DD231805A1 - Kombiniertes verfahren zur herstellung von cellulaseenzymen und pilzprotein - Google Patents

Abstract

Die Erfindung befasst sich mit der aeroben Fermentation von Pilzen zur gleichzeitigen Gewinnung von Pilzprotein und von Cellulaseenzym. Ziel der Erfindung ist es, in einem Kombinationsverfahren durch Erreichung hoher Myzelkonzentrationen und hoher Konzentrationen an extrazellulaerem Cellulaseenzym eine effektive Nutzung des Fermentationsvolumens zu erreichen. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe geloest durch ein kombiniertes Naehrmedium, das ein oder mehrere, die Cellulasebildung induzierende Bestandteile und ein oder mehrere, die Cellulasebildung nicht reprimierende, aber leicht utilisierbare Bestandteile, enthaelt, und eine entsprechende Prozessfuehrung, so dass maximale Myzelkonzentrationen und maximale Enzymaktivitaet zeitlich zusammenfallen. Die Erfindung ist anwendbar zur gleichzeitigen Erzeugung proteinreicher Futtermittel und von Cellulaseenzym.

Description

Titel

Kombiniertes Verfahren zur Herstellung von Cellulaseenzymen und Pilzprotein

Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die vorliegende Erfindung betrifft ein kombiniertes Verfahren zur Herstellung von Cellulaseenz-ymen und Pilzprotein durch aerobe Submerszüchtung von Pilzen. Die Erfindung kann in die IPK C 12 Ή eingeordnet werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Ss ist allgemein bekannt, die Enzyme des Cellulasekomplexes durch aerobe Submerszüchtung von Pilzen herzustellen. Beispielsweise werden gemäß den DDR-Patentschriften 145 182, 145 028 und 142 130 (C 12 Π 9/42) hierfür Pilze der Gattungen Gliocladium, Penicillium und Srichoderma eingesetzt, wobei das Hährmedium Cellulose in einer Konzentration von 0,5 bis 1 % als Induktor für die Cellulasebildung und als Kohlenstoffquelle enthalten muß.

Es ist ebenso bekannt, Pilzprotein durch aerobe Fermentation von Pilzen herzustellen. Beispielsweise ist von Chahal und Moo-Young (Can. J. Microbiol. 25 (1979), 793 - 797) ein Verfahren beschrieben, bei dem aus vorbehandeltem Weizenstroh bzw· verschiedenen Fraktionen des Weizenstrohes Protein mittels Pilzen gewonnen wird.

13.3.3 4 - 01 91 4 6 G

Ton Moo-Young, Chahal und Macdonald .(Process Biochemistry 14 (1979), 10, 38 - 40) wird in einem sogenannten Waterloo-Prozeß ein Verfahren beschrieben, bei dem der Pilz Chaetomium cellulolyticum zur Gewinnung von Pilzprotein aus cellulosehaltigen Substanzen eingesetzt wird.

Alle bisher bekannten Verfahren zur Cellulasegewinnung sowie zur Gewinnung von Pilzprotein haben jedoch den Nachteil, daß sie praktisch entweder nur für die Cellulasegewinnung oder nur für die Gewinnung von Pilzprotein geeignet sind. Dadurch bedingt ist das Fermentorvolumen nicht effektiv ausgenutzt. Von Peitersen (Biotechnol. Bioeng. XVII (1975), 361 -374) ist zwar ein Verfahren zur Gewinnung von Cellulase-Enzym und Pilzprotein durch Kultivierung von Trichoderma viride-Stämmen auf Gerstenstroh beschrieben, jedoch ist bei diesem Verfahren die Cellulaseausbeute wesentlich niedriger, als bei den bekannten Verfahren zur Cellulasegewinnung. Außerdem sind die erforderlichen Fermentationszeiten sehr groß und der Zeitpunkt der maximalen Cellulaseaktivität liegt wesentlich später als der Zeitpunkt des maximalen Gehaltes an Pilzprotein.

Dadurch bedingt ist dieses Verfahren ökonomisch nicht rentabel.

