ITMI20101068A1 - Metodo per la determinazione dell'attivita' somatotropa - Google Patents

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Description

Titolo: “METODO PER LA DETERMINAZIONE DELL’ATTIVITA’ SOMATOTROPAâ€
Descrizione
E’ oggetto della presente invenzione un metodo per la determinazione dell’attività somatotropa in campioni biologici.
E’ ulteriore oggetto della presente invenzione un kit che permetta lo svolgimento della metodica di cui sopra.
Stato dell’arte
La somatotropina o GH à ̈ un polipeptide costituito da una catena singola di 191 aminoacidi e avente un peso molecolare di 22 kDa (Lewis et al., 2000). In circolo, oltre a questa che à ̈ la forma molecolare predominante, sono presenti una serie di isoforme, la principale delle quali à ̈ costituita da 176 aminoacidi ed ha una massa molecolare di 20 kDa. Si ritrovano anche frammenti di 5 e 17 kDa che si formano per proteolisi nonchà ̈ dimeri e trimeri delle isoforme di cui sopra.
Il GH ha un ruolo fondamentale nel regolare il normale accrescimento scheletrico e ponderale dell’individuo immaturo. Inoltre, il GH influenza spiccatamente lungo tutto l’arco della vita il metabolismo delle proteine, dei carboidrati e dei lipidi.
Il GH à ̈ secreto dall’ipofisi e tale secrezione à ̈ regolata principalmente da due neurormoni ipotalamici con funzioni opposte, il GHRH (Growth Hormone-Releasing Hormone), dotato di attività stimolatoria, e la somatostatina (SS), inibitoria. I neuroni ipotalamici che producono GHRH e SS sono a loro volta posti sotto il controllo di aree cerebrali superiori, grazie all’azione di numerosi neurotrasmettitori e neuropeptidi la cui azione integrata serve per adeguare la secrezione ormonale al variare delle condizioni di natura metabolica, ormonale, ambientale (Muller et al., 1999).
Questa complessa rete funzionale costituita da ormoni, neuropeptidi e neurotrasmettitori la cui azione si integra a livello ipotalamo-ipofisario à ̈ responsabile del profilo secretorio del GH, caratterizzato dalla presenza di picchi di concentrazione intervallati da periodi in cui la produzione à ̈ ridotta o addirittura assente (Veldhuis, 1998). E’ possibile individuare un ritmo di secrezione simil-circadiano in base al quale il 70-75% dell’ormone viene secreto in stretta correlazione con le fasi 3 e 4 del sonno profondo. Sovrapposto a questo ritmo se ne può evidenziare un altro, di tipo ultradiano, cioà ̈ con una fase dell’ordine di qualche ora, caratterizzato dalla presenza di picchi spontanei che si susseguono in modo abbastanza casuale sia durante il sonno che la veglia. Inoltre, l’entità globale della secrezione di GH varia considerevolmente con l’età: aumenta rapidamente dopo la nascita e raggiunge un massimo intorno alla pubertà, dopo di che decresce, fin quasi ad azzerarsi in una considerevole percentuale di individui anziani (Corpas et al., 1993).
Il profilo secretorio somatotropo differisce anche in base al sesso: gli steroidi sessuali femminili fanno sì che gli episodi secretori spontanei presentino una maggiore ampiezza e siano separati da periodi caratterizzati da una linea basale più elevata rispetto a quanto osservato nell’uomo (Veldhuis, 1998).
Il GH induce l’espressione dei geni che codificano per i fattori di crescita insulino-simili (Insulin-like Growth Factors, IGFs) di tipo 1 e 2. Il GH esercita inoltre un ruolo fondamentale nei processi di rimodellamento osseo (Chihara et al., 1997; Ohlsson et al., 1998), processi che risultano dalla formazione di peptidi che possono essere classificati come marcatori specifici di formazione o di riassorbimento osseo. In particolare, tra gli altri, appartengono al primo gruppo la fosfatasi alcalina ossea, l’osteocalcina, il propeptide C-terminale del procollagene (PICP) e il propeptide N-terminale del procollagene di tipo III (PIIINP) e al secondo gruppo il telopeptide C-terminale del collagene di tipo I (ICTP), la fosfatasi acida tartrato-resistente, la galattosilidrossilisina, il telopeptide N-terminale del collagene I (NTx), il telopeptide C-terminale del collagene I (CTx), la desossipiridinolina libera (urinaria), le piridinoline libere (urinarie).
I primi medicinali a base di ormone della crescita, da utilizzarsi nei casi di iposecrezione di GH, contenevano GH di origine biologica, estratto dall'ipofisi di cadaveri di uomini o scimmie, con notevoli problemi etici e sanitari. Questi problemi sono stati superati grazie alla disponibilità di GH prodotto utilizzando la tecnica del DNA ricombinante (rhGH).
