DD254027C2 - Verfahren zur kontrolle und steuerung mikrobieller fermentationsprozesse - Google Patents

Abstract

Die Erfindung dient der Kontrolle und Steuerung mikrobieller Fermentationsprozesse und kann für die Beurteilung der Stabilität der Eigenschaften von Mikroorganismenstämmen oder zum Nachweis von Störungen in biotechnologischen Prozessen genutzt werden. Grundlage der Erfindung ist die Reaktion mikrobieller Zellen mit rezeptorspezifischen Proteinen. Erfindungsgemäß wird die Geschwindigkeit der Zellagglutination nach Zugabe agglutinationsauslösender Substanzen.ermittelt und mit einem prozeßspezifischen Wert verglichen. Bei Abweichungen von diesem Wert werden die entsprechenden prozeßbeeinflussenden Maßnahmen vorgenommen.

Description

Hierzu 3 Seiten Tabellen

Anwendu ngsgebiet

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kontrolle und Steuerung mikrobieller Fermentationsprozesse und kann für die Beurteilung der Stabilität der Eigenschaften von Mikroorganismenstärnmen oderzum Nachweis von Störungen in biotechnologischen Prozessen genutzt werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Im Vergleich zu den in der technischen Chemie seit Jahrzehnten genutzten Synthesen, die sich durch hohe Stabilität der katalysierten Prozesse auszeichnen, sind biotechnologische Prozesse relativ störanfällig. In diesen Prozessen auftretende Störungen können oftmals nicht eindeutig oder nicht rechtzeitig nachgewiesen werden.

Zur Kontrolle und Steuerung von Fermentationsprozessen werden gegenwärtig bevorzugt Eigenschaften des Mediums gemessen, in dem die Mikroorganismenzellen leben und produzieren, z. B. pH-Wert, Sauerstoffpartialdruck, Sauerstoffverbrauch, Produktbildung, CCVBildung, spezifische Wachstumsrate usw.

Diese Methoden sind jedoch unzureichend, da sie nicht Eigenschaften der produzierenden Mikroorganismenzelle selbst nutzen.

Veränderungen am Produktionsstamm, hervorgerufen durch spontane Mutation, Fremdinfektion oder Fehler in der Prozeßführung, können dadurch nicht eindeutig bzw. nicht rechtzeitig erfaßt werden.

Deshalb wurde in den letzten Jahren damit begonnen, Methoden zu entwickeln, mit denen charakteristische Eigenschaften der produzierenden Mikroorganismenzelle quantitativ bestimmt werden sollen.

Die verschiedenen Verfahrensvorschläge haben diese Aufgabe qualitativ unterschiedlich gelöst und sind deshalb mehr oder minder störanfällig.

So wird z. B. die Kontrolle und Steuerung von Prozessen zur Biomassegewinnung bzw. der Synthese verschiedener Produkte durch eine Bestimmung der Gesamthydrogenasenaktivität der Zellen empfohlen (WP C 12 NI289970).

Dieser Vorschlag hat jedoch den Nachteil, daß nur bei konstanten Milieufaktoren eine direkte Proportinalität zwischen der Dehydrogenasenaktivität und z. B. der Produktsyntheserate besteht und der Proportionalitätsfaktor in Abhängigkeit z. B. von der Mediumzusammensetzung, dem osmotischen Druck u.a. unterschiedlich groß ist.

Auch einzelne Atmungsenzyme wie das Cytochrom с werden für die Beurteilung von Fermentationsprozessen und zur Prozeßsteuerung empfohlen (DD-WP 154449, DD-WP 160232). Sowohl der zelluläre Gehalt als auch das Verhältnis der einzelnen

Atmungsenzyme ist jedoch von den Milieubedingungen abhängig. So enthält eine Fe-Iimitierte Hefe mitunter nur — des Cyto-

chrom-c-Anteils C-Iimitierter Hefezellen.

