparin ."nit deutlich größerer Effizienz kovalent zu koppeln als das bei den herkömmlichen Verfahren bekannt ist. Das Konjugat zwischen stationärer Gelphase und Heparin soll sich durch höhere mechanische Beanspruchbarkeit auszeichnen und die Kopplungsbindung eine Stabilität des Konjugats gewährleisten, so daß sich die Zahl der Affinitätschromatografieläufe erhöhen kann im Vergleich zu der üblicherweise verwendeten Heparin-Sepharose-Matrix als stationäre Phase in der Affinitätschromatografie von biologischen Substanzen mit unterschiedlicher Bindungsneigung zu Heparin. Durch die Art des Gels sowie den Liganden-Gel-Kopplungstyp und durch den höheren Kopplungserfolg sollen die Trennbedingungen verbessert werden. Das Verfahren zielt auf einen geringeren Material- und Zeitaufwand für di6 Herstellung der Affinitätsmatrix im Vergleich zu anderen möglichen Lösungswegen und darauf, daß die Erfahrungen bei der Durchführung der Affinitätschromatografie mit der üblicherweise verwendeten Heparin-Sepharose genutzt werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Es ist Aufgabe der Erfindung, durch eine entsprechende Gelwahl, Gelaktivierung und Gestaltung der Reaktionsbedingungen bei der Erzeugung des Heparin-Konjugates einen höheren Heparinkopplungserfolg zu erreichen als das bei dem üblicherweise verwendeten Verfahren (Herstellung von Heparinagarose) möglich ist.

Des weiteren soll eine stationäre Phase mit hoher mechanischer Beanspruchbarkeit gefunden werden. Dabei müssen die Eigenschaften der aktivierten stationären Phase eine stabile kovalente Kopplung des Liganden ermöglichen und die Verfahrensschritte bei der Herstellung der Affinitätsmatrix im Vergleich zu anderen, bekannten Verfahren verringert sein.

Erfindungsgemäß wird ausgehend von sphärischen Polyacryllamidgelpartikeln das Konjugat zwischen stationärer Gelphase und Heparin hergestellt, indem in wäßrigem Medium bedinclliche sphärische Polyacrylhydrazidpartikel mit underivatisiertem Heparin, das in einer Pufferlösung mit einem pH-Bereich bis zu 3,8 gelöst ist, in Kontakt gebracht wird. Dabei verwendet man einen Carboxylpuffer mit einer Molarität bis 0,2 M und einem pH-Wert bis 3,8. Mit diesem Puffer wird eine 0,2-O,5%ige Heparinlösung hergestellt und 1 Volumen der Lösung mit 1 Gelvolumen 0,5-1 h bei Zimmertemperatur vermischt, daß die Puffermolarität = 0,1 wird.

Mindestens ⁷h des Heparins aus einer 0,2%igen Haparinlösung werden kovalent konjugiert. Der Bindungserfolg kann du'ch Spektrofotometrie bei A 255nm des Überstandes im Vergleich zu 1 Volumen 0,2% Heparinlösung + 1 Volumen H₂O gernessen werden.

Nach Entfernen des ungekoppelten Restheparins mit 0,2 M neutralem Natriumazetat kann die ungekoppelte Heparinmenge auch direkt beispielsweise über die Hexosen-Cysteinreaktion gemessen werden.

Die Resthydrazidgruppen werden beispielsweise durch Essigsäureanhydrid in stabile Azetylhydrazide überführt.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel 1: Herstellung einer Heparin-P300-Matrix

Die Hydrazinderivatisierung von Polyacrylamid wird geringfügig modifiziert nach J. Inman, H. Dintzis Biochemistry 8,1969, 4074-4082, vorgenommen.

Beispielsweise werden 2g Biogel P300 in 80 ml destilliertem H₂O gequollen und mit 6,4 M Hydrazinhydrat (Endkonzentration) bei 47-48⁰C 5h inkubiert. Danach wird mit 0,1 M neutralem CH₃COONa gewaschen, bis im Filtrat keine Hydrazingruppen mehr nachweisbar sind. Der Hydrazidsubstitutionserfolg wird gemessen, indem die Verringerung der 2-4-6-Nitrobenzolsulfonsäure (TNBS)-Konzentration in einer Suspension aus Hydrazidgel in TNBS-Na₂B₄O₇10 H₂O-Lösung festgestellt wird (siehe auch M.Wilchek, T. Miron, J. Kohn Affinity Chromatography Methods in Enzym. 104,1984,76).