L’ampia disponibilità di rhGH ha contribuito a farne crescere la popolarità. Il suo utilizzo à ̈ stato esteso alle terapie anti-invecchiamento ed ha riscontrato un notevole successo anche in ambito sportivo dove viene utilizzato come farmaco dopante per i suoi effetti anabolici, lipolitici e iperglicemizzanti.
Le dosi di GH usate dagli atleti a fini di doping sono variabili, ma in genere comprese tra 2 mg a giorni alterni e 5 mg/die in cicli di 6-12 settimane o più (Di Pasquale, 1990). Si tratta di dosi molto elevate, che possono addirittura superare di 10 volte la quantità di ormone fisiologicamente prodotta dall’ipofisi nel soggetto normale (MacGillivray et al., 1970).
rhGH esogeno à ̈ indistinguibile dall’isoforma endogena 22 kDa, per questo motivo à ̈ molto difficile smascherarne l’uso improprio. Inoltre, l’emivita plasmatica del rhGH a seguito di iniezione endovenosa à ̈ di circa 15-20 minuti (Parker et al., 1962). A seguito di assunzione sottocutanea o intramuscolare, le concentrazioni plasmatiche dell’ormone raggiungono un picco entro 1-3 ore dalla somministrazione e successivamente diminuiscono progressivamente fino ad essere praticamente non misurabili dopo 24 ore (Ho et al., 1989).
L’assunzione di GH à ̈ vietata agli atleti dal Comitato Olimpico Internazionale e dalle maggiori federazioni sportive, ma allo stato attuale non esiste un test approvato per rilevarne l’abuso.
In ogni caso, anche qualora si rendesse disponibile un metodo per monitorare l’attività biologica di GH, quest’ultima verrebbe vicariata da ormoni noti e con analoga attività somatotropa, quali gli IGFs.
Nel tentativo di distinguere tra GH endogeno ed esogeno, à ̈ stata sviluppata una metodica che prevede di valutare il rapporto esistente tra l’isoforma 22 kDa e il GH 20 kDa presenti in circolo. Dopo assunzione di GH esogeno, infatti, il rapporto tra le diverse isoforme si sposta in favore dell’isoforma 22 kDa (Hashimoto Y et al., 1998; Wu Z et al., 1999). Tuttavia, questo non permette di superare il limite temporale dovuto alla breve emivita del GH e la sua predittività diagnostica si esaurisce entro 24-36 ore dall’assunzione dell’ormone. Inoltre, tale metodo non sarebbe in grado di rilevare sostanze di abuso ad attività somatotropa diverse dal GH.
Disporre di un metodo in grado di determinare l’abuso con certezza e in tempi successivi all’assunzione del GH o di altre sostanze ad attività somatotropa à ̈ pertanto una necessità fortemente avvertita.
Con l’obiettivo di poter valutare i) la presunta assunzione dell’ormone mediante test effettuati in tempi successivi alle 24-36 ore e ii) di evidenziare l’assunzione non solo di GH ma anche di altre sostanze ad attività somatotropa, ci si à ̈ orientati verso la valutazione di marcatori indiretti della funzione somatotropa noti, dotati di una vita media più prolungata del GH (Longobardi et al., 2000). Una serie di studi al riguardo sono stati effettuati dal GH-2000 Project Study Group. In particolare, il GH-2000 Project Study Group à ̈ giunto a suggerire la valutazione combinata di IGF1 e PIIINP quale test per determinare l’abuso di GH (Powrie JK et al., 2007). Sartorio et al. 2004 ha descritto l’utilizzo combinato di tre marcatori: IGF1, PIIINP e ICTP.
Scopo della presente invenzione à ̈ quello di fornire un metodo che, grazie ad una procedura standardizzata e facilmente replicabile, permetta di determinare in maniera univoca e oggettiva la storia del soggetto circa la sua presunta esposizione nel tempo a GH esogeno o ad altre sostanze ad attività somatotropa.
Il metodo che qui si propone combina i vantaggi delle metodiche dirette e di quelle indirette, permettendo una predittività diagnostica in una finestra temporale che va da poche ore dopo l’assunzione di GH a settimane dopo l’assunzione di GH o altre sostanze ad attività somatotropa.
Grazie ad un algoritmo che correla i livelli di espressione dei marcatori diretti ed indiretti selezionati al tempo X, momento in cui viene effettuata l’analisi, e ad un eventuale successivo test di secondo livello, si giunge a determinare in maniera univoca e oggettiva e con una specificità che può raggiungere il 98.5% se e quando vi sia stata assunzione di GH o di altre sostanze ad attività somatotropa.
