DD222491A1 - Verfahren zur gewinnung virusfreien zuchtmaterials vegetativ vermehrter kulturpflanzen - Google Patents

Abstract

Das Ziel der Erfindung besteht in der Verbesserung des Erfolges der Meristemkultur zur Gewinnung virusfreien Zuchtmaterials vegetativ vermehrter Kulturpflanzen, d. h. in einer Erhoehung des Prozentsatzes der aus den Meristemexplantaten hervorgehenden virusfreien Pflanzen. Die Aufgabe der Erfindung wird im Auffinden chemischer Wirkstoffe gesehen, die dem Naehrmedium von Meristemkulturen zugesetzt werden und die Replikation der nicht selten auch noch in Meristemexplantaten vorhandenen Viren bzw. eine Neuinfektion der Explantate verhindern. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass den Naehrmedien der Meristemexplantate synthetische Alkyl-Lysophospholipide der allgemeinen Formelzugesetzt werden. Hierdurch wird die Ausbeute an virusfreien Explantaten von herkoemmlich 10 bis 20 % auf 80 bis 100 % gesteigert, und zwar auch in grossen Explantaten, die sich gut bewurzeln, aber bei den herkoemmlichen Verfahren nur zu einem sehr geringen Prozentsatz virusfrei sind. Die erfindungsgemaessen synthetischen Alkyl-Lysophospholipide koennen auch in Praeparationen, die ggf. zusaetzlich Tenside, Haftmittel und weitere Formulierungshilfsmittel enthalten, auf Pflanzensprosse aufgesprueht werden, wodurch die Virusreplikation eingeschraenkt wird.

Description

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Membranen gelegen sein können, abdrängen, gegebenenfalls auch Viruspartikeln umhüllen, hierdurch inaktivieren und auf diese Weise in einzelnen Zellen der Meristemkultur vorhandenen Virusbefall eliminieren bzw. lokalisieren. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß dem Nährmedium von Meristemkulturen synthetische Alkyl-Lysophospholipide der allgemeinen Formel

CK₀ - 0 - R¹i 2

I о

CK-O- ΊΓ

^GH2 - ° -/\-^° * <^GVn - И^Ф(СН₃)₃

о о^ѳ

zugesetzt werden.

Darin bedeuten:

R : —H, —CH₃, —C₂Hg, -C₃H₇, —C₄H₉, —CsH₁₁, —CH₂—CgHs, —COCH₃

R : -CuH₂₉, -C₁₆H₃₃, -C₁₈H₃₇, -C₂₀H₄₁

n: 2 bis 5

Die Verbindungen sind antiphytoviral aktiv, inaktivieren die Viren auch in vitro, indem sie mit diesen in Wechselwirkung treten, und weisen alle Voraussetzungen auf, um den Anteil virusfreier Meristemexplantate wesentlich zu steigern. Zur Erzielung einer ausreichenden Viruseliminierung genügt es im allgemeinen, die erfindungsgemäßen Verbindungen in Aufwandmengen zwischen 10~^z und 10"⁵mol/l der Nährlösung zuzusetzen. Zugabe von Lösungsvermittlern ist nicht erforderlich, da die erfindungsgemäßen Verbindungen wasserlöslich sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch, gegebenenfalls in Kombination mitTensiden, Haftmitteln und/oder weiteren Formulierungshilfsmitteln, auf Sprosse aufgesprüht werden, vermindern hierdurch deren Viruskonzentration und die virusbedingten Wuchsdepressionen beträchtlich und stabilisieren damit die Pflanzenerträge.

