DD157346A1 - Von den verfahrensbedingungen abhaengiges steuerverfahren zur kontinuierlichen kultivierung von mikroorganismen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein von den Verfahrensbedingungen abhaengiges Steuerverfahren zur kontinuierlichen Kultivierung von Mikroorganismen zum Zwecke der Einzell-Proteingewinnung und Produktherstellung. Es liegt ihr die Aufgabe zugrunde, einer im Durchflusssystem wachsenden Mikrobenkultur kontinuierlich Medium mit einer dem Zuwachs entsprechende Geschwindigkeit zuzufuehren, so dass die Substratkonzentration in der Kulturloesung waehrend des Prozesses unveraenderlich bleibt und damit eine konstante Wachstumsrate beliebig nahe der maximalen Wachstumsrate eingestellt werden kann. Dies wird dadurch erreicht, dass im Fermentationsprozess die Zell- oder Substratkonzentration kontinuierlich als Massgroesse erfasst wird und als Sollwert zur Regulation der Zuflussrate des Mediums dient.

Description

-Λ-

Z 6 8 1 6 5

Titel der Erfindung ·

Ton den Yerfahrensbedingungen abhängiges Steuerverfahren zur kontinuierlichen Kultivierung von Mikroorganismen

Anwendung der Erfindung

Die Erfindung "betrifft ein Steuerverfahren für mikrobielle Stoffumwandlungen, die zum Zwecke der Gewinnung von likro- _: Organismenzellen oder Produkten durchgeführt werden.

Charakteristik "bekannter technischer Lösungen

Die kontinuierliche Zuführung von Substanzen zu mikrobiellen SubmerskultuTen ist eine weit verbreitete Züchtungsmethode, die der Herstellung von Einzellereiweiß und anderer Produkte dient. Bei den nach dem Chemostat-Prinzip arbeitenden'Regimen -treten dabei stationäre Zustände der Zeil- und Produktkonzentration auf COj während in den fed-batch-Regimen (2) mit stetig anwachsendem oder cyclisoh vermindertem Volumen quasistationäre Zustände erreicht werden C5)·

Der Nachteil dieser Kultivierungsmethoden besteht darin, daß infolge der gering zu.haltenden Substratkonzentration im Kulturgefäß die maximal möglichen Reaktionsgeschwindigkeiten der mikrobiellen Systeme kontinuierlich nicht eingestellt werden können, da leicht der Äuswaschpunkt überschritten werden kann» Bei den ausgedehnten "extended" Kulturen (4) mit exponentiell ansteigendem Zufluß läßt sich diese Einschränkung zwar durch die Einstellung beliebig hoher Substratkonzentrationen während des Prozesses wesentlich einschränken,

Jedoch müssen die Fermentationen wegen· des relativ schnallen Err eic hens der Reaktor-F Uligrenze abgebrochen oder in einen cyclischen fed-batch mit periodischer Volumenkorrektur bei diskontinuierlicher Prozeßstörung und Produktabführung überführt vrer den.

Ziel der !Erfindung

Mit dem vorgeschlagenen Verfahren ist es möglich, in Systemen' mit Zu- und Ablauf einen exponentiellen Anstieg der Zuflußrate zu vermeiden, obgleich die Mikroorganismen nahe der maximales Wachstumsrate sich vermehren und der Prozeß kontinuierlich abläuft*

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einer wachsenden Mikroorganismenkultur kontinuierlich Medium mit einer dem Zuwachs entsprechenden Geschwindigkeit so zuzuführen, daß die Substratkonzentration im Reaktor während des Prozesses einen konstanten Wert beibehält und die von einem ausgewählten Substrat bestimmte Wachstumsrate unverändert beliebig nahe der maximalen Wachstumsrate bleibt, ohne daß die Kultur ausgev/aschen wird* Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, daß die Zellkonzentration oder ein zu ihr in Relation stehender Parameter der Kultur als Signal für die Regulierung der •zufließenden Mediumsmenge verwendet wird, in welcher alle für das Wachstum erforderlichen Komponenten in der stöchiometrischen Relation ihrer Ertragskoeffizienten vorhanden sind» Dieses Rückkopplungsprinzip sichert einen dem Wachstum adäquaten Zulauf, durch welchen wiederum in einem Durchflußsystem der Ablauf festgelegt wird«,