Ziel der Erfindung

Es ist deshalb das Ziel der Erfindung, ein kombiniertes Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von Cellulaseenzymeη und Pilzprotein zu entwickeln, welches ermöglicht, sowohl die extrazellulären Cellulaseenzyme als auch Pilzprotein in hoher Konzentration herzustellen und somit eine effektive Ausnutzung des Fermentors gewährleistet.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, in einer Fermentationsstufe mittels ausgewählter Mahrmedien und einer speziellen Prozeßführung gleichzeitig hohe extrazelluläre Cellulasekonzentrationen und hohe M7zelkonzentrationen zu bilden. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe so gelöst, daß dem lährmedium erstens ein oder mehrere die Bildung von Cellulaseenzymeη in-

duzieren&e Substanzen und zweitens ein oder mehrere die CeI-lulasebildung nicht reprimierende aber leicht utilisierbare und somit die Myzelbildung erhöhende Substrate zugegeben werden. Als Substanzen für die Induktion der Cellulaseenzyme werden beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Celluloseabfälle der Baumwollverarbeituag, chemisch nicht vorbehandeltes zerkleinertes Stroh oder lösliche Induktoren wie z. B. Sophorose verwendet

Zur Erhöhung der Myzelkonzentration werden als leicht utilisierbare, aber die Cellulasebildung nicht reprimierende Kohle η st off quellen beispielsweise chemisch vorbehandeltes Stroh, gequollene Cellulose oder lösliche Substanzen in geringer aktueller Konzentration, wie z. B. Lactose, verwendet· Die zeitliche Zugabe der Substanzen zur Induktion der Ce Hulaseenzyme einerseits und der nicht reprimierendeη Kohlenstoffquellen zur Erhöhung der Myzelkonzentration andererseits werden erfindungsgemäß so aufeinander abgestimmt, daß der Zeitpunkt der maximalen Myzelkonzentration und der Zeitpunkt der maximalen Cellulaseaktivität im Permentationsmedium etwa zusammenfallen.

Werden zur Erhöhung der Myzelkonzentration beispielsweise lösliche Kohlenstoffquellen verwendet, welche in geringer aktueller Konzentration die Cellulasebildung nicht reprimieren, so werden diese Substanzen erfindungsgemäß dem Permentationsmediun in einer solchen Weise kontinuierlich oder in Form von Teilmengen zugesetzt,, daß im Fermentationsmedium die reprimierende Konzentration nicht erreicht bzw. überschritten wird. Werden zur Erhöhung der Myzelkonzentration cellulosehaltige Substanzen wie beispielsweise chemisch vorbehandeltes Stroh verwendet, so wird erfindungsgemäß am Ende der Fermentation der an den nicht umgesetzten Peststoffen adsorbierte Anteil an CeHuIaseenzymeη mittels pH-Verschiebung des Fermentationsmediums desorbiert.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1;

In einem Rührfermentor mit einem Bruttovolumen von 30 Litern wird der Pilz Aspergillus terreus i 996 für die Gewinnung von Gellulaseenzvmen und Pilzprotein kultiviert.

Die Bestandteile des Nährmediums werden folgendermaßen zusammengesetzt:

KH₂PO₄ 50,4 g

(1TH₄)₂SO₄ 86,4 g

CaCl_p . 2 H₂O 5,4 g

MgSO₄ . 7 H₂O 9,0 g

Harnstoff 5,4 g

Pepton 27,0 g

Tyyeen 80 36,Og

FeSO₄ . 7 H₂O 0,090 g

MnSO₄ . 7 H₂O 0,029 g

ZnSO₄ . 7 H₂O 0,026 g

CoGl₂ . 0,036 g

Als induzierendes Substrat wird der Holzzellstoff Heweten 10 Hz in einer Menge von 180 g verwendet. Die angegebenen Bestandteile v/erden in 12,6 Litern Wasser in geeigneter Weise gelöst bzw. suspendiert und sterilisiert. Dieses Medium wird

mit ca. 9 x 10 Konidien des Aspergillus terreus-Stammes beimpft und im 30 1-Fermentor unter Ausschluß von Fremdkeimen fermentiert. Die Kultivierungstemperatur beträgt 30⁰G; der pH-Wert wird mittels Regelung innerhalb der Grenzen 3,5 bis 5,0 gehalten. Bei Erreichen der unteren Regelgrenze wird durch. Zudosieren von 12 %iger EH^-Lösung der pH-Wert geregelt. Das Fermentationsmedium wird mit 200 l/h Luft begast. Die Rührerdrehzahl wird mittels eines Regelkreises so eingestellt, daß der aktuelle Sauerstoffpartialdruck im Fermentationsmedium den Betrag von 20 % - bezogen auf Luftsättigung - nicht unterschreitet. Die Schaumbildung wird mit einem Entschäumer in

