DD276531A1

DD276531A1 - Testbesteck zur immunenzymometrischen bestimmung von humanem wachstumshormon (hgh)

Info

Publication number: DD276531A1
Application number: DD32104788A
Authority: DD
Inventors: Luise Pasternak; Franz Noll; Bernhard Neef
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1988-10-25
Filing date: 1988-10-25
Publication date: 1990-02-28

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Testbesteck zur immunenzymometrischen Bestimmung von humanem Wachstumshormon (hGH) fuer die medizinische Diagnostik sowie fuer das biotechnologisch hergestellte rekombinante hGH zur Prozesskontrolle. Das erfindungsgemaesse Testbesteck ist dadurch gekennzeichnet, dass es aus dem ersten, an der festen Phase fixierten monoklonalem AK (mAK) A64-D/E3 (ZIM-0199) oder A9 (ZIM-0289), dem zweiten mit einem Enzym markierten mAK A64-E/C8 (ZIM-0200) oder A64-E-/B12 (ZIM-0202), einem hGH-Standardpraeparat, dem Enzymsubstrat und einem Chromogen oder Fluorogen oder Luminogen besteht. Erfindungswesentlich ist die Auswahl des jeweiligen Antikoerper-Paares, wobei beide mAK an raeumlich distinkte antigene Determinanten binden, so dass eine quantitative hGH-Bestimmung im Bereich von 0,01 ng/ml bis 50 ng/ml durchfuehrbar ist und die Moeglichkeit der wahlweisen Messung der an der festen Phase gebundenen Enzymaktivitaet durch Photometrie, Fluoreszenz- oder Chemiluminiszenzmessung besteht.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Testbosteck für die Durchführung von quantitativen Bestimmungen von humanem Wachstumshormon in Lösungen, das für die medizinische Diagnostik und für die Prozeßkontrolle bei der biotechnologischen Herstellung von rekombinantem hGH benötigt wird.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

hGH ist ein Polypeptidhormon, Has in der Hypophyse gebildet wird und das Körperwachstum reguliert. Regulationsstörungen in der hGH-Bildung bzw. -Ausschüttung führen zu Minderwuchs. Die Therapie des Minderwuchses erfolgt durch Substitution des hGH, wobei zunehmend gen'.echnisch hergestellte Produkte eingesetzt werden.

Für die Diagnostik und eine effektive Therapie sowie für die Produktionskontrolle bei der gentechnischen Herstellung von rekombinantem hGH ist ein empfindliches, quantitatives und schnelles Bestimmungsverfahren für hGH erforderlich. Bishei ige Testsysteme zum hGH-Nachweis beruhen in erster Linie auf konventionollen Radioimmunoassays (RIA) mit polyklonalen Antiseren (z. B. hGH-RIA Sebnitz IDDR]; hGH-RIA Kit der Fa.Cambridge Medical Diagnostics IUSA)). Polygonale Antikörper haben den Nachteil, daß ihre Herstellung zu Antikörpergemischen unterschiedlicher Quantität und Qualität führt. Unter diesem Gesichtspunkt wurden von verschiedenen Herstellern die polyklonalen Antikörper im RIA dur„h monoklonal Antikörper ersetzt (z.B. F. Gomez, G.Pirens, C.Schaus, J.CIosset, G.Hennen J.: Immunoassay 5,115-157 (1984]; R Aston, L. Cooper, A. Holder, I. Ivanji, M.Preece: Molec. Immunol. 22, 271-275(1985)). Besonders vorteilhaft sind dabei immunomctrische Tests nach dem Zweiseitenbindungsprinzip, die gegenüber kompetitiven Bindungstests eine erhöhte Empfindlichkeit und Präzision garantieren (z.B. Sucrosep™ immunoradiometric assay hGH der Fa.Boots-Celltech Diagnostics Ltd. (England); hGH TandemR Kit der Fa. Hybritech Europa S.A. !Belgien]). Trotz dieser verbesserten Qualitätsparameter haftet den immunoradiometrischen Tests dor Nachteil des Umgangs mit Radioaktivität und der relativ kurzen Verwendungszeit der Testkits an. Diese Nachteile können durch Verwendung nichtradioaktiver Markör (Enzyme/Fluorogene) umgegangen werden. Solche Tests wurden von verschiedenen Autoren beschrieben (S.Hashida, E.lshikawa: Anal. Letters 18 1143-1155 (10851; T. Torresani, E. Schuster, B. Dinosen, R. IlIig wird nachgereicht), jedoch kommen dabei nur polygonale Antikörper zum Einsatz. Von der Fa. Nordisk Gentofte A/S (Produkt) wird kommerziell ein immunoenzymometrischer Testkit zur Bestimmung von hGH auf Basis eines polyklonalon AS vom Meerschweinchon angeboten. Ein entsprechender Test mit luminometrischer Messung wurde von WEEKS beschrieben (I. Weeks: CNn. Chim. Acta 159 139-145 (1986)).

