DD225715A1 - Verfahren zur bestimmung von ammoniumionen mittels mikrobiologischer sensoren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Ammoniumionen in Loesungen mittels mikrobiologischer Sensoren. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, geeignete mikrobiologische Sensoren zu finden, die einfach aufgebaut sind und aus leicht zugaenglichen Mikroorganismen bestehen. Erfindungsgemaess wird eine den Sauerstoffverbrauch messende Elektrode mit einem Mikroorganismus praepariert, der hinsichtlich C- und N-Reservestoffe verarmt ist. Dieser mikrobiologische Sensor wird in eine C- und Energiequelle enthaltende Pufferloesung eingetaucht. Anschliessend wird die Ammoniumionen enthaltende Probe zugesetzt und die Stromaenderung pro Zeiteinheit wird als Mass fuer die Ammoniumionenkonzentration erfasst.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Ammoniumionen in Lösungen. Das Verfahren ist geeignet für den Einsatz in der chemischen Analytik, Mikrobiologie, Fermentationsindustrie, Medizin, der Landwirtschaft und Umweltschutz. Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Zur Bestimmung von Ammoniumionen stehen spektralphotometrische und elektrochemische Methoden zur Verfügung. Die gebräuchlichen spektralphotometrischen Verfahren wie zum Beispiel die Berthelot-Reaktion, dieOximreaktion oder die Methode nach Neßler sind aber durch einen hohen manuellen Arbeitsaufwand und ihre Störanfälligkeit gegenüber vielerlei Substanzen im Meßgut gekennzeichnet, was häufig zu fehlerhaften Analysenergebnissen führt.

Auf elektrochemischem Wege können Ammoniumionen sowohl nach dem potentiometrischen als auch nach dem amperometrischen Meßprinzip quantitativ bestimmt werden. Beim potentiometrischen Meßprinzip gelingt die Bestimmung unter anderem mit ionenselektiven oder gassensitiven Elektroden. Zum Stand der Technik gehört aber, daß ionenselektive Elektroden, und das trifft auch auf ammoniumselektive Elektroden zu, eine beträchtliche und das Meßergebnis verfälschende Querempfindlichkeit gegenüber anderen Kationen besitzen. Gassensitive Elektroden überwinden zwar diesen Nachteil, erfordern aber zur Bestimmung von Ammoniumionen die mit zusätzlichem apparativen Aufwand verbundene Freisetzung des gasförmigen Ammoniaks aus den Ammoniumionen. Nachteilig ist bei beiden potentiometrischen Elektrodenprinzipien, daß die Analysenzeiten verhältnismäßig lang sind und deshalb in der Routineanalytik schwer Eingang finden.

Die zur Zeit bekannten mikrobiologischen Sensoren zur quantitativen Bestimmung von Ammoniumionen beruhen auf dem amperometrischen Meßprinzip. Sie sind jedoch relativ kompliziert aufgebaut und erfordern nicht allgemein zugängliche Mikroorganismen. So werden durch eine Kombination verschiedener Mikroorganismen Ammoniumionen in Nitrit und anschließend in Nitrat umgewandelt. Der dabei auftretende Sauerstoffverbrauch wird schließlich auf elektrochemischem Wege gemessen. Dieser durch Kombination mehrerer Mikroorganismen entstandene Sensor ist jedoch relativ unempfindlich und langsam (OKADA, T. et. al. Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechn. 14 149 (1982), J.P.— 092740, C 12 q - 01/02, G 01 n - 27/46).

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein amperometrisches Verfahren zur Bestimmung von Ammoniumionen durch Einsatz mikrobiologischer Sensoren zu entwickeln, das schneller und empfindlicher ist als bisher bekannte Verfahren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, geeignete mikrobiologische Sensoren zu finden, die einfach aufgebaut sind und aus leicht zugänglichen Mikroorganismen bestehen.

Erfindungsgemäß wird ein solcher mikrobiologischer Sensor aus einer den Sauerstoffverbrauch messenden Elektrode und einem Mikroorganismus, der hinsichtlich C- und N-Reservestoffe verarmt ist, präpariert. Es wird für die Präparation des Sensors ein Mikroorganismus aus der stationären Wachstumsphase eingesetzt.

Der Mikroorganismus wird aus dem Kultivierungsmedium in kleiner Menge auf ein Filterplättchen zentrifugiert. Dieses Filterplättchen wird schließlich zwischen Polyäthylen- und Dialysemembran einer Sauerstoffelektrode plaziert. Der so hergestellte Sensor wird 1-2 Tage in einer gepufferten Lösung ohne C- und N-Quelle aufbewahrt.

Zur Messung der Ammoniumionen taucht dieser mikrobiologische Sensor in eine C- und Energiequelle, bevorzugt Glukose enthaltende Pufferlösung, der die Ammoniumionen enthaltende Probe zugesetzt wird. Die Mikroorganismen verbrauchen in Abhängigkeit von der Ammoniumkonzentration Sauerstoff. Der verbleibende Restsauerstoff wird elektrochemisch in Form des für die Reduktion des Sauerstoffs notwendigen Stromes gemessen. Als Meßwert wird die Änderung der Stromstärke pro Zeiteinheit erfaßt. Die Ansprechzeit beträgt durchschnittlich 30 Sekunden.