Bei der mathematischen Behandlung der rückgekoppelten Mediumszuführung wurde überraschend gefunden,- daß die Zellkonzentration und die Durchflußrate Grenzwerten zustreben oder konstant bleiben und lediglich von zu Prozeßbeginn einstellbaren Größen bestimmt werden. Wird mit S₁, bzw, S_Q die Substratkonzentration im Vorratsmedium bzw. in der Kulturlösung bei Fermentationsbeginn bezeichnet, mit jx die spezifische

1 b b

Iachstumsrate, mit T(t) die zum Zeitpunkt t erreichte Zellkonzentration sowie mit T / der Ertragskoeffizient für das

x/ s

die fachstumsrate bestimmende Substrat, so nimmt die Durchflußrate D gemäß Formel (1) in Abhängigkeit von der Zeit einen definiertaren Wert an: ·

X(t) erscheint in der Formel als einzige Variable, die sich aus den genannten Größen und der Zellkonzentration X₀ zum Erozeßbeginn nach (2) berechnen läßt:

XCt):- -2-

Für XCt) und damit für D ergeben sich die Grenzwerte:

C4) D = ja

denen sich die Kultur in Abhängigkeit von der Eelation X / Ya CS_r - S) in einem unterschiedlichen Zeitverhalten nähert.

Es gelten folgende Beziehungen:

X₀ < Y_x/_S CS_r - S₀) XCt) bzw. D sigmoid

X₀ = ^Yx/_S C^s _r - S₀) XCt) konstant

X₀ > X_x/s CS₂. - S₀) XCt) hyperbolisch

Die Kulturen nähern sich diesen Grenzwerten asymptotisch bereits nach kurzer Prozeßdauer,.so daß die weitere asymptotische Näherung wegen Geringfügigkeit vernachlässigt werden kann, das bedeutet, daß ein "steady'state" vorliegt. Durch beliebige Wahl der Differenz S_r - S_Q läßt sich dieser_Asteady state"beliebig nahe der maximalen Wachstumsrate einstellen»

Diese Grenzwertbeziehungen v/erden durch die nachfolgenden

Ausfuhrungsbeispiele dargestellt.

Beispiel 1_ .

Mn Stamm von Escherichia coli wird auf einem Medium submers kultiviert, we lches als Bestandteile pro liter 3 g KH₂PO₄, 3 g K₂HPO₄, 4 g'NH₄Cl, 0,5 g MgSO₄ · 7H₂O' und 25 g Glucose sowie die Spurenelemente Mn, Zn und Fe enthält. Die Starkonzentrationen "betragen für S₀: 5 g Glucose/1 und für X : 1 g Trockenmasse/l. Bei einem Y / -Wert von 0,5 und einer spezi- fischen Wachstümer at β von μ = Oy69 h. ergeben sich die in Abbildung 1 dargestellten Kurven« Die Zellkonzentration strebt gegen 10 g X/l_s während D sich sigmoidal dem Grenzwert 0,69 nähert. lach 10-stündiger Kultivierung kann bereits von einem experimentell erreichten quasistationären Zustand gesprochen v/erden»

.Beispiel Z.

