DD248960A1 - Verfahren zur gewinnung eines proliferationshemmstoffes (mdgi-mamma derived growth inhibitor) - Google Patents

Abstract

Anwendungsgebiet der Erfindung sind die Biotechnologie und Medizin. Erfindungsgemaess wird hemmstoffhaltiges Gewebe im halbgefrorenen Zustand zerkleinert, mit Praeparationspuffer versetzt und homogenisiert. Anschliessend wird das Homogenisat mehrmals zentrifugiert, der Ueberstand einer fraktionierten Ammoniumsulfatfaellung unterzogen. Die erhaltene Eiweissfraktion wird nach Molekularmasse aufgetrennt, danach wird eine Trennung nach elektrischer Ladung durchgefuehrt. Nach einer Gelpermeation-HPLC werden die den Hemmstoff enthaltenden Fraktionen anhand ihrer biologischen Wirkungen bestimmt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Proliferationshemmstoffes aus tierischem Gewebe Anwendungsgebiet ist die Biotechnologie und Medizin.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Endogene polypeptidische Faktoren sind höchstwahrscheinlich maßgeblich an der Regulation von Proliferation und Differenzierung tierischer Zellen in vivo beteiligt. Neben Verfahren für die Isolierung zahlreicher entsprechender Stimulatoren („Wachstumsfaktoren") sind bisher nur wenige Verfahren für die Aufreinigung von entsprechenden Inhibitoren („Wachstumsinhibitoren") beschrieben worden. Bisher wurden nurzwei Gruppen dieser Gewebsfaktoren chemisch identifiziert: Eine Gruppe von niedermolekularen Peptiden, die aus Epidermis sowie aus Leukozyten-Überständen gereinigt wurden (1,2) sowie eine Klasse sogenannter „Transformierender Wachstumsfaktoren" (TGF beta), die durch saure Extraktionen aus verschiedenen Geweben erhalten werden können (3,4).

(1) K.EIgjo, K. L. Reichelt, Cell Biol. Int. Rep. 8, (1984)379-382

(2) W.R.Paukovits, O. D. Laerum, Z. Naturforsch. 37C, (1982)1297-1300

(3) R. Derynck et al., Nature 316, (1985) 701-705

(4) A. B.Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 82, (1985) 119-123

Ein Verfahren zur Gewinnung partiell gereinigter proliferationshemmender Fraktionen aus Kuheuter wurde 1980 in der DDR patentrechtlich geschützt (Pat.-Nr. 143926).

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, einen Proliferationshemmstoff zu gewinnen, der der Erforschung und gegebenenfalls der Beeinflussung normaler und gestörter Proliferations- und Differenzierungsprozesse dient.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und ökonomisches Verfahren zur Gewinnung eines hochgereinigten Proliferationshemmstoffes zu entwickeln.

Erfindungsgemäß wird das den Hemmstoff enthaltende Gewebe, vorzugsweise Kuheuter, im halbgefrorenen Zustand zerkleinert, mit Präparationspuffer, vorzugsweise Phosphatpuffer, versetzt und in einem hochtourigen Messerhomogenisator homogenisiert. Das Homogenisat wird mehrfach zentrifugiert, und zwar zuerst niedertourig, vorzugsweise für 10-20 min bei 1000Ox g, dann hochtourig, vorzugsweise bei 50000 χ g für 50-70 min.

Der Überstand dieser Zentrifugation wird einer fraktionierten Ammoniumsulfatfällung unterzogen. Vorzugsweise wird zunächst mit 30% (der Sättigungskonzentration) Ammoniumsulfat gefällt, der Überstand dieser Fällung mit 60% der Sättigungskonzentration an Ammoniumsulfat erneut einer Fällung unterzogen und das zuletzt erhaltene Präzipitat in Präparationspuffer gelöst.

Ungelöste Bestandteile werden anschließend entfernt, vorzugsweise durch Ultrazentrifugation.

Die weitere Reinigung der so erhaltenen Eiweißlösung erfolgt durch wirksame Abtrennung von Molekülen mit Molekularmassen kleiner als 10000 und größer als 50000, vorzugsweise durch Ultrafiltration. Es wird zunächst ein molekulargewichtsselektives Ultrafilter mit einer nominellen Ausschlußgrenze von 50000 Dalton eingesetzt. Danach wird das Filtrat unter Verwendung eines Ultrafilters mit der Ausschlußgrenze 10000 konzentriert. Anschließend erfolgt die Abtrennung von Ammoniumsulfat, die Überführung in einen für eine Anionenaustauschchromatographie passenden schwach alkalischen kationischen Puffer und gegebenenfalls eine weitere Größenfraktionierung zur Gewinnung einer Eiweißfraktion des Molekularmassebereiches von 10000-30000 Dalton, vorzugsweise durch Gelchromatographie, z.B. an Sephadex G50 oder G25 in Imidazolpuffer,pH8,0.

