DE19743077A1 - Verfahren zur Produktion von Esterasen durch Fermentation - Google Patents
Verfahren zur Produktion von Esterasen durch FermentationInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von
rekombinanten Esterasen durch Fermentation von rekombinanten
Mikroorganismen.
Der Einsatz von Enzymen in der modernen organischen Synthesechemie wächst
ständig. Insbesondere hydrolytische Enzyme, wie Lipasen und Esterasen, finden
in der organischen Synthesechemie breite Anwendung.
Die Hauptvorteile des Einsatzes von Biokatalysatoren in der organischen Chemie
sind die Synthese von chiralen Verbindungen und die vergleichsweise milden
Reaktionsbedingungen unter Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln,
wobei im gegenständlichen Fall vor allem die Synthese optisch aktiver Alkohole
interessant erscheint.
Die gegenständlichen Esterasen wurden zudem in überkritischem Kohlendioxid
untersucht, wobei eine vergleichsweise hohe Stabilität der Enzyme gefunden
werden konnte, wodurch auch ein Einsatz dieser Enzyme in der
Lebensmittelindustrie möglich erscheint.
In modernen industriellen Verfahren werden Enzyme auch mit Hilfe rekombinanter
Mikroorganismen industriell hergestellt. Im gegenständlichen Fall wurde dazu der
Wirtsorganismus Escherichia coli BL21 gewählt, um die Esterasen in großen
Mengen produzieren zu können.
In der Regel werden zur Produktion halbkontinuierlich betriebene
Fedbatch-Prozesse eingesetzt, um entsprechend hohe Zelldichten erreichen zu können.
Übliche Fedbatch-Prozesse werden empirisch so gesteuert, daß die limitierende
Kohlenstoffquelle während der Wachstumsphase meist mit konstantem bzw. mit
exponentiell ansteigenden Fluß in den Reaktor zudosiert wird.
Zur Induktion der rekombinanten Enzymsynthese wird meist der Induktor am Ende
der exponentiellen Wachstumsphase nach dem vollständigen Verbrauch der für
das Wachstum notwendigen Kohlenstoffquelle mit hoher Flußrate und über einen
kurzen Zeitraum in den Reaktor dosiert.
Allen bekannten Verfahren zur Produktion von Enzymen aus rekombinanten
Mikroorganismen ist der Mangel eigen, daß sie eine rein empirische
Fütterungsprozedur der Mikroorganismen vollziehen.
Es wurde jetzt gefunden, daß eine derartige Prozeßführung, bei der die
Kohlenstoffquelle während der Wachstumsphase z. B. exponentiell oder linear
zudosiert wird, zu einer verstärkten Nebenproduktbildung führt, welche
inhibitorisch auf Wachstum und Produktbildung des rekombinanten
Wirtsorganismus wirkt.
Bei einer Vorgangsweise entsprechend dem Stand der Technik während der
Induktionsphase des Prozesses ist eine Verschlechterung der Produktausbeute
und starke Schaumbildung zu beobachten.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Produktivität
bzw. die Reaktorleistung oder beides zu steigern.
Diese Aufgabe wird durch Verfahren nach den Patentansprüchen gelöst.
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von Esterasen durch
Fermentation von rekombinanten Mikroorganismen, welche dadurch
gekennzeichnet sind, daß man die für das Wachstum notwendige
Kohlenstoffquelle, die für die Produktbildung notwendigen Substanzen wie
Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zusammen mit einer adäquaten Menge anderer
Nährstoffe und Spurenelemente in zwei oder mehr auch zeitlich getrennten
Zulaufströmen mit zeitlichen Zufütterungsprofilen unterschiedlicher Form
zudosiert, wobei die Dosierung bevorzugt nicht in proportionalen Mengen erfolgt.
Insbesondere erfolgt die Zugabe des Zulaufstromes mit der für die Produktbildung
notwendigen Kohlenstoffquelle bei allen Prozeßvarianten noch vor dem
vollständigen Verbrauch der für das Wachstum notwendigen Kohlenstoffquelle
während der exponentiellen Wachstumsphase des Organismus.
