CZ421199A3 - Proteiny s insekticidní účinností a jejich použití - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká kompozic a způsobů hubení hmyzích ·' škůdců. Kromě toho se vynález týká rostlin a jiných organismů, jež byly kompozicemi podle vynálezu geneticky transformovány.

Dosavadní stav techniky

Četné hmyzí druhy jsou významnými škůdci pro běžné zemědělské plodiny jako jsou kukuřice, sojové boby, hrách, bavlna a podobné potravinářské a textilní suroviny.

Základním způsobem hubení těchto škůdců je aplikace syntetických chemických sloučenin. Široké používání chemických sloučenin však vytváří mnoho problémů z hlediska ochrany prostředí, protože tyto sloučeniny jsou neselektivní a hmyz si vůči nim vytváří rezistenci.

Byly zkoušeny jiné přístupy k potírání škůdců, zahrnující použití biologických organismů s charakterem přírodních predátorů vůči druhům, jež je třeba potlačovat. Tito predátoři mohou zahrnovat jiné hmyzí druhy, plísně a bakterie jako je Bacilius thuringiensis. Alternativně byly vypěstovány v zajetí velké kolonie hmyzích škůdců, sterilizovány a vypuštěny do přírody v naději, že páření mezi sterilizovaným a normálně plodným divokým hmyzem sníží hmyzí populaci. Tyto přístupy měly sice jisté úspěchy, ale na druhé straně byly nákladné a vyznačovaly se řadou nesnází. Je například obtížné použít žijící biologické organismy na velkých rozlohách a docílit toho, aby se delší dobu udržely v této oblasti nebo na takto ošetřených rostlinách. Hmyzí predátoři mohou migrovat a plísně a bakterie mohou být smyty z rostlin nebo odplaveny z ošetřené plochy deštěm. I když má tedy použití této biologické regulace žádoucí charakteristiky a setkává se s určitým • · 9 9 9 9 9 9 9 99 99 · 9 · « ·· 9 · 9 «

999 · 9 · 9

9 999 999 99 9 _ 99 9999999

9999 9 <9 999 99 99 úspěchem, v praxi se tyto metody zdaji silně omezeny.

Pokroky v biotechnologiích v posledních dvou dekádách přinesly nové možnosti potlačování škůdců pomocí genetického inženýrství. Zejména pokroky v rostlinné genetice ve spojení s určením růstových faktorů hmyzu a v přírodě se vyskytujících ochranných sloučenin nebo činidel rostlin poskytly možnost vytvořit transgenní zemědělské plodiny schopné produkovat taková ochranná činidla a tím chránit rostliny proti napadení hmyzem.

Byly vytvořeny transgenní rostliny rezistentní proti specifickým hmyzím škůdcům použitím genů kódujících endotoxiny Bacillus thuringiensis (Bt) nebo rostlinné inhibitory proteázy (PI). Je dokázáno, že transgenní rostliny obsahující geny pro endotoxin Bt jsou účinné pro potírání některých druhů hmyzu. V polních podmínkách však dosud nebyla prokázána účinná ochrana rostlin za pomoci transgenního insertu genetického materiálu PI. I když kultivary exprimující geny Bt dnes vykazují odolnost vůči některým druhům hmyzu, odolnost založená na expresi jediného genu může být případně ztracena během vývoje resistence hmyzu vůči Bt. Proto je nutný další výzkum zaměřený na další geny, jež lze vložit do rostlin za účelem ochrany proti hmyzím škůdcům.