oder es gehen nichtstandardisiorbare Testbestandteile wie polyklonalo Antikörper ein.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Tastbar.er k zur Verfügung zu stellen, mit dem hGH quantitativ, schnell und präzise noch in sehr geringer Konzentration und ohne Einsatz ν on Radioaktivität routinemäßig bestimmbar ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Testbestock zur immunanzymomeidschen Bestimmung von humanem Wachstumshormon ist dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus

- dem ersten, an der festen Phase fixierten mAK A64-D/E3 (ZIM-0199) oder dessen Fab-Fragmente

- dem zweiten, mit Enzym markiorton mAK A64-E/C8 (ZIM-0200) oder dessen enzymmsrkierten Fab-Fragmenten

- dom hGH-Standardpräparat

- einem vom Standard unabhängigen Kontrollmaterial

- dem Chromogon oder gegebenenfalls an Stelle des Chromogens ein Luminogen und ein Verstärkerreagens oder ein Fluorogen

- dem Puffer zum Aufnohmon des markierten mAK

- dem Enzymsubstrat

- dem Substratpuffer

- einer Boschreibung für die Testdurchführung oder

daß es besteht aus

- dem ersten, an der festen Phase fixierten mAK Il A9 (ZIM-0289) oder dessen Fab-Fragmente,

- dem zweiten, mit Enzym markierten mAK A64-E/B12 (ZIM-0202) oder dessen enzyrnmarkierten Fab-Fragmenten

- demhGH-Standardpräparet

- einem vom Standard unabhängigen Kontrollmaterial

- dem Chromogen oder gegebenenfalls an Stelle des Chromogens ein Luminogen und ein Verstärkerreagens oder ein Fluorogen

- dem Puffer zum Aufnehmen des markierten mAK

- dem Enzymsubstrat

- dem Substratpuffer

- einer Beschreibung für die 1 Ostdurchführung oder

dafi es besteht aus

- einer festen Phase

- dem ersten mAK A64-D/E 3 (ZIM-0199) oder dessen Fab-Fragmente

- dem zweiten, mit Enzym markierten mAK A64-E/C8 (ZIM-0200) oder dessen enzymmarkierten Fab-Fragmenten

- dom hGH-Standardpräparat

- einem vom Standard unabhängigen Kontrollpräparat

- dem Chromogen oder gegebenenfalls an Stelle des Chromogens ein Luminogen und ein Verstärkerreagens oder ein Fljorogen

- ein Puffersubstanz zum Aufnehmen des ersten mAK

- dem Puffer zum Aufnehmen des markierten mAK

- einer Lösung zum Blockieren freigebliebener proteinbindender Stellen an der festen Phase

- dem Enzymsubstrat

- dem Substratpuffor

- einer Beschreibung für die Testdurchführung odei

daß es besteht aus

- einer festen Phase

- dem ersten mAK Il A9 (ZIM-0289} oder dessen Fab-Fragmente

- dem zweiten, mit Enzym markierten mAK A64-E/B12 (ZIM-0202) odor dessen enzymmarkierten Fab-Fragmenten

- dem hGH-Standardpräparat

- einem vom Standard unabhängigen Kontrollmaterial

- dem Chromogen oder gegebenenfalls an Stelle des Chromogens ein Luminogen und ein Verstärkerreagen· oder ein Fluorogen

- einer Puffersubstanz zum Aufnehmen des ersten mAK

- dem Puffer zum Aufnehmen des markierten mAK

- einer Lösung zum Blockieren freigebliebener protoinbindender Stellen an dor festen Phase

- dem Enzymsubstrat

- dem Substratpuffer

- einer Beschreibung für die Tostdurchführung.

Die jeweils paarweise eingesetzten mAK sind gegen räumlich distinkte antigene Determinanten gerichtet. Dadurch und durch die

hohe Bindungsstärke der mAK an das hGH-Molekül ist die hohe Empfindlichkeit des Testes gegeben.