Erfindungsgemäß werden bei den Fermentationsverfahren zur Produktion
rekombinanter Esterasen aus rekombinantem E.coli BL21 zwei bis fünf sterile,
regelbare Dosierstrecken am Fermenter eingesetzt, die zeitlich veränderliche
Dosierprofile der Schlüsselkomponenten zulassen.
Entsprechend der Erfindung wird jede einzelne Schlüsselkomponente unabhängig
voneinander stufenförmig mit einer für den Mikroorganismus optimalen Zulaufrate
und -konzentration zudosiert.
Die bevorzugte Ausführungsform (Beispiel 1) im komplexen Medium
(Start-Zusammensetzung M1) arbeitet mit drei Zulaufströmen, wobei der Zulaufstrom,
der die für das Wachstum limitierende Kohlenstoffquelle (Zusammensetzung M2)
enthält, ein bezüglich der Zeitachse stufenförmig steigendes Profil (Fig. 1)
aufweist, welches in der Mitte der exponentiellen Fermentationsphase beginnt.
Der Zulaufstrom, der die für die Produktbildung notwendigen Nährmedien
bestandteile mit Ausnahme der Kohlenstoffquelle enthält, weist ein bezüglich der
Zeitachse rechteckförmiges Dosierprofil (Fig. 2) auf, wobei dieser Zulaufstrom zur
gleichen Zeit wie der Zulaufstrom, der die für das Wachstum notwendige
Kohlenstoffquelle enthält, gestartet, aber erst 0,5 h später beendet wird
(Zusammensetzung M3).
Der Zulaufstrom, der die zur Induktion der Produktbildung notwendige
Kohlenstoffquelle enthält (Zusammensetzung M4), weist ebenfalls ein bezüglich
der Zeitachse stufenförmig steigendes Profil auf (Fig. 3), insbesondere
gekennzeichnet durch einen langsamen Anstieg, wobei dieser Zulaufstrom bereits
während der exponentiellen Phase d. h. nach 7,0 h des Wachstums gestartet wird.
Bei einer Versuchsdurchführung entsprechend der bevorzugten Ausführungsform
stellen sich die in Fig. 4 dargestellten Konzentrationsverläufe der wesentlichen
Prozeßparameter ein.
Eine weitere erfindungsgemäße Verfahrensvariante zeichnet sich dadurch aus,
daß die Zulaufströme, welche die für das Wachstum erforderliche
Kohlenstoffquelle und die für die Produktbildung notwendigen Nährstoffe mit
Ausnahme der Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthalten (Zusammensetzungen
M2 und M5) während der exponentiellen Wachstumsphase entsprechend Beispiel
1 zudosiert werden.
Der Zulaufstrom, der die für die Produktbildung erforderliche Kohlenstoffquelle
enthält, weist wie in der bevorzugten Ausführungsform ein bezüglich der
Zeitachse stufenförmig steigendes Dosierprofil auf, wobei neben der für die
Produktbildung notwendigen Kohlenstoffquelle und verschiedenen Mineralsalzen
(Zusammensetzung M8) ein Zusatz von 5 bis 30% Trypton zur Anwendung
kommt.
Eine weitere erfindungsgemäße Verfahrensvariante der bevorzugten
Ausführungsform zeichnet sich dadurch aus, daß die Zulaufströme, welche die für
das Wachstum erforderliche Kohlenstoffquelle und die für die Produktbildung
notwendige Stickstoffquelle enthalten (Zusammensetzungen M2 und M3)
während der exponentiellen Wachstumsphase entsprechend Beispiel 1 zudosiert
werden.
Der Zulaufstrom, der die für die Produktbildung erforderliche Kohlenstoffquelle
enthält (Zusammensetzung M4) weist hingegen ein bezüglich der Zeitachse
intermittierendes Dosierprofil entsprechend Fig. 5 auf, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß drei Pulse dieses Zulaufstromes dosiert werden, wobei
die Abstände und die Dosierintensität durch die Physiologie des Wachstums der
rekombinanten Wirtszelle vorgegeben werden.