Das P300-Hydrazidgel kann in 0,2 M neutralem CH₃COONa · 3H₂0,2mM EDTA · Na₂, gegebenenfalls 0,05% NaN₃, bis 1 Woche bei 0-4⁰C aufbewahrt werden, wird vorzugsweise jedoch am nächsten Tag weiter verwendet.

Das P300-Hydrazidgel wird mit destilliertem H₂O gewaschen. 10ml Gel werden mit 10ml, je nach Hydrazidsubstitutionserfoig, 0,2-0,5% Natriumheparinlösung in 0,2 M Natriumazetatpuffer pH 3,6 30min mit einem Magnetrührer bei Zimmertemperatur gemischt. Das Gel wird dann mit etwa 110,2 M neutralem CH₃COONa gewaschen, um das ungekoppelte Heparin zu entfernen.

Zur Umwandlung des Resthydrazidgruppen in Azetylhydrazid werden 2 ml (CH₃CO)₂O in 50 ml 0,2 M neutralem CH₃COONa rasch vermischt. Das Essigsäureanhydridgemisch wird 2-3 Minuten mit dem Gel verrührt und dann entfernt. Das Gel wird mit etwa 21 0,2 M neutralem CH₃COONa gewaschen. Man kann dann eine Prüfung mit Trinitrobenzolsulfonsäurelösung auf Resthydrazidgruppen im Gel wahrnehmen.

Der Heparinkopplungserfolg kann beispielsweise mit der Cysteinreaktion (Z. Dische, J. Biol.Chem. 181,1949,379, zitiert von

G. Ashwell Methods in Enzym. Ill, 1957,73-105) mit geringfügigen Modifikationen der Originalvorschrift bestimmt werdon.

Zu 2,5ml einer H₂SO₄-Verdünnung (8VoIH₂SO₄ + 1 VoI H₂O) werden 0,5 Prüflösung (Heparingel in 0,2 Mk neutralem CH₃COONa) im Eisbad gemischt, die 10 bis 100/ig Hexosen enthält. Anschließend wird 3-4 minim kochenden Wasserbad hydrolysiert. Nach Abkühlung wird 0,1 ml Cystein (2% in 0,1 NHCI) pipettiert, gemischt und nach 1 h (Zimmertemperatur) nahe dem Absorptionsoptimum (A4~15nm)gemesson.

Als Standard wird 0,02% bis 0,2% Heparin in 0,2 M neutralem CH₃COONa eingesetzt, die je nach Konzentration eine rosa bis lila Färbung ergibt. Als Blindwert wird unsubstituiertes Biogel P300oder Hydrazid P300 in 0,2 M neutralem CH₃COONa verwendet.

Ausführungsbeispiel 2: Affinitätschromatografische Herstellung einer mit dem Translations-F.longationsfaktor 1 (EF-1) angereicherten Proteinfraktion

über die Extraktion der Ribosomen und des postribosomalen Überstandes Der nahe der elektrophonischen Homogenität gereinigte EF-1 ist Bestandteil beispielsweise eines Testes auf Wirksamkeit von Wachstumshemmstoffen für pathophysiologisches Wachstum von Zellen und Geweben unter dem Aspekt der Hemmung der EF 1-Aserns-Ribosomuntereinheit-Template-Bindung und wird hinsichtlich des Zeitbedarfs und des Materialeinsatzes am vorteilhaftesten mit der Heparinaffinitätschromatografie angereichert.

10ml der im Beispiel 1 hergestellten HeparirvP300-Ligandenmatrix werden in eine kühlbare Chromatografiesäule (20-30cm Länge mit Adapter, 1 cm Durchmesser) gegeben.

Äquilibriert ist das Gel mit 2OmM Tris HCI pH 7,8 bei 4°C, 0,2mM EDTA · Na₂,14mM 2-Merkaptoäthanol, 15% Glyzerin - im folgenden Puffer genannt-und 2OmM KCI.