Ein methylotropher Stamm aus der Gattung Pseudomonas wird auf einem Medium submers kultiviert,-welches als Bestandteile pro Liter 0,5 g KH₂PO₄, 5 g NH₄Cl, 0,25 g" MgSO₄ · 7H₂O in wässriger Lösung neben den Spurenelementen Mn₅ Zn und Fe enthält. Als C-Quelle dient Methanol, welches in einem sparatem Strom dem Kulturgefäß zugeführt wird. Bei einem Ya -Wert

x/ s

von 2 für HK₄Cl und 0,4 für Methanol stehen der wässrige und •der methanolische Strom in einem Tolumenverhältnis von 1 : 5. Wegen der wasserfreien Zuführung der C-Quelle ergibt sich bei stöchiometrischer Substraturnsetzung keine zusätzliche Yolumenänderung«, Das Zeitverhalten der Kultur ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Zellkonsentration sinkt bei einem S₀ von 2,5 g M₄Cl/! und einem X₀ von 10 g Trockenmasse/l auf 5 g X/l ab, während sich D dem Wert von p. - 0,2 hyperbolisch. nähert,, Die Annäherung an diese Grenzwerte ist nach 10-stündiger Kultivierung noch nicht hinreichend vollzogen.

Beispiel 5

In einem Ferment er, der mit einer Nährlösung kontinuierlich beschickt werden £ann_? wird ein Kohlenwasserstoff verwesten-

der Hefestamm auf flüssigen Paraffinen der Kettenlänge C-_n C₂₀ gezüchtet. Das Medium enthält 2 g KE^PO^/l, 2 g MgSO^ ♦ 7Hp0/l| 8 g NH/Cl sowie die Spurenelemente Mn, Zn und Fe in wässriger Lösung, während das Paraffin in einem separaten Strom zugeführt wird· Aus dem T„/—Wert 'von..1,0 für die C-Quelle und von 2_r5 für M/Cl ergibt sich ein Volumenverhältnis der Ströme von 1 : 0,4. Der Kurvenverlauf ist in Abbildung 5 dargestellt. Bei einer Substratanfangskonzentration von 0,1 g/l und einer Zeilanfangskonzentration X₀ = 2: g nähert sich die Trockenmassekonzentration dem Grenzwert 20 g X/l sowie die Durchflußrate D dem Grenzwert p. = 0,5. Die Substratkonzentration in bezug auf die C-Substrate und liegt dabei "^ 0,1 g/l. .

Claims (3)

Brfindungsanspruoh

1. Yon den Yerfahrensbedingungen abhängiges Steuerverfahren zur kontinuierlichen Kultivierung von Mikroorganismen dadurch gekennzeichnet, daß die Zeil- oder Substratkonzentration in der Eulturlösung gemessen und der gemessene Wert für die Regulierung der Zuflußrate als Sollwert verwendet wirdj so daß durch die dem Zuwachs adäquate Zuführung von wässrigem Medium, welches alle für das Wachstum erforderlichen Komponenten enthält, die Zellkonzentration X(t) zum Zeitpunkt t und die Durchflußrate D in Abhängigkeit von der Wachstumsrate μ_% der Substratkonzentration S₂, im Vorratsmedium bzw. S₀ in der Kulturlösung zu Beginn des Prozesses, der Zeilanfangskonzentration X sowie dem Srtragskoeffizienten Χ_χ/₃ für das gemessene Substrat gemäß Formeln (1) und C)

Λ -

2. Verfahren gemäß. !Punkt· 1 dadurch...gekennzeichnet,- daß die Zellkonzentration indirekt über die zu.ihr in stöchiometrischer Relation stehenden Größen des Sauerstoff Verbrauches, der Kohlendioxidbildung, der Stickstoffverwertung, des Phosph.ainrerbrauch.es oder der Br ο tonenaus se hei dung bestimmt wird.

⁽²⁾ _D . -L

den Grenzv/erten

- S₀)

sowie D =

entgegenstreben»

Tl b b I b. b

3« Verfahren nach!- Punkt; 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß bei Mikroorganismen, welche nicht wasserlösliche Substrate als Kohlenstoff- und Energiequelle verwerten, diese Substrate als getrennte Ströma von den Strömen der in Wasser gelösten Komponenten der Kultur zugeführt werden.

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