DD228824A1 - Verfahren zur isolierung von meerrettichperoxidase - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung der Meerrettichperoxidase. Das Ziel besteht in der Isolierung von Meerrettichperoxidaseisoenzymen hoher spezifischer Enzymaktivitaet. Die Aufgabe wird im Angeben eines Verfahrens gesehen, Enzyme der genannten Art aus einem Rohprodukt abzutrennen und dabei eine Qualitaet des Endprodukts zu erreichen, das dieses als Marker in Enzymimmunassays einzusetzen erlaubt. Die Aufgabe wird geloest durch den Einsatz monoklonaler Antikoerper der Art BL-POD/1-12 in einem affinitaetschromatografischen Verfahren.

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Isolierung von Meerretticbperozidase

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur affinitätscbromatograpbiscben Isolierung von Peroxidase aus Meerretticb-Robpräparaten. Das Enzym Meerretticbperoxidase wird als Marker für Enzymimmunassays benötigt·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Peroxidase für die Verwendung als Markerenzym bei Enzym·? immunassays muß bocbgereinigt sein, da jede Verunreinigung sieb negativ auf die Sensitivität des Assays auswirkt. Die hauptsächlich benutzte Methode der Herstellung gereinigter Peroxidase ist die Adsorptionscbromatograpbie an Concanavalin A-Agaröse (WAGNER, M. Acta biol«med«germ· 2a. (1975) 1429). Die Bindung erfolgt aufgrund der Affinität dieses trägerfixierten Lektins zu der Koblenbydratkomponente des Enzyms« Da auch andere in den Peroxidaserobpräparaten enthaltene Glykoproteine vom Con A gebunden werden, ermöglicht dieses Verfahren nur eine Anreicherung der Peroxidase und keine boebspezifisebe Isolierung· Die EIution der adsorbierten Komponenten erfolgt durch 1 M Saccharose in Azatatpuffer pH 6,0·

Eine Verbesserung der Reinheit der Peroxidase läßt sich zwar durch eine anschließende Auftrennung nach dem Molekulargewicht durch Gelcbromatograpbie an Sepbadex G 200 erreichen (PORSTMABU, B* und T· PORSTMANH; Z.med.Labor.-Diagn« 20 (1979) 87). Eine spezifische Isolierung der

λ α ii nn λ ο 0 / * Λ C- Q '*' 'Ί Ο

Meerrettichperoxidase von Begleitproteinen wird nicht erreicht· Ebenso ist die Isolierung von Isoenzymen, die eine besonders hohe spezifische Enzymaktivität aufweisen, mit diesen Verfahren nicht möglich«

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein schnelles und einfach zu handhabendes Verfahren zur Isolierung von Meerretticbperoxidasei/isoenzymen, die sich durch eine hohe spezifische Enzymaktivität auszeichnen* aus Meerretticbperoxidaserobprodukten anzugeben. Diese hochgereinigten Peroxidasepräparationen sollen kostengünstig herstellbar sein«

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren auszuarbeiten, das die Isolierung von Meerretticbperoxid as ei;is ©enzymen mit hoher spezifischer. Aktivität, wie sie als Marker in Enzymimmanassays benötigt werden, durchzuführen gestattet·

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Abtrennung der Peroxidese von anderen in den Rohprodukten enthaltenen Uichtperoxidasekomponenten sowie die Isolierung von Isoenzymen, die eine besonders hohe spezifische Aktivität besitzen, unter Verwendung monoklonaler Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper der Serie BL-POD/1 bis 12 erfolgt· Die monoklonalen Antikörper BL-POD/1 bis 12 werden von den jeweiligen Hybridomen H-BL-POD/1 bis 12 sezerniert und von der Sektion Biowissenschaften der KMJ Leipzig produziert und vertrieben· Die monoklonalen Antikörper BL-POD/1 bis 12 reagieren spezifisch mit Meerrettichperoxidaseisoenzymen, die eine hohe spezifische Aktivität aufweisen· Die Isolierung der Peroxidaseisoenzyme erfolgt durch die Verwendung eines Gliedes oder einer Kombination mehrerer Glieder der Serie monoklonaler Antikörper BL-POD/1 bis 12·