Bei einer weiteren erfindungsgemäßen Verfahrensvariante der bevorzugten
Ausführungsform kommen ebenfalls 3 Zulaufströme zur Anwendung, welche
dadurch gekennzeichnet sind, daß die Zulaufströme, die die für das Wachstum
und die Produktbildung erforderlichen Kohlenstoffquellen enthalten
(Zusammensetzungen M2 und M4), wie in der bevorzugten Ausführungsform
beschrieben, zudosiert werden, während der Zulaufstrom, der die für die
Produktbildung notwendigen Nährstoffe mit Ausnahme der Kohlenstoffquelle
enthält (Zusammensetzung M3) mit einem Zusatz von 5 bis 15% Hefeextrakt
entsprechend Fig. 6 in der Mitte der exponentiellen Wachstumsphase in Form
eines treppenförmig an- und absteigenden Dosierprofiles zudosiert wird.
Eine weitere erfindungsgemäße Verfahrensvariante der bevorzugten
Ausführungsform arbeitet mit 2 Zulaufströmen, wobei der Zulaufstrom, der die für
das Wachstum limitierende Kohlenstoffquelle (Zusammensetzung M2) und der
Zulaufstrom, der die für die Produktbildung notwendigen Nährstoffe mit
Ausnahme der Kohlenstoffquelle (Zusammensetzung M3) enthält, wie in der
bevorzugten Ausführungsform beschrieben zudosiert werden, während die für die
Produktbildung notwendige Kohlenstoffquelle in optimaler Konzentration dem
Startansatz der Fermentation zugemischt wird.
In einer weiteren Ausführungsform gemäß vorliegender Erfindung (Beispiel 2) in
einem synthetischen Minimalmedium (Zusammensetzung M6) mit zwei
Zulaufströmen ergibt sich das Bild, daß der Zulaufstrom (Zusammensetzung M7),
der die für das Wachstum notwendige Kohlenstoffquelle enthält, ein bezüglich der
Zeitachse stufenförmig variierenden Verlauf zeigt (Fig. 7), der dadurch
gekennzeichnet ist, daß Phasen einer höheren Belastung des Organismus eine
Ruhepause mit niedrigerer Belastung folgt, wodurch die Nebenproduktbildung
signifikant gesenkt werden kann.
Der Zulaufstrom (Zusammensetzung M8), der die für die Produktbildung
notwendige Kohlenstoffquelle enthält, weist ein Dosierprofil bezüglich der
Zeitachse auf, welches durch einen flachen stufenförmigen Anstieg noch während
der Wachstumsphase gekennzeichnet ist, wodurch starke Schaumbildung und
verringerte Produktausbeute durch Überbelastung der Zellen verhindert werden
kann (Fig. 8).
Bei einer Versuchsdurchführung entsprechend Beispiel 2 stellen sich die in der
Fig. 9 dargestellten Verläufe der wesentlichen Prozeßparameter ein.
Eine weitere erfindungsgemäße Verfahrensvariante zu Beispiel 2 ist dadurch
gekennzeichnet, daß dem synthetischen Startmedium mit der Zusammensetzung
M6 zwischen 0,5 und 5% Hefeextrakt zugesetzt werden, wobei die beiden
Zuläufe mit den Zusammensetzungen M7 und M8 entsprechend Beispiel 2
zudosiert werden.
Eine weitere erfindungsgemäße Verfahrensvariante zu Beispiel 2 ist dadurch
gekennzeichnet, daß 2 Zulaufströme Verwendung finden, wobei der Zulaufstrom,
der die für das Wachstum notwendige Kohlenstoffquelle enthält
(Zusammensetzung M7) mit einem Zusatz von 5 bis 15% Hefeextrakt und der
Zulaufstrom, der die für die Produktbildung notwendige Kohlenstoffquelle enthält
(Zusammensetzung M8) mit einem Zusatz von 5 bis 30% Trypton versetzt ist.