Ausführungsbeispiele

Beispielsreihe 1 zeigt, daß die erfindungsgemäßen synthetischen Alkyl-Lysophospholipide die Konzentration des Kartoffel-X-Virus sowohl in primär als auch besonders in sekundär infizierten Blättern von Nicotiana tabacum „Samsun" mehr oder weniger stark, in jedem Fall aber merklich, vermindern, wenn sie 2 Tage vor sowie 2 Tage nach der Virusinokulation auf Sprosse aufgesprüht worden sind. Die Bestimmung der Viruskonzentration wird serologisch im Präzipitationstropfentest durchgeführt. Alle erforderlichen Manipulationen und die Verrechnung sind bei G.SCHUSTER (Archiv Phytopath. u. Pflanzenschutz 13,1977, 231-241) sowie z.B. in der Patentschrift DD-PS 157664 ausführlich beschrieben. Die Prüfung der Signifikanz der in den in Tabelle 1 bis 3 in Form von Relativwerten zum Ausdruck gebrachten Differenzen in der Viruskonzentration erfolgte mittels des t-Testes nach STUDENT (einseitige Fragestellung). Die Prüfungsergebnisse wurden neben den Hemmprozenten mit folgenden Symbolen wiedergegeben: : ρ > 5%

Ähnlich wie das Kartoffel-X-Virus reagieren zahlreiche weitere Kartoffelviren, so daß die in Beispielsreihe 1 angeführten Befunde mit geringen Abweichungen z. B. auch für das Kartoffel-S-, Kartoffel-Α- und -Y-Virus und das Kartoffelblattroll-Virus gültig sind.

In Beispielsreihe 2 ist am Beispiel des Rotkleescheckungs-Virus dargestellt, daß einige der erfindungsgemäßen synthetischen Alkyl-Lysophospholipide auch die Replikation multikomponenter Viren, d. h. von Viren, deren Genom auf mehrere Viruspartikeln verteilt ist, beeinträchtigt. Als Viruswirt diente die Erbse (Pisum sativum convar. speciosum, Sorte „Nadja"). Die Bestimmung der Viruskonzentration erfolgte serologisch im Ringtest (KLUGE, S., MARCINKA, K.: Acta virol. 23,1979,148-152). In Beispielsreihe 3 ist dargestellt, daß die erfindungsgemäßen synthetischen Alkyl-Lysophospholipide auch die Aktivität freier, d.h. aus der Zelle isolierter Viruspartikeln, die im Reagenzglas (in vitro) in der in den Beispielen angeführten Konzentration mit den erfindungsgemäßen Verbindungen versetzt worden sind, inaktivierte. Die Einwirkungsdauer der synthetischen Alkyl-Lysophospholipide betrug wenige bis 15 Minuten. Anschließend wurde die Aktivität der Viruspartikeln in den angeführten biologischen Tests (Tabakmosaik-Virus im Lokalläsionentest auf Nicotiana tabacum „Samsun NN", Kartoffel-X-Virus im Lokalläsionentest auf Gomphrena globosa, Rotkleescheckungs-Virus im Lokalläsionentest auf Phaseolus vulgaris) ermittelt und mit unbehandelten Kontrollen verglichen. Die Ausgangsviruskonzentrationen (10... 100mg/ml) in den Versuchsansätzen waren auf Grund der Ergebnisse von Vorversuchen so bemessen worden, daß mit der angeführten Viruskonzentration optimal meßbare Ergebnisse innerhalb der Proportionalitätsbereiche der Tests erhalten werden konnten. Nach den in Beispielsreihe 3 angeführten Ergebnissen beeinflussen die erfindungsgemäßen synthetischen Alkyl-Lysophospholipide nicht nur den Replikationszyklus der Viren in vivo, sondern sie inaktivieren auch freie bzw. replizierte Viruspartikel. Auf Grund von Wechselwirkungen zwischen Substanz und Viruspartikeln sind somit wesentliche Voraussetzungen gegeb'en, um in einigen Zellen der Meristeme vorhandenes Virus von der Replikation auszuschließen bzw. zu inaktivieren. Auch wird hierdurch verhindert, daß ggf. im Zuge der Präparation der Explantate (Meristeme) in das Nährmedium gelangte Viren das sich aus dem Explantat entwickelnde Pflänzchen reinfizieren.

