CZ77497A3

CZ77497A3 - Process for preparing trans-hydroxysulfone

Info

Publication number: CZ77497A3
Application number: CZ97774A
Authority: CZ
Inventors: Michel M Chartrain; Lorraine G Katz; Steven A King
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1994-09-13
Filing date: 1995-09-08
Publication date: 1997-07-16
Also published as: RU2134296C1; UA42024C2; CZ289030B6; TW384310B; CN1162980A; CN1057796C; FI971035A0; SK31597A3; SK283028B6; WO1996008577A1; AU3464195A; US5474919A; FI971035A; BR9508921A

Description

(57) Anotace:

Řešení spočívá ve způsobu výroby transhydroxysulfonu obecného vzorce II, v němž obecné symboly mají význam, uvedený v hlavním nároku, postupuje se tak, že se pěstuje mikroorganismus Rhodotorula rubra, ATCC 74283 nebo Rhodotorula piliminae ATCC 32762 v živném prostředí, které obsahuje využitelný zdroj dusíku a uhlíku a jako substrát sulfoketon obecného vzorce III, v němž R² má význam, uvedený v hlavním nároku, za aerobních podmínek do nahromadění transhydroxysulfonu obecného vzorce II, který se pak izoluje.

Tí fl

*□ > í

W S <3 ¹ o - □ o

cn o

o

C/X u?·

L/Ί

-J

Způsob výroby trans-hydroxysulfonu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby trans-hydroxysulfonu biologickou přeměnou. Výsledná látka je vhodná pro lecení zvýšeného nitroocního tlaku.

Dosavadní stav techniky

Glaukotn je oční onemocnění, spojené se zvýšeným nitroočním tlakem, jehož hodnoty jsou příliš vysoké pro normámi funkci oka, takže může dojít k nevratné ztrátě zraku. 3ez léčení často dochází k oslepnutí. Zvýšený nitrooční t_ak, to znamená tlak, zvýšený na takové hodnoty, při nichž ještě nedochází k poškození očního nervu nebo k charakteristickým defektům zorného pole jako oři glaukomu je pravcepodobné nejčasnější fází glaukomu.

Z látek, účinných při snižování zvýšeného očního tlaku se zvláště užívají sulíonové deriváty obecného vzorce I

I a jejich diasteroeomery, jednotlivé enanciomery nebo jejich směsi nebo jejich oftalmologicky přijatelné soli, v nichž

A znamená atom uhlíku nebo dusíku, znamená skupinu NHR nebo -OR,

R znamená alkyl o 1 až 6 atomech uhlíku s přímým nebo rozvětveným řetězcem,

R'· znamená

a) alkyl o 1 až 5 atomech uhlíku s přímým nebo rozvětveným řetězcem, zvláště n-propyl nebo isobutyl,

b) alkenyl o 3 až 5 atomech uhlíku, zvláště allyl,

c) alkinyl o 3 až 5 atomech uhlíku, zvláště propargyl,

d) atom vodíku nebo

e) alkoxyalkyl o 1 až 4 atomech uhlíku v každé části a

X znamená skupinu -SOg- nebo -C(0)-, tyto látky jsou známé z US patentových spisů č. 4 794 ^13 a 5 157 129. Je známo, že při místním podání jsou tyto látky účinnými inhibitory anhydrázy kyseliny uhličité (TCA!) a je možno je použít při místním podání. Syntéza těchto látek zahrnuje redukci sulfoketonu na prekursor trans-hydroxysulfonu. Syntetické postupy však vedou k získání diastereomerních nebo racemických produktů, které je nutno od sebe oddělit, což znamená ztrátu nejméně 50 % produktu při získávání účinnějšího enanciomeru.

Vynález si klade za úkol navrhnout nový, výhodnější postup pro přeměnu sulfoketonu na transhydroxysulfon mikrobiologickým způsobem.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob výroby trans-hydroxysulfonu obecného vzorce II

OH

kde A a r! mají svrchu uvedený význam.

Tento transhydroxysulfon je prekursorem výsledného produktu svrchu uvedeného vzorce I. Postup spočívá ve fermentaci sulfoketonu jako substrátu v přítomnosti mikro organismu Rhodotorula rubra, ATCC 74283 nebo Rhodotorula piliminae, ATCC 32762, výhodný je zejména mikroorganismus Rhodotorula rubra. Biologická přeměna se provádí v submersní kultuře za aerobních podmínek ve vodném prostředí s obsahem uhlohydrátů a živin s obsahem dusíku při pH 4,5 až 8,0, s výhodou 6,0 do nahromadění sloučeniny obecného vzorce II.