Eine weitere erfindungsgemäße Verfahrensvariante zu Beispiel 2 ist dadurch
gekennzeichnet, daß 2 Zulaufströme Verwendung finden, wobei der Zulaufstrom,
der die für das Wachstum limitierende Kohlenstoffquelle (Zusammensetzung M7)
und der Zulaufstrom, der die für die Produktbildung notwendigen Nährstoffe mit
Ausnahme der Kohlenstoffquelle enthält (Zusammensetzung M9), entsprechend
Beispiel 2 zudosiert werden, während die für die Produktbildung notwendige
Kohlenstoffquelle bereits dem Startansatz der Fermentation in optimaler
Konzentration zugemischt wird.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Verfahrensvariante zu Beispiel 2 wird die
für die Produktbildung erforderliche Kohlenstoffquelle ebenfalls dem Startmedium
der Fermentation zugesetzt, während dem Zulaufstrom, der die für das Wachstum
erforderliche Kohlenstoffquelle enthält (Zusammensetzung M7) ein Zusatz von 5
bis 15% Hefeextrakt und dem Zulaufstrom, der die für die Produktbildung
erforderlichen Nährmedienbestandteile mit Ausnahme der Kohlenstoffquelle
enthält (Zusammensetzung M9) ein Zusatz von 5 bis 30% Trypton zugesetzt
wird.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahrensstrategien gegenüber Verfahren
entsprechend dem Stand der Technik mit nur einem Zulaufstrom während der
Wachstumsphase und intensiver Induktion der rekombinanten Enzymsynthese
am Ende der exponentiellen Wachstumsphase und nach vollständigem
Verbrauch der für das Wachstum notwendigen Kohlenstoffquelle ist die
signifikante Steigerung der Produktivität der Mikroorganismen, besonders in
Hinsicht auf Esterasen.
Ein Vergleich der volumenbezogenen Produktivitäten der erfindungsgemäßen
Verfahrensstrategien gegenüber der konventionellen Vorgangsweise führte im
Falle des komplexen Nährmediums (Beispiel 1) zu einer Verbesserung von 3,0
mg/L.h auf 57,0 mg/L.h.
Im synthetischen Minimalmedium (Beispiel 2) konnte die volumenbezogene
Produktivität von 3,0 mg/L.h auf 13,0 mg/L.h gesteigert werden.
Auch die Reaktorleistung zeigt im Falle des komplexen Nährmediums eine
Erhöhung von 0,036 g/h auf 0,623 g/h und im Falle des synthetischen
Minimalmediums eine Erhöhung von 0,036 g/h auf 0,104 g/h gegenüber der
konventionellen Verfahrensführung.
Die Einsatzmöglichkeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß der
vorliegenden Erfindung werden nachfolgend anhand von 2 Beispielen erläutert.
Dabei zeigt:
Fig. 1 Zeitlicher Verlauf der Dosierrate des Zulaufstromes, der die für das
Wachstum notwendige Kohlenstoffquelle enthält, während der
bevorzugten Ausführungsform in Beispiel 1.
Fig. 2 Zeitlicher Verlauf der Dosierrate des Zulaufstromes, der die für die
Produktbildung notwendigen Nährstoffe mit Ausnahme der
Kohlenstoffquelle enthält, während der bevorzugten Ausführungsform in
Beispiel 1.
Fig. 3 Zeitlicher Verlauf der Dosierrate des Zulaufstromes, der die für die
Produktbildung notwendige Kohlenstoffquelle enthält, während der
bevorzugten Ausführungsform in Beispiel 1.
Fig. 4 Verläufe der wesentlichen Prozeßparameter während der bevorzugten
Ausführungsform in Beispiel 1.
Fig. 5 Zeitlicher Verlauf der Dosierrate des Zulaufstromes, der die für die
Produktbildung notwendige Kohlenstoffquelle enthält, während einer
erfindungsgemäßen Verfahrensvariante der bevorzugten
Ausführungsform in Beispiel 1.
Fig. 6 Zeitlicher Verlauf der Dosierrate des Zulaufstromes, der die für die
Produktbildung notwendigen Nährstoffe mit Ausnahme der
Kohlenstoffquelle enthält, während einer erfindungsgemäßen
Verfahrensvariante der bevorzugten Ausführungsform in Beispiel 1.