Beispielsreihe 4 schließlich zeigt, daß es die in den Beispielsreihen 1 bis 3 nachgewiesenen antiphytoviralen Aktivitäten der erfindungsgemäßen synthetischen Alkyl-Lysophospholipide ermöglichen, den Erfolg der Meristemkultur bei der Gewinnung virusfreien Zuchtmaterials zu verbessern, indem diese dem Nährmedium der Meristemexplantate zugesetzt werden. Die Meristemewaren aus Achseiknospen von in-vitro-kultivierten, 100%ig mit Kartoffel-Y-Virus infizierten Kartoffelpflanzen (Sorte „Ackersegen") in einer durchschnittlichen Länge von 0,86mm (Versuch 1, η = 20 je Versuchsglied) bzw. 1,67 mm (Versuch 2, η = 20 je Versuchsglied) gewonnen worden. Die Meristeme wurden in flüssigem Nähragar auf Filterpapierbrücken aufgesetzt. Das Nährmedium war nach MURASHIGE und SKOOG (Physiol. Plantarum 15,1962 473-497) angesetzt worden und enthielt

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zusätzlich 1 ppm NES, 1 ppm Kinetin, 3 ppm Pantothenat und 40μΙ Vitamin B6. Zusätzlich enthielt der flüssige Nähragar ferner die erfindungsgemäßen synthetischen Alkyl-Lysophospholipide in der in der Beispielsweise 4 angeführten Konzentration. Nach einer Einwirkungszeit von 4 Wochen erfolgte die Übertragung der Explantate auf festes MS-Medium, das weder Wuchsstoffe und Vitamine noch die erfindungsgemäßen Verbindungen enthielt. Nach 10- bzw. 14wöchiger Subkultur wurden die entstandenen Sprosse jeweils mit Hilfe eines hochempfindlichen Enzym-Immunoassays, des ELISA-Tests (= enzyme linked immunosorbent assay; CLARK und ADAM, J. gen. virol. 34,1977, 475-483), auf Befall mit dem Kartoffel-Y-Virus bzw. auf Virusfreiheit geprüft. In den konventionell, d.h. ohne Zusatz erfindungsgemäßer synthetischer Alkyl-Lysophospholipide, durchgeführten Kontrollansätzen hatten sich 67% der kleineren Explantaten (durchschnittliche Länge 0,86mm) zu Pflanzen weiterentwickelt. Von diesen erwiesen sich 20% als virusfrei (Beispielsreihe 4, Z. 1). Von den größeren Explantaten (durchschnittliche Länge 1,67mm) hatten sich demgegenüber 83% zu Pflänzchen entwickelt. Von diesen erwiesen sich jedoch nur 10% als virusfrei. Demnach wurden insgesamt in Versuchsreihe 1 13,4% virusfreie Pflanzen, in Versuchsreihe 2 trotz besserer Anwachsrate jedoch nur 8,3% virusfreie Pflanzen gewonnen. 1-Benzyl-2-hexadecyl-glycerol-3-phosphocholin und 1-Acetyl^-hexadecyl-glycerol-S-phosphocholin erhöhten die Zahl der virusfreien Pflanzen, die sich aus den kleinen Explantaten entwickelt hatten, signifikant von 20% bei den Kontrollen auf je 67% und 1-Ethyl-2-hexadecyJ-glycerol-3-phosphocholin hochsignifikant auf 83% (Signifikanzberechnung nach S.KOLLER, Darmstadt 1953, S.8u. 28-32, durch Vergleich der in zwei Reihen gleichen Umfanges beobachteten Häufigkeiten, einseitige Fragestellung). Bei den größeren Explantaten hatte 1-Ethyl-2-hexadecyl-glycerol-3-phosphocholin die Zahl der virusfreien Explantate hochsignifikant von 10 auf 100% gesteigert, also zur Gewinnung von 100% gesunden Pflanzen geführt. Damit ist das gestellte Ziel erreicht, in leicht handhabbaren, großen Explantaten, von denen ein hoher Prozentsatz zu Pflanzen auswächst, einen sehr hohen Anteil virusfreier Pflanzen zu erhalten und somit den Erfolg der Meristemkultur bei der Gewinnung virusfreien Zuchtmaterials wesentlich zu steigern. Beispielsreihe 1: Hemmung (prozentuale Verminderung) der Konzentration des Kartoffel-X-Virus (PVX) in primär infizierten (inokulierten) und sekundär infizierten Blättern des systemischen Wirts Nicotiana tabacum L. „Samsun" (Viruskonzentration der Kontrolle = 100%) durch die erfindungsgemäßen synthetischen Alkyl-Lysophospholipide (10~³mol/l). Virusgehaltsbestimmung serologisch im Präzipitationstropfentest durch Endpunktbestimmung; Verdünnung jeweils 1:1 mit physiologischer Kochsalzlösung.