Il metodo rivendicato dalla presente invenzione trova applicazione nella determinazione di un abuso di sostanze ad attività somatotropa.
Sommario dell’invenzione
La presente invenzione rivendica un metodo per la determinazione dell’attività somatotropa che prevede un test di primo livello e, in caso di positività, un test di secondo livello. In particolare, il test di primo livello prevede:
i) la rilevazione dei livelli di espressione in campioni biologici di marcatori diretti, quali GH 22 kDa e GH 20 kDa, e marcatori indiretti, quali IGF1 e osteocalcina grazie ad anticorpi monoclonali o policlonali specifici;
ii) sulla base dei livelli di espressione misurati, l’assegnazione di un punteggio a ciascuno dei fattori di cui sopra;
iii) la somma dei punteggi di cui in ii) a dare un valore che à ̈ indice dell’attività somatotropa.
Il test di secondo livello prevede:
- l’analisi del profilo secretorio spontaneo del GH in condizioni basali;
- l’analisi del profilo secretorio del GH in seguito a stimolazione dinamica.
E’ ulteriore oggetto della presente invenzione un kit che permetta la rilevazione dei livelli di espressione di GH 22 kDa e di GH 20 kDa, e di uno o piu’ marcatori indiretti dell’attività somatotropa e l’assegnazione del punteggio di cui in ii).
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Il metodo à ̈ basato sulla rilevazione immunologica in campioni biologici dei livelli di espressione di marcatori diretti e indiretti dell’attività somatotropa e sulla correlazione dei valori ottenuti. La descrizione à ̈ integrata dagli esempi che seguono.
Il test può essere basato sull’uso di anticorpi marcati con un enzima, con fluorofori o con altri marcatori opportuni. In una forma di realizzazione preferita, il test à ̈ basato su un saggio ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Altre metodiche note in letteratura possono essere utilizzate convenientemente allo scopo.
Una modalità di rilevazione prevede l’utilizzo di anticorpi monoclonali (mAb) specifici per i fattori di interesse.
Saggi ELISA sono utilizzati da tempo e con successo per determinare anche piccole quantità di antigeni in campioni di plasma, non implicano passaggi di estrazione e sono di semplice esecuzione, pertanto facilmente eseguibili all’interno di laboratori per lo svolgimento di analisi di routine. La strumentazione richiesta per la lettura di un saggio ELISA consiste in uno spettrofotometro. In una forma preferita di realizzazione, si utilizza il saggio ELISA diretto. In alternativa, si può applicare il saggio ELISA indiretto.
Per ciascun antigene di interesse, viene selezionata una coppia di mAb specifici che riconoscono porzioni diverse dello stesso antigene, in maniera tale da disporre di un anticorpo per il rivestimento del pozzetto e di un anticorpo da usarsi come rilevatore.
In una forma di realizzazione, tramite saggio ELISA diretto condotto su plasma/siero del soggetto in esame, vengono utilizzate coppie di mAb in grado di riconoscere i seguenti antigeni: GH 22 kDa, GH 20 kDa, IGF1 e/o osteocalcina. Vengono così misurati i livelli di espressione dei marcatori indicati, ai quali viene attribuito un punteggio a seconda che il livello di espressione misurato sia inferiore o superiore ad un valore soglia, in base alle istruzioni contenute nella tabella 1. I valori soglia ed i relativi punteggi derivano da uno studio effettuato su un elevato numero di campioni e risultano quindi statisticamente significativi (Irie M et al., 2009, Sartorio A et al., 2004, Healy ML et al. 2005).
TABELLA 1
Parametro Valore soglia Punteggio GH 22 / GH 20 ≥ 20.57 3
kDa < 20.57 0
≥ 51.2 (età ≤ 30) 2
IGF-1 (nmol/l) < 51.2 (età ≤ 30) 0
≥ 32.4 (età > 30) 2
< 32.4 (età > 30) 0
≥ 19.3 (maschio) 1
< 19.3 (maschio) 0
Osteocalcina ≥ 17.0 (femmina) 1
(µg/l) < 17.0 (femmina) 0
I punteggi assegnati ad ogni parametro vengono correlati tra loro a dare un punteggio totale che à ̈ indice dell’attività somatotropa. In particolare, effettuando il test per valutare un presunto abuso di sostanze ad attività somatotropa, se dalla somma dei parametri GH 22 kDa/GH 20 kDa, IGF1 e osteocalcina si ottiene un valore inferiore a 3, il risultato del test à ̈ negativo e l’uso improprio di sostanze viene escluso. Se al contrario il valore ottenuto à ̈ uguale o superiore a 3, il test di primo livello à ̈ considerato positivo e si passa al test di secondo livello per confermare o smentire il sospetto di abuso. Un’altra informazione ottenibile dal test di primo livello à ̈ la tempistica dell’assunzione di GH e/o altra sostanza ad attività somatotropa o GH-liberatrice (GH secretagoghi, GHRH, aminoacidi, sostanze neuroattive come clonidina, etc). In tabella 2 viene descritto come interpretare in tal senso i risultati ottenuti dal test di primo livello. In tabella 2, il segno dove presente indica un valore superiore al valore soglia. Con punteggio totale si intende la somma dei punteggi di cui alla tabella 1.