An Hand einer Eichkurve, die auf einer linearen Relation zwischen NH/-Ionen Konzentration und Stromstärkeänderung pro Zeiteinheit beruht, ist es möglich, unbekannte Konzentrationen an Ammoniumionen zu ermitteln.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es möglich ist, mit nur einer Mikroorganismenart direkt die Ammoniumionenkonzentration zu bestimmen. Im Vergleich zu den bisher bekannten mikrobiologischen Sensoren ist diese Methode wesentlich schneller und empfindlicher.

Die Erfindung wird nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert.

Ausführungsbeispiel

Die in einem Glukose, Aminosäuren und Salze enthaltenden Medium angezogenen Bacillus subtilis-Zellen werden nach 10-20stündiger Anzucht zu Beginn der stationären Phase geerntet und zur Herstellung einer mikrobiologischen Elektrode nach der in DD-Patent 210761 beschriebenen Art und Weise benutzt. Hierzu werden 100μΙ Kulturlösung auf einem Filterplättchen von 2-5 mm Durchmesser zentrifugiert, so daß eine Zellkonzentration von ca. 0,2 mg Trockengewicht pro Filter erreicht wird. Das Filter wird auf eine Polyäthylenmembran gebracht, so daß es unmittelbar über der Platinkathode liegt, und durch eine Dialysemembran lösungsmittelseitig abgeschlossen. Die Mikroorganismen des Sensors werden bezüglich C- und N-Quelle verarmt, indem der Sensor in eine gerührte, bei 30°C temperierte Meßzelle mit 2,5ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 6,8 2 Tage ___a uf b ew a hrt wird.__________________i----------------------------------------:----

Zur Ammoniumionenbestimmung wird die gleiche Pufferlösung mit 0,15mM Glukose eingesetzt.

Die Änderung der Sauerstoffkonzentration nach Ammoniumionenzusatz wird in Amper/min mittels Meßverstärker bei einer angelegten Spannung von -600mV gemessen. Nach Zugabe von Ammoniumionen kommt es zu einer Verminderung der Sauerstoffkonzentration, gemessen als Änderung der Stromstärke (ηA) (Abb. 1). Die Ansprechzeit beträgt ca. 30 Sekunden. Die

Claims (2)

1. Erfindungsansprüche:

   1. Verfahren zur Bestimmung von Ammoniumionen mittels mikrobiologischer Sensoren, dadurch gekennzeichnet, daß man eine den Sauerstoffverbrauch messende Elektrode mit Mikroorganismen präpariert, die hinsichtlich C- und N-Reservestoffe verarmt sind, diesen mikrobiologischen Sensor in eine C- und Energiequelle enthaltende Pufferlösung eintaucht, anschließend die Ammoniumionen enthaltende Probe zusetzt und die Stromänderung pro Zeiteinheit als Maß für die Ammoniumionenkonzentration erfaßt.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als C- und Energiequelle vorzugsweise Glukose verwendet.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Ammoniumionen in Lösungen. Das Verfahren ist geeignet für den Einsatz in der chemischen Analytik, Mikrobiologie, Fermentationsindustrie, Medizin, der Landwirtschaft und Umweltschutz.

   Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

   Zur Bestimmung von Ammoniumionen stehen spektralphotometrische und elektrochemische Methoden zur Verfügung. Die gebräuchlichen spektralphotometrischen Verfahren wie zum Beispiel die Berthelot-Reaktion, die Oxim reaktion oder die Methode nach Neßler sind aber durch einen hohen manuellen Arbeitsaufwand und ihre Störanfälligkeit gegenüber vielerlei Substanzen im Meßgut gekennzeichnet, was häufig zu fehlerhaften Analysenergebnissen führt.

   Auf elektrochemischem Wege können Ammoniumionen sowohl nach dem potentiometrischen als auch nach dem amperometrischen Meßprinzip quantitativ bestimmt werden. Beim potentiometrischen Meßprinzip gelingt die Bestimmung unter anderem mit ionenselektiven oder gassensitiven Elektroden. Zum Stand der Technik gehört aber, daß ionenselektive Elektroden, und das trifft auch auf ammoniumselektive Elektroden zu, eine beträchtliche und das Meßergebnis verfälschende Querempfindlichkeit gegenüber anderen Kationen besitzen. Gassensitive Elektroden überwinden zwar diesen Nachteil, erfordern aber zur Bestimmung von Ammoniumionen die mit zusätzlichem apparativen Aufwand verbundene Freisetzung des gasförmigen Ammoniaks aus den Ammoniumionen. Nachteilig ist bei beiden potentiometrischen Elektrodenprinzipien, daß die Analysenzeiten verhältnismäßig lang sind und deshalb in der Routineanalytik schwer Eingang finden. Die zur Zeit bekannten mikrobiologischen Sensoren zur quantitativen Bestimmung von Ammoniumionen beruhen auf dem amperometrischen Meßprinzip. Sie sind jedoch relativ kompliziert aufgebaut und erfordern nicht allgemein zugängliche Mikroorganismen. So werden durch eine Kombination verschiedener Mikroorganismen Ammoniumionen in Nitrit und anschließend in Nitrat umgewandelt. Der dabei auftretende Sauerstoffverbrauch wird schließlich auf elektrochemischem Wege gemessen. Dieser durch Kombination mehrerer Mikroorganismen entstandene Sensor ist jedoch relativ unempfindlich und langsam (OKADA, T. et. al. Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechn. 14 149 (1982), J. P.— 092740, C 12 q - 01/02, G 01 η - 27/46).