Alkyl-Lysophospholipid

2-Hexadecyl-glycerol-3-phosphocholin

i-Methyi^-hexadecyl-glycerol-S-phosphocholin i-Benzyl^-hexadecyl-glycerol-S-phosphocholin 1-Acetyl-2-hexadecyl-glycerol-3-phosphocholin 2-Hexadecyl-glycerol-3-trimethylammonium-propylester i-Acetyl^-hexadecyl-giycerol-S-phosphorsäure-3-trimethylammoniumpropylester

Verminderung des Virusgehaltes um % (Kontrolle =100%) Primär infiz. Bl. ±0,0 +6,7 +38,4 +62,1* +34,0

+ 12,9'

Sekundärinfiz. Bl. +59,4- +78,2"" + 29,3

+6,7

+29,3

Die an die Prozentzahlen angebrachten Symbole sind Signifikanzzeichen; bezüglich der Bedeutung vgl. S. 5.

Beispielsreihe 2:

Hemmung (prozentuale Verminderung) der Konzentration des Rotkleescheckungs-Virus (RCMV) im systemischen Wirt Pisum sativum convar. speciosum (Dierb.) Alef „Nadja" (Viruskonzentration der Kontrolle = 100%) durch die erfindungsgemäßen synthetischen Alkyl-Lysophospholipide (10-³mol/l). Virusgehaltsbestimmung serologisch im Ringtest durch Endpunktbestimmung; Verdünnung jeweils 1:1 mit 0,025M Phosphatpuffer. Alkyl-Lysophospholipid Verminderung des Virusgehaltes um %

(Kontrolle 100%)

2-Hexadecyl-glycerol-3-phosphocholin 64""

1-Methyl-2-hexadecyl-glycerol-3-phosphocholin 43"

i-Ethyl^-hexadecyl-glycerol-S-phosphocholin 64"""

1-Benzyl-2-hexadecyl-glycerol-3-phosphocholin 29

Die an die Prozentzahlen angebrachten Symbole sind Signifikanzzeichen; bezüglich der Bedeutung vgl. S. 5.

Beispielsreihe 3: Einfluß der erfindungsgemäßen synthetischen Alkyl-Lysophospholipide (10-³mol/l) auf freie Virionen von Tabakmosaik-Virus (TMV), Kartoffel-X-Virus (PVX) und Rotkleescheckungs-Virus (RCMV) anhand der Anzahl gebildeter Lokalläsionen (pro Blatt¹ bzw. Blatthälfte²)

	TMV2 (auf Nicotiana	„Samsun P	siN")	PVXMaufGomphrena	Vari	%	RCMV2 (auf Pha-	Vari	%
	tabacum	Vari		globosa)	ante	Hem	seolusvulgaris)	ante	Hem
	Kon	ante	%	Kon	(+Sub	mung	Kon	(+Sub	mung
	trolle	(+Sub	Hem	trolle	stanz)		trolle	stanz)
	(-Sub	stanz)	mung	(-Sub		97"""	(-Sub		98"""
Alkyl-Lysophospholipid	stanz)			stanz)	1 ±1		stanz)	1±0
г-НехааесуІ-дІусегоІ-З-		22 ±4	55""			100T+"			97"""
phosphocholin	49 ±8			28 ±5	0±0		50 ±8	1 ±0
i-Methyl-2-hexadecyl-gly-		17±3	56""			78T			97"""
cerol-3-phosphochoiin	38 ±4			10±1	2±1		44±6	1 +1
1 -Ethyl-2-hexadecyl-gly-		30 ±4	ЗГ			82"			82""
cerol-3-phosphocholin	43 ±5			9r2	3±1	37 ±6	6r2
1 -Benzyl-2-hexadecy l-g Iy-		42 ±8	25
cerol-3-phosphocholin	56 ±7		17±3		33 τ 8

Die an die PVozentzahlen angebrachten Symbole sind Signifikanzzeichen; bezüglich der Bedeutung vgl. S. 5.