TABELLA 2
GH 22 / GH IGF1 Osteocalcina Punteggio Interpretazione 20 kDa totale
3 Il soggetto ha assunto o sta assumendo GH da 24-36 ore
5 Il soggetto sta assumendo GH da 3-4 giorni
6 Il soggetto sta assumendo GH da almeno 2 settimane 3 Il soggetto ha interrotto l’assunzione di GH da 24-36 ore dopo un trattamento di almeno 2 settimane
1 Il soggetto ha interrotto l’assunzione di GH da 3-4 giorni dopo un trattamento di almeno 2 settimane
2 Il soggetto ha assunto GH per pochi giorni e ha interrotto l’assunzione da 24-36 ore
Test di secondo livello
Qualsiasi test in grado di diagnosticare l’abuso di sostanze nello sport deve dare priorità all’esclusione di falsi positivi. Per questo motivo, la metodica qui rivendicata prevede, in caso di positività al test di primo livello, di effettuare a conferma un test di secondo livello. Il test di secondo livello prevede:
i) l’analisi della pulsatilità basale spontanea del GH valutata in un periodo da 1 a 8 ore, preferibilmente di 3 ore durante il quale vengono analizzati campioni prelevati dallo stesso soggetto ad una distanza di 20 minuti uno dall’altro;
ii) l’analisi della secrezione di GH stimolata da un GH-secretagogo, preferibilmente ghrelina o un suo analogo, analizzando un campione prelevato nell’ora che precede l’esposizione al GH-secretagogo e da 2 a 10, preferibilmente 6 campioni, prelevati nell’arco delle 2 ore successive all’esposizione. In una forma preferita, vengono analizzati 7 campioni che derivano da prelievi effettuati ai seguenti tempi, considerando t=0 il tempo al quale avviene l’esposizione al GH-secretagogo: t= -30 minuti, t=0, t= 15, 30, 45, 60, 90 minuti.
L’ eventuale trattamento con GH o altra sostanza ad attività somatotropa attiverà un meccanismo di feedback negativo. Pertanto, l’analisi della pulsatilità basale spontanea i) misurerà elevati livelli di GH qualora il soggetto sia stato esposto, nelle 24-36 ore precedenti il campionamento, a GH esogeno. Qualora invece il trattamento fosse stato sospeso da oltre 48 ore, si osserveranno livelli di GH ridotti o non dosabili a causa della persistenza del feedback negativo che, a differenza dell'eliminazione farmacocinetica del GH esogeno, potrebbe durare qualche giorno. Dall’analisi della secrezione di GH stimolata ii), si osserverà una marcata riduzione del picco di GH se il soggetto ha assunto da tempo GH e ha sospeso il trattamento da oltre 48 ore. Pertanto, un valore costante tra il valore in i) ed il valore in ii) à ̈ indice di esposizione alla sostanza.
Il risultato del test di secondo livello sarà del tipo positivo o negativo e servirà da conferma al test di primo livello.
Il kit oggetto della presente invenzione à ̈ basato sulla tecnica ELISA ed à ̈ in grado di valutare in modo correlato le concentrazioni plasmatiche/sieriche di GH isoforma 22 kDa e GH isoforma 20 kDa e di uno o piu’ marcatori indiretti scelti tra IGF1 e osteocalcina. In una forma di realizzazione, il kit à ̈ atto a valutare in maniera correlata i livelli di espressione di GH isoforma 22 kDa, GH 20 kDa, IGF1 e osteocalcina. Il kit comprende:
- mAb anti hGH 22 kDa, mAb anti hGH 20 kDa, mAb anti IGF-1, mAb anti osteocalcina legati ad opportuno supporto per l’esecuzione di saggio ELISA diretto.
- anticorpi anti-hGH 22 kDa, anti-hGH 20 kDa, anti-IGF-1 e anti-osteocalcina da usarsi quali anticorpi di rilevazione.
- controllo positivo per hGH 22 kDa, hGH 20 kDa, IGF1, osteocalcina. Per ciascun controllo positivo, si utilizza l’antigene diluito ad una concentrazione pari ai valori definiti soglia nella tabella 1.