Form eines MischpoLymerisates aus ButtlengLykolformal und Diethylengl^kolformal gedämpft. Each 75 Stunden Kultivierungszeit werden 5»4 kg eines gequollenen, nach den bekannten Verfahren mit Natronlauge alkalisch vorbehandelten und defibrierten Weizenstrohes mit einem Wassergehalt von 80 % dem Fermentationsniedium zugegeben· Die Begasungsmenge wird auf 400 l/h Luft erhöht· Ansonsten werden die Fermentationsbedingungen beibehalten. .Nach einer Fermentationszeit von insgesamt ca. 120 Stunden ist die Fermentation beendet, erkennbar an einer Alkalisierung des pH-Wertes· Fach Beendigung der Fermentation wird der pH-Wert des Fermentationsmediums durch Laugezugabe auf 7,3 eingestellt; anschließend werden die Feststoffe mittels Separation oder Filtration entfernt. Die Feststoffe betragen 730 g - bezogen auf Trockensubstanz - und ent- -halten 24 % Hohprotein. Die CeHulaseaktivität im KuIturfiltrabe trägt 0,6 IU/ml Filterpapieraktivität bzw. 4,1 IU/ml CMC-Aktivität·

Beispiel 2:

In dem Fermentor gemäß Beispiel 1 wird der Pilz Aspergillus fumigatus i 1000 zur Gewinnung von Cellulaseenz-ym und Pilzprotein kultiviert. Die Bestandteile des üiährmediums sind die gleichen wie im Beispiel 1, jedoch wird als induzierendes Substrat mechanisch zerkleinertes pulverförmiges Weizenstroh in einer Menge von 360. g verwendet. Diese Bestandteile werden in 9 Litern Wasser gelöst bzw. suspendiert und sterilisiert. Dieses Medium wird mit ca. 1 Liter einer Myzelsuspension des Aspergillus fumigatus-Stammes beimpft, welche erhalten wird durch 2- bis 4tägige Fermentation nach einer Konidienbeimpfung von Mandels-lährmedium mit 2 % säuregequollener Cellulose als Kohlenstoffquelle.

Die Kultivierung im 30 1-Fermentor erfolgt unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1. Nach 48 Stunden Kultivierungszeit werden 4,5 kg eines wie im Beispiel 1 gequollenen, chemisch vorbehandelten und defibrierten Weizenstrohes dem Fermentationsmedium zugegeben. Die Begasungsmenge wird auf 500 l/h Luft erhöht.

Nach einer Fermentationszeit von insgesamt 74 Stunden werden weitere 4,5 kg des gequollenen Strohes dem Fermentationsmedium zugegeben· Nach ca. 96 Stunden ist die Fermentation beendet. Die Gellulaseaktivität im Kulturfiltrat beträgt 0,4 IU/ml FiI-terpapieraktivität bzw. 2,5 IU/ml CMC-Aktivität· Die Feststoffe betragen 1220 g und enthalten 22 % Rohprotein. Durch Waschen der Feststoffe mit einer Pufferlösung / pH = 8 werden die an den Feststoffen noch adsorbierten Cellulaseenzyme mit einer Gesamtaktivität von 3600 IU Filterpapieraktivität bzw. 21600 IU CMC-Aktivität freigesetzt, was einer Erhöhung der Ensymausbeute von etwa 50 % entspricht.

Beispiel 3:

In dem Fermentor gemäß Beispiel 1 wird der Pilz Trichodernia koningii i 828 zur Gewinnung von Cellulaseenz-Ymen und PiIzprotein kultiviert. Als induzierendes Substrat wird der Holzzellstoff Heweten 10 Hz in einer Menge von 10 g/l verwendet; als nicht reprimierendes aber die Mvzelbildung erhöhendes Substrat dient Lactose in Form von Molke. Der Molke werden folgende Bestandteile zugesetzt:

KH2PO4	H2O	2	g/1
(NH4)2S04		4,8	g/i
MgSO4 . 7.		0,5	.g/i
Harnstoff	Hz	0,3	g/1
Tween 80	H2O	2	g/i
Heweten 10	H2O	10,0	g/i
MnSO4 · 7		1,6	mg/
ZnSO . 7	1,4	mg/
CoCl2	2	mg/

Die angegebenen Bestandteile werden sterilisiert und in der angegebenen Konzentration in 16 Liter frische sterilisierte Molke gegeben, welche einen Lactosegehält von 48 g/l enthält und in welcher das Protein durch Hitze sterilisation weitgehend ausgefällt und abgetrennt wurde.