Výsledný analog transhydroxysulfonu se získá v diastereomerním přebytku vyšším než 95 %. Klíčovým stupněm tohoto nového postupu, to znamená řízení diastereomerního přebytku hydroxysulfonu je řízení koncentrace zbývajícího sulfoketonu v reakčním prostředí.

Podstatu vynálezu tedy tvoří způsob výroby trans-hydroxysulfonu obecného vzorce II on

kde

A znamená atom uhlíku nebo dusíku a r! znamená

b)	alkenyl o 3	až 5	atomech uhlíku,	zvláště	allyl,
c)	alkinyi o 3	až 5	atomech uhlíku,	zvláště	propargyl
d)	atom vodíku	nebo
e)	alkoxyalkyl	o 1	až 4 atomech uhlíku v každé části,

tyto látky jsou prekursory sloučenin obecného vzorce I

I jejich jednotlivých diastereomerů, jednotlivých enanciomerů nebo jejich směsí nebo oftalmologicky přijatelných solí, v nichž

A znamená atom uhlíku nebo dusíku,

Z znamená skupinu -NHR nebo -0R,

R'· znamená

a)	alkyl o 1 až 5 atomech uhlíku s	přímým nebo roz-
větveným řetězcem	, zvláště n-pro	pyl nebo	isobutyl,
b)	alkenyl o 3 až 5	atomech uhlíku,	zvláště	allyl,
c)	alkinyl o 3 až 5	atomech uhlíku,	zvláště	prcpargyl,
d)	atom vodíku nebo

e) alkoxyalkyl o 1 až 4 atomech uhlíku v každé části a X znamená skupinu -SO^- nebo -C(0)-.

Při novém postupu podle vynálezu se provádí fermer.tace mikroorganismů Rhodotorula piliminae nebo Rhodotoruia rubra, s výhodou Rhodotorula rubra v příoomnosti substrátu, kterým je sloučenina obecného vzorce ITT, sulfoketon

kde R znamena

a) alkyl o 1 až 5 atomech uhlíku s přímým nebo rozvětveným řetězcem, zvláště n-prtpyl nebo isobutyl,

b) alkenyl o 3 až 5 atomech uhlíku, zvláště allyl,

c) alkinyl o 3 až 5 atomech uhlíku, zvláště propargyl,

d) atom vodíku nebo

e) alkoxyalkyl o 1 až 4 atomech uhlíku v každé části, v živném prostředí za aerobních podmínek do nahromadění sloučeniny obecného vzorce II, která se pak izoluje.

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se získává sloučenina obecného vzorce II

II kde

A znamená atom uhlíku nebo dusíku a _nl

R znamena

b) alkenyl o 3 až 5 atomech uhlíku, zvláště allyl,

c) alkinyl o 3 až 5 atomech uhlíku, zvláště propargyl,

d) atom vodíku nebo

e) alkoxyalkyl o 1 až a atomech uhlíku v každé části, která je prekurzorem sloučenin obecného vzorce I ^A·

I so₂nh₂ jejich jednotlivých diastereomeru, jednotlivých enancictnerů neoo jejich směsí nebo oftalmologícky přijatelných solí, v nichž

A znamená atom uhlíku nebo dusíku,

Σ znamená skupinu -NHR nebo -OR,

R znamená alkyl o 1 až 5 atomech uhlíku s přímým nebo rozvětveným řetězcem,

R~ znamená

a) alkyl o 1 až 5 atomech uhlíku s přímým nebo rtz-

	větveným ře	tězoem, zvláště n-propyl nebo	isobutyl,
	alkenyl o 3	až 5 atomech uhlíku, zvláště	allyl,
C /	alkinyl o 3	až 5 atomech uhlíku, zvláště	propargyl
f-i Ϊ /	atom vodíku	nebo
e)	aikoxyalkyl	o 1 až 4 atomech uhlíku v kaž	dé části

X znamená skupinu -SC^^- nebo -C(0)-_r tak, že se pěstuje mikroorganismus Rhodotorula rubra, ATCC 74 283 v živném prostředí, které obsahuje zdroje dusíku a uhlíku a substrát, sloučeninu obecného vzorce III

