DD263994A1

DD263994A1 - Verfahren zur herstellung von oligodesoxyribonucleotiden zur splenopentinexpression

Info

Publication number: DD263994A1
Application number: DD30479287A
Authority: DD
Inventors: Siegfried Hoffmann; Walter Meister; Eckhard Birch-Hirschfeld; Hilmar Reinert; Eckhard Guenther
Original assignee: Univ Halle Wittenberg
Priority date: 1987-07-09
Filing date: 1987-07-09
Publication date: 1989-01-18

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligodesoxyribonucleotiden der allgemeinen Formel 1, die in pro- und eukaryotischen Vektoren insertions- und clonierungsfaehig sind sowie die Expression von Splenopentinen sowohl in pro- als auch in eukaryotischen Systemen codieren. 1 Oligodesoxyribonucleotid-Doppelstraenge:Erfindungsgemaess werden die neuen doppelstraengigen Oligodesoxyribonucleotide mit Splenopentininformation erhalten durch eine traegergestuetzte Phosphotriestersynthese des codierenden und nichtcodierenden Oligodesoxyribonucleotidstrangs und ihre anschliessende Hybridisierung zu in pro- und eukaryotischen Vektoren unmittelbar insertions-, clonierungs- und innerhalb von Fusionsproteininformationen in pro- und eukaryotischen Systemen expressionsfaehigen Splenopentingenen. Splenopentine sind immunomodulatorisch wirksam.

Description

wobei die Restriktionsenzymerkennungsbereiche mit 5'-bzw. 3'-überstehenden cohesiven bzw. glatten Enden für den in Leserichtung (Pfeil) initialen Restriktionsschritt gegebenenfalls 1 bis 2 zusätzliche Desoxyribonucleotidpaarungen zur Justierung des Leserasters enthalten, der Met-Code mit

als Codierung der späteren BrCN-Spaltstellen der Fusionsproteine eingefügt ist, die Splenopentincodierungen — einschließlich der infolge Code-Degeneration außerdem verwendungsfähigen Codons — durch die folgenden Sequenzen repräsentiert werden:

Splenopentin (SP-5) Arg-Lys-Glu-Val-Tyr

Prokaryoten-Expression (E. coli) 5'-CGT-AAA-GAA-GtA-TAC-S'

3'-GCA-TTT-CTT-CAT-ATg-B' Eukaryoten-Expression (Hefe) 5'-AGA-AAG-GAA-GTT-TAc-S'

3'-TCT-TTC-CTt-CAA-ATG-B' Pro²-Splenopentin (Pro?-SP-5-) Arg-Pro-Glu-Val-Tyr

Prokaryoten-Expression (E. coli)

3'-GCA-GGC-CTt-CAT-ATG-B' Eukaryoten-Expression (Hefe) 5'-AGA-CCA-GAA-GTT-TAc-S'

3'-TCT-GGT-CTT-CAA-ATg-S' Pentin (I) Arg-Pro-Gln-Val-Tyr

Prokaryoten-Expression (E. coli) B'-CGT-CCG-CAG-GTA-TAC-S'

3'-GCA-GGC-GTC-CAt-ATG-B'

Eukaryoten-Expression (Hefe) B'-AGA-CCA-CAA-GTT-TAC-S'

3'-TCT-GGT-GTt-CAA-ATG-B'

Pentin (II) Arg-Pro-Gln-Pro-Tyr

Prokaryoten-Expression (E. coli) B'-CGT-CCG-CAG-CCG-TAC-S'

3'-AGA-CCA-CAa-CCA-TAC-S'

Eukaryoten-Expression (Hefe) B'-AGA-CCA-CAA-CCA-TAC-S'

3'-TCT-GGT-GTTGGT-ATg-B'

Pentin (III) Glu-Pro-Gln-Va!-Tyr

Prokaryoten-Expression (E. coli) S'-GAA-CCA-CAG-GTA-TAC-S'

3'-CCT-GGc-GTC-CAT-ATG-B'

Eukaryoten-Expression (Hefe) B'-GAA-CCA-CAA-GTT-TAC-S'

3'-CCT-GGT-GTt-CAA-ATG-B'

und alsStop-Codierungen 1-2 Condons der folgenden drei Tripletts Verwendung finden:

3'-ATTATCACT-B'

durch trägergestützte Phosphotriestersynthesen hergestellt und anschließend hybridisiert werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verführen zur Herstellung von Oligodesoxyribonucleotiden der allgemeinen Formel 1, die in pro- und eukaryotischen Vektoren insertions- und clonierungsfähig sind und die Expression von Splenopentinen codieren.

1 Oligodeeoxyribonucleotid-Dojppeletränge:

Re8trikt:Lone- schnitt

Mat- Spleinopentin- I etop- - Codierung

Reetriktione- echnitt

Pfail; Läserichtung ———— Splenopentine sind irnmunomodulatorisch wirksam.