Dieses Medium wird mit ca· 1 Liter einer Myzelsuspension des !Crichoderma koningii-Stammes beimpft, welche - wie im Beispiel 2 beschrieben - durch Kultivierung auf säuregequollener Cellulose hergestellt wurde. Die Kultivierung im 30 1-Fermentor erfolgt unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1, wobei die Begasungsmenge auf 400 1 luft/Stunde eingestellt und die Schaumbildung im Bedarfsfall mit Silikonentschäumer gedämpft werden

ITach einer Kultivierungszeit von etwa 80 Stunden ist die Lactose' konzentration auf ca. 1 bis 3 g/l gesunken und es wird auf konti nuierliche Betriebsweise mit einer Verweilzeit von 48 Stunden umgestellt. Die Zusammensetzung des zudosierten liährmediums bleibt die gleiche

Gegebenenfalls wird die Verweilzeit so korrigiert, daß der Bereich der aktuellen Lactosekonzentration von 1 bis 3 g/l nicht über- bzw. unterschritten wird.

Nach etwa 3 Verweilzeitperioden sind stationäre Bedingungen erreicht. Die Cellulaseaktivität im Kulturfiltrat des Permentorablaufes beträgt 0,5 Iü/ml Filterpapieraktivität bzw. 4,8 IU/ml CMC-Aktivität. Die Peststoffe betragen 27,3 g/l mit einem Rohproteinanteil von 46 %.

Beispiel 4:

In dem 30 1-Permentor gemäß Beispiel 1 wird der Pilz Aspergillus terreus i 996 zur Gewinnung von Cellulaseenzym und Pilzprotein kultiviert.

Als induzierendes Substrat werden Celluloseabfälle der Papierindustrie in einer Menge von 15 g/l verwendet; als nicht reprimierenaes aber die Kyzelbildung erhöhendes Substrat dient Xylose in Porm von Sulfitablauge der Zellstoffindustrie, wobei die aktuelle Xylosekonzentration durch geeignete kontinuierliche Prozeßführung gering gehalten wird. Der Sulfitablauge werden folgende Substanzen zugesetzt: KH₂PO₄ 2 g/l

. (IJH₄)₂SO₄ 4,8 g/l.

Harnstoff 0,3 g/i

Tween 80 1,0 g/l

Pepton 1,5 g/l

Celluloseabfälle 15 g/l

Die angegebenen Bestandteile werden in Buchenholzsulfitablauge mit einem Sylosegehalt von 35 g/1 gegeben und sterilisiert, Dieses Medium wird mit ca. 1 liter einer Myze!suspension des Aspergillus terreus-Stammes beimpft, welche - wie im Beispiel 2 beschrieben - durch Kultivierung auf säuregequollener Cellulose hergestellt wurde

Die Kultivierung im 30 1-Fermentor erfolgt wie im Beispiel 3 beschrieben, lach Absinken der Xylosekonzentration auf 0,5 bis 1 g/l wird auf kontinuierliche Betriebsweise mit einer Verweilzeit von 48 Stunden umgestellt. Die aktuelle Xylosekonzetitration darf den Wert von 1,0 g/l nicht überschreiten. Die Cellulaseaktivität im KuIturfiltrat'des Fernentorablaufes beträgt 0,4 Iü/ml. Filterpapieraktivität bzw. 3,4 IU/ml CMC-Aktivität. Die Feststoffe betragen 22,5 g/l mit einem Rohproteingehalt von 45 %· .

Claims (4)

Er fin dun g san a pr uch
1. .1 · Kombiniertes Verfahren zur Herstellung von Cellulaseenzymen und Pilzprotein durch aerobe Submerszüchtung cellulοLytischer Pilze gekennzeichnet dadurch, daß dem Nährmedium ein oder mehrere, die Cellulasebildung nicht reprämierende, aber die Myzelbildung erhöhende Substrate, und ein oder mehrere, die Bildung von Ce Hula se enzyme η induzierende Substrate zugesetzt werden und das nach Beendigung der Fermentation die an den Pe ststoffen adsorptiv gebundenen Gellulaseenzyme durch pH-Veränderung - desorbiert werden.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1., gekennzeichnet dadurch, daß als die Cellulasebildung nicht reprimierende, aber die Myzelbildung erhöhende Substrate vorzugsweise chemisch vorbehandeltes Stroh, gequollene Cellulose oder lösliche Substanzen, wie beispielsweise Lactose verwendet werden.
3. 3· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als die Bildung von Celluloseenzymen induzierende Substrate vorzugsweise mikrokristalline Cellulose, Celluloseabfälle der Baumwollverarbeitung, chemisch nicht νorbehandeltes zerkleinertes Stroh oder lösliche Induktoren wie beispielsweise Sophorose verwendet werden.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß das nicht reprimierende, aber die Myzelbildung erhöhende Substrat und das induzierende Substrat zu unterschiedlichen Zeitpunkten dem Fermentationsmedium diskontinuierlich oder kontinuierlich zugeführt werden.