DD144792A1

DD144792A1 - Verfahren zur herstellung von zitronensaeure durch hefen

Info

Publication number: DD144792A1
Application number: DD21417079A
Authority: DD
Inventors: Erika Weissbrodt; Ulrich Behrens; Ulrich Stottmeister
Original assignee: Erika Weissbrodt; Ulrich Behrens; Ulrich Stottmeister
Priority date: 1979-07-06
Filing date: 1979-07-06
Publication date: 1980-11-05

Abstract

Das Ziel der Erfindung besteht darin, bakterielle Infektionen, die bei dem pH-Optintum der Zitronensäure-Synthese von 5 bis 6 auftreten, zu beseitigen oder zu begrenzen. Erfindungsgemäß wird das Wachstum der Hefen in einem pH-Bereich zwischen 5 und 6 bevorzugt durch eine PufferSubstanz, wie z.B. CaCOß, gehalten, während er in der nachlogarithmischen Phase auf 2 bis 3 bevorzugt durch die Eigensäuerung für einen längeren Zeitraum gesenkt wird,· wodurch die weniger säuretoleranten Bakterien inaktiviert werden. Die Erfindung ist für die Herstellung von Zitronensäure mit Hefen anwendbar.

Description

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Titel :

Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Hefen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung gehört in das Gebiet .der mikrobiellen Produktsynthese, in die IPK V 12 D.

Die Erfindung kann genutzt v/erden, um bei der Herstellung •von Zitrat xmd/oder Isozitrat durch Hefen, unter aeroben, submersen Bedingungen aus verschiedenartigen Kohlenstoffquellen, wie Glukose, Saccharose, n-Alkanen, Äthanol oder Essigsäure nach diskontinuierlicher oder semikontinuier-Iieher Betriebsweise bakterielle Infektionen zu verringern oder zu vermeiden.

Bekannte technische Lösungen

Zitronensäure wird' seit über fünfzig Jahren durch oxidative Gärung des Pilzes Aspergillus niger aus saccharosehaltigen Lösungen, wie Melasse oder aus Glukoselösungen gewonnen. Seitdem es bekannt geworden ist, daß auch bestimmte Hefen Zitronensäure - meist zusammen mit Isozitronensäure' - in relativ großer'Menge unsscheidsn können und daß als Kohlenstoffquelle neben. Sacchariden auch Kohlenwasserstoffe, wie n-Alkane von einer Kettenlänge C..Q bis etwa C₂Q, Äthanol oder Essigsäure geeignet sind (Tabuchi, T. Tanaka, Y. Abe: J. Agr. Chem. Soc^ Jap. 43/, 154 (1969); Abe, M. Tabuchi, Y.: J. Agr. Chem. Soc. Jap. 44, 493 (1970), sind in zahlreichen Patenten unter-

schiedliche \Yege zur Herstellung von Zitronensäure mit Hefen beschrieben worden (DE-OS 2005848), (DE-OS 2028933), (DE-OS 2109094).

Besonders hohe Produktausbeuten wurden mit Stämmen der Hefeart Candida lipolytica erzielt (DE-OS 2050361; JA 72/24.152 29.IO.69/4.7.72). Aber auch über die Gewinnung leistungsfähiger Mutanten wurde berichtet, v/obei das Hauptziel die Unterdrückung der Isozitratsynthese ist (DE-OS 2264764, DE-OS 2521469).

Die Fermentation kann diskontinuierlich, semikontinuierlich oder auch kontinuierlich durchgeführt werden (DE-OS 236OO9I).

Typisch für den Verlauf einer diskontinuierlichen Zitronensäurefermentation ist die Trennung von Wachstums- und Produktbiljdungsphase. Produktbildung setzt erst ein, wenn das Wachstum zum Erliegen kommt, was allgemein durch Auszehren der N-Quelle erreicht wird.