Fig. 7 Zeitlicher Verlauf der Dosierrate des Zulaufstromes während Beispiel 2, der
die für das Wachstum notwendige Kohlenstoffquelle enthält.
Fig. 8 Zeitlicher Verlauf der Dosierrate des Zulaufstromes während Beispiel 2, der
die für die Produktbildung notwendige Kohlenstoffquelle enthält.
Fig. 9 Verläufe der wesentlichen Prozeßparameter während der in Beispiel 2
beschriebenen Ausführungsform.
Dieser Prozeßablauf erläutert die Verfahrensführung einer Fermentation zur
Produktion einer Esterase mit besonders hoher Reaktorleistung in einem
komplexen Nährmedium:
In zwei Propagationsstufen wird der Stamm Escherichia coli BL21 zu 0,5 Liter Inokulum herangezüchtet. Dazu wird jeweils das Anzuchtmedium M1 verwendet. Die Vorkulturen werden auf einen pH-Wert von 6,8 mit steriler NaOH eingestellt und nach einer jeweiligen 15-stündigen Anzucht bei 30°C, 65% relative Luftfeuchte und einer Schüttlerdrehzahl von 145 rpm geerntet. Mit dem so gewonnenen Inokulum wird der Hauptfermenter, welcher 5,0 Liter des Mediums M1 enthält, derart beimpft, daß sich eine optische Dichte von OD 1,0 bei einer Wellenlänge von 500 nm ergibt.
In zwei Propagationsstufen wird der Stamm Escherichia coli BL21 zu 0,5 Liter Inokulum herangezüchtet. Dazu wird jeweils das Anzuchtmedium M1 verwendet. Die Vorkulturen werden auf einen pH-Wert von 6,8 mit steriler NaOH eingestellt und nach einer jeweiligen 15-stündigen Anzucht bei 30°C, 65% relative Luftfeuchte und einer Schüttlerdrehzahl von 145 rpm geerntet. Mit dem so gewonnenen Inokulum wird der Hauptfermenter, welcher 5,0 Liter des Mediums M1 enthält, derart beimpft, daß sich eine optische Dichte von OD 1,0 bei einer Wellenlänge von 500 nm ergibt.
Das verwendete Medium M1 besteht aus 10,0 g/l Glucose-Monohydrat, 46,7 g/l
Hefeextrakt, 12,3 g/l Casaminosäuren, 8,0 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 8,4 g/l
Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 4,0 g/l Natriumchlorid und 0,25 ml/l
Fermentationsmedium Polypropylenglykol 2000 als Antischaummittelzusatz.
Die Hauptkultur wird bei einer Temperatur von 30°C, einem pH-Wert von 6,8,
einer Drehzahl von 800 rpm und einer Belüftungsrate von 0,7 vvm Luft mit
steigendem zusätzlichen Anteil an reinem Sauerstoff (bis 0,5 vvm), so daß sich ein
pO2-Wert stets < 50% der Sättigungskonzentration einstellt, bis zum Erreichen
einer optischen Dichte von OD 40 geführt.
Dann erfolgt der Start der Zuläufe mit den Zusammensetzungen M2 und M3, ohne
daß dabei die Temperatur oder der pH-Wert verändert werden. Diese
Zufütterungsmedien werden wie in den Fig. 1 und Fig. 2 dargestellt zudosiert.
Dabei besteht das Zufütterungsmedium M2 ("Glucosedosierung") aus einer
Lösung von 285,7 g/l Glucose-Monohydrat und 70,5 g/l Magnesium
sulfat-Heptahydrat und das Zufütterungsmedium M3 ("Nährstoffdosierung für die
Produktbildung") aus einer Lösung von 194,8 g/l Trypton und 77,9 g/l
Dinatriumhydrogenphosphat.
Beim Erreichen einer optischen Dichte von OD 100 wird der Zulauf M4, noch
während der exponentiellen Wachstumsphase, entsprechend dem in Fig. 3
dargestellten Dosierprofil gestartet.
Dieser Zulauf mit der Zusammensetzung M4 besteht aus einer Lösung von 360 g/l
Lactose-Monohydrat.
