DD160415A1 - Verfahren zur herstellung von peptiden - Google Patents

Abstract

Die Erfindung ein Vefahren zur Herstellung von Peptiden unter Verwendung aktivierter Ester von N-Hydroxyverbindungen ohne Isolierung von Zwischenstufen. Die Aminokomponenten dewachsenden Peptids werden in einem Halogenkohlenwasserstoff mit bis zu doppelt moralem Ueberschuss N"-Boc-geschuetzter Aminosaeureaktivester von N-hydroxyverbindungen unter Rueren mit einer waessig-alkalischen Puffer- o.Salzloesung schneller als ohne Verwendung dieser alkalischen Zweitphase quentitativ u.racemisierungsfrei gekuppelt,so dass d.entstandenen Peptide in der organischen Phase danach durch Ueberfuehrung d.Carboxylkomponentenueberschusses in ein saeureloesliches Amid durch Waschprozesse gereinigt,durch Zusatz einer hoch aciden organischen Saeure mit Methansulfonsaeure an der N"-Box-Gruppe deblockiert und durch Neutralisation m.Natriumhydrogencarbonat als Aminokomponenten f.d.nachfolg.Kupplungen im Zweiphasensystem vorbereitet werden koennen,ohne d.Zwischenprodukte auf irgendeiner Stufe ausgefaellt werden muessen.Das Verfahren erlaubt, biologisch aktive Peptide oder ihre Zwischenstufen schnell,mit hoher Reinheit und in guten Ausbeuten herzustellen.

Description

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Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden in homogener Lösung ohne Isolierung von Zwischenstufen und ermöglicht damit eine rationelle und ökonomisch vorteilhafte Darstellung biologisch aktiver Peptidwirkstoffe oder von deren Synthesezwischenprodukten.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Schnell verlaufende Peptidsynthesen, die pro Tag 1-2 Aminosäurekupplungen gestatten, sind nur möglich, vienn. die beim konventionellen Arbeiten erforderlichen Isolierungs-, Reinigungs- und Charakterisierungsschritte nach jeder Aminosäurekupplting und jeder ^-Aminogruppendeblockierung entfallen können. Das ist jedoch nur möglich, wenn die beiden genannten Reaktionen quantitativ ausführbar sind, weil sich sonst wegen der fehlenden Zwischenreinigung schnell Fehl- und RumpfSequenzen der Peptide anreichern. Diesem Anliegen trug die von LESRRIFrßLD eingeführte Pestphasenpeptidsynthese ' (R.B.Merrifield, Federation Proc..21,,412(1962)) Rechnung. Dabei wird die Aminokomponente der wachsenden Peptidkette

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an einem festen polymeren Träger verankert und die Peptidknüpfungen werden mit einem großen Überschuß der aktivierten Carboxy!komponenten soweit als möglich quantitativ vollzogen· Reagensüberschüsse und lösliche Nebenprodukte lassen sich dann leicht durch Filtrier- und Y/aschvorgange entfernen, was sinngemäß auch für die leichter quantitativ ausführbaren M^-Schutzgruppendeblockierungen gilt. Die heterogene Reaktionsführung gestattet aber bei zahlreichen Kupp-

' · ·

lungen trotz der verwendeten Überschüsse keine quantitativen Acylierungen, so daß im allgemeinen mehr oder minder stark verunreinigte Peptidgemische entstehen, deren notwendige intensive Reinigung die Vorteile der schnellen Synthese wieder zunichte macht·

Es liegt auf der Hand, daß man solche quantitativen Kupplungen mit einem Überschuß an aktivierter Carboxylkomponentθ auch in Lösung unter Verzicht auf die Polymerbindung der Aminokomponente ausführen kann, wenn es gelingt, den Überschuß und eventuell auftretende Kupplungsnebenprodukte zu entfernen. Aus der Literatur sind bisher mehrere Varianten einer in Lösung durchführbaren schnellen Peptidsynthese bekannt (G.R.Pettit,"Synthetic Peptides", Vol.4,33(1976)), die sich im wesentlichen in der Aktivierung der Carboxylkomponente und in der Art und Weise der Abtrennung der Reagensüberschüsse unterscheiden. Letzteres kann im Prinzip entweder durch Fällung des Peptids aus dem Reaktionsmedium oder durch Auswaschen des Überschusses und der Nebenprodukte erfolgen. In bezug auf die N -Deblockierungen setzt man mit