Vědci identifikovali několik specifických rostlinných složek nebo sloučenin působících jako ochranné prostředky bránící rostlinu před napadením hmyzími škůdci a patogeny. Obvykle jsou sice v různých tkáních rostlin přítomny v malých množstvích, ale koncentrace některých z nich se zvýší po napadení rostlinným škůdcem nebo patogenem. Příklady takových ochranných sloučenin představují alkaloidy, terpeny a různé proteiny jako enzymy, inhibitory enzymů a lektiny. Zvláštní zájem je věnován sloučeninám rostlinného původu, jež mohou blokovat nebo změnit normální biomolekulární aktivitu a tak inhibovat růst hmyzu nebo jej usmrtit.

mww^wW-S • · · · • * · * • · · ft

99

Ve Spojených státech je zastoupen rod Diabrotica (bázlivec, čeleď mandelinkovitých, jehož larva poškozující kořeny kukuřice je v USA známa jako corn rootworm; CRW) třemi druhy: Diabrotica barberi Smith and Lawrence (severní), Diabrotica undecimpunctata howardi Barber (jižní) a Diabrotica virgifera virgifera LeConte (západní). Západní a severní druhy nejvíce přispívají k ekonomickým škodám na kukuřici. Výdaje na ochranu proti škůdcům a ztráty jimi způsobené se odhadují na více než miliardu dolarů ročně. Jak uvedeno výše, hlavním problémem použití pesticidů na ochranu proti škodám způsobeným larvou bázlivce (CRW) je jejich záporný účinek na prostředí a vývoj rezistence u hmyzu. Střídání plodin se jako způsob ochrany proti CRW stává méně účinným v důsledku delší diapauzy u larev. severních bázlivců a pozměněného chování při kladení vajíček larvy bázlivce západního. Tvorba transgenních rostlin s rezistencí vůči CRW by mohla mít významný ekonomický dopad. Bohužel však existuje v transgenních rostlinách málo genů . schopných potírat CRW, jsou-li vůbec jaké. Proto trvá potřeba dalších insekticidních účinných látek, zvláště proti CRW.

Podstata vynálezu

Popisují se kompozice a způsoby potírání hmyzu a dalších škůdců. Kompozice obsahují proteiny s pesticidní účinností, jež lze izolovat z rostlin rodu Pentaclethra. Nabízí se přečištěný protein stejně jako aminokyselina a genetická informace v podobě sekvence DNA pro bílkoviny s účinností proti larvě bázlivce západního. Sekvence DNA kódující pesticidní proteiny lze užít pro transformování rostlin, bakterií, plísní, kvasinek a dalších organismů pro získání schopnosti ochrany proti škůdcům.

Kompozice a způsoby podle vynálezu lze užít v řadě • 9 9 9 9 · ·

9 · 9 9 9 9 9 Λ · · • 9 999 9999 • 9 999999999

9 999 9999

9909 '3 99 999 99 99 systémů potlačování rostlinných a jiných škůdců.

Stručný popis obrázků:

Obrázek 1 ukazuje aminokyselinovou a nukleotidovou sekvenci cDNA sekvence účinné složky proti larvě bázlivce (CRW) pentinu-1 z Pentaclethra SEQ ID č. 1 a 2.

Obrázek 2 ukazuje aminokyselinovou a nukleotidovou sekvenci sekvence cDNA účinné složky pentinu-1, optimalizovanou pro zesílenou expresi SEQ ID č. 3 a 4.

Obrázek 3 ukazuje aminokyselinovou sekvenci proteinu pentinu-1 s podtrženým úsekem představujícím předpokládanou signální sekvenci. Zbytky AFS bezprostředně následující za signální sekvencí jsou první tři zbytky zralého proteinu. Zbytky ASK začínající pět zbytků od AFS startu zralého proteinu označují oblast zřejmého zralého amino-konce pentinu-1 exprimovaného jako protein v plné délce a proteolyzovaného v kořenech kukuřice.

Obrázek 4 ukazuje expresní kazetu pro expresi sekvencí pentinu-1.

Popisují se kompozice a způsoby potlačování škůdců, zvláště rostlinných škůdců. Zejména se popisují nové pesticidní proteiny. Proteiny jsou získány přečištěním z čeledi Leguminosae, zvláště z rodu Pentaclethra a speciálně z druhů P. macrophylla a P. macroloba.