Gleichzeitig mit dem Start dieses Zufütterungsmediums wird der pH-Wert des
Mediums auf 7,0 und die Temperatur durch einen Temperaturshift auf den für die
Produktbildung optimalen Wert von 27,6°C eingeregelt.
Bei einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante wird der Zulaufstrom, der die für
die Produktbildung notwendige Kohlenstoffquelle enthält beim Erreichen einer
optischen Dichte von 120 in Form eines intermittierenden Dosierprofiles zudosiert,
wobei nach jeder Zugabe eine Pause von 1 Stunde eingehalten und die Dauer der
Pulse jeweils halbiert wurde.
Bei einer weiteren erfindungsgemäßen Verfahrensvariante werden die
Zulaufströme entsprechend Beispiel 1 zudosiert, mit dem Unterschied, daß der
Zulaufstrom, der die für die Produktbildung mit Ausnahme der Kohlenstoffquelle
notwendigen Nährstoffe enthält (Zusammensetzung M3) mit einem Zusatz von 5
bis 15% Hefeextrakt versehen ist.
Bei einer weiteren erfindungsgemäßen Verfahrensvariante werden die
Zulaufströme entsprechend Beispiel 1 zudosiert, mit dem Unterschied, daß der
Zulaufstrom, der die für das Wachstum notwendige Kohlenstoffquelle enthält
(Zusammensetzung M2) mit einem Zusatz von 5 bis 15% Hefeextrakt versehen
ist.
Bei einer weiteren erfindungsgemäßen Verfahrensvariante werden die
Zulaufströme, der für das Wachstum notwendigen Kohlenstoffquelle und der für
die Produktbildung notwendigen Nähstoffe entsprechend Beispiel 1 zudosiert. Die
Dosierung des Zulaufstromes, der die für die Produktbildung notwendige
Kohlenstoffquelle enthält, besteht aus einer Lösung der Zusammensetzung M8
und wird in analoger Art und Weise wie in Beispiel 1 beschrieben zudosiert.
Bei einer weiteren erfindungsgemäßen Verfahrensvariante werden die
Zulaufströme, der für das Wachstum notwendigen Kohlenstoffquelle und der für
die Produktbildung notwendigen Nährstoffe entsprechend Beispiel 1 zudosiert,
wobei der Zulaufstrom, der die für die Produktbildung notwendigen Nährstoffe
enthält, kein Trypton enthält. Die Dosierung des Zulaufstromes, der die für die
Produktbildung notwendige Kohlenstoffquelle enthält, besteht aus einer Lösung
der Zusammensetzung M8 mit Zusätzen zwischen 5 und 30% Trypton und wird
analog zu Beispiel 1 zudosiert.
Dieser Prozeßablauf erläutert die Prozeßführung einer Fermentation zur
Produktion von Esterasen in einem synthetischen Minimalmedium mit zwei
Zulaufströmen:
In zwei Propagationsstufen wird der Stamm Escherichia coli BL21 zu 1,0 l Inokulum in einem Nährmedium der Zusammensetzung M6 herangezüchtet. Die Vorkulturen werden auf einen pH-Wert von 6,1 mit steriler NaOH eingestellt und nach einer jeweiligen 15-stündigen Anzucht bei 30°C, 65% relative Luftfeuchte und einer Schüttlerdrehzahl von 150 rpm geerntet. Mit dem so gewonnenen Inokulum wird der Hauptfermenter, welcher 5,0 Liter des Mediums M6 enthält, derart beimpft, daß sich eine optische Dichte von OD 1,0 bei einer Wellenlänge von 500 nm ergibt.
In zwei Propagationsstufen wird der Stamm Escherichia coli BL21 zu 1,0 l Inokulum in einem Nährmedium der Zusammensetzung M6 herangezüchtet. Die Vorkulturen werden auf einen pH-Wert von 6,1 mit steriler NaOH eingestellt und nach einer jeweiligen 15-stündigen Anzucht bei 30°C, 65% relative Luftfeuchte und einer Schüttlerdrehzahl von 150 rpm geerntet. Mit dem so gewonnenen Inokulum wird der Hauptfermenter, welcher 5,0 Liter des Mediums M6 enthält, derart beimpft, daß sich eine optische Dichte von OD 1,0 bei einer Wellenlänge von 500 nm ergibt.