Für die Auswahl dor jeweiligen Antikörperpaaro sind darüber hinaus ihre Eigenschaften hinsichtlich ihrer Adsorptionsfähigkeit

an Plastoberflächen sowie ihre Markierbarkeit von entscheidender Bedeutung. Als mAK können entweder die natürlichen

Produkte der Zellinien ZIM-0199 (A64D/E3), ZIM-0200 (A64-E/C8), ZIM-0288 (IIA9) und ZIM-0202 (A64E/B12) eingesetzt

werden oder deren durch enzymatische Spaltung gewonnenen Fab-Fragmente.

Der jeweils arste mAK wird an die Oberfläche der Näpfe von Reaktionsgefäßen aus Plaste oder einem anderen Material,

vorzugswoiso an 96-Napf Mikrotostplatton (MTP) aus Polystyren adsorbiert. Solche mit mAK bereits vorbeschichtete MTP im

Testbosteck sind besonders anwenderfreundlich. Der Anwender kann aber auch die Beschichtung der MTP mit dom ersten mAK

selbst vornehmen. Zur Erhöhung der Proteinbindung an die feste Phase kann deren Oberfläche mit Haftvermittlern, z.B.

siliciumorganische Verbindungen vorbehandelt werden (DD-WP/288647, DD-WP/305376).

Im Fall der Variante, daß der Anwender die Beschichtung der MTP selbst vornimmt, ist dem Testbesteck eine Rlockierungssubstanz beigefügt, die NHj-Gruppen und/oder Proteine enthält, um die nach der Beschichtung der MTP mit dem

ersten mAK freigcbliebenon unspezifischen Adsorptionsstellen blockieren zu können. Hierfür eignet sich z.B. Gelafusal".

Der jeweils zweite Antikörper ist auf an sich bekannte Woise mit einem Markerenzym konjugiert, vorzugsweise mit Meerrettichperoxydase. Dadurch kann wahlweise eine photometrische Auswertung oder oine weit empfindlichere,

luminometrische oder auch fluorometrisch^ Auswertung erfolgen.

Je nach Auswertomodus kommen Chromogene, Luminogene oder Fluorogene für die Nachweisreaktion in Frage. Als Chromogene wo'den vorzugsweise o-Phenylendiamin oder ABTS (2,2-Azino-di-3enthylbenzthiazolin-sulfat) eingesetzt. Als Luminogen werden vorzugsweise Luminol oder dessen Derivate und als Verstärkerreagens Jodphenol eingesetzt. Als Fluorogene eigenen vieh besonders p-Hydroxyphenylpropionsäure oder p-Hydroxylphenylessigsöure. Die empfindlichsten Nachweisrcdkürnen < »Orden mit Hilfe dor Chemilumineszenz und der Fluororeszenzmessung erhalten. So liogt der Meßbereich

entweder bei 0,1 ng/ml-12,5ng/ml oder bei 0,01 ng/mMOng/ml.

.Der Vorteil des erfindungsgemäßen Testbesteckes liegt in der hohen Nachweisempfindlichkeit für hGH, die sich aus der Auswahl der mAK-Paare mit den vorteilhaften Eigenschaften für dio Adsorption an die feste Phase, für die Konjugation mit einem

Markctcnzym und aus der Nutzung der Zwoiseitenbindungstechnik sowie den empfindlichen Nachweisreaktionen ergibt.

Der Testkit besticht durch seine hohe Anwenderfreundlichkeit, d. h. die einfache Durchführbarkeit des immunenzymometrischen Tests, die kurzen Testzeiten und die lange Verwendbarkeit (mind. 1 Jahr). Darüber hinaus ist dieses Testbesteck sehr umweltfreundlich und in einem beliebigen Laboratorium machbar ohne speziell geschultes Personal, ohne spezielle Ausrüstungen und Schutzvorrichtungen sowie ohne Abfallprobleme, da hierbei keine Radioaktivität zum Einsatz kommt. Außerdem ist die Verwendung dieses Testbestecks materialsparend, da alle Waschschritte bei der Durchführung des immunenzymometrischen Tests mit Leitungswasser vorgenommen werden können.

Ausführungsbeispiele

1. Beispiel: Das Testbesteck besteht ausfolgenden Komponenten:

- oiner Mikrot»stplatte, deren Näpfe beschichtet sind mit dem mAKA64-D/E3(ZIM-0199) und deren unspezifische Bindungsstel en für Proteine blockiert sind.

- dem zweiten niAK (A64-E/C8 [ZIM-0200]), der mit Meerrettich-Peroxydase markiert ist.