Descrizione delle figure:
Figura 1:
a) Rappresentazione grafica dei risultati ottenuti utilizzando gli standard internazionali NIBSC per la somatropina (ipofisaria e ricombinante) in un test ELISA diretto effettuato con la coppia di mAb 12C9/E3 e 18E2/B1 Biotinilato.
b) Analisi in Western Blot dello standard internazionale dell’ hGH ipofisario (NIBSC) e della somatropina 22 kDa incubati con gli anticorpi anti GH 20 kDa 12C9/E3 e 18E2/B1.
Figura 2:
a) Rappresentazione grafica della curva standard per GH 22 kDa. In tabella sono indicati i valori attesi e quelli calcolati sulla retta standard nei campioni di plasma preparati e le percentuali di recovery ottenute.
b) Rappresentazione grafica dei risultati ottenuti utilizzando gli standard internazionali NIBSC per GH ipofisario e rhGH in un test ELISA diretto effettuato con la coppia di mAb 25B4/A5 e 15G5/E11 Biotinilato. c) Analisi in Western Blot dello standard internazionale dell’ hGH ipofisario (NIBSC) e di GH 22 kDa incubati con l’ anticorpo anti GH 22 kDa 25B4/A5. Analisi in Western Blot dello standard internazionale dell’ hGH ipofisario (NIBSC) e di GH 22 kDa incubati con l’ anticorpo anti GH 22 kDa 15G5/E11.
Figura 3:
a) Rappresentazione grafica della curva standard per l’Osteocalcina. In tabella sono indicati i valori attesi e quelli calcolati sulla retta standard nei campioni di plasma preparati e le percentuali di recovery ottenute.
b) Analisi di dot blot effettuata utilizzando gli anticorpi 1H5/E7 e 9F6/G10.
Figura 4:
a) Rappresentazione grafica della curva standard per l’IGF-I. In tabella sono indicati i valori attesi e quelli calcolati sulla retta standard nei campioni di plasma preparati e le percentuali di recovery ottenute.
b) Rappresentazione grafica dei risultati ottenuti utilizzando lo standard internazionale NIBSC per IGF-I in un test ELISA diretto effettuato con la coppia di mAb 15E4/C9 e 24D10/A5 Biotinilato.
ESEMPI
Esempio 1: selezione di coppie di mAb in grado di riconoscere GH 22kDa, GH 20 kDa, osteocalcina e IGF-1 utilizzabili per lo svolgimento del saggio ELISA diretto.
Per ciascun antigene sono stati immunizzati 2 topi BALB/c ai seguenti tempi e con le seguenti dosi: giorno 0, 20µg/topo; giorno 14, 10 µg/topo; giorno 21, 10µg/topo. Per ovviare alla bassa immunogenicità intrinseca di osteocalcina e IGF-1, gli stessi sono stati coniugati con KLH così da aumentarne l’immunogenicità. Non à ̈ stato necessario procedere con la coniugazione degli antigeni GH 22 kDa e GH 20 kDa.
Al giorno 28 sono stati prelevati i sieri immuni e testati in ELISA per verificare la risposta immune degli animali verso gli antigeni. Viene considerata positiva e quindi adeguata per l’esecuzione della fusione somatica una risposta degli antisieri alla diluizione 1/10<4>.
Vengono collezionate le milze degli animali per i quali il valore soglia à ̈ raggiunto.
I cloni positivi dalla fusione somatica vengono espansi e si giunge all’ottenimento di cloni che vengono sotto clonati così da stabilizzarli e generare monocloni.
La tabella 3 elenca i monocloni selezionati. Per chiarezza, si sottolinea che gli anticorpi selezionati per l’antigene GH totale sono in grado di riconoscere selettivamente GH 20 kDa in un intervallo di concentrazioni fisiologiche compreso tra 1 e 40 ng/ml, gli anticorpi contro GH 22 kDa riconoscono e legano indistintamente il GH endogeno, isoforma 22 kDa, e il rhGH esogeno.
TABELLA 3
ANTIGENE mAb
7B5/B8
12C9/E3
GH totale
18E2/B1
15G5/E11
11D7/B7
11D7/C9
GH 22 kDa 19A2/H1
25B4/A5
25B4/D4
6H2/C2
9F6/G10
OSTEOCALCINA 1H5/E7
21F6/H3
24A1/H7
3C6/G7
9G11/A7
11F9/F6
IGF-I 12G2/B4
12H2/D7
15E4/C9
24D10/A5
Tra i mAb generati, si sono selezionate le coppie utilizzabili in un saggio ELISA diretto.