Das Anzuchtmedium M6 besteht aus 15,0 g/l Glucose-Monohydrat, 12,7 g/l
Ammoniumchlorid, 9,0 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 3,7 g/l
Dinatriumhydrogenphosphat, 1,3 g/l Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 81 mg/l
Eisen(III)-Citrat-Monohydrat, 52 mg/l Zinksulfat-Heptahydrat, 11 mg/l
Thiamin-Hydrochlorid und 0,25 ml/l Fermentationsmedium Polypropylenglykol 2000 als
Antischaummittelzusatz.
Die Hauptkultur wird bei einer Temperatur von 30°C, einem pH-Wert von 6,1,
einer Drehzahl von 800 rpm und einer Belüftungsrate von 0,7 vvm Luft mit
steigendem zusätzlichen Anteil an reinem Sauerstoff (bis 0,5 vvm), so daß sich ein
pO2-Wert stets < 50% der Sättigungskonzentration einstellt, bis zum Erreichen
einer optischen Dichte von OD 10 geführt.
Dann erfolgt der Start des Zulaufes mit der Zusammensetzung M7, der die für das
Wachstum notwendige Kohlenstoffquelle enthält, ohne daß dabei die Temperatur
oder der pH-Wert der Kultur verändert werden.
Dieses Zufütterungsmedium wird wie in Fig. 7 dargestellt zudosiert.
Dabei besteht das Zufütterungsmedium M7 ("Glucosedosierung") aus einer
Lösung von 300 g/l Glucose-Monohydrat, 44,9 g/l Kaliumdihydrogenphosphat,
18,5 g/l Dinatriumhydrogenphosphat, 13,1 g/l Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 0,41
g/l Eisen(III)-Citrat-Monohydrat, 0,26 g/l Zinksulfat-Heptahydrat und 0,11 g/l
Thiamin-Hydrochlorid.
Beim Erreichen einer optischen Dichte von OD 20 wird der Zulauf, der die für die
Produktbildung notwendige Kohlenstoffquelle und andere Nährstoffe in adäquaten
Verhältnissen enthält, entsprechend dem Dosierprofil in Fig. 8 zudosiert.
Gleichzeitig mit dem Start dieses Zulaufstromes wird die Temperatur durch einen
Temperaturshift auf den für die Produktbildung optimalen Wert von 27,6°C
eingeregelt.
Dieser Zulauf mit der Zusammensetzung M8 ("Lactosedosierung") besteht aus
einer Lösung von 350 g/l Lactose-Monohydrat, 0,48 g/l des Dinatriumsalzes der
Ethylendiamintetraessigsäure, 2,48 g/l Zitronensäure-Monohydrat, 0,18 g/l
Borsäure, 0,48 g/l Kobaltdichlorid und 0,27 g/l Mangandichlorid-Dihydrat.
Bei einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante unterscheidet sich das
Startmedium des Fermentationsansatzes vom Medium mit der Zusammensetzung
M6 nur durch einen Zusatz von 0,5 bis 5% Hefeextrakt.
Bei einer weiteren erfindungsgemäßen Verfahrensvariante unterscheidet sich das
Zulaufmedium, das die für das Wachstum notwendige Kohlenstoffquelle enthält
(Zusammensetzung M7) durch den Zusatz von 5 bis 15% Hefeextrakt. Der
Zulaufstrom, der die für die Produktbildung notwendige Kohlenstoffquelle enthält
(Zusammensetzung M8) enthält Zusätze zwischen 5 und 30% Trypton.
Es findet sich eine volumetrische Produktivitätssteigerung von 1900% im Falle des
komplexen Nährmediums aus Beispiel 1 und 433% im Falle des definierten
Mediums aus Beispiel 2 (aus der Berechnung 57,0 : 3,0 bzw. 13,0 : 3,0).
Die füllgradunabhängige Berechnung führt zu einer Leistungssteigerung des
Reaktors um 1711% im Falle des Beispieles 1 und 286% im Falle des Beispieles
2 (aus der Berechnung 622,8 : 36,4 bzw. 104,0 : 36,4).
