DD218392A1

DD218392A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von mikrobiell verwertbaren n-alkyl-verbindungen

Info

Publication number: DD218392A1
Application number: DD25225083A
Authority: DD
Inventors: Joachim Huth; Hans-Georg Mueller; Horst Honeck; Rosel Blasig
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1983-06-23
Filing date: 1983-06-23
Publication date: 1985-02-06

Abstract

Die Erfindung betrifft ein quantitatives Bestimmungsverfahren von mikrobiell verwertbaren n-Alkyl-Verbindungen. Sie hat das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem man den n-Alkylgehalt von Proben, Fraktionen oder Destillaten aus der Petrolchemischen Industrie bestimmen kann. Erfindungsgemaess werden Mikroorganismen in einem Kleinfermenter bei intensiver Durchmischung und Belueftung unter Kohlenstoff-limitierten Bedingungen in Gegenwart einer waessrigen Naehrloesung, die alle zum Wachstum erforderlichen Naehrsalze und Stickstoff in Form von NH4 -Ionen enthaelt, kultiviert. Die zu untersuchende n-Alkyl-Verbindungen enthaltende Probe wird bei einem p H-Wert zugesetzt, der dem Schaltpunkt der p H-Statierungseinrichtung im Fermenter entspricht und der Laugeverbrauch fuer die p H-Statierung wird bestimmt. Anwendungsgebiet ist die Petrolchemische Industrie und die Prozesskontrolle in der mikrobiologisch-biotechnologischen Industrie und Forschung bzw. zur Untersuchung von Umweltproben.

Description

-A-Huth, ο.

Dr. Müller, H.-G

Dr. Honeck, H

Blasig,' R.

"Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mikrobiell verwertbaren n-Alkyl-Verbindunqen " ^

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mikrobiell verwertbaren n-Alkyl-Verbindungen. Sie findet Anwendung in der petrolchemischen Industrie bei der Untersuchung des n-Alkylgehaltes von Proben aus verschiedenen Stufen der Erdölverarbeitung, bei der Untersuchung von ölverschmutzten Boden-, Wasser- und Abwasserproben sowie bei der Prozeßkontrolle in der mikrobiologisch-biotechnologischen Industrie und Forschung,, speziell in der mikrobiologischen Erdölkonvertierung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösung Quantitative Bestimmungen für bestimmte Erdölbestandteile sind z.Z. nur mit Hilfe aufwendiger Trennverfahren chromatographisch möglich. So ist bekannt, daß nach entsprechender Abtrennung über Molsiebe, Einschlußverbindungen oder Gelsäulen die Konzentration von n-Alkanen in zu untersuchenden Proben quantitativ mittels Gaschromatographie bestimmt werden.' Eine Analyse, die die Gesamtheit aller mikrobiell abb^vaubaren Verbindungen unabhängig von deren chemischer Struktur anzeigt, ist mit den bekannten Verfahren nicht möglich. Erschwerend kommt hinzu, daß das Spektrum der von Mikroorganismen verwertbaren Einzelsubstanzen sich von Stamm zu Stamm unterscheidet, und bei der Vielzahl der im Erdöl vorkommenden Verbindungen für keinen Mikroorganismus die potentielle Rohstoffbasis vollständig bekannt ist.

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Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens, das es gestattet, die Konzentration mikrobiell verwertbarer'. Kohlenwasserstoffe von Untersuchun.gsproben zu bestimmen, um daraus Aussagen treffen zu können betreffs:

- des n-Alkylgehaltes von Proben, Fraktionen oder Destilla- _] ten aus der Petrolchemischen Industrie

- des Anteils verwertbarer n-Alkyl-Verbindungen in der Kohlenwasserstoff phase bei der mikrobiellen Erdölkonvertierung zur Kontrolle und Steuerung des Prozesses

- des Reinheits- bzw. Verschmutzungsgrades von Wasser-,

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Abwasser-, Boden- und anderer Umweltproben.

Darlegung des Wesens der Erfindung · Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß Mikroorganismen, die befähigt sind, auf Kohlenwasserstoffen als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle zu wachsen, in einem Mine-· ralsalzmedium, das alle für das Wachstum erforderlichen Elemente, und Stickstoff in Form von Ammoniumionen enthält, bei intensiver Belüftung und Durchmischung vorkultiviert werden. Diese Mikroorganismen werden von der überschüssigen Kohlenstoffquelle durch C-I imitierte Kulturbedingungen, Filtration oder Zentrifugation befreit, in frischer Nährlösung suspendiert und in einen Kleinfermenter überführt, in dem die Untersuchungen zur. quantitativen Bestimmung mikrobiell verwertbarer. n-Alkyl-Verbindungen durchgeführt werden bzw., die Mikroorganismen werden gemeinsam mit der überschüssigen C-Quelle in dem Kleinfermenter Umgesetzt, bei Bedarf mit frischer Nährlösung versorgt und im Kleinfermenter bis zur Kohlenstoff limitation kultiviert. ' ·

