CZ5976U1 - Rozvětvené linearisované analogy vasopresinu - Google Patents

Description

Oblast techniky

Technické řešení se týká rozvětvených linearizovaných synthetických analogů vasopresinu Dosavadní stav technikv

Desmopresin, [8-D-arginin] deaminovasopresin je synthetický analog přírodního hormonu vasopresinu, peptidu zadního laloku hypofysy, ovlivňujícího metabolismus vody u savců a majícího též

4. presorický účinek. Desmopresin (INN), jehož synthesa byla popsána v druhé polovině sedmdesátých let a jež se stal léčivem nahrazujícím chybějící vasopresin při onemocnění diabetes insipidus, byl ^v používán i pro jiné indikace, jako je aktivace Faktoru VIII. Od intranasálního používání desmopresinu, kdy jedna až dvě aplikace za den zregulovaly onemocnění na téměř fysiologickou hodnotu příjmu a výdeje vody, se postupně dospělo až k používání perorálnímu, kdy se podávají tablety desmopresinu. Nízká biodostupnost účinné látky k ledvinným receptorům je jev, který může mít více příčin. Dosažený biologický účinek, který odpovídá cca 0,1 až 1 % podané látky, může být způsoben jak špatnou prostupností látky z gastrointestinálního traktu do krevního řečiště, tak zvýšenou degradací enzymy gastrointestinálního systému. Metabolické produkty se mohou uplatnit inhibičně vazbou na receptory, kdy budou kompetovat s intaktním peptidem a tak snižovat jeho účinnost. Na druhé straně lze zcela obecně očekávat, že metabolické produkty najdou receptory, na kterých se uplatní lépe než výchozí látka a vyvolají v množství, ve kterém vznikají, neočekávané účinky (CNS). Autoři analysovali chymotryptické fragmenty desmopresinu a připravili je pro biologickou a fysikálně chemickou analysu syntheticky.

* Podstata technického řešení

T Předmětem technického řešení jsou rozvětvené linearisované analogy vasopresinu (desmopresinu) obecného vzorce I t*

Y-Asn-Cys-Pro-D-Arg-GlyNH₂

Mpa (I)

Tyr

X kde X je Phe nebo OH;

Y je Gin nebo pGlu a

Mpa znamená zbytek kyseliny β-merkaptopropionové.

Pokud není uvedeno jinak, jsou zbytky aminokyselin odvozeny od L - stereoisomerů.

Látky obecného vzorce I se připraví působením alfa chymotrypsinu na desmopresin

-1CZ 5976 Ul (Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-GlyNH₂) a produkty postupné hydrolysy se isolují s výhodou HPLC či se připraví syntheticky.

Příklady provedení

Příklad 1 mg desmopresinu bylo rozpuštěno v 14 ml 0,01 M Na-fosfátového pufru pH 7,0 a přidány 2 mg alfa-chymotrypsinu, rozpuštěného v 1 ml stejného pufru. Po 36 hod inkubace byla odebrána polovina reakční směsi a zlyofilisována. Ke zbytku byly přidány další 2 mg chymotrypsinu a v reakci bylo pokračováno dalších 24 hodin. Poté byl vzorek namražen a lyofilisován. Produkty hydrolysy zastoupené v jednotlivých porcích inkubovaného vzorku nerovnoměrně (dle postupující konverse) byly isolovány HPLC a analysovány jak hmotovou spektroskopií tak kapilární elektroforesou a zastoupením aminokyselin.

Příklad 2

Při přípravě látek dle vzorce (I) se nejprve připravily na pevné fázi lineární sekvence Mpa-Tyr-X a sekvence Y-Asn-Cys-Pro-D-Arg-GlyNH₂ a to za použití Boc/Bzl chránící strategie. Postranní řetězce aminokyselin byly chráněny takto: D-Arg skupinou tosylovou, Cys skupinou 4-methylbenzylovou, Tyr skupinou 2,6dichlorobenzylovou. Kyselina beta-merkaptopropionová byla chráněna skupinou 4-methylbenzylovou. V případě dipeptidu respektive tripeptidu byla použita Merrifieldova pryskyřice, pro další sekvenci byla použita 4-methylbenzhydrylaminová pryskyřice.

Byl použit následující synthetický protokol: 1) DMF, 4x30 s, 2) 55 TFA v DCM, 5+25 min. 3) DMF, 6x50 s, 4) 10 % DIEA v DCM, 2x2 min., 5) kondensace za použití trojnásobného molárního přebytku HOBt esteru aktivované aminokyseliny. Preaktivace (DCC, HOBt) byla prováděna v minimu DCM: DMF 9:1 po 20 minut za laboratorní teploty, sraženina dicyklohexylmočoviny byla odfiltrována, promyta malým množstvím DMF a koncentrována ve vakuu. Výsledná koncentrace byla upravena přidáním DMF na cca 0,2 mol/1 a roztok přidán k pryskyřici. Po jedné hodině byl průběh kontrolován Kaiserovým testem, v positivním případě byla kondensace opakována za použití trojnásobného molárního přebytku BOP činidla a chráněné aminokyseliny a šestinásobného přebytku DIEA v DMF po 30 minut až do negativního Kaiserova testu. Na konci synthesy byla odštěpena poslední Boc skupina, pryskyřice promyta DCM, DMF, ethanolem a etherem a pryskyřice s navázaným peptidem vysušena ve vakuu. Peptid byl odštěpen z pryskyřice kapalným fluorovodíkem (HF-anisol 9:1, 10 ml/g pryskyřice s peptidem, 1 hod. při 0 ’C). Spolu s Boc skupinou dojde k odštěpení chránících skupin v postranních řetězcích. Fluorovodík byl vyfoukán proudem dusíku a surová reakční směs byla promyta etherem. Peptid byl poté rozpuštěn v 20% roztoku kyseliny octové a lyofilisován.

-2CZ 5976 Ul

K tvorbě intermolekulárních disulfidických můstků byla použita oxidace vodným roztokem (0,01 M) ferrikyanidu draselného. K oxidaci byla použita ekvimolární směs di(tri)peptidu a příslušného hexapeptidu (0,5 mmol), pH upraveno na 7 až 7,5 a roztok ferrikyanidu přidáván do trvale žlutého zabarvení. PH roztoku bylo upraveno na hodnotu 4-4,5 a sole odstraněny na sloupci Amberlitu CG-50. Peptid byl uvolněn 50% AcOH, eluát zahuštěn a lyofilisován. Peptidy byly rozděleny preparativní chromatografíí na koloně 250 x 10 mm naplněnou LiChrospherem WP 300 RP-18.

Jednotlivé peptidy byly charakterisovány pak analysou, HPLC, kapilární elektroforesou a hmotovým spektrem.

Průmyslová využitelnost

Látky podle technického řešení lze využít v základním výzku- mu, ve farmaceutickém průmyslu a ve zdravotnictví.

Claims (1)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   Rozvětvené linearizované analogy vasopresinu obecného vzorce I

   Y-Asn-Cys-Pro-D-Arg-GlyNH₂

   Mpa

   Tyr (I) kde X je Phe nebo OH; Y je Gin či pGlu a Mpa znamená zbytek kyseliny β-merkaptopropionové.