ΙΠ kde R“ znamena

a) alkyl o l'až 5 atomech uhlíku s přímým neoo rozvětveným řetězcem, zvláště n-crcpyi něco isobutyl

b) aikenyl o 3 až 5 atomech uhlíku, zvláště aliyl,

c) alkinyi o 3 až 5 atomech uhlíku, zvláště prccarg;

d) atom vodíku nebo

e) aikoxyalkyi o 1 až 4 atomech uhlíku v každé část:

za aerobních podmínek do nahromadění sloučeniny obecného vzorce II, která se pak izoluje, substrát se rozpustí v přibližně 1% až 15% (% objemová) ethanolu, methanolu nebo DMSO a použije se v množství 1 až 3 g/1, postup se provádí při teplotě 20 ař 50 °C a při pH 4,5 až 3,0.

Sloučeninu obecného vzorce III, která se užívá jako substrát, je možno syntetizovat následujícím způsobem, který slouží pouze jako jeden z možných příkladů syntézy.

Methyl-3(R)-hydroxyhexanoát

44,7 g, 310 mmol methyl-3-ketohexanoátu se zředí 75 ml methanolu a přidají se 2 ml 0,2 N KOI. Pak se přidá ještě 200 mg Et2NH₂+Ru2Cl5-(BINAP)2 a směs se zahřívá na °C při tlaku vodíku 0,7 MPa celkem 2 hodiny. Pak se přidá 100 ml toluenu a směs se odpaří na olej s hmotností 75g.

Methyl-3(R)-toluensulfonyloxyhexanoát

Roztok 310 mmol surového methyl-3(R)-hydroxyhexanoátu se rozpustí ve 100 ml pyridinu a přidá se 59 g, 310 mmol p-toluensulfonylchloridu. Směs se míchá 24 hodin při teplotě 5 °C a pak 16 hodin při teplotě 15 °C. Pak se pomalu v průběhu jedné hodiny přidá 5 ml vody k rozložení přebytečného reakčního činidla. Směs se vlije do 600 ml 20% toluenu v hexanu a pak se promyje 3 x 250 ml vody. Organická vrstva se odpaří, čímž se získá 83 g produktu ve formě oleje, čistota produktu je 95 %.

Methyl-3(S)-(2-thiofenrhiol)hexanoát

97,6 ml, 1,64 M roztoku n-butyllithia, celkem 160 mmol této látky se přidá k 15,1 g, 180 mmol thiofenu ve 100 ml THF při teplotě -20 °C. Směs se 30 minut míchá a pak se po částech přidá 5,23 g síry. Po jedné hodině se přidá ještě 100 ml formamidu, zbaveného kyslíku a pak ještě 40 g, 33,3 mmol methyl-3(R)-toluensulfonyloxyhexanoátu. Směs se míchá 24 hodiny při teplotě místnosti a pak se zředí 100 ml ethylacetátu a 50 ml vody. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se zpětně extrahuje 100 ml ethylacetátu. Organické fáze se spojí a odpaří na 23,9 g produktu ve formě žlutého oleje. Celkový výtěžek, vztaženo na použité množství methyl-3-ketohexanoátu byl 74 %.

5,6-dihydro-6(S)-(propy1)-4H-thieno/2,3-b/thiopyran-4-on

125 g, 513 mmol methyl-3(S)-(2-thiofenthio)hexanoátu se zahřívá 96 hodin na 100 °C spolu se 150 ml kyseliny octové a 150 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Pak se směs extrahuje 2 x 300 ml toluenu. Organické vrstvy se spojí, promyjí a odpaří na tmavěhnědý olej, který se rozpustí v 1200 ml toluenu. Roztok se zchladí na 0 °C a přidá se 126 g, 600 mmol anhydridu kyseliny trifluoroctové. Po 45 minutách se směs promyje 2 x 200 ml vody a odpaří, čímž se získá 151 g oleje, který se užije v následujícím stupni bez dalšího čištění.

5,6-dihydro-6(S)-(propyl)-4H-thieno/2,3-b/thiopyran-4-on-7,7-dioxid

4,25 g, 20 mmol 5,6-dihydro-6(S)-(3-propyl)-4H-thieno /2,3-b/thiopyran-4-onu se rozpustí v 80 ml ethylacetátu.

Pak se přidá 660 mg, 2 mmol wolframanu sodného, 8,2 ml, mmol 30% peroxidu vodíku a 10 kapek kyseliny sírové.