Charakteristik der bekannten technis :hen Lösungen

Splenopentin-Typ Peptide sind bisher nur als Teilsequerizen des entsprechenden Vorläuferproteinr. Splenin (T. Audhya et öl.,

Biochemistry 20 (1981) 6195) bzw. als Strukturanaloge bekannt. Splenopeniin-5 (SP-5) (W. Diezel et al., Biomed. B'ochim. Acta 43 (1984 K9) wurde neban einer Reihe von Strukturanalogen bisher peptidsynthetisch dargestellt. Nurdie Gensequenz des Thymopentin-5 wurde bisher in einer von der spezifischen Expression innerhalb eines Fusionsproteins abweichenden Tandom-Oligomer-Va riante formuliert (C. Russells et al. DE 3102 721A1 vom 28.1.1981). Eine direkte chemische Synthese von Splenopentingenen so /vie die Gene selbst sind bisher nicht bekannt. Zur Herstellung von Nucleinsäuresecuenwn sind verschiedene Verfahren bekannt, so das Phosphordiester-, das Phosphotriester- und das Phosphora nidilverfahren (HG<. Gassen und A. Lang, Chemical and enzymatic synthesis of gene fragments — a laboratory manual, V<rlag Chemie, Weinheim 1982).

Ziel dei' Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht in der chemischen Synthese von doppelsträngigen Oligodesoxyribonucleotiden, die aufgrund ihrer spezifischen Strang-, Code- und Leserastergestaltiing in pro- und eukaryotischen Vektoren insertions- und clonierungssowie in pro- und eukaryotischen Wirtssystemen expreusionsfähig für Splenopentine sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren, nach dem entsprechende Oligodesoxyribonucieotidstränge herstellbar sind, die als hybrid vierte Doppelstränge die Expression von Splenopentinen codieren.

Erfindungsgemäß werden die Oiigodesoxyribonucleotidstränge der allgemeinen Formel 1 mit:

Restriktionsschritt:

Met-Codierung:

Restrlktionsenzymerkennungsbereiche mit 5'- bzw. 3'-überstehenden cohesiven bzw. glatten Enden, für Jen in Leserichtung initialen Restriktionsschritt gegebenenfalls unter Einbeziehung von 1 bis 2 zusätzlichen Desoxyribonucleotidpaaren zur Justierung des Leserasters. 5'-ATG-3' als Codierung der späteren 3'-TAC-5' 8rCN-Spaltstelle der Fusionsproieine

Splenopsntin der allgemeinen Formel A-B-C-D-Tyr

Peptid

Splenopontin (Sp-5)	Arg	Arg-Lys-Glu-Val-Tyr	Lys	GIu
Pro²-Splenopentin	Arg	Pro	GIu
(Pro²-SP-5)
Pentin(l)	Arg	Pro	GIn
Pentin(ll)	Arg	Pro	GIn
Pentin(lll)	GIu	Pro	GIn
Splenopentin-Codierungen:
Splenopentin(Sp-5)

VaI VaI

VaI Pro VaI

Prokaryoton-Expression (E. coli) Eukaryoten-Expression (Hefe) Pro²-Splenopentin (Pro²-Sp-5)

Prokaryoten-Expression (E. coli) Eukaryoten-Expression (Hefe) Pentin(l)

5'-CGT-AAa-GAA-GTA-TAC-S' 3'· GCA-TTT-CTT-CAT-ATG-B' 5'-AGA-AAG-GAA-GTT-TAc-S' 3'-TCT-TTC-CTT-CAa-ATG-B' Arg -Pro-Glu-Val-Tyr

5'-CGT-CCG-GAA-GTa-TAC-S' 3'-GCA-GGC-CTT-CAT-ATg-B' 5'-AGA-CCA-GAA-GtT-TAC-S' 3-TCT-GGT-CTT-CAa-ATG-B' Arg-Pro-Gln-Val-Tyr

Prokaryoten-Expression (E. coli) Eukaryoten-Expression (Hefe) Pentin(ll)

5'-CGT-CCG-CAG-GTA-TAc-S' 3'-GCA-GGC-GTC-CAt-ATG-B' B'-AGA-CCA-CAA-GTT-TAC-S' 3'-TCT-GGt-GTT-CAA-ATG-S' Arg-Pro-Gln-Pro-Tyr

Prokaryoten-Expression (E. coli) Eukaroyten-Expression (Hefe) Pentin(lll)

5'-CGT-CCG-CAG-CCG-TAc-S' 3'-GCA-GGc-GTC-GGC-ATG-B' B'-AGA-CCA-CAA-CCA-TAC-S' 3'-TCT-GGT-GTT-GGt-ATG-B' Glu-Pro-Gln-Val-Tyr

Prokaryoten-Expression (E. coli)