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Vorteil den tert«-Butyloxycarbonyl-Schutz ein, der mit hinreichend aciden Säuren quantitativ und schnell entfernbar ist, wobei nur gasförmige Nebenprodukte entstehen und die Deblockierungssäure mit wässrig-alkalischen Lösungen leicht ausgewaschen werden kann·

Die bekannteste unter den Sehnellsynthesen in Lösung ist die von TILAK entwickelte ( DOS 2022032 und Tetrahedron Letters 849(1970)) und später von BBYERRiANN (Rec.Trav.Chim.Pays-Bas 22,481(1973)) als REMA-Technik (Repetitive Mixed Anhydride) bezeichnete Methode unter Verwendung von Mischanhydriden. Bezogen auf die eingesetzte Aminokomponente werden dabei 1,5 Äquivalente des Mischanhydrids einer N-geschützten Aminosäure benötigt und nach der quantitativen Kupplung (0,5 bis 2 Stunden) wird der Reagensüberschuß durch eine Bicarbonatlösung hydrolysiert. Man verwendet für die Kupplungsreaktion ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, so daß bei der Hydrolyse das Peptid ausfällt. Dieses wird gewaschen, wieder im organischen Lösungsmittel aufgenommen, N^-deblockiert, gefällt und dann in den nächsten Syntheseeyelus eingesetzt. Diese Technik eignet sich nicht für die Ankupplung von sterisch anspruchsvollen Aminosäuren, wie Isoleucin, Valin, Prolin u.a., weil es dabei zur teilweisen Fehlacylierung durch das Mischanhydrid kommt. Diese Einschränkung ist ebenso von Nachteil wie die häufigen Fällungsreaktionen des Peptids· Die Fehlacylierungen lassen: sich prinzipiell vermeiden, wenn die Peptidkupplungen mit aktivierten Estern ausgeführt werden. Da jedoch aktivierte Ester im allgemeinen weniger reaktiv sind als Mischanhydride, muß man einerseits

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größere Überschüsse verwenden und andererseits möglichst reaktive Ester einsetzen, um in vertretbaren Zeiten zu quantitativen Kupplungen zu kommen. H-Hydroxysuccinimidester (C.H.Schneider u. W.Wirz, Helv.chim.Acta £5», 1062(1972)), o-Nitrophenylester (M.Bodanszky US 3944538; J.org.Chemistry ^8,3565(1973)) und N-Hydroxybenzotriazolester (G.T.Young, J.Chem.Soc.,Perkin I 1979.1901; H.Rolli u.Mit.,Int.J.Peptide Prot.Res.Jl,41K1980)) erfüllten in dieser Hinsicht die Er-Wartungen nicht, da zu langsam ablaufende Kupplungen entweder hohe Reagensüberschüsse oder zu lange Reaktionszeiten erforderten. Als wesentlich besser geeignet erwiesen sich hingegen für diesen Zweck die Pentafluorphenylester (L.Kisfaludy, Tetrahedron Letters 1785(1974)), die eine quantitative Peptidkupplung in 15-30 Minuten erlauben, wenn 2-3 Äquivalente an Aktivester verwendet werden. Nachteilig erscheinen dabei nicht so sehr die Reagensüberschüsse, sondern der hohe Preis des Pentafluorphenols und dessen hohe Toxicitat. > Bei den Aktivesterschnellsynthesen wurde in der Regel

in einem kleinen Volumen Dimethylformamid gekuppelt, was die notwendige Löslichkeit der wachsenden Peptide sichert und durch die hohe Konzentration der Reaktionspartner den gewünschten quantitativen Umsatz begünstigt. Die Aufarbeitung der Reaktionsansätze nach der Kupplung verfolgt das Ziel, den Überschuß der Boc-aminosäureaktivester und die als Kupplungsnebenprodukte entstehenden Hydroxyverbindungen vom IT^-Boc-geschützten Kupplungsprodukt abzutrennen. Dazu könnte man durch Versetzen der Kupplungslösung mit bspw. Essigester (M.Bodanszky, J.org.Chemistry 3§,3565(1973)) oder Hexan (L.Kisfaludy, Tetra-

