DD245903A1 - Verfahren zur trypsinhemmung bei der durch trypsin katalysierten humaninsulinsynthese - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trypsinhemmung, bei der enzymatischen Synthese von Humaninsulin, vor allem bei der Umwandlung von Insulinen tierischen Ursprungs in Humaninsulin. Aufgabe ist es, ein Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe die auf der Wirkung von Trypsin beruhende enzymatische Synthese von Humaninsulin verbessert wird. Die Aufgabe wurde dadurch geloest, dass der Reaktionsmischung Aprotinin im mindestens aequimolaren Verhaeltnis zu Trypsin zugesetzt wirda) nach der Bildung des Umwandlungsproduktes undb)nach Durchfuehrung spezieller Verfahrensschritte zur Trypsinabtrennung bzw. -hemmung.Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zurTrypsinhemmung bei der enzymatischen Synthese von Humaninsulin, vor allem bei der Umwandlung von Insulinen tierischen Ursprungs, insbesondere Schweineinsulin in Humaninsulin. Gebräuchliche Verfahren basieren auf einer durch die Serinprotease Trypsin katalysierten Reaktion. Nachfolgend muß Trypsin inaktiviert oder entfernt werden.

Humaninsulin ist das Mittel der Wahl zur Behandlung des insulinpflichtigen Diabetes mellitus. Die Erfindung ist zur Anwendung in der pharmazeutischen Industrie geeignet.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß durch proteolytische Enzyme unter speziellen Bedingungen Reaktionen katalysiert werden, die zur Synthese von Peptiden bzw. zur enzymatischen Abwandlung natürlich vorkommender Polypeptide und Proteine genutzt werden können. Derartige Reaktionen haben bei der enzymatischen Umwandlung von tierischen Insulinen in Humaninsulin (im folgenden als enzymatische Humaninsulin-Synthese bezeichnet) Bedeutung erlangt, insbesondere die durch Trypsin katalysierte Umwandlung (INOUYE, K. et. al., J.Amer. Chem. Soc. 101,751 [1939], MORIHARA, K. et. al., Nature 280,412 [1979], EP 17938, EP 45187, DE-AS 3104949, DD-WP 160282).

Für die an die enzymatische Reaktion anschließenden Verfahrensschritte zur Reindarstellung des Humaninsulins ist die fortgesetzte Wirkung desTrypsins auszuschließen, um einen proteolytischen Abbau des Reaktionsproduktes zu verhindern. Dies geschieht in den bisherigen verfahrensgemäßen Lösungen entweder durch Ansäuern auf pH-Werte, bei denen Trypsin praktisch inaktiv ist (unter pH3,0), und nachfolgende chromatographische Abtrennung des Enzyms bei niedrigem pH-Wert oder durch Zusatz von Harnstoff zum Reaktionsprodukt in Konzentrationen bis zu 8 mol/l, wodurch das Enzym ohne störende Einflüsse auf das Reaktionsprodukt denaturiert und'inaktiviert wird und nachfolgend chromatographisch abgetrennt werden kann. Ferner ist bekannt, daß das basische Polypeptid Aprotinin in der Lage ist, mit verschiedenen Serinproteasen, z. B. Trypsin, Chymotrypsin, Kallikrein, Plasmin u.a. stabile Komplexe zu bilden und diese Enzyme auf diese Weise durch Blockade der katalytischen Zentren zu hemmen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, die durch Trypsin bewirkte enzymatische Humaninsulin-Synthese, insbesondere die Umwandlung von Schweineinsulin durch vollständige Enzymblockade nach der Umwandlungsreaktion zu verbessern, so daß zusätzlich Verfahrensschritte zur Abtrennung oder Inaktivierung des Enzyms nicht eingeschaltet werden müssen.

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht'darin, auch die bei bisher üblichen Verfahren der enzymatischen Humaninsulinsynthese noch aktiv bleibenden Trypsinspuren zur Ausschaltung deren proteolytischer Wirkung, einfach und ohne zusätzliche Verfahrensschritte zu blockieren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe die auf der Wirkung von Trypsin beruhende enzymatische Synthese von Humaninsulin, insbesondere die Umwandlung von Schweineinsulin, verbessert wird. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß der Reaktionsmischung nach Bildung des Reaktionsproduktes das basische Polypeptid Aprotinin in einem mindestens äquimolaren Verhältnis zu Trypsin zugesetzt wird.