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Esterasen durch Fermentation
rekombinanter Mikroorganismen,
dadurch gekennzeichnet, daß die für das Wachstum der Mikroorganismen notwendige
Kohlenstoffquelle zunächst batchweise verbraucht wird und in der Mitte der sich
ausbildenden exponentiellen Wachstumsphase eine stufenförmige Zudosierung der
Kohlenstoffquelle erfolgt, wobei die Dosierrate in Abhängigkeit von der
Biomassekonzentration in zwei bis vier Schritten jeweils um 50 bis 25% des
Höchstwertes zu steigern ist, und daß die Zudosierung der für die Produktbildung
notwendigen Nährmedienbestandteile des komplexen Mediums separat in Form eines
Rechteckprofiles erfolgt, wobei der Dosierbeginn ebenfalls bereits im Bereich der Mitte
der exponentiellen Wachstumsphase zu legen ist, während die für die Produktbildung
notwendige Kohlenstoffquelle getrennt davon zum Ende der exponentiellen
Wachstumsphase bei einer Restkonzentration der für das Wachstum notwendigen
Kohlenstoffquelle zwischen 5 und 100% der Ausgangskonzentration mit einem
stufenförmig jeweils sich in der Dosierrate verdoppelnden Profil erfolgt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die komplexen Medien
durch synthetische Minimalmedien ersetzt werden.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das komplexe Medium
nur in der Wachstumsphase verwendet wird, während in der Produktbildungsphase
Minimalmedien mit und ohne einem Zusatz von 5 bis 30% Trypton zudosiert werden.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für die
Produktbildung notwendige Kohlenstoffquelle erst am Ende der exponentiellen
Wachstumsphase bei einer Restkonzentration der für das Wachstum notwendigen
Kohlenstoffquelle zwischen 1 und 20% der Ausgangskonzentration intermittierend im
Abstand von 0,5 bis 2 Stunden zudosiert wird, wobei die Dauer der Pulse mit der Zeit
entsprechend abnimmt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Wachstum
der Mikroorganismen notwendige Kohlenstoffquelle ab der Mitte der exponentiellen
Wachstumsphase intermittierend im Abstand von 0,5 bis 2 Stunden zudosiert wird,
während die Zudosierung der für die Produktbildung notwendigen Kohlenstoffquelle
bei einer Restkonzentration der für das Wachstum notwendigen Kohlenstoffquelle
zwischen 5 und 100% der Ausgangskonzentration am Ende der exponentiellen
Wachstumsphase stufenförmig zu- und abnehmend erfolgt, wodurch sich ein
bezüglich der Zeitachse stufenförmig zu- und abnehmendes Dosierratenprofil ergibt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für die
Produktbildung notwendige Kohlenstoffquelle dem Startansatz in optimaler
Konzentration zwischen 5 und 15% zugesetzt wird, während die Zuläufe
entsprechend den Ansprüchen 1 bis 5 zudosiert werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1997143077 DE19743077A1 (de) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | Verfahren zur Produktion von Esterasen durch Fermentation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1997143077 DE19743077A1 (de) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | Verfahren zur Produktion von Esterasen durch Fermentation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19743077A1 true DE19743077A1 (de) | 1999-04-01 |
Family
ID=7844063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1997143077 Withdrawn DE19743077A1 (de) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | Verfahren zur Produktion von Esterasen durch Fermentation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19743077A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10011728A1 (de) * | 2000-03-10 | 2001-09-27 | Andreas Schmid | Verfahren zur Leistungssteigerung mikrobieller Systeme |
-
1997
- 1997-09-30 DE DE1997143077 patent/DE19743077A1/de not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10011728A1 (de) * | 2000-03-10 | 2001-09-27 | Andreas Schmid | Verfahren zur Leistungssteigerung mikrobieller Systeme |
| DE10011728B4 (de) * | 2000-03-10 | 2005-02-10 | Andreas Schmid | Verfahren zur Leistungssteigerung mikrobieller Systeme |
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| 8128 | New person/name/address of the agent |
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