Le coppie selezionate sono riportate qui di seguito, dove il primo anticorpo indicato à ̈ quello utilizzato per il rivestimento e il secondo, biotinilato, à ̈ utilizzato come rilevatore. Per hGH 20 kDa à ̈ stata selezionata la coppia di mAb 12C9/E3-18E2/B1. La coppia di anticorpi 12C9/E3-18E2/B1 à ̈ stata testata utilizzando gli standard internazionali preparati presso l’Istituto Nazionale per gli Standard Biologici e di Controllo (NIBSC). Si à ̈ utilizzato lo standard WHO IS 98/574, costituito esclusivamente da GH 22kDa ricombinante, e WHO IS 80/505, ottenuto per estrazione da ipofisi di cadavere, GH 22 kDa, disponibile commercialmente, e GH 20 kDa (Irie et al., 2009), ottenuto tramite precedenti collaborazioni. I risultati ottenuti sono riportati in figura 1a. A sostegno dei dati ELISA, à ̈ stata effettuata analisi di Western Blot che ha confermato la specificità di legame dei mAb 12C9/E3-18E2/B1 per lo standard internazionale di hGH ipofisario, figura 1b.
Per hGH 22 kDa à ̈ stata selezionata la coppia di mAb 25B4/A5-15G5/E11, ottenendo la curva standard riportata in figura 2a. La coppia di anticorpi 25B4/A5-15G5/E11 à ̈ stata testata utilizzando gli standard internazionali NIBSC WHO IS 98/574 e WHO IS 80/505 sopra descritti. I risultati ottenuti sono riportati in figura 2b. A sostegno dei dati ELISA, à ̈ stata effettuata analisi di Western Blot che ha confermato la specificità di legame dei mAb 25B4/A5-15G5/E11 per lo standard internazionale di hGH ipofisario, figura 2c.
Per l’osteocalcina, à ̈ stata selezionata la coppia di mAb 9F6/G10-1H5/E7, ottenendo la curva standard riportata in figura 3a.Come evidenziato dall’analisi di Dot-Blot, figura 3b, gli anticorpi possiedono un’elevata specificità per l’osteocalcina.
Per IGF-1, Ã ̈ stata selezionata la coppia mAb 15E4/C9-24D10/A5, ottenendo la curva standard riportata in figura 4a. La coppia di anticorpi 15E4/C9-24D10/A5 Ã ̈ stata testata utilizzando lo standard internazionale NIBSC WHO IS 02/254 ricombinante e costituito esclusivamente da IGF-1. I risultati sono riportati in figura 4b.
Gli anticorpi selezionati sono in grado di riconoscere l’antigene specifico non solo quando diluito il tampone ma anche quando presente nel plasma.
Un ulteriore oggetto dell’invenzione sono detti anticorpi monoclonali, da utilizzarsi all’interno del kit qui rivendicato ovvero per altre applicazioni che prevedano l’impiego di mAb in grado di riconoscere in maniera specifica detti antigeni.
Esempio 2: kit per la rilevazione dei livelli di espressione di GH 22 kDa, GH 20 kDa, IGF-1, osteocalcina e l’assegnazione di un punteggio ad ogni singolo parametro.
Il kit comprende i seguenti componenti:
- strisce di pozzetti per ELISA rivestiti con mAb. In particolare, vi saranno 24 pozzetti rivestiti con mAb anti hGH 22 kDa, 24 pozzetti rivestiti con mAb anti hGH 20 kDa, 24 pozzetti rivestiti con mAb anti IGF-1, 24 pozzetti rivestiti con mAb anti osteocalcina. I pozzetti verranno conservati sigillati in presenza dell’essiccante ad una temperatura compresa tra 2 e 8°C fino alla data di scadenza.
- anticorpi di rilevazione: quattro tubi contenenti 10 ml (1-5 µg/ml) rispettivamente di anti-hGH 22 kDa, anti-hGH 20 kDa, anti-IGF-1 e anti-osteocalcina biotinilati. Conservare a temperature comprese tra 2 e 8°C.
- controllo positivo per hGH 22 kDda, hGH 20 kDa, IGF1, osteocalcina. Per ciascun controllo positivo, si tratta dell’antigene diluito ad una concentrazione pari ai valori definiti soglia nella tabella 1. Conservare a temperatura comprese tra -80 e 10°C, preferibilmente in aliquote così da evitare ripetuti cicli di scongelamento-congelamento.
- controllo negativo.
- Horseradish Peroxidase (HRP) - Streptavidina coniugato. Conservare a temperature comprese tra 2 e 8°C.
- Buffer 1 di incubazione, 10 ml.
- 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina, 10 ml.
Conservare a temperature comprese tra 2 e 8°C. - soluzione di lavaggio, 60 ml di tampone fosfato salino (PBS) e detergente non ionico, da diluire prima dell’uso 1:25 con acqua deionizzata. Conservare a temperature comprese tra 2 e 8°C. - soluzione stop, 10 ml acido solforico.