Zusammenfassend wird festgestellt, daß allen bisher praktisch genutzten Methoden zur Kontrolle und Steuerung mikrobieller Produktionsprozesse der Nachteil anhaftet, daß sie entweder ungenau und zeit- und materialaufwendig sind oder nur auf spezielle Prozesse angewandt werden können.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Kontrolle und Steuerung von Fermentationsprozessen mittels einer Methode, die es erlaubt, den Prozeßzustand zuverlässig und aktuell zu charakterisieren und dementsprechend unverzüglich auf Störungen des Prozesses zu reagieren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Kenngröße zur Charakterisierung von Fermentationsprozessen einzusetzen, die mit der spezifischen Leistungsfähigkeit der Mikroorganismen korreliert und damit über den aktuellen Prozeßzustand Auskunft geben kann.

Mikrobielle Zellen reagieren mit rezeptorspezifischen Proteinen wie z. B. Immunseren, „natürlichen" Antikörpern und Lektinen, wenn die entsprechenden Rezeptoren auf der Zelloberfläche vorhanden sind. Die Reaktion läßt sich durch quantitative Bestimmung der Agglutinationsgeschwindigkeit beschreiben.

Es wurde gefunden, daß in einem standardisierten Ansatz zur Bestimmung der Wechselwirkungen zwischen den Zellen und den genannten rezeptorspezifischen Proteinen Unterschiede nachweisbar sind, wenn sich der physiologische Zustand der Zellen verändert, z. B. bei Änderungen der Wachstumsphase und Wachstumsgeschwindigkeit, der Kohlenstoffquelle, der Art der Limitation, sowie der Temperatur und des pH-Wertes. Dagegen verändern sich die rezeptorspezifischen Reaktionen nicht, wenn die Zellen aus einem kontinuierlichen stabilen Prozeß entnommen werden.

Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe so gelöst, daß die Geschwindigkeit der Zellagglutination der Mikroorganismen nach Zugabe agglutinationsauslösender Substanzen unter standardisierten Bedingungen ermittelt und mit einem vorgegebenen prozeßspezifischen Wert verglichen wird. Ergeben sich Abweichungen von letzterem werden entsprechende prozeßbeeinflussende Maßnahmen vorgenommen.

Als agglutinationsauslösende Substanzen werden rezeptorspezifische Proteine, wie Antikörper, Lektine oder andere die Agglutination auslösende Stoffe verwendet.

Dem Fermentationsprozeß entnommene Proben ergeben dann gleiche Agglutinationsgeschwindigkeiten, wenn der Prozeß stabil verläuft. Verändern sich die beobachteten Agglutinationsgeschwindigkeiten, so ist das entweder auf eine technische Störung im Prozeß oder auf eine Veränderung des Produktionsstammes (Mutation, Fremdinfektion, Phagenbefail) zurückzuführen. Die Bestimmung der Agglutinationsgeschwindigkeit von Proben, die zu verschiedenen Zeiten entnommen wurden, ermöglicht es, kosten- und zeitsparend nachzuweisen, ob ein biotechnologischer Prozeß stabil abläuft oder ob Störungen der Fermentation eingetreten sind.

Verändern sich die registrierten Agglutinationskurven, so kann aus dem Grad der Veränderung wie z. B. langsamere Agglutination, verzögert einsetzende Agglutination oder Bildung von nur kleinen Agglutinaten häufig direkt auf die Ursache der Störung geschlossen werden, was eine umgehende Beseitigung dieser Störung erlaubt.

Die Beispiele 3-6 beschreiben Modellversuche, bei denen gezielt Störungen in der Fermentation hervorgerufen wurden. Die Folge dieser Störungen ist ein verändertes Agglutinationsverhalten, das auf die Ursache dieser Störung schließen läßt und zur rechtzeitigen Beseitigung der Fermentationsstörung führt So wird beispielsweise das Wachstum eines Stammes von Saccharomyces cerevisiae durch steigende Alkoholkonzentrationen zunehmend gehemmt, parallel dazu vermindert sich auch die Agglutinationsgeschwindigkeit von Zellen, die aus dem Prozeß entnommen wurden (Beispiel 3).

Für die Steuerung eines entsprechenden Fermentationsprozesses müßte nun so lange die Melassezuführung in den Fermentor unterbrochen werden, bis aus einer wieder erhöhten Agglutinationsgeschwindigkeit auf eine erneut stabilisierte Prozeßführung geschlossen werden kann. Im Beispiel 4 wird auf ein exponentielles Wachstum eines Mikroorganismenstammes orientiert, dies ist durch hohe Agglutinationsgeschwindigkeit charakterisiert, während die Hemmung des Wachstums durch gebildete Produkte zu einer Verminderung der Agglutinat'ionsgeschwindigkeit führt. Die Entfernung dieser Stoffwechselprodukte führte wieder zu hoher Wachstumsgeschwindigkeit.