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hedron Letters 1785(1974)) - je nach Löslichkeit des Peptides - das Kupplungsprodukt ausfällen. In den meisten Fällen wird dabei der Boc-aminosäureaktivester und die Hydroxyverbindung in Lösung bleiben, so daß man nach Isolierung des Peptide den folgenden Boc-Abspaltungsschritt einleiten kann· Zweckmäßiger ist es, nach TILAIC (Tetrahedron Letters 849(1970)) die überschüssige aktivierte Carboxy!komponente sofort im Anschluß an die Kupplung mit einem prim./tert.-Diamin, bspw. 2-Diethylaminoethylamin, in ein eindeutig mit wässrigen Säuren auswaschbares Amid zu überführen» Dann ergeben sich für die Aufarbeitung 2 Möglichkeiten; Entweder man gibt zur Dimethylformamid-Kupplungslösung nach der Amidbildung einen Überschuß wässriger Säure, wobei dann nur das Peptid ausfällt und entsprechend weiter verarbeitet werden kann (L»Kisfaludy, Tetrahedron Letters 1785(1974))» oder man nimmt den Kupplungsansatz in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel auf und wäscht das Boc-aminosäureamid und die Hydroxyverbin- ^_n dung mit wässriger Säure bzw. Base aus (H.Rolli u. Mit., Int. J.Peptide Prot.Res. J£,411(1980)). Bei der zuletzt genannten Aufarbeitungsvariante kommt man folglich ohne die sonst übliche Zwischenisolierung des Peptides nach dem Kupplungsschritt aus.

Letzteres trifft auch für eine Schnellsynthese zu, bei der die Kupplung in einem wässrig-organischen Zweiphasensystem mit Hilfe eines wasserlöslichen Carbodiimids vorgenommen wurde (S.Hozaki, Chem.Letters 1977»1057).Dabei kann nach der Kupplung die wässrige Phase abgetrennt und aus der organischen Phase der Reagensüberschuß und der gebildete Harnstoff mit

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wässrigen Säuren und Basen extrahiert v/erden, während das entstandene Peptid in der organischen Phase verbleibt· Um in für eine Schnellsynthese angemessener Zeit von etwa 2 Stunden quantitative Kupplungen zu erreichen, waren allerdings jeweils 4-fache Überschüsse an den Carboxy!komponenten, dem Carbodiiraid und dem zur Racemisierungsunterdrückung zugesetzten N-Hydroxybenzotriazol notwendig. Hinsichtlich der Einfachheit und damit der Wirtschaftlichkeit der Verfahren verdient auch der nach den Kupplungen erforderliche N -Boc-Deblockierungsschritt Beachtung· Wird das geschützte ιPeptid nach der Kupplung fest isoliert, spaltet man zweckmäßig mit Trifluoressigsäure ab, indem man das Peptid darin aufnimmt und nach ca. 15 Minuten Deblockierungszeit die Trifluoressigsäure abdestilliert, mit Ether ausfällt und das Peptid mit freier Aminogruppe wieder für die nächste Kupplung in DMP aufnimmt (H.C.Beyermann, Rec.Trav· Chim.Pays-Bas ,22,481(1973); M.Bodanszky, J.org.Chemistry ν ^8,,3565(1973) u.a.). Die Isolierung für den Boc-gruppen-Abspaltungsschritt kann sich auch dann als zweckmäßig erweisen, wenn das Kupplungsprodukt nach der Aufbereitung nicht isoliert wurde, weil bei der sauren Deblockierung in einem organischen Lösungsmittel relativ hohe Konzentrationen an bspw. Salzsäure oder Trifluoressigsäure notwendig sind, die anschließend bei der Neutralisation sehr viel Salz bilden wurden (H.Rolli u. Mitarb., Int.J.Peptide Prot.Res· 15.411 (1980)). Lediglich NOZAKI (Chem.Letters 1977.1057) hat in der zuletzt genannten Weise seiner organischen Phase HCl/ Dioxan zugesetzt und nach Beendigung der Boc-Abspaltung die