Die Wachstumsphase dauert etwa 18 bis 24 Stunden, die' Produktionsphase bis zu 6 -bis 7 Tagen. Das pH-Optimum für das Wachstum liegt allgemein zwischen 4 und 5, pH-Werte bis hinunter zu 2,5 werden von Hefen häufig toleriert, ohne daß allerdings noch Wachstum auftritt (A,H, Cook: The Chemistry and Biology of Yeasts, S. 304, Academic press, Ne ν/ York, 1958).

Das pH-Optimum für die Produktbildung liegt zwischen pH und 6,5 (Nakanishi, T. et al·, J. Perm. Technol. 50, S 855 (1972)), obwohl ein Hefestamm beschrieben wurde, der bis hinunter zu einem pH-WerV von 2 noch produktiv bleibt (DE-OS 2134826).

Wird während der Produktionsphase der pH-Yiiert unter 4, auf etwa 3,5 gesenkt, tritt eine Verringerung der Zitronensäureakkumulation zugunsten von Polyolausscheidung ein.

Grundsätzlich wird unter aeroben, submersen Bedingungen bei Temperaturen um 30 ⁰C fermentiert. Der Nachteil der in üblicher Y/eise durchgeführten diskontinuierlichen und semikontinuierlichen Verfahren liegt in der Gefahr des Auswachsens bakterieller Infektionen. Durch die Notwendigkeit, die Stickstoffquelle · auszehren zu müssen, um den Stillstand des Wachstums zu erreichen, wird die nachlogarithmische Phase des Wachstums stark verlängert, so daß für schnellwüchsige bakterielle Infektionen die Gelegenheit einer starken Vermehrung gegeben ist. Besonders bei semikontinuierlichen Verfahren, wo nicht mit neu gezüchteten Kulturen angeimpft wird, sondern wo ein Rest der ausfermentierten Produktionskujltur im Permentor als Impflösung belassen wird_ (meist 1/10 des Füllvolumens), ist die Unterdrückung des Wachstums von PremdOrganismen - als solche kommen hier nur Bakterien in Betracht - von besonderer Bedeutung. Bei semikontinuierlicher Betriebsweise würde eine Infektion mit Premdorganismen den Abbruch der Fermentation erforderlich

Ziel der Erfindung '

Es ist daher das Ziel der vorliegenden Erfindung, Maßnahmen vorzuschlagenj die bei diskontinuierlichen oder semikontinuierlichen Verfahren das Auswachsen von Bakterien verhindern.

Merkmale der Erfindung

Erfindungsgemäß wird das Ziel dadurch erreicht, daß etwa bei Beendigung der logarithmischen ¥/achs turns phase der pH-Wert der Lösung gesenkt wird, wodurch die weniger säuretoleranten Bakterien im Wachstum gehemmt oder gar geschä-

digt werden. Zweckmäßigerweise wird die Senkung des ',··- pH-Wertes durch die physiologische Säuerung und durch die nachfolgende Eigensäuerung, bedingt durch die Ausscheidung von Zitronen- und Isozitronensäure, erreicht« Die Bestandteile des Nährmediums müssen daher so gewählt sein, daß die Pufferkapazität in der nachlogarithmisehen Phase so gering ist, daß eine Säuerung des Mediums nicht verhindert wird. Zweckmäßigerweise werden für die Gewährleistung des pH-Optimums für das Wachstum während, der logarithmischen Phase (pH 4) und für die Absenkung des pH-Wertes in der nachlogarithmiseheη Phase solche Verbindungen gewählt,· die essentielle Bestandteile des Währmediums sind und deren Wirkungsweise im Sinne der vorliegenden Erfindung keinerlei zusätzlicher Manipulationen bedarf. Solche Verbindungen sind z.B. Kalziumsalze, wie CaCO-. Eine bestimmte Menge an CaCO^ verhindert während des logarithmischen Wachstums das Absinken des pH-Wertes: die Menge muß aber so gewählt sein, daß in der nachlogari thmi sehen Phase der pH-Wert langsam fällt, jedoch in einem Bereich bleibt, der die Aktivität der Produktionshefen nicht gefährdet, Dieser Bereich liegt zwischen 2,0 und 3»5» Er kann jedoch bei besonders säuretoleranten Hefen noch tiefer liegen. Die vorzulegende Menge an Ca-Ionen wird von vielerlei Paktoren bestimmt, wie Menge der Biomasse, Maß der physiologischen Säuerung (das von den freisetzbaren Kationen der Bestandteile der TJährsalze abhängt), erwünschter End-pH-Wert u.a_e Durch experimenteile Untersuchungen läßt sich die vorzulegende Menge des Kalziumsalzes oder eines anderen im Sinne der Erfindung v/irkenden Salzes unschwer bestimmen, (z.B. 0,1 bis 0,5 %, bevorzugt 0,2 bis 0,3 %, bezogen auf 10 g Hefetrockensubstanz). Es ist durchaus im Sinne der Erfindung, auch durch Zugabe einer Säure den gewünschten pH-Wert einzustellen, wobei hierfür nicht nur Mineralsäuren, sondern