Im Beispiel 5 wird gezeigt, daß eine irrtümlich ohne Phosphatzugabe hergestellte Nährlösung zu Veränderungen im Agglutinationsverhalten der Zellen führt, noch bevor der Phosphatmangel zu einem markanten Nachlassen der Wachstumsgeschwindigkeit führt. Und im Beispiel 6 wird nachgewiesen, daß Temperaturerhöhungen während der Fermentation sich in ausbleibender Agglutination äußert. In diesem Fall muß sofort die Temperatur korrigiert werden, anderenfalls stirbt die Zellpopulation ab.

Anhand von Beispielen wird die Erfindung näher erläutert.

Ausführungsbeispiele Beispiele 1 Untersuchungen an Synchronkulturen eines Hefestammes

Ein selektiver Hefestamm von Saccharomyces cerevisiae wurde in einem Fermentor als Synchronkultur unter aeroben Bedingungen kultiviert. DerTeilungscyclusder Hefezellen wurde durch eine zeitlich dosierte Zugabe von Glukose induziert. Im Abstand von 20 min wurden Proben entnommen, von denen das Agglutinationsverhalten und der Anteil knospenden Zellen bestimmt wurde.

Die Aggiutinationsgeschwindigkeit wurde aus der Verminderung der optischen Dichte der gerührten Zellsuspension nach Zugabe von Linsenlektin ermittelt, dazu wird der Wert (E_o/E,)³ gegen die Agglutinationszeit aufgetragen (E₀ = Extinktion vor Beginn der Agglutination, E_t1 = Extinktion der Meßzeit bei der Agglutination). Der Anstieg der erhaltenen Gerade'entspricht dabei der Agglutinationsgeschwindigkeit v_Aggi.

Wie aus Abb. 1 zu entnehmen ist, steigt die Agglutinationsgeschwindigkeit bereits nach einer Fermentationsdauer Von 20 min an und erreicht nach 40 min ein Maximum, dagegen steigt der Anteil erst nach 1 Std. deutlich an. Aus dem Absinken der Agglutinationsgeschwindigkeit nach 2¹/2Std. auf den Ausgangswert wird auf das Ende des Teilungscyclus geschlossen. Erneute Zugabe von Glucose bedingt dann den Ablauf eines 2. Cyclus.

Beispiel 2 Einfluß der Kohlenstoffquelle auf das Agglutinationsverhalten des Bakterienstammes Acetobacter methanolicus

Der Bakterienstamm wurde einmal auf Methanol und einmal auf Glukose als Kohlenstoffquelle kultiviert. Nach Erreichen des stationären Zustandes wurden die Zellen gewaschen und durch Zugabe von Antiserum zur Agglutination gebracht. Die aufgezeichneten Agglutinationskurven (s. Abb.2) zeigen deutliche Unterschiede im Agglutinationsverhalten, so beginnt die Agglutination bei der auf Methanol gewachsenen Kultur sofort, verläuft aber mit geringer Geschwindigkeit, während bei der auf Glukose gewachsenen Kultur die Agglutination verzögert einsetzt, aber dann mit relativ hoher Geschwindigkeit verläuft. Ein Vergleichsstamm der gleichen Art zeigt ebenfalls ein deutlich zu unterscheidendes Agglutinationsverhalten bei Kultivierung auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen.

Beispiel 3 Einfluß des Ethanolgehaltes im Nährmedium auf das Agglutinationsverhalten eines alkoholverwertenden Hefestammes

Der Hefestamm Saccharomycescerevisiae H 310 wurde im Schüttelkolben auf Melasse unter Zugabe unterschiedlicher Mengen an Ethanol gezüchtet. Nach 24h Kultivierung bei 30⁰C wurde der Versuch abgebrochen und die Zellen durch Zusatz von Linsenlektin agglutiniert. Aus den in Abb. 3 wiedergegebenen Agglutiagtionskurven ist einwandfrei zu erkennen, daß sich das Agglutinationsverhaiten in Abhängigkeit von der Alkoholkonzentration verändert. Im Agglutinationstest ähnelt die bei der höchsten Ethanolkonzentration gemessene Probe dem Kontroilansatz, der mit Melasse ohne Aikoholzusatz geschüttelt wurde, weil durch die hohe Ethanolkonzentration (100g/l w/w) das Wachstum der Hefezellen nahezu vollständig inhibiert wird. In diesem Fall muß Wasser oder Substrat zugefügt werden, um die Alkoholkonzentration so weit zu vermindern, daß das Wachstum des Stammes wieder möglich wird.