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Säure mit Sodalösung neutralisiert. Da das Peptid bei dieser Methode weder, nach der Kupplung noch nach der Boc-Abspaltung zwischenisoliert wird, bezeichneten die Autoren das Verfahren auch als "hold in solution method". Die gewählte Deblockierungsvariante hat jedoch auch Nachteile, denn der notwendige hohe Zusatz von HCl/Dioxan birgt die Gefahr in sich, daß bei der anschließenden Neutralisation mit der Verteilung von Dioxan zwischen organischer und wässriger Phase die Aminokomponente teilweise ausgewaschen wird.

Abschließend muß man bemerken, daß alle diese Methoden erfordern, daß diejwachsende Aminokompaente im organischen Kupplungslösungsmittel löslich sein muß. Dieses kann jedoch in vielen Fällen durch geeignete Schutzgruppenwahl an der terminalen Carboxylgruppe und an den Aminosäureseitenketten beeinflußt werden

Ziel der Erfindung -

Das Ziel der Erfindung besteht in einer ökonomisch günstigen Bereitstellung von reinen biologisch aktiven Peptiden oder Peptidfragmenten von hochmolekularen Peptiden als Synthesebausteine unter Vermeidung langer Reaktionszeiten, der Isolierung von Zwischenstufen sowie eines großen Überschusses an aktivierter Carboxylkomponente und unter Vermeiden der Aktivierung dieser Komponente durch relativ toxische Verbindungen

Darlegung .des·. Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden zu entwickeln, das durch eine Schnellsynthese den schrittweisen Aufbau von Peptiden ohne Isolie-

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rung von Zwischenstufen gestattet, materialsparend unter quantitativ ablaufenden Kupplungsschritten durchführbar ist» die Verwendung toxischer Materialien nicht erfordert und bei dem das aufzubauende Peptid in allen Stufen in Lösung gehalten wird.

Bisher bekannte technische Lösungen befriedigen in bezug auf die Kupplung mit Ausnahme des Einsatzes der sehr reaktiven Pentafluorphenylester von N-geschützten Aminosäuren nicht» da die Kupplungsgeschwindigkeiten zu langsam sind» so daß schnell erzielbare quantitative Umsetzungen mit vertretbaren Reagensüberschüssen, insbesondere an sterisch gehinderten Aminosäuren nicht zu erreichen sind. Pentafluorphenylester der Carboxy!komponenten sind wegen des hohen Preises und der erheblichen Toxizität des Pentafluorphenols ebenfalls Von Nachteil. Das "in Lösung halten" des wachsenden Peptides, was die Synthese vereinfacht, bereitet bei den bisher bekannten Verfahren Schwierigkeiten, weil entweder die Abtrennung der Reagensüberschüsse und der Kupplungsnebenprodukte nicht ohne Zwischenfällung gelingt oder weil zur Deblockierung der N -Boc-Gruppe nach jedem Kupplungsschritt Säuren eingesetzt v/erden, die relativ hoch dosiert werden müssen und sich deshalb im Anschluß nur unter Bildung großer Salzmengen neutralisieren lassen.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß Aktivesterkupplungen zwischen N-geschützten Carboxyl- und Aminokomponenten in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel durch Rühren mit einer schwach alkalischen (pH 7-9) wässrigen Phase wirksam beschleunigt werden können, ohne daß die Carboxy!komponente racemisiert wird. Auf diese Art und Weise