Eukaryoten-Expression (Hefe)

5'-GAA-CCG-CAG-GTA-TAc-S'

3'-CTT-GGC-GTC-CAt-ATG-B'

5'-GAA-CCA-CAA-GTt-TAC-S'

3'-CTT-GGT-GTt-CAA-ATG-B' Stop-Codierungen: 5'-TAA TAG TGA-3' Verwendung von 3'-ATT-ATC-ACT-B' 1-2Tripletts

sowie sämtliche Splenopentin-Codierungen einschließlich der infolge Code-Degeneration anstelle der oben aufgeführten Tripletts verwendungsfähigen Codierungen hergestellt durch eine trägergestützte Phosphotriestersynthese. Die Hybridisierungen zu insertions-, clcnierungs- und expressionsfähigen Splenopentin-Doppelsträngen werden nach herkömmlichen Techniken durchgeführt (T. Maniatis et al.. Molecular cloning — a laboratory manual, Cold Spring Harbor, 1982, sowie B.Lewin in gene expression Vol.2/Wiley lnterscience 1980).

Die Auswahl der Splenopentin-Informations-Tripletts erfolgte nach den Expressionsstrategien der zugrundeliegenden pro- und eukaryotischen Systeme (J. L Bennetzen et al., Biol. Chem. 257 [1982] 3026) sowie nach den Erfordernissen zusätzlicher Restriktionserkennungen für Restriktionskartierungen der Insertionen und Cionierungen.

Die chemisch synthetisierten Splenopentingene sind aufgrund ihrer cohesiven bzw. glatten Restriktionsschnitte unmittelbar insertions-, clonierungs- und expressionsfähig in pro- und eukaryotischen Systemen. Abhängig von der Spezifik der jeweiligen Vektoren sichern 0-2 zusätzliche Desoxyribonucleotidpaarungen im Übergang der in Loserichtung initialen Restriktionsschritte zu den Met-Startcodes die Justierung der Leseraster.

Die den Splenopentininformationen, den eigentlichen Splenopentingenen, vorgeschalteten Met-Start-Informationen gewährleisten die nachträgliche Abspaltung der Splenopentininformationen aus den Fusionsproteinen, die den Splenopentingenen nachgeschalteten Stop-Signale die ordnungsgemäße Termination.

Die Freisetzung der Splenopentininformationen aus den aus pro- und eukaryotischen Systemen ausgeschleusten Fusionsproteinen liefert die immunomodulatorisch wirksamen Splenopentine.

Die direkte chemische Synthese dieser in pro- und eukaryotischen Systemen unmittelbar insertions-, clonierungs- und expressionsfähigen Splenopentingene ist — wie die. Splenopentingene selbst — neu.

Ausführungsbeispiele

Synthese des Splenopentin (Sp-5)-Gens 28mer: nichtcodiorender Strang 26mer: codierender Strang

EcoRI Met Arg Lye GIu VaI Tyr stop CIaI

1) 28mer 5'-AATTC ATG CGT AAA GAA GTA TAC TAA AT -3'

2) 26mer 3¹- G TAC GCA TTT CTT CAT ATG ATT TAGC-5'

L Accil Sn a I

Zur Realisierung der vorgegebenen Genstruktur wurde ein 26- und ein 28mer Oligodesoxyribonucleotid synthetisiert. Zur Synthese wurde ein modifiziertes Phosphotriesterverfahren an fester Phase in 5'-3'-Richtung gewählt.

Der Kettenaufbau erfolc^e in Einzelschritten in einer manuell betriebenen geschlossenen Apparatur.

Die entsprechenden 2'-Desoxyribonucleotide wurden nach bekanntem Verfahren im Basenteil durch N-Acylierung geschützt und am Zucker in δ'-Ροελίοη dimethoxytrityliert. Die Phosphorylierung der 3'-OH-Gruppe erfolgte mit p-Chlorphenylphosphorditriazolid zu dem entsprechenden Monotriazolid und mit 2-Cyanoethanol zum voll geschützten Desoxyribonucleosid-S'-monophosphorsäuretriester. Danach erfolgte eine Säurespaltung der 4,4'-Dimethoxytritylschutzgruppe vom 5'-Ende. Diese Verbindungen kamen nach der Chromatographie an Kieselgel zum Einsatz.

Als Endbaustein diente ein basenges-;hütztes und 3'-acetyliertes Nucleosid.

Entsprechend Schema 1 erfolgte ein schrittweiser Aufbau bei einer Cyclusdauer von 20-22 min.