Die Weiterreinigung erfolgt durch Gewinnung einer Fraktion des isoelektrischen Punktes 4,5-5,0, vorzugsweise durch Anionenaustauschchromatographie, z.B. an DEAE-Sepharose CL4B. Zur Weiterreinigung für Strukturuntersuchungen oder immunologische Zwecke wird das so erhaltene MDGI-Präparat einer HPLC an Gelpermeationsträgern unter stark desaggregierenden Bedingungen, bei einem pH > 6, vorzugsweise in SDS- oder Guanidin-haltigen Puffern, unterzogen.

Biochemische Eigenschaften

Die nach dem beschriebenen Verfahren erhältlichen Präparate von MDGI enthalten reproduzierbar mindestens 90-95% (nach HPLC 99%) eines sich in der SDS Polyakrylamidgelelektrophorese sowohl unter reduzierenden als auch unter nichtreduzierenden Bedingungen als Bande von etwa 13kD (gleiche Mobilität von Zytochrom C) darstellenden Proteins. Durch immunochemische Untersuchungen mittels eines spezifischen Mäuseantiserums ist bewiesen, daß dieses Protein für die Hemmeigenschaften der Präparation essentiell ist.

Die ca. 13kD Eiweißbande spaltet in der isoelektrischen Fokussierung in zwei Komponenten von IP etwa 4,6 sowie IP4,9 auf, welche bezüglich mehrerer Kriterien unterschiedlich geladene Derivate derselben oder sehr ähnlicher Polypeptidketten darstellen (identisches Spaltmuster mit Bromcyan, gleiche Reaktivität gegen einen monoklonal en Antikörper). Das Protein neigt zur Adsorption an Glasoberflächen. Mit immunchemischen Tests konnte das Vorliegen verwandter Proteine in verschiedenen Geweben gezeigt werden u.a. bei Rind: Michfett-Tröpfchen-Membranen, Lunge; beim Menschen: Milchfett-Tröpfchen-Membranen, Milchdrüse, Haut, Leber, glatte Muskulatur.

Biologische Eigenschaften

Das nach dem beschriebenen Verfahren erhaltene Präparat entfaltet im Dosisbereich von 1— 3ng/ml und darüber profilerationshemmende Aktivität gegenüber folgenden Zellinien:

Ehrlich Ascites Mammakarzinom- (EAC) Zellen (Maus):

in vitro Kurzzeitkultur,

Suspensionskultur,

Zellzahleffekt meßbar nach 24h, zur Kultur „Plateau-Phase" Zellen des Transplantations-Tumors eingesetzt.

Menschliche Mammakarzinomzellinie ,,MaTu";

— Hemmung des ³H-Thymidineinbaus unter verschiedenen Kulturbedingungen

— Hemmung der Vermehrungsgeschwindigkeit in einem Weichagar-Kolonie-Bildungstest Normale menschliche Mammaepithelzellinien ,,NoMa" sowieT47D (menschl. Mammakarzinomlinie):

— Hemmung des³H-Thymidineinbaus bei Stimulierung ruhender Zellen.

Die Hemmungen sind (a) nichttoxisch, (b) auf das in den Präparaten enthaltene Protein zurückzuführen und (c) bezüglich verschiedener Kriterien spezifisch. Insbesondere wurden bezüglich der Wirkung auf EAC-Zellen eine die Hemmung aufhebende Wirkung von Insulin, EGF (Epidermaler Wachstumsfaktor) und dCyd

(Desoxycytidin) aufgefunden.

Das MDGI-Präparat hat keine Interferon-Aktivität und keine Aktivität eines „Transformierenden Wachstumsfaktors".