- den Puffer zum Aufnehmen des markierten mAK: 0.05M Tris/HCI-pH 7,4- 0,2 M NaCI -0,1 %, Tween 20-10% Gelafusal": davon 10mi

- dem Substratpuffer: 0.15M Na₂HPO₄-0,07MZitronensäure-pH5,0; 25ml

- dem Enzymsubstrat: 30% HjO₂

- dem Chromogeti: 8mg o-Phenylendiamin

- der Boschreibung für die Testdurchführung

- Kontrollmaterial mit deklariertem hGH-Gehalt

- dem hGH-Standardpräparat in acht Konzentrationen zu jeweils 0,4ml: 0,1 ng/ml; 0,2ng/ml; 0,4ng/ml; 0,4ng/ml; 0,8ng/ml; 1,6ng/ml; 3,2ng/ml; 6,4ng/ml; 12,8ng/ml; 0ng/ml.

2. Beispiel: Da* Testbesteck besteht aus folgenden Bestandteilen:

- einer Mikrotestplatte, deren Näpfe mit dem mAK IIA9 (ZIM-0289) beschichtet sind und deren unspezifische Bindungsstellen für Proteine blockiert sind.

- dem zweiten mAK (A64-E/B12 IZIM-0202]), der mit Meerrettich-Peroxydase markiert ist.

- dem Puffer zum Aufnehmen des markierten mAK: 0.05M Tris/HCI-pH7,4- 0,2 M NaCI- 0,1 %, Tween 20-10% Gelafusal"; davon 10ml

- dem hGH-Standardpräparat in acht Konzentrationen zu jeweils 0,4ml: 0,1 ng/ml; 0,2 ng/ml; 0,4 ng/ml; 0,8ng/ml; 1,6ng/ml; 3,2ng/ml; 6,4ng/ml; 12,8ng/ml; Ong/rnl.

- dem Substratpuffer: 0,15M Na₂HPO₄ -0,07 N Zitronensäure -pH 5,0; 25ml

- dem Enzymsubstret: 30% H₂O₂

- dem Chromagen: 8mg o-Phenylendiamin

- der Beschreibung der Tostdurchführung

- dom Kontrollmaterial mit deklariertem hGH-Gehalt.

3. Beispiel: Das Tostbesteck besteht aus:

- einer Mikroplatte mit 96 Näpfen

- dem ersten mAK A64-D/E 3 (ZIM-0199): 10ml (20pg Antikörper/ml 0,01 M Phosphat-0,15M NaCI, pH7,4-MerthiolatO,.02%)

- einer Blockierungslösung: 0.05M Tris/HCI - pH 7,4 - 0,2 M NaCI - 0,1 % Tween 20-10% Gelafusal" davon 35ml

- dem zweiten mAK (A64-E/C8 (ZIM-0200)), der mit Meerrettich-Peroxydase markiert ist;

- dem hGH-Standardpräparat in acht Konzentrationen zu jeweils 0,4ml: 0,1 ng/ml; 0,2 ng/ml; 0,4 ng/ml; 0,8ng/ml; 1,6ng/ml 3,2ng/ml; 6,4ng/ml; 12,8ng/ml; 0ng/ml.

- dem Substratpuffer: 0,15M Na₂HPO₄ - 0,07 M Zitronensäure -pH5,0; 25ml

- dem Enzymsubstrat: 30% H₂Oj

- dom Chromagen: 8mg o-Phenylendiamin

- der Beschreibung der Testdurchführung

- dem Kontrollmaterial mit deklariertem hGH-Gehalt.

4. Beispiel: Das Tostbes' eck hat folgende Zusammensetzung:

- eine Mikrotestplatte rr it 96 Näpfen

- eiern ersten mAK Il A9 (ZIM-0289): 10ml (20μρ Antikörper/ml 0,01 M Phosphat - 0,15M NaCI - pH 7,4 - Merthiolat 0,02%)

- einer Blockierungslösung: 0.05M Tris/HCI-pH 7,4 - 0,2M NaCI -0,1 % Tween 20-10% Gelafusal" davon 35ml

- dom zweiten mAK (A64-E/B12 IZIM-0202)), der mit Meerrettich-Peroxydase markiort ist

- dem hGH-Standardpräparat in acht Konzentrationen zu jeweils 0,4ml: 0,1 ng/ml; 0,2 ng/ml; 0,4 ng/ml; G,8ng/ml; 1,6ng/ml; 3,2ng/ml; 6,4ng/ml; 12,8ng/ml; 0ng/ml.