Po 24 hodinách se reakční směs zředí 100 ml ethylacetátu a promyje se 10% roztokem siřičitanu sodného a nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Organická vrstva se odpaří a rozetře se s ethanolem, čímž se ve výtěžku 95 % získá 4,5 g produktu.

Mikroorganismus

Biologicky čistý vzorek Rhodotorula piliminae se izoluje z hawajské larvy Drosophila piliminae. Organismus je běžně dostupný a byl uložen podle podmínek Budapešťské úmlu vy do stálé veřejné sbírky kultur American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland pod příjmovým číslem ATCC 32762. Biologicky čistý vzorek Rhodotorula rubra je dostupný pod příjmovým číslem ATCC 74283 v téže sbírce. Jakákoliv omezení přístupu k mikroorganismu budou odvolána po udělení patentu. Rhodotorula rubra ATCC 74283 byla izolována z kontaminované kyselé smetany.

V průběhu různých postupů byly použity následující analytické metody:

Měření biomasy

Biomasa byla měřena pomocí optické hustoty a sušiny buněk. Optická hustota byla měřena při použití diodového spektrometru (Hewlett Packard 8451A), nastaveného na 660nm Sušina buněk byla stanovena po oddělení buněk filtrem Millipore, typ HA s velikostí pórů 0,45 mikrometrů.

Glukosa

Glukosa byla stanovena kapalinovou chromatografií s klasickým počítačem Macintosh pro řízení postupu a ukládání získaných údajů, s detektorem indexu lomu, s automatickým vstřikovacím zařízením Al-2 Dynamax, analytickým čerpadlem HP, tlakovým modulem a sloupcem Biorad Aminex HPX-87H pro odstranění iontů s rozměrem 300 x 78 mm, sloupec byl zahříván na teplotu 50 °C. Jako eluční činidlo byl použit 0,005 M roztok kyseliny sírové, 0,7 ml/min.

Extrakce živného prostředí

Živné prostředí bylo extrahováno stejným objemem ethylacetátu. Směs byla uložena na 5 minut na třepací zařízení a pak odstředěna 10 minut při 2000 ot/min při použití odstředivky Beckman TJ-5. Výsledný supernatant byl vysušen a znovu uveden do suspenze v methanolu pro provedení chromatografie na tenké vrstvě nebo HPLC.

Chromatografie na tenké vrstvě

K provedení byly užity předem připravené plotny F254 ze silikagelu 50. Mobilní fáze obsahovala 94 % methylenchloridu, 5 % methanolu a 1 % hydroxidu amonného. Vzorky byly naneseny na plotnu a usušeny. Jedna hrana plotny byla ponořena do mobilní fáze a rozpouštědlo postupovalo směrem vzhůru po plotně až do vzdálenosti přibližně 2,5 cm pod horní hranou plotny.

Vysokotlaká kapalinová chromatografie

HPLC byla prováděna při použití systému Rainin, který byl opatřen klasickým počítačem Macintosh pro řízení a ukládání získaných údajů, detektorem absorbance Dynamax UV-M, automatickým vstřikovacím zařízením Al-2, dvěma analytickými čerpadly HP a tlakovým modulem se sloupcem Zorbax RX-C8 s rozměrem 4,6 x 250 nm při teplotě místnosti. Bylo použito dvou elučních činidel, a to methanolu a vody s 0,1 % objemovým kyseliny fosforečné při průtoku 1,5 ml/min, detekce UV při 254 nm. Bylo použito objemového gradientu methanolu a okyselené vody 30 : 70 až 70 : 30 v průběhu 15 minut. Nejprve byl udržován poměr 70 : 30 na 5 minut, načež byl postupně poměr obrácen na 30 : 70 a na této hodnotě byl udržován rovněž 5 minut. Při tomto postupu dochází k oddělení cis-hydroxysulfonu, trans-hydroxysulfonu a sulfoketonu, odpovídající doby retence pro tyto látky jsou 9,5, 10 a 12,8 minut.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Kultivační metody