   Ziel der Erfindung

   Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein amperometrisches Verfahren zur Bestimmung von Ammoniumionen durch Einsatz mikrobiologischer Sensoren zu entwickeln, das schneller und empfindlicher ist als bisher bekannte Verfahren.

   Darlegung des Wesens der Erfindung

   Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, geeignete mikrobiologische Sensoren zu finden, die einfach aufgebaut sind und aus leicht zugänglichen Mikroorganismen bestehen.

   Erfindungsgemäß wird ein solcher mikrobiologischer Sensor aus einer den Sauerstoffverbrauch messenden Elektrode und einem Mikroorganismus, der hinsichtlich C- und N-Reservestoffe verarmt ist, präpariert. Es wird für die Präparation des Sensors ein Mikroorganismus aus der stationären Wachstumsphase eingesetzt.

   Der Mikroorganismus wird aus dem Kultivierungsmedium in kleiner Menge auf ein Filterplättchen zentrifugiert. Dieses Filterplättchen wird schließlich zwischen Polyäthylen- und Dialysemembran einer Sauerstoffelektrode plaziert. Der so hergestellte Sensor wird 1—2 Tage in einer gepufferten Lösung ohne C- und N-Quelle aufbewahrt.

   Zur Messung der Ammoniumionen taucht dieser mikrobiologische Sensor in eine C- und Energiequelle, bevorzugt Glukose enthaltende Pufferlösung, der die Ammoniumionen enthaltende Probe zugesetzt wird. Die Mikroorganismen verbrauchen in Abhängigkeit von der Ammoniumkonzentration Sauerstoff. Der verbleibende Restsauerstoff wird elektrochemisch in Form des für die Reduktion des Sauerstoffs notwendigen Stromes gemessen. Als Meßwert wird die Änderung der Stromstärke pro Zeiteinheit erfaßt. Die Ansprechzeit beträgt durchschnittlich 30 Sekunden.

   An Hand einer Eichkurve, die auf einer linearen Relation zwischen NH₄*-lonen Konzentration und Stromstärkeänderung pro Zeiteinheit beruht, ist es möglich, unbekannte Konzentrationen an Ammoniumionen zu ermitteln.

   Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es möglich ist, mit nur einer Mikroorganismenart direkt die Ammoniumionenkonzentration zu bestimmen. Im Vergleich zu den bisher bekannten mikrobiologischen Sensoren ist diese Methode wesentlich schneller und empfindlicher.

   Die Erfindung wird nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert.

   Ausführungsbeispiel

   Die in einem Glukose, Aminosäuren und Salze enthaltenden Medium angezogenen Bacillus subtilis-Zellen werden nach 10-20stündiger Anzucht zu Beginn der stationären Phase geerntet und zur Herstellung einer mikrobiologischen Elektrode nach der in DD-Patent 210761 beschriebenen Art und Weise benutzt. Hierzu werden 100μΙ Kulturlösung auf einem Filterplättchen von 2-5 mm Durchmesser zentrifugiert, so daß eine Zellkonzentration von ca. 0,2 mg Trockengewicht pro Filter erreicht wird. Das Filter wird auf eine Polyäthylenmembran gebracht, so daß es unmittelbar über der Platinkathode liegt, und durch eine Dialysemembran lösungsmittelseitig abgeschlossen. Die Mikroorganismen des Sensors werden bezüglich C- und N-Quelle verarmt, indem der Sensor in eine gerührte, bei 30^cC temperierte Meßzelle mit 2,5ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 6,8 2 Tage aufbewahrt wird. -

   Zur Ammoniumionenbestimmung wird die gleiche Pufferlösung mit 0,15 mM Glukose eingesetzt.

   Die Änderung der Sauerstoffkonzentration nach Ammoniumionenzusatz wird in Amper/min mittels Meßverstärker bei einer angelegten Spannung von -60OmV gemessen. Nach Zugabe von Ammoniumionen kommt es zu einer Verminderung der Sauerstoffkonzentration, gemessen als Änderung der Stromstärke (nA) (Abb. 1). Die Ansprechzeit beträgt ca. 30 Sekunden. Die