. ' " ..· s . :... -. ' Die Untersuchungen im Kleinfermenter erfolgen bei intensiver Durchmischung und Belüftung bei pH-Statierung der Kultur mittels Laugenzudosierung und beginnen nach einer kurzen Adaptationsphase bei eindeutiger C-Limitation der Kultur. Diese ist daran erkennbar, daß die Kultur keine Säure (Protonen) ausscheidet, der pH-Wert der Kultur über mehrere,Minuten kon-

stant bleibt oder schwach ansteigt. Zu dieser. Zeit erfolgt die Zugabe der zu untersuchenden Probe zum Kleinfermenter bei einem pH-Wert, der dem Schaltpunkt der pH-Statierungseinrichtung des FermenterSentspricht. Die in der Probe enthaltenen, vom verwendeten Mikroorganismus als C-Quelle^lverwertbaren n-Alkyl-Verbindungen werden in den Intermediärstoffwechsel eingeschleust und ermöglichen somit die für Wachstumsprozesse erforderlichen Syntheseleistungen. Die bei der Synthese stickstoffhaltiger Zellbestandteile (Aminosäuren, Proteine, Nucleotide, Nukleinsäuren, Aminozucker u.a.) auf dem Wege der direkten Aminierung freigesetzten Protonen werden von den Zellen ins Medium ausgeschieden und bewirken dort eine' pH-Wert-Senkung, die ihrerseits zur Auslösung der Mechanismen zur pH-Statierung der Kultur mittels laugenzudosie- ; rung führt.

Diese Säureausscheidung der Kultur setzt wenige Sekunden nach Zugabe der n-Alkyl-Verbindungen enthaltenden Probe ein, bleibt bei ausreichender Konzentration dieser Verbindungen' über einige Zeit konstant, verringert sich bei sinkenden Substratkonzentrationen und kommt mit Verbrauch der verwertbaren Verbindungen zum völligen Erliegen. Der pH-Wert bleibt dann konstant oder beginnt schwach zu steigen. Zu diesem Zeitpunkt kann die nächste zu untersuchende Probe zugesetzt werden. Die während des Versuches ausgeschiedene Säuremenge, die sich schnell und unkompliziert aus dem Laugeverbrauch für die pH-Statierung¹ der Kultur bestimmen läßt, dient als Maß für den Gehalt der zu untersuchenden Meßproben an vom verwendeten Mikroorganismus verwertbaren n-Alkyl-Verbindungen (oder, falls nachgewiesen, auch anderer Kohlenwasserstoffe, die in der Pr.obe enthalten sind).

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Summe der n-Alkyl-Verbindungen bestimmt, die vom Mikroorganismus als C-Quelle für Wachstumsprozesse (d.h., Biomasse- und Proteinsynthese) verwendet werden kann. Das Verfahren bedient sich dabei der Substratspezifitat der verwendeten Mikroorganismen, erübrigt somit die sehr zeit- und materialaufwendigen Aufarbeitungsprozesse, die bei herkömmlichen Bestimmungsmethoden erforderlich

. 4> '.. ' sind, und erfaßt darüber hinaus auch solche verwertbaren n-Alkyl-Verbindungen, die mit den herkömmlichen Verfahren nur schwer oder nicht quantitativ nachweisbar sind bzw. deren Existenz oder Verwertbarkeit bisher noch nicht nach- ;. weisbar* ist. Auf dieser Grundlage ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet für die quantitative Kontrolle der Ausnutzung der angebotenen C-Quelle bei mikrobiellen Biomasse- oder Produktsyntheseprozessen auf Erdölbasis. Bei Verwendung einer Subkultur der Mikroorganismen aus dem Produktionsprozeß ist parallel zu diesem mit relativ geringem Aufwand eine schnelle Bestimmung der Konzentration an n-Alkyl-Verbindungen möglich, die vom verwendeten Mikroorganismus als C-Quelle verwertet werden können. Auf Grund dieser Meßergebnisse ist es möglich, schnelle Veränderungen im Fermentationsregime vorzunehmen, wenn die angebotene Substratkonzentration von den Soll-Parametern abweicht, was bei Anwendung bisher üblicher Kontrollverfahren wegen des großen Zeitaufwandes zwischen Probenahme und vorliegendem Ergebnis nicht realisierbar ist. Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Kontrolle von Fermentationsprozessen ist es auch möglich, die im Fermenter real vorhandene Menge an vom Produktionsstamm verwertbaren n-Alkyl-Verbindungen dadurch quantitativ zu bestimmen, daß definierte Probevolumina oder -mengen aus der Produktionsanlage entnommen und in den-Klein-, fermenter überführt werden. Dort wird die in dieser Probe enthaltene Konzentration an verwertbaren n-Alkyl-Verbindungen sofort (ohne Adaptationsphase) aus dem Laugeverbrauch zur pH-Statierung bis zum Erreichen der Kohlenstofflimitation im Kleinfermenter wie oben beschrieben ermittelt. Auf diese Art und Weise ist das erfindungsgemäße Verfahren auch zur rhythmischen Kontrolle solcher Prozesse geeignet, wobei in regelmäßigen Abständen oder bei Bedarf Proben aus dem Prozeß entnommen und untersucht werden. Weiterhin gestattet es das erfindungsgemäße Verfahren, Untersuchungsproben auf ihren Gehalt an n-Alkyl-Verbindungen bestimmter Kettenlängen vorzugsweise mit 5 und mehr C-Atomen und Substituenten hin zu untersuchen, indem man verschiedene Mikroorganismenkulturen verwendet, deren Substratspektren bekannt, begrenzt und von-