Transhydroxysulfon je možno získat tak, že se pěstuje Rhodotorula rubra ATCC 74283 na sítech nebo v třepacích lahvích po naočkování ze šikmého agaru (Sabouraudův agar s dextrosou, D-ifco) nebo později ze zmrazené suspenze buněk v glycerolu, užije se 1 ml suspenze pro jednu Erlenmeyerovou baňku s objemem 250 ml a s obsahem 50 ml Sabouraudova bujónu s dextrosou. Toto živné prostředí se běž ně dodává a obsahuje 10 g/1 neopeptonu Difco a 20 g/1 dextrosy Bacto. Lahve se inkubují 24 hodin při teplotě 28 °C a protřepáváním 220 ot/min k získání dostatečného množství biomasy k dalšímu naočkování. Očkovací materiál se pak v množství 5 %, to znamená 25 ml přenese do Erlenmeyerovy baňky s objemem 2 litry a s obsahem 500 ml Sabourauóova bujónu s dextrosou. Pak se kultura inkubuje 42 hodin při teplotě 28 °C a míchání 188 ot/min. Buněčný materiál se pak odstředí, promyje se pufrem MES při pH 6,0 a pak se znovu uvede do suspenze v pufru MES o pH 6,0 před přidáním sulfoketonu.

Kultivace v zařízení Bioreactor se provádí ve fermentoru s obsahem 23 litrů, k naočkování se užijí 2 litry Sabouraudova bujónu s dextrosou s obsahem kmene Rhodotorula rubra ATCC 74283 po pěstování 42 hodin, jak bylo svrchu popsáno. Teplota při kultivaci je 28 °C, míchání při alespoň 200 ot/min, provzdušnění 10 litrů/min a tlak 0,001 MPa. Tlak rozpuštěného kyslíku byl řízen mícháním na nejméně 40 %>. Jakmile rychlost příjmu kyslíku, OUR poklesla pod 5 mmol/l/h, byly buňky izolovány za sterilních podmínek.

Parametry reakce

Optimální biologické přeměny je možno dosáhnout v případě, že se jako pufr v molární koncentraci 0,5 M užije kyselina 3-/N-morfolino/propansulfonová, MOPS, nebo kyselina 2-/N-morfolino/ethansulfonová, MES, při teplotě 20 až 40 °C a při pH 4,5 až 8,0, čímž je možno dosáhnout rychlosti biologické přeměny přibližně 0,011 g/g CDW/h až 0,150 g/g CDW/h. Teplotní rozmezí je 20 až 50 °C, s výhodou 30 až 35 °C. Použitelnými rozpouštědly pro rozpuštění sulfoketonu jako substrátu jsou ethanol, methanol nebo DMSO, s výhodou DMSO v koncentraci 1 až 15, s výhodou 1 až 3 % objemových. Množství substrátu je 1 až 3 g/1, s výhodou 1,5 g/1 k dosažení výtěžku 66 % trans-hydroxysulfonu s diastereomerním přebytkem 95 %. Buněčný materiál se pěstuje 16 až 60 hodin, s výhodou 40 až 60 hodin v závislosti na poklesu hodnoty OUR pod 5 mmol/l/h.

Biologická přeměna a izolace trans-hydroxysulfonu vzorce II (5,6-dihydro-4(S)-hydroxy-6(S)-propyl-4H-thieno/2,3-b/thiopyran-7,7-dioxidu)

Podíly 10 nebo 50 ml živného prostředí s obsahem buněk Rhodotorula rubra se odstředí 10 minut při 4000 ot/min při použití odstředivky Beckman TJ-6 a supernatant se slije. Usazenina buněk se znovu uvede do suspenze v 0,5 M kyseliny 2-/N-morfolino/ethansulfonové, MES, jako pufru při pH 6,0 a pak se materiál znovu odstředí. Promytý buněčný materiál se znovu uvede do suspenze v 50 ml pufru MES. V případě potřeby se materiál zředí pro snadnější analýzu reakční rychlostí při biologické přeměně. Pak se do lahví, které obsahují promyté buňky přidá surový sulfoketon s čistotou 56 %, což odpovídá 1 g/1 čistého sulfoketonu v 3% ethanolu (% objemová). Lahve se inkubuji ve vodní lázni při teplotě 32,5 °C za stálého třepání. Pak se živné prostředí extrahuje chloroformem v objemovém poměru 1 : 1 nebo stejným množstvím ethylacetátu, materiál se vysuší a uvede do suspenze v methanolu. Pak se provádí analýza chromatografií na tenké vrstvě a pomocí HPLC. Doby retence pro transhydroxysulfon, cis-hydroxysulfon a sulfoketon při provádění HPLC jsou 9,5, 10,0 a 12,8.