Strukturuntersuchungen

Die nach dem beschriebenen Verfahren erhaltene MDGI-Präparation ist durch folgende Strukturmerkmale charakterisiert:

a) Brutto-Aminosäurezusammensetzung

Asp und Asn (zusammen ca. 10%), GIu und GIn (zusammen ca. 12%),Thr, Ser, GIy (je ca 10%), Ala, VaI, Leu (je 5-8%), Pro, He, Phe, Arg, Cys (je 3-4%), Met, Tyr, His (je 2-3%), Lys (7-8%), Trp (nicht bestimmt).

b) Aminosäuresequenzen tryptischer Spaltpeptide Asn-Thr-Glu-Ile Leu-Val-His-Val-Gln Thr-Gln-Ser-Thr-Phe Glu-M,et-Val-Asp-G!y Leu-Gly-Val-Glu-Phe-Asp Leu-Val-Ser-Ser-Glu-Asn Gln-Val-Gly-Asn-Met-Thr Ser-Ile-Val-Asn-Leu-Asp AsR-Phe-Asp—Asp—Tyr

Ser-Ile-Val-Thr-Leu-Asp-Gly-Gly

Trp-Leu-Gly-Val-Gly-Phe-Ala-Thr-Arg

Ser-Leu-Gly-Val-Gly-Phe-Ala-Thr-Arg

Leu-Ile-Leu-Thr-Leu-Thr-His-Gly-Thr-Ala-Val-Cys-Thr-Arg

Eine Recherche unter ca. 3500 in einer zum Zeitpunkt der Abfassung dieser Patentschrift den aktuellen internationalen Kenntnisstand repräsentierenden Datenbank vorhandenen bekannten Proteinsequenzen ergab, daß das erfindungsgemäß beschriebene Präparat MDGI mit keinem dieser Proteine identisch ist.

Teilbereiche der Aminosäuresequenzen weisen Homologien zu einem als „P2-Protein" bezeichneten basischen Myelinprotein des peripheren Nervengewebes auf.

Ausführungsbeispie!

Ausgangsmaterial der Reinigung ist gesundes, laktierendes Euter, das unmittelbar nach Schlachten des Tieres gekühlt wird (Eis bzw. 4⁰C), bei4°C von Fett und Bindegewebe befreit wird und in 50-100g-Portionen durch Übergießen mit flüssigem Stickstoff innerhalb von 2-3h nach dem Tod des Tieres eingefroren wird. Die Lagerung des Gewebes erfolgt bei -17°C bis zu 3 Monaten. Für eine Aufarbeitung werden 800-90Og dieses Materials für 30—60 min bei Raumtemperatur kurz angetaut. Alle weiteren Aufarbeitungsschritte erfolgen bei 0-4⁰C. Das Gewebe wird im halbgefrorenen Zustand mit Messern in kleine Stücke (5-1Og) zerkleinert, mit 1,31 Präparationspuffer (1OmM Na-Phosphat, 1OmM NaCI, pH7,4) versetzt und in einem hochtourigen * Messerhomogenisator (Waring Blendor)für insgesamt 2 min in 30s-Perioden homogenisiert. Das Homogenisat wird 15min bei lOOOOxg zentrifugiert, der klare Überstand abesaugt, und erneut zentrifugiert bei 50000xg für 60min. Der Überstand dieser Zentrifugation wird durch Baumwollgaze (vier Lagen) gegossen. Unter Rühren wird innerhalb von 10-15 min festes fein zermörsertes Ammoniumsulfat (p.a., nicht weiter vorgereinigt) zugesetzt zu einer Endkonzentration von 30% der Sättigungskonzentration.