einander verschieden sind. Weiterhin bietet das erfindungsgemäße Verfahren die Möglichkeit, nach entsprechender Eichung Aussagen zur Qualität von Wasser-, Abwasser-, Boden- und anderen Umweltproben zu treffen, die sich auf n-Alkyl-Verbindungen enthaltende ölverschmutzungen beziehen.

Die Erfindung wird nachstehend durch Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Lodderomyces elongisporus EH 15 (D) wird über Nacht in einem Fermenter auf Parex II (einem n-Alkangemisch mit Kettenlängen von 10 - 20 C-Atomen) in einem Mineralsalzmedium bei 32 ⁰C und pH 4,6 bis zum Kohlenstoff limit kultiviert, wobei NH^⁺-SaIZe

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als Stickstoffquelle dienen. 20 ml dieser Kultur werden in 60 ml frischer, kohlenstofffreier Nährsalzlösung aufgenommen und in einen Kleinfermenter überführt. Die Reaktionsbedingungen sind wie folgt: .

Rührung 1 800 - 100 rpm

Belüftung . 4 VVm Temperatur 32 i 0,5 ⁰C

pH-Statierung auf 4,60 +. 0,02 mit 0,100 η NaOH Ausgangsvolumen 80 ml mi.t einer Biomasse von ca. 2g Frischgewicht. .

Nach dem Umsetzen wird der pH-Wert auf 4,60 statiert und ca. 30 Minuten zur Adaptation der Kultur an die neuen Bedingungen gewartet. Bei eindeutiger C-Limitation, charakterisiert durch einen mehrere Minuten konstant bleibenden und dann schwach ansteigenden pH-Wert, erfolgt die Zugabe der Kohlenstoffquelle. Als zu untersuchende n-Alkyl-Verbindunge-i* wird zunächst reines n-Heptadekan als Kohlenstoffquelle zugegeben. Ca. 30 Sekunden nach Substratzugabe setzt die Säureausscheidung ein, die bei ausreichender Substratkonzentration über einige iVlinuten mit konstanter Geschwindigkeit anhält, dann abflacht, und mit Substratverbrauch abbricht. Wenig später beginnt der pH-Wert wieder schwach anzusteigen (Abb. . I)...

Beispiel 2 ·

Lodderomyces elongisporus EH 15 (D) unter Bedingungen wie in Beispiel 1. Zugabe reiner n-Alkane mit Kohlenstoffketten-

längen von 7 bis 17 C-Atomen in Portionen von 5 bis 50 μΐ als Kohlenstoffquelle. Es zeigt sich eine eindeutige lineare Korrelation zwischen der eingesetzten n-Alkanmenge und der ausge- , schiedenen Protonenmenge. Diese lineare Korrelation nimmt für jede einzelne untersuchte n-Alkyl-Verbindung einen definierten, von anderen untersuchten Kettenlängen verschiedenen Wert an (Abb. 2).

Diese Untersuchung mit reinen n-Alkanen eignet sich für die Eichung der Methode zur Untersuchung komplexer Kohlenwasser·¹-stoffgemische. _

Beispiel 3

Lodderomyces elongisporus EH 15 (D) unter Bedingungen wie in Beispiel 1. Einsatz von n-Alkyl-Benzenen mit unterschiedlich langen Kohlenstoffketten des n-Alkyl-Restes als Kohlenstoffquelle.

n-Alkyl-Benzene mit sehr kurzen Alkylresten sowie reines Benzen werden nicht für das Wachstum als C-Quelle verwendet. Zugabe solcher Substrate bewirken keine Säureausscheidung durch die Kultur, werden also nicht unter Verbrauch von NH.⁺-Ionen*zur Synthese stickstoffhaltiger Zellbestandteile verwendet. Beim Einsatz von n-Alkyl-Benzenen mit steigender Anzahl von Kohlenstoffatomen in der Alkyl-Seitenkette des Substratmoleküls steigt auch der Umfang der Säureausscheidung der Kultur beim Einsatz gleicher Substratmengen, d.h., mit steigender Kettenlänge der n-Alkyl-Seitenkette steigt auch der vom Mikroorganismus verwertbare Anteil der zugesetzten Substratmenge und somit auch die ausgeschiedene Protonenmenge (Abb. 3).