^H-NMR pro transhydroxysulf on (250 MHz, CDCl^) :

7,58 (d, J = 5,1 Hz, IH), 7,08 (d, J = 5,1 Hz, IH), 4,94 (t, J = 3,6 Hz, IH), 3,66 (m, IH), 2,6 - 2,1 (m, 3H),

1,7 - 1,5 (m, 3H), 1,01 (t, J = 7,01, 3H).

Při pěstování v zařízení Bioreactor se buněčný materiál izoluje po poklesu hodnoty OUR pod 5 mmol/l/h a pak se odstředí a promyje 0,5 M MES pufru o pH 6,0. Pak se buňky znovu uvedou do suspenze v tomtéž pufru a vrátí do fermentačního zařízení. Fermentor se pak pro biologickou přeměnu nastaví na teplotu 32,5 °C, míchání 400 ot/min provzdušnění 6 1/min a zpětný tlak 0,005 MPa. 1,5 g/1 sulfoketonu se rozpustí v DMSO a přidá do fermentoru (3 % objemová). Vzorky se periodicky odebírají a sleduje se biologická přeměna pomocí HPLC. Při izolaci buněk bylo dosaženo tímto způsobem rychlosti biologické přeměny 1,14 g/l/h nebo 0,126 g/g CDW/h a výtěžku trans-hydroxysulfonu 1,04 g/1 při diastereomerním přebytku 96,4 %.

Živné prostředí bylo extrahováno ethylacetátem v objemovém poměru 0,5 : 1 a rozpouštědlo bylo odpařeno na rotačním odpařovači.

Příklad 2

Biologická přeměna trans-hydroxysulfonu (5,6-dihydro-4(S)-hydroxy-6(S)-methyl-4H~thieno-/2,3-b/thiopyran-7,7-dioxidu)

Kultura buněk kmene ATCC 74283 ze šikmého Sabouraudova agaru s dextrosou, uchovávaného při 4 °C byla užita k naočkování Erlenmeyerovy baňky s objemem 250 ml a s obsahem 50 ml Sabouraudova bujónu s dextrosou. Po inkubaci 20 hodin při teplotě 28 °C za protřepávání se ketosulfon, rozpuštěný v ethanolu (33,3 mg/ml) přidá do lahví v množství 1 ml na láhev. Kultury se pěstují ještě 24 hodin za stejných podmínek inkubace. Zbývající ketosulfon a připravený hydroxysulfon se extrahují z bujónu stejným objemem chloroformu. Analýza pomocí TLC a HPLC prokázala úplnou přeměnu sulfoketonu na trans-hydroxysulfon. Analýza NMR potvrdila strukturu trans-hydroxysulfonu:

7,6- (d, IH, C₂-H) 3,8 (m, IH, C_g-H), C₅-H), 2,4 (m, IH,

7,1 (d, 1-H, C₃H), 4,9 (m, IH, C₄~H),

3,5 - 3,0 (br s, IH, OH), 2,6 (m, IH,

C.-H), 1,5 (d, 3H, C.-CH-).

Oj

Příklad 3

Příklad způsobu výroby sloučenin obecného vzorce I (5,6-dihydro-6(S)-propyl-4(S)-1-ethylamino-4H-thieno/2,3-b/-thiopyran-2-sulfonamid-7,7-dioxidu)

Stupeň 1:

7,32 g, 29,7 mmol trans-hydroxysulfonu se uvede do suspenze ve 38 ml acetonitrilu v lahvi s okrouhlým dnem s objemem 100 ml, opatřené magnetickým míchadlem, termočlánkem a přívodem pro dusík. Roztok se zchladí na 0 °C a po částech se přidá 5 ml, 88,7 mmol kyseliny sírové. Pak se reakční směs míchá při teplotě místnosti, načež se zchladí na 0 až 5 °C. Do baňky s objemem 500 ml se vloží 34 ml vody a 43 ml acetonitrilu, směs se zchladí na teplotu 0 až 5 °C a dobře promíchá. Pak se do baňky přidá ještě svrchu připravená reakční směs opatrně po částech tak, aby teplota zůstávala pod 5 °C. Pak se přidá ještě 30 ml nasyceného roztoku uhličitanu draselného, roztok se přidává tak dlouho, až se dosáhne pH vodné vrstvy v rozmezí 7 až 8 nebo až se přestane vyvíjet oxid uhličitý. Pak se organická vrstva odpaří' na 14,1 g surového olejovitého materiálu. Ve výtěžku 73 % se získá 5,99 g produktu. Čistota surového olejovitého materiálu byla 42,5 % hmotnostních.