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lassen sich erfindungsgemäß im Zweiphasenkupplungssystem unter Verwendung überschüssiger aktivierter Ester der N-Hydroxyverbindungen, insbesondere der relativ hydrölysestabilen Aktivester des K-Hydroxy-5-norbornen-2.3-dicarbonsäureimids (HONB) und des N-Hydroxysuecinimids (HOSu), leicht quantitative Umsetzungen erreichen. Je nach der Art der an der Kupplungsstelle stehenden Aminosäuren wählt man den Überschuß der Carboxylkomponente bis doppelt äquimolar und erreicht quantitative Umsätze in maximal 2 Stunden, häufig aber in wesentlich kürzerer Zeit. Größere Überschüsse sind nur bei ausgesprochen sterisch gehinderten Knüpfungen erforderlich· Mit Vorteil verwendet man als Kupplungsphase halogenierte . Kohlenwasserstoffe wie Dichlorethan, Methylenchlorid oder Chloroform und als wässrige Phase Puffer oder alkalisch hydrolysierende Salzlösungen, vorzugsweise Alkalihydrogencarbonatlösungen. Tabelle 1 enthält einige Peptidknüpfungs- , beispiele, in denen Kupplungen von Η-geschützten Aminosäure-OHB-estern mit Aminosäureestern in Dichlorethan in Gegenwart und in Abwesenheit einer wässrigen Natriumhydrogencarbonat-Phase miteinander verglichen werden.

Die Reaktionsbeschleunigung geht offenbar auf eine Basenkatalyse der Peptidkupplung und die Extraktion der bei der Reaktion entstehenden sauren, wasserlöslichen H-Hydroxyverbindungen aus dem Reaktionsmedium zurück»

Diese Kupplungslösung im Zweiphasensystem gestattet nun unter Verwendung der bekannten sauren Auswaschung des Carboxylkomponentenüberschusses nach dessen Überführung in ein säurelösliches Amid auf eine Zwischenfällung des N-geschützten Peptides zu verzichten.

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Tabolle 1:

²"

Aktivester Axninokomponente Lösungsm. Zeit²" Analytische Da

^{t (h) d}^

Z-Pro-ONB	Il	H-GIy-OBz1	1	0,2	64-66	-54,6(
	-VaI-ONB	Il	2	0,1	68-73	-55,61
Z-AIa-ONB	η	H-Leu-OMe	1	0,5	Öl	-34,4C
ι Il I .'	Boc-Leu-ONB	Il	2	0,3	Öl	-33,20
Z-Pro-ONB		H-Leu-OMe	1	1,0	68-70	-66,50
	ti	ti	2	0,5	71-72	-68,60
ζ	H-GIy-OBz1	1	5,0	129	-24V6(]
Il	2	2,0	133	-26,40
H-Leu-OMe	1	49,0	144	-53,6(1
Il	2	24,0	144	-52,0(1

Zeit bis zum quantitativen Umsatz Lösungsmittelsystem 1 : Dichlorethan Lösungsmittelsystem 2 : Dichlorethan/ 1 m NaHCOv

Eine hinreichend hydrophobe Aminokomponente wird in der Halogenkohlenwasserstoff phase mit einem bis zur doppelt molaren Menge betragenden Überschuß eines N^Boc-geschützten Aminosäure-ONB-esters (oder eines entsprechenden Aktivesters einer anderen N-Hydroxyverbindung) versetzt und bis zur quantitativen Acylierung (DC-Kontrolle) mit einer 1 m Natriumhydrogencarbonatlösung gerührt, was in der Regel weniger als 2 Stundejn in Anspruch nimmt. Danach wird die Hydrogencarbonatphase abgetrennt und die organische Phase mit einer zur Umwandlung des Aktivesterüberschusses in ein säurelösliches Amid notwendigen Menge eines eine primäre und eine tertiäre Aminogruppe tragenden Diamins, beispielsweise 4-Picolylamin oder N,N-Di- \ methy!ethylendiamin, versetzt und 15 Minuten gerührt· Danach