Conservare a temperature comprese tra 2 e 8°C. In aggiunta, il kit potrà contenere:
- puntali sterili monouso in quantità sufficiente allo svolgimento del test.
- supporto adatto a contenere le strisce di pozzetti durante il test.
- pellicola adesiva per la copertura dei pozzetti nella fase di incubazione e di lettura allo spettrofotometro.
- manuale di utilizzo.
Utilizzo del kit:
1. Contrassegnare i pozzetti delle strisce che verranno utilizzati.
2. Aggiungere a ciascun pozzetto 50 µl del buffer di incubazione 1, utilizzando una pipetta semiautomatica.
3. Utilizzando una micropipetta di precisione, aggiungere 50 µl di ciascun campione, o del controllo positivo o del controllo negativo al pozzetto appropriato. In particolare, per ogni soggetto avrò un campione che andrò ad incubare in un pozzetto rivestito con mAb anti hGH 22 kDa, uno in un pozzetto con mAb anti hGH kDa, uno con anti IGF-1 e uno con osteocalcina.
4. Coprire i pozzetti utilizzando l’apposito adesivo e incubare per un tempo compreso tra i 30 minuti e le 2 ore a temperatura ambiente o tra 10 e 16 ore a 4° su un agitatore orbitale per piastre.
5. Aspirare e lavare ciascun pozzetto tre volte con la soluzione di lavaggio, preferibilmente utilizzando lo strumento appropriato o, in alternativa, manualmente.
6. Aggiungere nei pozzetti 100 µl di anticorpo secondario biotinilato utilizzando una micropipetta semiautomatica.
7. Incubare per un tempo compreso tra i 30 minuti e le 2 ore a temperatura ambiente su un agitatore orbitale per piastre.
8. Aspirare e lavare ciascun pozzetto tre volte con la soluzione di lavaggio, preferibilmente utilizzando lo strumento appropriato. Lasciare asciugare i pozzetti rovesciati su un materiale assorbente.
9. Aggiungere 100 µl della soluzione HRP-streptavidina a ciascun pozzetto usando una pipetta semiautomatica.
10. Coprire i pozzetti utilizzando l’apposito adesivo e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orbitale per piastre.
11. Aspirare e lavare ciascun pozzetto tre volte con la soluzione di lavaggio, preferibilmente utilizzando lo strumento appropriato. Lasciare asciugare i pozzetti rovesciati su un materiale assorbente.
12. Aggiungere 100 µl della soluzione cromogena di TMB a ciascun pozzetto usando una pipetta semiautomatica.
13. Incubare per 10 minuti al buio a temperature ambiente.
14. Aggiungere 100 µl di soluzione stop a ciascun pozzetto usando una pipetta semiautomatica.
15. Misurare l’assorbanza della soluzione in ciascun pozzetto a 450 nm in un lettore di piastre.
Il risultato viene calcolato andando ad effettuare un confronto diretto della densità ottica di ciascun pozzetto contenente un campione rispetto al corrispondente pozzetto controllo positivo. In seguito a questo confronto, verranno attributi i punteggi come sopra descritto, punteggi che verranno inseriti nell’algoritmo per ottenere la risposta al test di primo livello.

Claims (16)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un metodo in grado di determinare l†̃esposizione a GH esogeno o ad altre sostanze ad attività somatotropa in funzione del tempo in un soggetto, che comprende: i) la rilevazione dei livelli di espressione di uno o piu’ marcatori diretti scelti tra GH 22 kDa, GH 20 kDa, e uno o piu’ marcatori indiretti quali IGF1 e osteocalcina grazie ad anticorpi monoclonali o policlonali specifici; ii) l’assegnazione di un punteggio a ciascuno dei fattori di cui sopra; iii) la correlazione dei punteggi di cui in ii) a dare un valore che à ̈ indice dell’attività somatotropa; iv) in caso di positività del risultato di cui in iii), l’esecuzione di un test di secondo livello.
  2. 2. Il metodo di cui alla rivendicazione 1, dove i marcatori diretti utilizzati sono GH 22 kDa e GH 20 kDa e i marcatori indiretti sono IGF1 e osteocalcina.
  3. 3. Il metodo di cui ad una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 2, dove gli anticorpi utilizzati sono monoclonali e sono scelti tra quelli elencati in tabella: ANTIGENE mAb 7B5/B8 12C9/E3 GH totale 18E2/B1 15G5/E11 11D7/B7 11D7/C9 GH 22 kDa 19A2/H1 25B4/A5 25B4/D4 6H2/C2 9F6/G10 OSTEOCALCINA 1H5/E7 21F6/H3 24A1/H7 3C6/G7 9G11/A7 11F9/F6 IGF-I 12G2/B4 12H2/D7 15E4/C9 24D10/A5
  4. 4. Il metodo alle secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, dove gli anticorpi utilizzati sono mAb 12C9/E3 e 18E2/B1 per GH 20 kDa, mAb 25B4/A5 e 15G5/E11 per GH 22 kDa, mAb 9F6/G10 e 1H5/E7 per osteocalcina, mAb 15E4/C9-24D10/A5 per IGF1.