Stupeň 2

Do baňky s okrouhlým dnem s objemem 100 ml, opatřené magnetickým míchadlem a termočlánkem se vloží 13,14 ml kyseliny chlorsulfonové a kyselina se zchladí na teplotu 0 až 5 °C. Pak se po částech v průběhu 30 minut přidá 6,57 g acetamidosulfonu tak, aby vnitřní teplota směsi zůstala pod 15 °C. Tmavě zbarvená reakční směs se pak zahřívá 16 hodin na teplotu 33 °C a pak ještě 5 hodin na teplotu 50 °C. Jakmile se při analýze HPLC prokáže, že zbývá méně než 0,5 % acetamidosulfonu (vztaženo na kyselinu sulfonovou a sulfonylchlorid), směs se zchladí na teplotu místnosti. Pak se po kapkách přidá 13,14 ml thionylchloridu. Po skončeném přidávání se teplota směsi zvýší na 45 °C. Po 16 hodinách zbývá méně než 0,5 % plochy pod křivkou pro kyselinu sulfonovou. Směs se zchladí na 0 až 5 °C. Do baňky s objemem 1 litr se vloží 325 ml vody a baňka se zchladí na 0 °C. Chlorační směs se pak přidá vá po kapkách v průběhu 30 minut k dobře míchanému roztoku tak, aby vnitřní teplota směsi zůstávala nižší než 5 °C

Směs se míchá ještě 45 minut a pak se zfiltruje. Vlhký filtrační koláč se promyje 10 ml chladné vody a pak se suší v proudu dusíku. Do baňky s objemem 250 ml s magnetickým míchadlem a termočlánkem se vloží 24 ml vodného amoniaku a 43 ml THF. Směs se zchladí na -10 °C a pak se přidá surový vlhký pevný sulfonylchlorid po částech v průběhu jedné hodiny tak, aby vnitřní teplota směsi byla udržována pod 0 °C. Po 2 hodinách zbývá méně než 1,8 % sulfonylchloridu. Přebytek amoniaku se neutralizuje 50 ml vodné kyseliny chlorovodíkové. Vodná vrstva se dvakrát promyje THF. Extrakty se spojí a odpaří. Získaný materiál se znovu uvede do suspenze v THF a opatrně se přidá voda. Vytvoří se hnědé krystalky ve žlutém vodném roztoku. Směs se zfiltruje a krystalky se usuší ve vakuu. Ve výtěžku 66 % se získá 5,58 g acetamidosulfonamidu.

Stupeň 3

4,21 g, 11,5 mmol acetamidosulfonamidu se vysuší destilací s 2 x 100 ml THF v baňce s objemem 250 ml, opatře né magnetickým míchadlem, termočlánkem a přívodem pro dusík. Suspenze acetamidosulfonamidu ve 22,5 ml tetrahydrofuranu se pak zchladí na teplotu 0 až 5 °C. Pak se k suspenzi po kapkách v průběhu 45 minut přidá 51 ml, 51 mmol komplexu boranu a tetrahydrofuranu, přičemž vnitřní teplota směsi se udržuje na hodnotě nižší než 5 °C. Jakmile se přestane vyvíjet vodík, což trvá přibližně 20 minut, zahřeje se vzniklý roztok na teplotu v rozmezí 30 až 35 °C. Po ukončení reakce, přibližně po 3 hodinách se reakční směs zchladí na teplotu místnosti. Do baňky s okrouhlým dnem s objemem 250 ml, opatřené magnetickým míchadlem, termočlánkem a přívodem pro dusík se vloží 60 ml kyseliny sírové a obsah baňky se zchladí na teplotu 0 až 5 °C. Reakční směs se pak opatrně po částech přidává do energicky míchaného roztoku kyseliny tak, aby vnitřní teplota směsi byla udržována pod 20 °C. Po skončeném přidávání se směs míchá při teplotě místnosti tak dlouho, až se přestane vyvíjet vodík. Pak se obsah baňky destiluje za atmosférického tlaku a směs se odpařuje tak dlouho, až je její vnitřní teplota vyšší než 97 °C. Po ukončení destilace se směs zchladí na 20 °C. Pak se směs neutralizuje vodným roztokem hydrogenuhličitanu draselného a extrahuje 100 ml ethylacetátu. Organická vrstva se odpaří, čímž se získá 3,45 g 5,6-dihydro-6(S)-propyl-4(S)-1-ethylamino-4H-thieno-/2,3-b/-thiopyran-2-sulfonamid-7,7-duoxidu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby trans-hydroxysulfonu obecného vzorce II kd= znamena atom uhiixu něco ouszxu a znamena a' alkyl o 1 až č atomech uhlíku s přímým nebe rozvětveným řetězcem, zvláště n-prccyi něco isobutyl, b' alkenyl c 2 až 5 atomech uhlíku, zvláště allyl, o; alkinyl c 2 až 5 atomech uhlíku, zvláště prcpargyl, a! atom voczxu něco alkoxyalkyl o i až 4 atomech uhlíku v každé části, vyznačující se tím, že se pěstuje mikroorganismus Rhodotorula rubra ATCC 74283 nebo Rhodotorula piliminae ATCC 32762 v živném prostředí, které obsahuje využitelné zdroje dusíku a uhlíku a substrát, sulfoketon obecného vzorce III r^{4 * 6}· i k kde R“ znamená