Als Träger diente ein 12% auf Teflon gepfropftes Polystyren, welcher mit einer Aminomethy!gruppe versehen wurde. Die Aminogruppenbestimmung erfolgte mittels Pikrinsäuretitration. Sie lag in unserem Fall bei 170μητιοΙ -NH₂/g Träger. Als Spacer diente die Bernsteinsäure. Die Beladung des Trägers erfolgte mit 5'-Succinyl-nucleosid-3'-p-chlorphenyl-2-cyanoethylphosphorsäuretriester in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Es wurde eine Nucleotidbeladung im Fall 1) von 76μπιοΙ dAp/g (bei 20mg Trägereinsatz = 1.5μπιοΙ) und bei 2) von ΘΟμιποΙ dCp/g (bei einem Trägereinsatz von 1,2μιτιοΙ) erreicht. Ausgegangen wurde von 20mg derivatisiertem Träger. Es wurde mit einem 10fachen Überschuß Nucleotidkomponente

It- If

in absolutem Pyridin, einem 30fachen Überschuß Kondensationsmittel (Triisopropylbenzertsulfonylchlorid TIPS) und einem SOfachen Überschuß an nucleophilem Katalysator 1-Methylimidazol (MeIm) gearbeitet (bezogen auf die Nucleotidbeladung des Trägers). Nach der Überführung des Trägers in den Reaktor erfolgte zur Blockierung der noch freien NH₂-Gruppen eine „Null-Kondensation" mit TIPS/1-Methylimidazol (10:30) in 10min.

Schema 1

Operation

Reagenz

Zeit

1. Trocknen des Trägers

2. Abspaltung der CNEt-Schutzgruppe

3. Waschen

4. Kondensation

5. Waschen

Pyridin

0,1 m Tetramethylguanidin in abs. Pyridin

abs. Pyridin

Kupplungsmischung b) in abs. Pyridin

Pyridin

a)

1-2 min

a)

12-15 min

a)

a) Die Waschvorgänge sind beendet, wenn die relative Leitfähigkeit den Endwert des abs. Pyridine erreicht hat.

b) Die Kupplungsmixture besteht aus einer Mischung von 10 äquiv. der getrockneten Nucleotidkomponente, Zusatz von 30 fiquiv. TIPS und 90 äquiv. von 1-Methylimidazol in abs. Pyridin (0,1-0,15molar) bezogen auf die Erstbeladung des Trägers.

Nach der Beendigung der Synthese und Waschen mit Ether wurde der Träger in ein verschraubbares Bombenrohr überführt, mit 30%igem NH₄OH + 10% Pyridin versetzt und über Nacht bei 5O⁰C erwärmt. Nach dem Filtrieren und Waschen mit Pyridin wurde vorsichtig zur Trocknung eingeengt. Die Menge an Rohprodukt wurde UV-spektroskopisch bestimmt. Sie betrug beim 28mer 295 O. D. E. und beim 26mer 240 O. D E. Ein Teil dieser Rohprodukte (Viο der Gesamtmenge) wurde an einem 20%igen denaturierten Polyacrylamidgel gereinigt (20 χ 40 χ 0,3 cm). Als Marker dienten XC, BPB und entsprechende Referenzsubstanzen. Die längsten UV-aktiven Banden wurden zugeschnitten, zermörsert und mit Wasser versetzt. Nach etwa 5 h bei 5O⁰C Inkubation wurde von) Polyacrylamid abzentrifugiert und der klare Überstand an DEAE-Sephacel entsalzt. Nach Waschen mit Wasser, 0,1 m TEAB v/urde das entsprechende Oligodesoxyribonucleotid mit 1 m TEAB-I ösung von der Säule eluiert und vorsichtig unter Zugabe von Pyridin eingeengt. Das gereinigte Endprodukt wurde UV-spektroskopisch vermessen. Zur Beweisführung erfolgte nach 5'-Markierung eine Autoradiographie der beiden Einzelstränge mit nachfolgender Sequenzierung an CCS-Papier (A. Rosenthal et al.. Nucleic Acids Res. 13 (1985] 1173). Weiterhin wurden die Restriktionsorte durch Ligation der hybridisierten Stränge über die EcoRI- und Cial-Orte und entsprechende Rückspaltungen unter zusätzlicher Verwendung der Accl-Schnitte überprüft.

Die Hybridisierung selbst wurde nach Maniatis et al. (T. Maniatis) et al.. Molecular cloning — a laboratory manual. Cold Spring Harbor, 1982) durchgeführt.

Die Ausbeuten betrugen beim 28mer nach der Polyacrylamidgeireinigung 23,9% = 94,8%/Stufe und beim 26mer 16,7% = 93,1 %/Stufe.

Abkürzungen: Xylencyanol (XC)

Bromphenolblau (BPB)

Claims

Verfahren zur Herstellung von Oligodesoxyribonucleotiden zur Splenopentinexpression, dadurch ,. gekennzeichnet, daß die Oligodesoxyribonucleotidstränge der allgemeinen Formel 1

Restriktlonssohnltt

Met-

Splenopentln-Oodierung

atop-

Eeetriktionssohnitt