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wird die organische Phase nacheinander mit einer verdünnten Säure, einer Hydrogencarbonatlösung und mit Wasser gewaschen· Nimmt man nun die Abspaltung der Boc-Gruppe mit einer stark aciden organischen Säure wie Methansulfonsäure (H.Yajima, Chem.Pharm.Bull. 2£, 740(1977)) anstelle von HCl oder Trifluoressigsäure vor, kommt man mit einer recht geringen Gesamtsäur ekofissentr at ion aus, um die Boc-Gruppe in 15 Minuten quantitativ abzuspalten· Dieser Säureüberschuß läßt sich mit einer Hydrogencarbonatlösung sehr leicht auswaschen, so daß die Aminokomponente auch in diesem Reaktionsschritt nicht zwischen gefällt werden muß·

Die organische Phase wird nach den oben beschriebenen Waschprozessen zur Abspaltung der Sn-Boc-Gruppe des Peptides mit der zur Herstellung einer 0,5 m Lösung notwendigen Menge Methansulfonsäure versetzt und 15 Minuten gerührt. Danach wird mit einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung neutralisiert und damit zugleich das Zweiphasensystem mit der aminogruppenfreien Aminokomponente für die nächste Peptidkupplung wieder hergestellt.

Die erfolgreiche Anwendung dieses Syntheseechemas setzt wie in den bisher beschriebenen Schnellsynthesen eine ausreichende Löslichkeit der Aminokomponenten des wachsenden Peptids in der organischen Phase bei entsprechend geringer Löslichkeit in der wässrigen Hydrogencarbonatphase voraus. Dafür muß gegebenenfalls durch geeignete Auswahl der terminalön und Seitenkettenschutzgruppen Sorge getragen werden. Die Seitenkettenschutzgruppenauswahl muß ferner berücksichtigen, daß entsprechende Boc-aminosäureamide in wässrigen Säuren

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löslich sein müssen.

Unter diesen Einschränkungen ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders zur Herstellung kurzkettiger biologisch aktiver Peptide wie Angiotensin, Oxytocin, Vasopressin, Somatostatin, Gonatropin-Releasinghormon (Gn-RH,LH-RH), Enkephalin, Substanz P, Pentagastrin, Pankreocymin-Cholecystokinin u.a. oder zur Darstellung von Zwischenstufen größerer biologisch-aktiver Peptide geeignet.

Die gute praktische Verwendbarkeit des Synthese Schemas wurde an den Peptiden der AusfülirungBbeispiele demonstriert, die sämtlich in sehr guten Ausbeuten uad hoher Reinheit dargestellt wurden. In der Regel ließ sich ein Synthesecyclus für die Ankupplung einer Aminosäure in 4-5 Stunden durchführen, Der notwendige Lösungsmitteleinsatz ist dabei im Gegensatz zur Festphasensynthese sehr geringj da sich im angegebenen Syntheseschema 5-10 mmol der wachsenden Aminokomponentö in 100 ml organischer Phase gut handhaben lassen. Die Zeitersparnis gegenüber der konventionellen Peptidsynthese ist erheblich, wie an der in 2 Tagen ausgeführten Leu-Enkephalinsynthese deutlich wird.

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Ausführungsbeispiele

1« Allgemeine Synthesevorschrift

7»5 mmol Boc-Aminosäure-OHB-ester (HOHB = N-Hydroxy-5-norbornen-2.3-dicarbonsäureimid) und 5 mraol der Aminokomponente (in der Regel Aminosäure- oder Peptidalkylester) werden in 100 ml 1.2-Dichlorethan im Gemisch mit 15 ml 1 η Natriumhydrogencarbonatlösung 0,5 - 2 Stunden intensiv gerührt. Danach wird die wässrige Phase abgetrennt, die Dichlorethanlösung mit 5 mmol 3-Dimethylamüiopropylamin versetzt und weitere 20 Minuten gerührt. Im Reaktionsge- ' faß wird anschließend je 3 mal mit 1 η HGl, 1 η NaHCOo und Wasser gewaschen, dann der organischen Phase 3,25 ml Methansulfonsäure und 2 ml Eisessig zugesetzt und wieder 20 Minuten gerührt. Schließlich wird mit Natriumhydrogen- ; carbonatlösung neutralisiert unddas Zv/eiphasensystem für die nächste Kupplung wieder hergestellt.