Bei fortgesetzter Einwirkung von Trypsin auf das Reaktionsprodukt wird dieses proteolytisch zu inaktiven Bruchstücken abgebaut. Die Wirkung desTrypsins muß daher zu einem Zeitpunkt, zu dem eine möglichst vollständige enzymatische Reaktion, aber noch kein nennenswerter Abbau des Reaktionsproduktes erfolgt ist, unterbrochen werden. Die genannten bisher eingesetzten Verfahren zurTrypsinhemmung haben den Nachteil, daß entweder zusätzliche Schritte zur Abtrennung des Enzyms in saurem Medium eingeschaltet werden müssen oder ein, insbesondere unter technischen Bedingungen, schwieriges Arbeiten in konzentrierten Harnstofflösungen erforderlich ist. Außerdem können Spuren von Trypsin aktiv bleiben und bei verlängerter Einwirkung einen merklichen Abbau des gebildeten Humaninsulinesters bewirken.

Diese Nachteile können durch den Einsatz von Inhibitoren, die eine spezifische Trypsinhemmung in der Reaktionsmischung bewirken, jedoch das Reaktionsprodukt nicht negativ beeinflussen, vermieden werden. Es wurde gefunden, daß das.basische Polypeptid Aprotinin diese Anforderungen erfüllt. Der Inhibitor (Molmasse 6500) bildet mit Trypsin (Molmasse 24000) einen Komplex, der sich durch eine hohe Stabilität (K_dj_SS = 10~¹⁴mol/l) auszeichnet und enzymatisch inaktiv ist. Bei Zugabe von Aprotinin zu dem Reaktionsprodukt der durch Trypsin katalysierten enzymatischen Humaninsulin-Synthese in einem mindestens äquimolaren Verhältnis (Gewichtsverhältnis AprotininiTrypsin =ä 1:4) erfolgt eine augenblickliche und vollständige Blockierung der Trypsinwirkung.

Aufgrund der Moleküleigenschaften des Aprotinins und des Aprotinin-Trypsin-Komplexes gelingt eine Entfernung des letzteren, sowie von überschüssigem Aprotinin leicht aus den Reaktionsmischungen im Rahmen der üblichen Abtrennungsverfahren des gebildeten Humaninsulinesters von unumgesetztem Tierinsulin. Letzteres erfolgt in den bisher bekannten enzymatischen Humaninsulin-Syntheseverfahren durch Chromatografie an basischen Ionenaustauschern bej einem pH-Wert von 8. Unter diesen Bedingungen wird das basische Aprotinin (I. P. = 10-10,5) auf entsprechenden Chromatografiesäulen nicht zurückgehalten, sondern erscheint im Durchlauf. Auch der ebenfalls basische Aprotinin-Trypsin-Komplex wird nur gering retiniert und in der Säulenchromatografie kurzfristig vollständig eluiert. Das saure Reaktionsprodukt und das ebenfalls saure Tierinsulin (I. P. 5,0-5,5) erscheinen aufgrund ihrer höheren Affinität zu denverwendeten Ionenaustauschern erst in Elutiorisfraktionen, die sich eindeutig von denen des Aprotinin-Trypsin-Komplexes absetzen.

Der Einsatz von Aprotinin in trypsinkatalysierten Humaninsulin-Syntheseverfahren kann auch zur Inaktivierung der bei den üblichen Verfahren zur Ausschaltung der Enzymwirkung noch übrig bleibenden Trypsinspuren mit Vorteil erfolgen. Ferner können durch Einsatz von Aprotinin technologisch leicht handhabbare Verfahren zurTrypsinausschaltung entwickelt werden, z.B. die Ausfällung des größten Teiles des Enzymsaus einer 80%igen isopropanolischen Lösung bei einem pH-Wert < 3 und die Blockierung der restlichen Trypsinaktivität durch Aprotinin. Derartige Verfahren gestatten den ökonomischen Einsatz kleinerer Aprotinin-Mengen, deren Wiederabtrennung in freier Form bzw. in Form des Aprotinin-Trypsin-Komplexes darüber hinaus erleichtert ist

Die Erfindung soll an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1:

11 mg Acetonfällungsprodukt der enzymatischen Reaktion (enthält ca. 70% Humaninsulinester und ca. 30% nicht umgewandeltes Schweineinsulin, sowie Trypsin im Masseverhältnis 10:1) werden in 1 ml 0,03M Trispuffer, pH8,3 und 50% Isopropanol enthaltend, oder in 1 ml des gleichen Puffers, der zusätzlich steigende Mengen Aprotinin enthielt, oder in 8 M Harnstofflösung, pH3,0, gelöst und bis zu 24 Stunden bei 25°C inkubiert. Diediskelektrophoretische Untersuchung der Inkubationsansätze zeigte, daß bei Abwesenheit von Aprotinin nur 5% Humaninsulinester am Ende der Inkubation nachgewiesen werden können, während der größte Teil zu Des-Threonin_B3o-Humaninsulin abgebaut wird. Bei Inkubation in Anwesenheit von 50% bzw. 100% der dem in den Ansätzen enthaltenen Trypsin (Aktivitätsbestimmung mit N-Benzyol-DL-arginin-p-nitroanilid) äquimolaren Aprotininmenge betrugen die Humaninsulinesteranteile 72% bzw. 81 % bzw. bei Inkubation in Harnstofflösung 80%.

Beispiel 2:

Acetonfällungsprodukt entsprechend Beispiel 1 wurde in einer Konzentration von 10 mg/mI in 0,03 M Trispuffer, pH 8,3 und 50% Isopropanol sowie 250/xg Aprotinin/ml enthaltend, gelöst. Die Aprotininmenge entspricht 110% der äquimolaren, in der Acetonfällungsprodukt-Lösung enthaltenen Trypsinmenge — bestimmt durch Hydrolyse von N-Benzolyt-DL-arginin-pnitroanilid.40ml dieser Lösung wurden an Säulen von DEAE-Sephadex A25 (Volumen 70ml) unter Verwendung eines NaCI-Gradienten chromatografie!!. Bei einem Elutionsvolumen von 1 000 ml trat Aprotinin in den ersten 20 ml Eluat auf, der Aprotinin-Trypsin-Komplex in den Fraktionen 20-12OmI Eluat, Humaninsulinester in den Fraktionen 350-50OmI Eluat und das unveränderte Ausgangsprodukt in den Fraktionen 500-70OmI Eluat.

Beispiel 3:

10mg Acetonfällungsprodukt gemäß Beispiel 1 wurden in 80%igem Isopropanol, pH3, gelöst. Das dabei ungelöste Trypsin wurde abzentrifugiert und der Überstand ohne weitere Zusätze, bzw. nach Zusatz von 20/xg Aprotinin auf 50% Isopropanol und mitTrisaufpH 8 eingestellt. Die eingesetzte Aprotininmenge entspricht ca. 10% der äquimolaren Aprotininmenge im Verhältnis zur ursprünglich vorhandenen Trypsinmenge. Durch diskelektrophoretische Untersuchung der Inkubationsansätze wurde nachgewiesen, daß in dem unbehandelten Ansatz eine Spaltung des Humaninsulinesters in Des-Threonin_B30-Humaninsulin erfolgt (ca. 20%), während nach Zusatz von Aprotinin der Humaninsulinester stabil bleibt.

Claims (5)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zurTrypsinhemmung bei der durch Trypsin katalysierten Humaninsulinsynthese, gekennzeichnet dadurch, daß der Reaktionsmischung Aprotinin im mindestens äquimolaren Verhältnis zu Trypsin zugesetzt wird,

   a) nach der Bildung des Umwandlungsproduktes

   b) nach Durchführung spezieller Verfahrensschritte zurTrypsinabtrennung bzw. -hemmung.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1 a, gekennzeichnet dadurch, daß die Abtrennung des Umwandlungsproduktes ohne spezielle Verfahrensschritte zurTrypsinabtrennung bzw. -hemmung bei pH 5 bis 9 durchgeführt werden kann.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 b, gekennzeichnet dadurch, daß noch aktive Trypsinspuren, die das Umwandlungsprodukt verändern können, blockiert werden.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß Aprotinin vorzugsweise im äquimolaren Verhältnis zu Trypsin oder in bis zu 25%igem molaren Überschuß zugesetzt wird.
5. 5. Verwendung von Aprotinin als Trypsinhemmstoff bei der durch Trypsin katalysierten enzymatischen Humaninsulin-Synthese, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionslösung nach der Bildung des Reaktionsproduktes Aprotinin in mindestens äquimolarem Verhältnis zu Trypsin zugesetzt wird.