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auch die produzierten Säuren selbst oder andere organische Säuren dienen können. Die Phase des erniedrigten pH-Wertes beträgt ca. 0,5 bis10 Stunden,

An nachfolgendem Beispiel wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel;

Stamm: Candida lipolytica

Medium (für etwa 10 g/l Biomasse): NELCl 3,0 g; CaCO₃ 2,5 g; KH₂PO₄ 0,8 g; MgSO₄ 0,4 g; CuSO₄ . 5 H₃O 0,04 g; ZnCl₂ 0,018 g; MnSO₄ . 4 H₃O 0,03 g auf 1 1 wurden mit Leitungswasser aufgefüllt. Zu 1 1 Medium wurden I60 ml n-Alkane ("Parex, Cj₁ bis C₁Q, bevorzugt C₁₃ bis Cjg) gegeben

Das Medium wurde bei 120 ⁰C 30 min erhitzt, Nach dem Erkalten wurde auf 1 1 wäßrige Lösung T mg Thiamin-HCl, als wäßrige Lösung durch Filtration sterilisert, gegeben. Der pH-Wert liegt nach der Sterilisation bei 6,0. Kultivierung: In einen sterilisierten 200 1 Rührfermentor wurden I60 1 Medium unter aseptischen Bedingungen gefüllt und mit 10 1 einer 24 Stunden gewachsenen Kultur (Medium wie oben beschrieben, lediglich der Paraffinanteil auf 30 ml/1 reduziert) beimpft. Die Temperatur wurde bei 30 ⁰C (ί 1 ⁰C) gehalten. Der Luftdurchsatz betrug 10 m /h. Die logarithmische Phase des Wachstums war nach 12 Stunden beendet. Während dieser Zeit blieb der pH-Wert bei 6 bis 6,2 und fiel danach innerhalb von 12 Stunden auf 2₅3. Auf dieser Stufe wurde der pH-Wert .für weitere 4 Stunden belassen. Für eine- optimale Zitronen-Isozitronensäureausscheidung wurde der pH-Wert auf 5,5 gehoben und bei 5»2 durch 20% laOH-Lösung automatisch gehalten.

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Claims

Patentanspruch

Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Hefen aus verschiedenen Kohlenstoffquellen, wie Glukose, n-Alkane, Azetat und Äthanol, unter submersen, aeroben Bedingunger, nach diskontinuierlicher oder semikontinuierlicher Betriebsweise, dadurch gekennzeichnet, daß während des logarithmischen Wachstums der pH-Wert'durch eine Puffersubstanz, vorzugsweise CaCO₀ in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 %, bevorzugt 0,2 bis 0,3 %_t berechnet für 10 g Hefebiomasse als Trockensubstanz, im optimalen Bereich zwischen pH 5 und pH 6 gehalten wird und in der nachlogarithmisehen Phase des Wachstums der pH-Wert für einen Zeitraum zwischen 0,5 und 10'Stunden auf einen Bereich unter pH 4, vorzugsweise zwischen pH 2 und pH 3 abgesenkt wird»

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