Podle vynálezu lze pesticidní proteiny produkované členy rodu Pentaclethra izolovat způsoby v oboru známými. Způsoby izolace proteinů zahrnují konvenční chromatografické methody včetně geiové filtrace, iontově výměnné a imunoafinitní chromatografie při použití vysokoúčinné kapalinové chromatografie s modifikacemi jako je vysokoúčinná kapalinová chromatografie s převrácenými fázemi, iontově výměnná vysokoúčinná kapalinová ······ « » · ·· · · • φ φ φ · φ φ · · « · φφ φφφ φφφφ •Φ <·» φφφ φφφ « · φφφ φφφφ

ΦΦΦΦ · ΦΦ ·ΦΦ 4J φ ΦΦ chromatografie, vylučovací (SEC) vysokoúčinná kapalinová chromatografie, vysokoúčinná chromatofokusace a chromatografie s hydrofobní interakcí ap., elektroforetická separace jako je například jednorozměrná a dvourozměrná gelová elektroforéza a podobně. Viz například Current Protocols in Molecular Biology, sv. 1 a 2, Ausubel a další (eds.), John Wiley and Sons, Nový York (1988), zde uvedený jako odkaz.

Po izolaci proteinu lze tento protein, nebo polypeptidy z nichž se skládá, charakterizovat a sekvencovat standardními způsoby známými v oboru. Přečištěný protein nebo polypeptidy z nichž se skládá lze fragmentovat bromkyanem nebo některou z proteáz jako je papain, chymotrypsin, trypsin, lysyl-C endopeptidáza atd. (Oike a další (1982), J.Biol.Chem. 257,

9751-9758; Liu a další (1983) Int. J. Pept. Protein Res. 21, 209-215). Výsledné peptidy se separují, výhodně vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií nebo rozpuštěním gelů a westernovým přenosem (elektroblotováním) na membránách PVDF, načež se podrobí sekvencování aminokyselin. Za tímto cílem je výhodné peptidy analyzovat automatizovaným sekvenátorem. Je známo, že lze stanovit aminokyselinové, sekvence vnitřní nebo s N-koncem nebo s C-koncem. Z aminokyselinové sekvence přečištěného proteinu lze synthetizovat nukleotidovou sekvenci použitelnou jako nukleotidová sonda pomáhající izolaci genu kódujícího pesticidní protein.

Podobně lze použít pro stanovení prostorové a časové distribuce proteinu, který nás zajímá, protilátek vypěstovaných proti částečně purifikovaným nebo purifikovaným peptidům. Takto lze určit tkáň, v níž je protein nejvíce zastoupen a případně vysoce exprimovaný, a

konstruovat expresní knihovny. Způsoby tvorby protilátek jsou v oboru známé. Viz například Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lané (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988), a v něm citované odkazy. Rovněž viz Radka a další (1983), J. Immunol. 128, 2804; a Radka a další (1984), Immunogenetics 19, s. 63. Takových protilátek lze užít pro izolování proteinů s podobnými vazebnými místy a proteinů zkoušených na aktivitu proti hmyzím škůdcům, proti nimž se hledá ochrana.

Pro přečištění proteinu s insekticidní aktivitou lze užít jakékoli kombinace metod. Protože izolační protokol je dán, může se zkoušet pesticidní aktivita každé frakce materiálu získaného po každém purifikačním stupni.