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Beispielsreihe 4:

Einfluß der erfindungsgemäßen synthetischen Alkyl-lysophospholipide (10~³mol/l) auf den Gehalt an Kartoffel-Y-Virus (PVY) in Kartoffelpflanzen (Sorte „Ackersegen") in Abhängigkeit von der Meristemlänge. Virusgehaltsbestimmung mitteis ELISA

Prozentsatz virusfreier Pflanzen Explantatlänge 0,86 mm 1,67 mm

Alkyl-Lyso-phospholipid

ohne (Kontrolle) 20 10

2-Hexadecyl-glycerol-3-phosphocholin 33' —

1 -Methyl-2-hexadecyl-

glycerol-3-phospho-cholin 58 30'

i-Ethyl-2-hexadecyl-

glycerol-3-phospho-cholin 83⁺⁺ 10O⁺*"¹"

1 -Benzyl-2-hexadecyl-

glycerol-3-phospho-cholin 67* —

i-Acetyl-2-hexadecyl-

glycerol-3-phospho-cholin 67⁺—

Die an die Prozentzahlen angebrachten Symbole sind Signifikanzzeichen. Bezüglich der Bedeutung vgl. S.

Claims (2)

¹ 2

CH-O-R^

CH₂ - 0 -P- 0 - (СН₂)_П - N®(CH₃)₃

о о

worin R¹ = -H,-CH₃,-C₂H₅,-C₃H₇,-C₄H₉,-C₅H₁₁,-CH₂-C₆H₅,-COCH₃
R₂ = —С₁₄Н_2Э,—С₁₆Н₃₃,-Ci₈H₃₇,-C₂₀H₄₁
η = 2 bis 5 bedeuten,
derart zugesetzt werden, daß ihre Konzentration im Nährmedium 10~²bis 10~⁵mol/l beträgt.

1. Verfahren zur Gewinnung virusfreien Zuchtmaterials vegetativ vermehrter Kulturpflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß dem in der Meristem- oder Sproßspitzenkultur eingesetzten Nährmedium synthetische Alkyl-Lysophospholipide der allgemeinen Formel

Шл — U — Л

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Erfindungsansprüche:

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß Sprosse intakter Pflanzen mit einer die synthetischen Alkyl-Lysophospholipide und gegebenenfalls Tenside, Haftmittel und/oder weitere Formulierungshilfsmittel enthaltenden Lösung eingesprüht werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung des Erfolges der Meristem- und Sproßspitzenkultur bei der Gewinnung virusfreien Zuchtmaterials von vegetativ vermehrten Kulturpflanzen dureh den Einsatz antiphytoviraler Wirkstoffe.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Meristem- und Sproßspitzenkultur (im folgenden unter der Bezeichnung „Meristemkultur" zusammengefaßt) werden verbreitet in der Kartoffel- und Zierpflanzenproduktion als Basisverfahren zur Viruseliminierung angewendet, um virusfreies Zuchtmaterial hochleistungsfähiger Zuchtstämme und Sorten vegetativ vermehrter Pflanzen zu gewinnen. Hierbei werden, in der Regel unter sterilen Bedingungen, meristematische Gewebestucke von Apikaiknospen oder axiallaren Knospen gewonnen, deren Länge je nach Pflanzenart und Verfahren zwischen 0,1 bis 1,7 mm schwankt. Diese Explantate werden zunächst steril in einer Nährlösung oder auf Nähragar angezogen. Im Verlauf von mehreren Wochen entwickeln sich je nach ihrer Länge aus 20 bis 80% der Explantate Pflänzchen mit Sprossen und Wurzeln, die dann verpflanzt und nach weiterem Wachstum auf Virusfreiheit geprüft werden. Da embryonale Zellen vielfach virusfrei sind, bzw. Viren in inaktiver Form enthalten, ist ein geringer Teil der Pflänzchen, die sich aus den Explantaten entwickelt haben, frei von Viren (etwa 5 bis 10%) und kann zum Zuchtaufbau verwendet werden. Je kürzer die geschnittenen Meristeme sind, desto höher ist der Anteil an embryonalem Gewebe und gleichzeitig auch der Prozentsatz virusfreier Pflanzen. Je kleiner aber das Meristem, desto mehr Pflanzen haben die Prozedur nicht überlebt. Umgekehrt entwickelt sich aus längeren Explantaten (Sproßspitzen) ein größerer Anteil zu Pflänzchen, von denen jedoch nur ein sehr geringer Prozentsatz virusfrei ist. Die Erfolgsquoten sind somit— unabhängig von der Explantatlänge — außerordentlich gering. Trotz seiner geringen Effektivität findet dieses Verfahren jedoch in der DDR und anderen Ländern mit fortgeschrittenem Zuchtaufbau für die Gewinnung virusfreier Stammzuchten von vegetativ vermehrten Pflanzen in großem Umfang Verwendung, da es in vielen Fällen keine andere geeignete Methode zur Virusfreimachung gibt. Bei der Kartoffel werden z. B. alljährlich viele Tausende von Explantaten angesetzt. Es würde daher eine wesentliche Einsparung an lebendiger Arbeit durch hochqualifizierte Fachleute, an Steril- und Klimaraumkapazität, Energie, Biochemikalien und Zeit und somit einen erheblichen Fortschritt bedeuten, wenn es gelänge, bei der Meristemkultur die Ausbeute an virusfreien Pflanzen durch Zusatz geeigneter antiphytoviraler Verbindungen zum Nährmedium um ein Mehrfaches zu erhöhen. Hierdurch könnte u.a. selbst bei gleichbleibender technischer Ausrüstung und gleichbleibendem Personalbestand der Aufbau virusfreier Zuchten aus dem hochleistungsfähigen Pflanzenmaterial der Sortimente der DDR und anderer Länder stark beschleunigt werden. Es gab bisher nur wenige Versuche, bei der Meristemkultur die Ausbeute an virusfreien Pflanzen durch geeignete Manipulationen bzw. Verfahren zu steigern. So wurde in einigen Fällen versucht, den Anteil virusfreier Explantate zu erhöhen, indem antiphytovirale Substanzen zum Nährmedium zugesetzt wurden. Bekannt geworden sind Untersuchungen mit 2-Thiouracil, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und Malachitgrün (M.KLINKOWSKI, Pflanzliche Virologie, Bd. 1,3. Auflage, Berlin 1980, S. 453). Keine dieser Verbindungen genügte jedoch den zu fordernden Parametern. 2-Thiouracil und 2,4-D verringerten infolge ihrer Phytotoxizität die Anwachsrate der Explantate in einem solchen Maße, daß eine gewisse Steigerung des Prozentsatzes virusfreier Explantate kaum praktischen Nutzen erbrachte. Malachitgrün zeigte insgesamt zu geringe Wirkung. Deshalb finden die entsprechenden Virusinhibitoren keine Anwendung im Rahmen der Virusfreimachung von Zuchtmaterial durch Meristemkultur.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, den Erfolg der Meristemkultur bei der Gewinnung virusfreien Zuchtmaterials zu verbessern, indem durch Zusatz von geeigneten antiphytoviralen Mitteln zum Nährmedium die Zahl der aus Meristemexplantaten hervorgehenden virusfreien Pflanzen beträchtlich gesteigert wird. Diese Steigerung soll unabhängig von der Explantatgröße, also auch bei großen Explantaten mit beachtlicher Anwachsquote und hoher Wahrscheinlichkeit einer Viruskontamination wirksam werden, so daß das neue Verfahren sowohl eine hohe Ausbeute an lebensfähigen Explantaten als auch einen hohen Prozentsatz virusfreier Pflanzen sicherstellt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Wirkstoffe aufzufinden, die aufgrund ihrer chemischen Konstitution von den Pflanzen aufgenommen werden und in diesen die Virusreplikation beeinträchtigen bzw. Viren von den Stellen der Replikation, die an