Das Rühren wird bis 30min nach Beginn des Ammonsulfatzusatzes fortgesetzt, dann eingestellt und für 2h die Präzipitation abgewartet. Es erfolgt dann Zentrifugation bei 6000xg für 30 min. Der Überstand dieser Zentrifugation wird durch Dekantieren gewonnen und unter völlig analoger Verfahrensweise nun einer Fällung mit 60% (der Sättigung) Endkonzentration Ammoniumsulfat unterzogen. Die anschließende Zentrifugation erfolgt bei 8000xg für30min. Der Überstand dieser Zentrifugation wird verworfen. Die Sedimente werden zu einem Volumen von 360 ml mit Präparationspuffer aufgenommen und durch vorsichtiges Mischen gelöst. Ungelöste Bestandteile werden durch Zentrifugation bei 75000xg für 45 min anschließend entfernt. Die so erhaltene Eiweißlösung wird durch ein molekulargewichtsselektives Ultrafilter mit einer nominellen Ausschlußgrenze von 50000 (Amicon XM 50 oder vorgetestete Chargen von UF150, VEB Zellstoffwerk Witten berge) filtriert. Das Fi Itrat wird unter Verwendung eines Ultrafilters mit der Ausschlußgrenze 10 000 (Amicon UM 10 oder YM 10) konzentriertauf 10-15 ml Volumen. Diese Fraktion wird einer Gelchromatographie unterzogen, und zwar entweder an Sephadex G 50 (50 χ 1 000mm Säule, Fraktion ^VE/V_O von 1,7-1,9 wird gesammelt) oder aη Sephadex G 25 (15 χ 300 mm Säule, ausgeschlossenes Material wird gesammelt) jeweils in 5OmM Imidazol/HCL-Puffer, pH-8,0. Die gesammelten, MDGI-haltigen Fraktionen werden anschließend einer Anionenaustauschchromatographie unterzogen. Dazu wird die entsprechende Lösung auf eine Säule mit 2 ml DEAE-Sepharose, CL-4B gepumpt, welche vorher mit dem 5OmM Imidazolpuffer, pH 8,0 equilibriert wurde. Nach dem Aufpumpen der Probe wird die Säule erneut im Imidazolpuffer gewaschen (etwa mit dem 10fachen Säulenvolumen) und die MDGI-Fraktion dann mit 5OmM NaCI im genannten Imidazolpuffer gelöst, eluiert. Die Eiweiß enthaltenden Fraktionen werden nun vereinigt und entweder durch Dialyse (2mal zum Gleichgewicht gegen das lOOfache Volumen) oder erneute Sephadex G25-Chromatographie wieder in den Präparationspuffer überführt. Für biologische Untersuchungen bestimmte Proben des so erhaltenen Materials werden mit Rinderserumalbumin zu 0,5mg/ml versetzt. Die Lagerung der Präparate erfolgt in silikonisierten Glasampullen. Bei 4⁰C ist eine Lagerung für 1-3 Tage möglich, nach Schockfrieren mit Flüssigstickstoff und Aufbewahrung bei —20⁰C/ oder unter Flüssigstickstoff/ oder Lyonphilisation und anschließende Aufbewahrung bei 4°C ist die Stabilität der biologischen Aktivität für 1-3 Wochen gegeben.

Für Strukturuntersuchungen oder immunologische Zwecke erfolgt Weiterreinigung des ca. 13kDMDGI-Polypeptidsdurch HPLC an einer TSK2000 SW-Säule in 6 M Guanidin-HCI, 0,1 M Phosphat pH 6,0 oder einer Serva Si-200 Polyol-Säule in 0,1 % SDS, 5OmM Phosphat, pH7,0.

Claims (8)

1. Verfahren zur Gewinnung eines strukturell definierten Proliferationshemmstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß man hemmstoffhaltiges Gewebe im halbgefrorenen Zustand zerkleinert, mit Präparationspuffer versetzt und homogenisiert, anschließend das Homogenisat mehrmals zentrifugiert, den Überstand einer fraktionierten Ammoniumsulfatfällung unterzieht, die so erhaltene Eiweißfraktion nach Molekularmasse auftrennt, anschließend eine Trennung nach elektrischer Ladung und abschließend eine Gelpermeations-HPLC durchführt und die den Hemmstoff enthaltenden Fraktionen anhand ihrer biologischen Wirkungen bestimmt.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Ammoniumsulfat zu einer Endkonzentration von 30% der Sättigungskonzentration zusetzt, den Überstand gewinnt, zu diesem wiederum Ammoniumsulfat zu einer Endkonzentration von 60% der Sättigungskonzentration zusetzt und nunmehr das Präzipitat gewinnt.

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst eine Eiweißfraktion des Molekularmassenbereiches von 10000-50000 Dalton dann des Molekularmassenbereiches von 10000-30000 Dalton gewinnt.

4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die Trennungen nach Molekularmasse molekulargewichtsselektive Ultrafilter und Gelchromatographie eingesetzt werden.

5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man durch lonenaustauschchromatographie eine Eiweißfraktion des Isoelektrischen Punktes 4,5-5,0 gewinnt.

6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine abschließende Reinigung durch Gelpermeation-HPLC unter desaggregierenden Bedingungen bei einem pH > 6 erfolgt.

7. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die den erfindungsgemäßen Hemmstoff enthaltenden Fraktionen durch die Bestimmung der proliferationshemmende Wirkung auf in vitro gehaltene Epithel-Zell-Linien, die Labilität der biologischen Wirkung gegen Hitze, und die antagonistische Wirkung von Insulin, EGF (Epidermaler Wachstumsfaktor) und dCyd unter Verwendung von Ehrlich Ascites Mammakarzinomzellen ermittelt.

8. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Vermeidung der Adsorption und Denaturation des Hemmstoffes bei allen Reinigungsoperationen möglichst mit silikonisierten Materialien arbeitet und die Lagerung unter Zusatz von Inertprotein erfolgt.