a) alkyl o 1 až 5 atomech uhlíku s přímým neoo rozvětveným řetězcem, zvláště n—propyl nebe isobutyl,

b) aikenyl c 3 až 5 atomech uhlíku, zvláště aliyl,

c) alkinyi o 3 až 5 atomech uhlíku, zvláště propargyi,

d) atom vedíku nebo

e) aikoxyalkyi o 1 až - atomech uhlíku v každé části, v živném prostředí za aerobních podmínek dc nahromadění sioučenir.v obecného vzorce 11, která se pak izoluje.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačuj íc í se t í m, že se užije mikroorganismus Rhodotorula rubra, ATCC 74233, substrát se rozpustí v ethanolu, methanolu nebo DMSO v koncentraci 1 až 15 % objemových a přidává se v množství 1 až 3 g/1.
3. Způsob podle nároku 2,vyznačuj ící se t í m , že se substrát rozpustí v DMSO v koncentraci 1 až 3 % objemová a přidává se v množství 1 až 3 g/1.
4. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se t í m , že se fermentace provádí při teplotě 20 až

50 °C a při pH 4,5 až 8,0.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačuj í c í se t í m, že se fermentace provádí při teplotě 30 až 35 °C a při pH 5,5 až 6,5.

6. Způsob výroby trans-hydroxysulfonu obecného vzorce II c-

znamená azom uh ,iíku necc dusíku a znamena a) alkyl c 1 až o a ternech uhlíku s přímým nebo rezvět- vsným řetěze srn, zvlástě n-propyl nebo isobutyl, b) alkenyl o 2 až 5 atomech uhlíku, zvláště allyl, c) alkinyl o 3 až 5 atomech uhlíku, zvláště propargyl, d) atom vodíku nebo e) alkoxyalkyl o 1 až 4 atomech uhlíku v každé Části, načující s e t í m , že se pěstuje mikro-

organismus Rhodotorula rubra, ATCC 74283 v živném prostředí, obsahujícím využitelné zdroje dusíku a uhlíku a jako substrát sulfoketon obecného vzorce III kde znamená

a) alkyl c i až 5 atomech uhlíku 3 přímým nebo rozvětveným řetězcem, zvláště n-orocyl nebo zsocutyl,

Ό) alkenyl o 3 až 5 atomech uhlíku, zvláště allyl,

c) alkiny. o 3 až 5 atomech uhlíku, zvláště proparzyl,

d) atom vodíku nebo

e) alkoxyalkyl o 1 až & atomech uhlíku v každé části, v živném prostředí za aerobních podmínek do nahromadění sloučeniny obecného vzorce IZ , která se pak izoluje.

postupuje se tak, že se substrát rozpustí v ethanolu, methanolu nebo DMSO s koncentrací 1 až 15 % objemových a přidá se v množství 1 až g/1, fermentace se provádí při teplotě 20 až 50 °C a při pH 4,5 až 3,0.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačuj íc í se t í m , že se substrát rozpustí v DMSO s koncentrací 1 až 3 % objemová, přidává se v množství 1 až 3 g/1 a fermentace se provádí při teplotě 30 až 35 °C a při pH v rozmezí 5,5 až 6,5.