  5. 5. Il metodo alle secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, dove i campioni biologici sono campioni plasma/siero.
  6. 6. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, caratterizzato dal fatto che detta correlazione viene effettuata secondo la tabella 1. Parametro Valore soglia Punteggio GH 22 / GH 20 ≥ 20.57 3 kDa < 20.57 0 ≥ 51.2 (età ≤ 30) 2 IGF-1 (nmol/l) < 51.2 (età ≤ 30) 0 ≥ 32.4 (età > 30) 2 < 32.4 (età > 30) 0 ≥ 19.3 (maschio) 1 Osteocalcina < 19.3 (maschio) 0 (µg/l) ≥ 17.0 (femmina) 1 < 17.0 (femmina) 0
  7. 7.Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, dove la tempistica dell’assunzione di GH e/o altra sostanza ad attività somatotropica à ̈ determinata come riportato in tabella 2. GH22/ IGF Osteocalci Punteggi Interpretazione GH20 kDa 1 na o totale 3 Il soggetto ha assunto o sta assumendo GH da 24-36 ore 5 Il soggetto sta assumendo GH da 3-4 giorni 6 Il soggetto sta assumendo GH da almeno 2 settimane 3 Il soggetto ha interrotto l’assunzione di GH da 24-36 ore dopo un trattamento di almeno 2 settimane 1 Il soggetto ha interrotto l’assunzione di GH da 3-4 giorni dopo un trattamento di almeno 2 settimane 2 Il soggetto ha assunto GH per pochi giorni e ha interrotto l’assunzione da 24-36 ore
  8. 8. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, dove detto test di secondo livello prevede: i) analisi del profilo secretorio spontaneo del GH in condizioni basali; ii) analisi del profilo secretorio del GH in seguito a stimolazione dinamica; in cui un valore costante tra il valore in i) ed il valore in ii) Ã ̈ indice di esposizione alla sostanza.
  9. 9. Il metodo secondo la rivendicazione 8, dove il profilo secretorio di cui in i) viene valutato in un periodo da 1 a 8 ore, preferibilmente di 3 ore durante il quale vengono analizzati campioni prelevati dallo stesso soggetto ad una distanza di 20 minuti uno dall’altro.
  10. 10. Il metodo di cui alla rivendicazione 8, dove il profilo secretorio di cui in ii) viene valutato analizzando un campione prelevato nell’ora che precede l’esposizione al GH-secretagogo e da 2 a 10, preferibilmente 6 campioni, prelevati nell’arco delle 2 ore successive all’esposizione.
  11. 11. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 10, dove il profilo secretorio di cui in ii) viene valutato analizzando 7 campioni che derivano da prelievi effettuati ai seguenti tempi, considerando t=0 il tempo al quale avviene l’esposizione al GH-secretagogo: t= -30 minuti, t=0, t= 15, 30, 45, 60, 90 minuti.
  12. 12. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 11, dove il profilo secretorio di cui in ii) viene ottenuto stimolando con un GH-secretagogo, preferibilmente ghrelina o un suo analogo.
  13. 13. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12, dove il risultato del suddetto test di secondo livello sarà del tipo positivo o negativo.
  14. 14. Il metodo cui secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13, dove il suo utilizzo à ̈ finalizzato alla diagnosi di abuso di GH o altra sostanza ad attività somatotropa.
  15. 15. Il kit per l’esecuzione del metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14 che comprende: - mAb anti hGH 22 kDa, mAb anti hGH 20 kDa, mAb anti IGF-1, mAb anti osteocalcina legati ad opportuno supporto per l’esecuzione di saggio ELISA diretto; - mAb anti-hGH 22 kDa, anti-hGH 20 kDa, anti-IGF-1 e anti-osteocalcina da usarsi quali anticorpi di rilevazione; - controllo positivo, costituito dall’antigene diluito ad una concentrazione pari ai valori definiti soglia, per hGH 22 kDa, hGH 20 kDa, IGF1, osteocalcina.
  16. 16. Gli anticorpi monoclonali 12C9/E3 e 18E2/B1 che riconoscono hGH 20 kDa, 25B4/A5 e 15G5/E11 che riconoscono hGH 22 kDa, 9F6/G10 e 1H5/E7 che riconoscono l’osteocalcina, e 15E4/C9 e 24D10/A5 che riconoscono IGF1.
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