Die monoklonalen Antikörper BL-POD/1 bis 12 werden zur Isolierung der Peroxidase nach an sich bekannten Verfahren

an feste Träger gekoppelt. Als Träger eignen aicb alle Substanzen, die sieb für die Affinitätscbromatograpbie als Träger bewäbrt haben· Geeignet sind z. B, Sepbarose oder bestimmte Zellulosen« Die Kopplung der monoklonalen Antikörper kann mit allen dem Fachmann bekannten Verfahren der Ankopplung von Proteinen an feste Träger erfolgen, wie z. B· Kopplung an CNBr-aktivierte Sepbarose 4B, Kopplung über Carbodiemid oder Glutardialdebyd·

Die Meerretticbperoxidaserobpräparate werden mit diesen trägerfixierten monoklonalen Antikörpern BL-POD/1 bis 12 inkubiert, wobei dies zweckmäßigerweise bei +4 ⁰C geschiebt· Uacb der erfolgten Bindung der Peroxidase an die trägerfixierten Antikörper wird dieser Komplex von den Begleitsubstanzen aus der Rohpräparation freigewaschen· Hierzu kann 0,15 M HaCl-Lösung, die mit 0,01 M Phosphat auf pH 7,4 gepuffert ist, verwendet werden· Dieses Waschen kann im kontinuierlichen Durchflußverfahren oder diskontinuierlichen Zentrifugationsverfahren erfolgen· Ist die Waschflüssigkeit von Begleitkomponenten frei, was durch geeignete Verfahren geprüft wird, werden die gebundenen Peroxidaseisoenzyme durch schonende Desorption eluiert· Zur Desorption dienen übliche Verfahren, die die enzymatische Aktivität der Peroxidase nicht beeinträchtigen· Die isolierte Peroxidase muß möglichst schnell in einen Puffer überführt werden, in dem sie ohne Aktivitätsverluste aufbewahrt werden kann· Die Lyopbilisierung gestattet eine längere Lagerungszeit bei geringerem Verlust der enzymatischen Aktivität·

Die trägerfixierten monoklonalen Antikörper BL-POD/1 bis 12 können mehrfach zur Isolierung von Peroxidase verwendet werden, wenn die Desorption schonend ausgeführt wird, so daß die Antikörperaktivität nicht zerstört wird·

Das Verfahren gestattet es in einfacher sowie material- und energiesparender Weise Meerretticbperoxidaseisoenzyme, die hohe spezifische Aktivität besitzen, zu isolieren.

Anwendungsbeispiel

30 ml gepackte, mit GUBr aktivierte Sepbarose 4B werden mit 50 mg monoklonalen Antikörper BL-POD/2 gemischt und die beiden komponenten 30 min bei Raumtemperatur gerührt· Nach der erfolgten Ankopplung wird die BL-POD/2-beladene Sepbarose auf einer Pritte gewaschen. Überschüssige reaktive Gruppen werden durch Inkubation mit 1 M blockiert·

Das Sepharose-BL-POD/2-Kon^ugat wird in eine Glassäule gepackt und im Durchflußverfahren gewaschen« Anschließend werden 50 ml klarer Meerrettichrohextrakt langsam durch die auf +4 ⁰C gekühlte Säule geleitet· Danach wird die Säule mit PBS (0,15 M IaCl, 0,01 M Phosphat, pH 7,4) gewaschen, bis im Eluat kein Protein mehr durch Absorptionsmessung bei 280 mn nachgewiesen werden kann·

Die Elution der voxs insolubilisierten monoklonalen Antikörper BL-POD/2 gebundenen Peroxidase erfolgt durch schonende Desorption, z« B« durch Überleiten von 2M KSCN.

Das Eluat wird zur Entfernung des KSCST sofort über eine mit PBS äquilibrierte Sephadex G25-Säule geleitet·

Die Spezifische Aktivität und die Reinheitszahl der Peroxidase werden in der bekannten Weise bestimmt. Es werden Reinheitszahlen (RZ

Claims (1)

1. Erfindungsansprucfa

   Verfahren zur affinitätschromatograpbiscben Isolierung von Bleerretticbperoxidase aus Hobpräparaten, gekennzeichnet dadurch, daß

   monoklonale Antikörper der Serie BL-POD/1 bis 12 in an sich bekannter Weise an feste Trägermaterialien gebunden werden,

   diese Adsorbentien mit Meerrettichperoxidaserohpräparaten in engen Kontakt gebracht werden, von nicht spezifisch gebundenen Komponenten freigewascben werden, die immunspezifisch gebundene Peroxidase schonend isoliert wird·