Beispiel 4 _v · .

Lodderomyces elongisporus EH, 15 (D) unter Bedingungen wie in Beispiel !.Zugabe von n-Hexadekan, Pristan (2,6,10,14-Tetramethyl-Pentadekan) bzw. eines Gemisches von beiden Substanzen als Kohlenstoffquelle. Pristan wird vom verwendeten Mikroorganismus nicht als C-Quelle verwertet und bewirkt folglich keine Säureausscheidung. Dagegen ist n-Hexadekan als Wachstumssubstrat sehr gut geeignet. Die Verwertung von n-Hexadekan wird

aber durch die gleichzeitige Anwesenheit des nicht verwertbaren Pristans nicht nennenswert beeinflußt (Abb. 4).

Beispiel 5

Lodderomyces elongisporus EH 15 (D) unter Bedingungen wie in Beispiel 1. Zugabe definierter Volumina komplexer Kohlenwasserstoffgemische als Kohlenstoffquelle (Abb. 5).

a. Zugabe von 200 μΐ Roh-Diesel (Gesamt-n-Alkangehalt 17,3 %) führt zu einer Säureausscheidung, die dem Verbrauch von 31,1 mg n-Hexadekan (nach Beispiel 2) entspricht.

b. Zugabe von 200 μΐ chemisch entparaffiniertem Roh-Oiesel (n-Alkangehalt wesentlich kleiner als 1 %.) führt zu einer Säureausscheidung, die dem Verbrauch von 13,7 mg n-Hexadekan. (nach Beispiel 2) entspricht. D.h., der Gehalt der Probe an für L. elongisporus EH 15 (D) verwertbaren n-Alkyl-Verbindungen die keine n-Alkaae sind, beträgt ca. 45 % der Gesamtmenge an verwertbaren n-Alkyl-Verbindungen des Roh-Diesels.

c. Zugabe von 200 μΐ biologisch entparaffiniertem Roh-Diesel, hergestellt durch Fermentation von L. elongisporus EH 15 (D) auf Roh-Diesel bis zum völligen Erliegen der Säureausscheidung der Kultur, anschließender Lösungsmittelextraktion und Abdestillation des Lösungsmittels bis 80 ⁰C (theoretischer Gehalt an n-Aikanen und anderen verwertbaren n-Alkyl-Verbindungen nahe Mull). Die beobachtete Säureausscheidung entspricht einem n-Hexadekanverbrauch (nach Beispiel 2) von 2,3 mg. Ursache für diese Säureausscheidung scheinen im Substrat0 enthaltene, vom Mikroorganismus verwertbare Lösungsmittelrückstände zu sein, die kein Bestandteil von biologisch entparaffiniertem oder normalem Roh-DÜssel sind (vergleiche folgenden Absatz d.) d; Zugabe von 200 μΐ biologisch entparaffiniertem Roh-Diesel, hergestellt analog Absatz c, aber destilliert innerhalb der Siedegrenzen von Roh-Diesel (235-370 ⁰C). Das als Kohlenstoffquelle eingesetzte Kohlenwasserstoffgemisch enthält keine durch L. elongisporus EH 15 (D) verwertbaren n-Alkyl-Verbindungen mehr. Die Kultur scheidet keine Protonen aus und der pH-Wert bleibt konstant. '

Claims

Erf indunqsans'pruch

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mikrobiell
verwertbaren n-Alkyl-Verbindungen,vorzugsweise von n-Alkyl-Verbindungen mit mindestens 5 C-Atomen, dadurch gekennzeichnet, daß n-Alkyl-Verbindungen verwertende Mikroorganismen
in einem Kleinfermenter bei intensiver Durchmischung und Belüftung unter Kohlenstoff-limitierten Bedingungen in Gegenwart einer wäßrigen Nährlösung, die alle zum Wachstum erforderlichen Nährsalze und Stickstoff in Form von NH₄ -Ionen enthält, kultiviert werden/die zu untersuchende n-Alkyl-Verbindungen enthaltende Probe bei einem pH-Wert zugesetzt wird, der dem Schaltpunkt der pH-Statierungseinrichtung im Fermenter entspricht und der Laugeverbrauch für die pH-Statierung bestimmt wird. · , .

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