Beispiel 4 Veränderungen des Agglutinationsverhaltens der Hefe Candida maltosa spez. während einer kontinuierlichen Fermentation

bei Änderung der Fermentationsbedingungen

Candida maltosa spez. wurde im Laborfermentor im Batch und kontinuierlich kultiviert.

Während der Fermentation werden die Milieu bedingungen gezielt verändert. In Abb.4 ist die Agglutinationsgeschwindigkeit von Proben mit charakteristischer Entnahmezeit nach Zugabe von Linsenlektin dargestellt. Bei exponentiellem Wachstum sind die Agglutinationsraten hoch (I/2; M/12; III/5).

Störungen im kontinuierlichen Wachstumsprozeß durch Produktbildung (I/6), Übergang von Nährstofflimitation zu Nährstoffmangel (III/3), Erhöhung der Verweilzeit (Il 12-11/10) sowie Temperaturschock (3/6) bewirken das Absinken der Agglutinationsgeschwindigkeiten.

Beispiel 5 Einfluß von Phosphatmangel im Nährmedium auf das Agglutinationsverhalten eines Hefestammes

Der Hefestamm Candida maltosa spez. wurde im Laborfermentor kontinuierlich kultiviert. Als Kohlenstoffquelle dienten die η-Paraffine eines Dieselkraftstoffs. Die Fermentation wurde zunächst C-Iimitiert geführt. Nach Erreichen des Gleichgewichtszustandes im kontinuierlichen Fermentationsprozeß wurde das Mineralmedium gleicher Zusammensetzung aber ohne Phosphat zugegeben. Infolge von eingelagerten Phosphatreserven in den Zellen ging das Wachstum zunächst mit unverminderter Geschwindigkeit weiter, aber die Agglutinationsgeschwindigkeit der Zellen vergrößerte sich. Nachdem der Phosphatmangel durch morphologische Veränderungen der Zellen sichtbar wurde, änderte sich das Agglutinationsverhalten erneut signifikant. Die Zellen neigten sehr stark zur Autagglutination und der Zusatz des Lektins Con A bewirkte nur noch eine geringe zusätzliche Agglutination

Durch Phosphatzugabe wurde wieder normales Wachstum und die typische Agglutination erreicht.

Beispiel 6 Einfluß von Temperaturerhöhung auf das Agglutinationsverhalten eines Hefestammes

In der in Beispiel 5 beschriebenen Fermentation wurde die Temperatur von 30⁰¹ C auf 42⁰¹ C erhöht. Der genannte Hefestamm neigt nach Zugabe von δ-D-Galaktose bei 30°C zur spontanen Autagglutination. Diese Agglutination blieb nach Temperaturerhöhung aus. Erst nach längerer Kultivierung bei 30⁰C wurde das frühere Niveau der Agglutinationsgeschwindigkeit wieder erreicht.

Die Beispiele zeigen, daß es mit der erfindungsgemäßen Methode möglich ist, mikrobielle Fermentationsprozesse laufend zu überwachen und die Ursache auftretender Störungen rechtzeitig zuerkennen und schnell zu beseitigen.

Claims (2)

1. Verfahren zur Kontrolle und Steuerung mikrobieller Fermentationsprozesse, dadurch gekennzeichnet, daß die Geschwindigkeit der Zeilagglutination der Mikroorganismen nach Zugabe agglutinationsauslösender Substanzen unter standardisierten Bedingungen ermittelt und mit einem vorgegebenen, prozeßspezifischen Wert verglichen wird und bei Abweichungen von diesem Wert prozeßbeeinflussende Maßnahmen vorgenommen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Agglutination rezeptorspezifische Proteine wie Antikörper, Lektine oder andere die Agglutination auslösende Substanzen verwendet werden.