- dem Substratpuffer: 0.15M Na₂HPO₄ -0,07 M Zitronensäure -pH 5,0; 25ml

- dem Enzymsubstrat: 30% H₂O₂

- dem Chromogen: 8mg o-Phenylendiamin

- der Beschreibung der Testdurchführung

- dem Kontrollmaterial mit deklariertem hGH-Gehalt.

5. Beispiel: Das Testbesteck für luminometrische Auswertung bestoht aus:

- einer Mikrotestplatte, deren Näpfe beschichtet sind mit dem mAK A64-D/E 3 (ZIM-0199) und deren unspezifische Dindungsstellen für Protoine blockiert sind

- dem zweiten mAK (A64-E/C8IZIM-0200)), der mit Meerrettich-Peroxydase markiert ist

dem hGh-Standardpräparat (12,8ng/ml); 1 ml; Nullserum 5ml dem Luminogen: 2,5mg Na-Luminol dem Verstärkerreagens: 5mg Jodphenol dem Substratpuffer: 0,2 M Natriumborat, pH8,6,25ml dem Puffer zum Aufnehmen des markierten mAK: 0.05M Tris/HCI - pH 7,4 - 0,2 M NaCI -0,1 % Tween, 20-10% Gelafusal"; davon 10ml.

dem Enzymsubstrat: 30%ig H₂Oj dam Kontrollmaterial mit deklariertem hGH-Gehalt der Beschreibung der Testdurchführung.

Claims

1. Testbesteck zur immunenzymometrischen Bestimmung von humanem Wachstumshormon (hGH), dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus

- einem Festphasenträger, an dem der erste mAK A64-D/E3 (ZIM 0199) oder dessen Fab-Fragmente fixiert sind

- dem hGH-Standardpräparat

-· einem vom Standard 'inabhängigen Kontrollmaterial

- dem Puffer zum Aufnehmen des markierten mAK

- dem Enzymsubstrat

- dem Substratpuffer oder

daß es besteht aus

- einem Festphasenträger, an dem der erste mAK Il A9 (ZIM-0289) oder dessen Fab-Fragmente fixiert ist

- dem zweiten, mit Enzym markierten mAK A64-E/B12 (ZIM-0202) oder dessen enzymmarkierten Fab-Fragmenten

- dem hGH-Standardpräparat

- einem vom Standard unabhängigen Kontrollmaterial

- dem Puffer zum Aufnahmen des markierten mAK

- dem Enzymsubstrat

- dem Substratpuffer daß es besteht aus

- einer festen Phase (Festphasenträger)

- dem ersten mAK A64-D/E3 (ΖΙΜ-0Ί99) oder dessen Fab-Fragmente

- dem zweiten, mit Enzym markierten mAK A64-E/C8 (ZIM-0200)

- dem hGH-Standardpräparat

- einem vom Standard unabhängigen Kontrollmaterial

- dem Chromogen oder gegebenenfalls an Stelle des Chromogens ein u'jminogen und ein Verstärkerreagens oder ein Fluorogen

- einer Puffersubstanz zum Aufnehmen des ersten mAK

- dem Puffer zum Aufnehmen des markierten mAK

- einer Lösung zum Blockieren freigebliebener protoinbindender Stellen an der festen Phase

- dem Enzymsubstrat . - dem Substratpuffer

oder
daß es besteht aus

- einer festen Phase (Festphasenträger)

- dem ersten mAK Il A9 (ZIM-0289) oder dessen Fab-Fragmente

- dem hGH-Standardpräparat

- einem vom Standard unabhängigen Kontrollmaterial

- einer Puffersubstanz zum Aufnehmen des ersten mAK

- dem Puffer zum Aufnehmen des markierten mAK

- einer Lösung zum Blockieren frei gebliebener proteinbindender Stellen an der festen Phase

- dem Enzymsubstrat

- dem Substratpuffer

2. Testbesteck nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase eine 96-Napf-Mikrotestplatto ist.

3. Testbesteck nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym am zweiten mAK Meerrettichperoxydase ist.

4. Töstbesteck nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromogen o-Phenylendiamin, ABTS (2,2'-Azino-di-3-9thylbenzthiazclin-sulfünat (6) ist.

5. Testbestock nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Luminogen, Luminol sowie dessen Derivate und das Verstärkerreagens Jodphenol oder Phenylphenol ist.

6. Testbesteck nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluorogen p-Hydroxyphenylpropionsäure odor p-Hydroxyphenylossigsäure ist.