Ein 50% Leberhomogenat, in dem die Ribosomen durch Detergenzien freigesetzt wurden, wird zentrifugiert, so daß ein postmitochondrialer Überstand nach einem bekannten Verfahren entsteht (B.Löhrke,Theor.Appl.Genet.70,1985,667-670).

Der die Ribosomenfraktion enthaltende Überstand wird mit 0,5 M KCI (Endkonzentration) extrahiert und durch Zentrifugation postribosomaler Überstand erhalten.

Der Überstand wird mit (NH₄I₂SO₄ in 5OmM Tris · HCI pH 7,6,20°C, 14mM 2 Merkaptoäthanol, 0,2 mM EDTA-Na₂ nach einem bekannten Verfahren (T.Staehelin, B.Erni, M.Schreier Methods in Enzym. l.X, 1979,136-165) fraktioniert. Die 85% von der Gesamt-EF 1-Menge enthaltende Fraktion wird gegen Puffer dialysiert, die Proteinkonzentration mit dem A210-Verfahren (B.Löhrke Z.med.Lab.diag.27,1986,92-96) bestimmt, auf etwa 60 mg/ml eingestellt und die resultierenden 15-25 ml auf das Heparin P300 Gel aufgetragen. Mit 50mM KCI-Puffer wird das Gel gewaschen, bis A280 auf den Ausgangswert (oder unter 0,1) zurückgeht. Dann wird mit 12OmM KCI-Puffer die EF1-Fraktion eluiert.

Wird auch auf die Präparation von Translationsiniliationsfaktoren Wert elegt, kann man, wie für die Heparin-Sopharose 4B Matrix beschrieben, vorgehen (LSIobin, W.Möller Methods in Enzym. LX, 1979,685-703).

Mit 1M KC1-Puffer werden alle noch am Liganden haftenden Moleküle (vor allem Ribonukleinsäuren) abgelöst und das Heparingel auf diese Weise regeneriert. Es wild im Puffer mit 0,05% bei 0°-4°C aufbewahrt.

Zur weiteren Erhöhung der Reinheitsstufe der EF1-Fraktion bis nahe der elektrophonischen Homogenität schließt sich eine Carboxymethyl-Ionenaustauschchromatographie mit beispielsweise CM-Sophadex C 25 oder wie beschrieben (K. Iwasaki, Y.Kaziro Methods in Enzym. LX, 1979,657-676) an.

Ausführungsbeispiel 3: Affinitätschromatografische Herstellung einer mit dem Translations-Elongations-Faktor (EF-1) angereicherten Proteinfraktion

ohne Salzextraktion

Da der ribosomengebundone EM-Anteil gering ist gegenüber dem im postribosomalen Überstand befindlichen Anteil (L.SIobin Europ.J.Biochem.110,1980,555-563), kann die EF-1-Herstellung mit der Heparin-P300-Affinitätschromatografie durch Auftragung dieses Überstandes ohne vorherige Salzextraktion, Salzfraktionierung und Dialyse erfolgen. Der Überstand kann auch in einem ersten Schritt in einem Becherrührverfahren mit dem matrixgebundenen Heparinliganden in Kontakt gebracht und dann, wie im Beispiel 2 beschrieben, gewaschen und eluiert werden.

Liegen statt Gewebe Zellen vor (meist Ret-ikulozyten oder in vitro bzw. in situ proliferative Tumorzellen), wird das Lysat oder sein postribosomaler Überstand der Heparin-P300-Affinitätschromatografie unterzogen, wie für die üblicherweise verwendete Hepara-Sepharose 4B-Matrix beschrieben (J.Goldstein, B.Safer Methods in Enzym. LX 1979,165-181). Die erfindungsgemäße Heparin-Polyacrylamidderivat-Matrix kann zwecks Anheftung eines Heparin als Liganden akzeptierenden Stoffes und zur fraktionellen Ablösung im pH-Bereich 3 bis 10 und bei Salzkonzentrationen bis 2 M verwendet werden. Die Affinitätsmatrix ist besonders geeignet zur Auftrennung eines Gemisches aus biologischen Substanzen, wie es bei der Homogenisation von Geweben oder Zellverbänden und Lysutenerzeugung aus Zellen entsteht.