2. Beispiele

2.1 Z-Gly-PhePhe-Tyr(BzI)-OMe (Fragment B23-26 der Insulin- B-Kette)

Ausbeute 2,74 g (71% bezogen auf die Startaminosäure);

P. 161-164⁰Cj WgO __g.₀o (_c=ljDFiF)_{; DC} einheitlich ^C45^H46V8 (770,8)

Ber. C 70,11 H 6,02 N 7,27

Gef. 70,00 6,07 7,07

Aminosäureanalyse: GIy -1.0(1); Phe 2,0(2); Tyr 0,7(1)

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2.2 Z-Tyr(Bzl)-Gly-Gly-Phe-Leu-OBzl (Leu-Enkephalin)

Ausbeute 3,26 g (75% d.Th.); F. 151-153⁰C; W^⁰ -17,0° (c=1,CHoOH); DC einheitlich nach KieseIge!chromatografie

C₅₀H₅₅N₅O₉ (870,0)

Ber. C 69,03 H 6,37 N 8,05 Gef. 68,67 6,24 8,26

Amino säure ana Iy se : jGljr 2,0(2); Phe 1,1(1); Leu 1,1(1);

Tyr 1,0(1)

2.3 Boc-Tyr(BaI)-Gly-Leu-OMe (Fragment 5-7 des Gn-RH)

Ausbeute 2,31 g (83% d.Th.); F. 55-58⁰C; Ώ0 einheitlich C₃₀H₄₁N₃O₇ (555,7)

Ber. C 64,85 H 7,44 N 7,56 Gef. 65,36 7,55 7,47

AminosäureanaIyse: GOjr 1,0(1); Leu 1,0(1); Tyr 0,8(1)

Claims (3)

1. 229688 A

   Br findungs ans pr uch

   1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden gekennzeichnet dadurch, daß ein Aminosäure- oder Peptidester oder -amid mit ungeschützter «st-Aminogruppe als Aminokomponente und ein ir'-Boc-geschützter Aminosäureaktivester als Carboxyl-.-komponente'· unter Anwendung, eines geringen Überschusses dieser Carboxy!komponente in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel gelöst, die beiden Komponenten unter Rühren der Lösung mit einer wässrigen, schwach alkalisch reagierenden Puffer- oder Salzlösung bei einem pH-Wert , zwischen 7 und 9 racemisierungsfrei innerhalb von wenigen Minuten bis 2 Stunden miteinander gekuppelt, danach die wässrige Phase abgetrennt, die organische, restliche . Carboxylkomponente und·gebildetes Peptid enthaltende Phase zur Entfernung der Carboxylkomponente mit einem eine primäre sowie tertiäre Aminogruppe tragenden Diamin unter Rühren behandelt, entstandenes Säureamid mit verdünnter Säure ausgewaschen, die organische Phase mit Hydrogencarbonat und Wasser neutral gewaschen und anschließend das in dieser Phase verbliebene Peptid mit einer stark aciden organischen Säure, vorzugsweise Methansulfonsäure, am Stickstoff deblockiert, die organische Lösung mit der wässrig-alkalischen Lösung des Zweiphasensystems neutral gewaschen und deblockiertes Peptid in dieser organischen Phase erneut der weiteren Kupplung mit einem N^-Boc-geschützten Aminosäureaktivester im Zweiphasensystem unterzogen wird· ' ';
2. 2. Verfahren nach Punkt 1 gekennzeichnet dadurch, daß als
   N^-Boc-geschützter Arainosäureaktivester vorzugsweise
   Ester von !!-Hydroxyverbindungen, insbesondere relativ hydrolysestabile Ester des N-Hydroxy~5-norbornen-2.3-c1.icarbonsäureimids oder des N-Hydroxysuccinimids verwendet- werden*
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 gekennzeichnet dadurch, daß als
   mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel vorzugsweise halogenierte Kohlenwasserstoffe oder Essigest-er und als wässrige Phase mit dem pH-Bereich von 7 bis 9
   entweder Puffer, Basen unter pH-stat-Bedingungen oder
   alkalisch hydrolysierende Salzlösungen, vorzugsweise Alkalihydrogencarbonate Anwendung finden«