Wie bei der bisher bekannten bzw. üblicherweise verwendeten Heparin-Sepharose-Matrix wird die unterschiedliche Affinität verschiedener Proteine und Ribonukleinsäuren zum Heparinliganden benutzt, um im Verlaufe eines pH- oder/und Salzgradienten bzw. durch schrittweise Änderung von pH- und/oder Salzkonzentrationswerten eine getrennte Elution herbeizuführen (siehe Anwendungsbeispiel 2). Eine hohe Heparinkonzentration/ml Feuchtgel (mindestens 1,4 mg/ml im Vergleich zu der üblichen CNBr-aktivierten-Sepharose-Kopplung mit einem Kopplungserfolg von 0,5-0,6mg Heparin/ml Feuchtgel) begünstigt die Auftrennung der Gemische von wäßrig löslichen biologischen Molekülen, wenn sie im Isolierungsverlauf zur Vermeidung von Denaturierungen in hoher Konzentration gehalten werden müssen, infolge der ausreichenden Ligandenkapazität und der Art der Liganden-Gelmatrix-Kopplungsbindung.

Die mechanische Beanspruchbarkeit gewährleistet, daß das erfindungsgemäße Polyacrylamidderivat-Heparin-Gel zur Affinitätschromatografie bzw. als Konzentrierungsmittel in einem Rührgefäß (Batchtechnik) mit dem Stoffgemisch intensiv durchmischt werden kann, ohne Vorsorge gegen ein Zerbrechen der Gelpartikel treffen zu müssen.

Die Affinitätschromatografie in Glassäulen unter Nutzung der erfindungsgemäßen Heparin-Polyacrylamidderivat-Matrix wird andererseits dann bevorzugt, wenn stetige Gradienten zur Elution eingesetzt werden oder Gelfiltrationswirkungen in Kombination mit den Ligandenbindungseffekten ausgenutzt warden sollen. Die Lauf eigenschaften der neuen Heparaingelmatrix ähnelt bei Verwendung von Biogel P300 zur Derivatisierung denen der üblicherweise verwendeten Heparin-Sepharose-4B-Matrix.

Das erfindungsgemäße Hepnrin-Polyacrylamidderivat hat nicht nur eine höhere Heparinkapazität, sondern ist als Matrix öfter vorwendungsfähig als die bekannte Heparin-Sepharose-Matrix.

Während für letztere bis 5 Chromatografieläufe empfohlen worden (J. Goldstein, B. Safer Methods in Enzym. LX, 1979,165-181), können mit dor erfindungsgemäßen Heparinmatrix über 10 Chromatografieläufe ohne erkennbare Aktivitätsverluste ,vorgenommen werden. Die Stabilität der erfindungsgemäßen Heparinmatrix bei neutralem pH, einer Puffermolarität um 0,2, Anwesenheit von 0,05% NaN₃ und O⁰C bis 4⁰C beträgt übor 12 Monate.

Für die üblicherweise verwendete Hoparin-Sepharose-4B-Matrix werden bis zu 6 Monate ausgewiesen (J.Goldstein, B.Safer Methods in Enzym. LX, 1979,165-181).

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung einer Affinitätsmatrix für die Auftrennung biologischer Sustanzen, insbesondere Proteine, mittels Chromatografie über eine Matrix, die Heparin immobilisiert enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Heparin in underivatisierter Form an die stationäre Phase konjugiert wird, wobei es als Ligand gegenüber der in wäßriger, gepufferter oder gepufferter und eine Salzmischung oder Zusätze von organischen Lösungsmitteln enthaltende Lösung abzutrennenden Substanz Wirksamkeit entfaltet und das als Matrix, die für die Heparinkopplung derivatisiert wird, sphärische Polyacrylamidpartikel verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Heparinkopplung über eine Hydrazid-Derivatisierung der Aminogruppen von Polyacrylamidgelpartikeln in einem gepufferten Medium erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Medium für die kovalente Kopplung des Heparins als Liganden an die Polyacrylhydrazidpartikel ein Carboxyl-Puffer mit einer Molarität bis 0,2 M und einem pH-Wert bis 3,8 verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Heparinlösung mit einer Konzentration von 0,2% bis 0,5% mit dem Hydrazidgel in einem Verhältnis von 1:1 über einen Zeitraum bis zu 60 Minuten bei Zimmertemperatur gemischt wird.