Výsledkem takových purifikačních protokolů bude v podstatě purifikovaná bílkovinná frakce. Termínem v podstatě přečištěný nebo v podstatě čistý se míní protein, který je v podstatě zbaven jakékoliv sloučeniny normálně spojené s tímto proteinem v přírodním stavu. V podstatě čistý proteinový preparát se může hodnotit podle nepřítomnosti dalších detekovatelných proteinových pásů následujících po SDS-PAGE při vizuálním nebo denzitometrickém stanovení. Alternativně může nepřítomnost dalších aminem končících sekvencí nebo dusíkem končících zbytků v čištěném preparátu udávat úroveň čistoty. Čistota se může ověřit opakovanou chromatografií čistých preparátů vykazujících nepřítomnost ostatních píků při iontoměničové . nebo kapilární elektroforéze nebo elektroforéze s převrácenými fázemi. Termíny v podstatě čistý nebo v podstatě přečištěný nejsou míněny tak, aby vylučovaly umělé nebo syntetické směsi proteinů s dalšími sloučeninami. Tyto termíny nejsou míněny ani tak, aby vylučovaly přítomnost minoritních nečistot, • · «··· « · · ·· «· • 9 9 9 9 9 ·«*· • · 9 9 · 9 9 9 9 které neinterferují s biologickou aktivitou proteinu a které mohou být přitomny například vlivem neúplné purifikace.

Celá nukleotidová sekvence kódující protein se může stanovit z fragmentů proteinu pomocí testů PCR (řetězová reakce katalyzovaná polymerázou). Podobně se mohou fragmenty získané testy PCR použít pro izolaci sekvencí cDNA z expresních knihoven. Viz například Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání, sv. 1 až 3, Sambrook a další (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) a tam uvedené odkazy.

Tímto způsobem se mohou izolovat proteiny a nukleotidové sekvence kódující takové proteiny, jež mají inhibiční nebo toxické účinky vůči určitým hmyzím druhům. Takové proteiny a nukleotidové sekvence podle vynálezu lze použít pro ochranu rostlin proti škůdcům, to znamená proti hmyzu, houbám, baktériím, nematodům, virům a viroidům a. podobně, ale zvláště proti hmyzím škůdcům. Zejména lze získat proteiny a nukleotidové sekvence inhibiční nebo toxické proti hmyzím druhům řádu Coleoptera.

Hmyzí škůdci zahrnují hmyzí druhy řádů Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera atd., ale zvláště Coleoptera. Hmyzí druhy podle vynálezu pro nej důležitější plodiny zahrnují: Kukuřice: Ostrinia nubilalís_r Agrotis ipsilon, Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda, Díatraea grandiosella, Elasmopalpus lignosellus, Díatraea saccharalis, Diabrotíca vírgífera, Diabrotíca barberi, Diabrotica und&impunctata howardi, Melanotus spp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Popillía japoníca, Chaetocnema pulicaria, Sphenophorus maídis, Rhopalosiphum maidis, Anuraphís maldiradicis, Blíssus «····· «· · ,, ·φ •9 · 9 · 9 9 9 φ 9 · * · · » 9 9 9 9 » * f* 99» *9999«

8· · 999 9999

9999 9 99 999 99 99 leucopterus, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus sanguinipes, Delia platura, Agromyza parvicornis, Anaphothrips obscurus, Solenopsis milesta, Tetranychus urticae, Busseola fusca,

Sesamia calamístis, Eldana Sacchharina, Chilo partellus, Ostrinía furnacalis, Sesamia nonagrioídes; Čirok: Chilo partellus, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea,

Elasmopalpus lignosellus, Agrotis subterranea, Phyllophaga críníta, Eleodes, Conoderus a Aeolus spp. , Oulema melanopus, Chaetocnema pulicaria, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Sipha flava, Blissus leucopterus, Contarinia sorgícola, Tetranychus cínnabarinus, Tetranychus urticae, Schizaphis graminum; Žito: Pseudaletia unipunctata,

Spodoptera frugiperda, Elasmopalpus lignosellus, Agrotis orthogonia, Oulema melanopus, Hypera punctata, Diabrotica undecimpunctata howardi, Schizaphis graminum, Sitobion avenae, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentlalis, Melanoplus sanguinipes, Mayetiola destructor, Sitodiplosís mosellana, Meromyza americana, Hylemya coarctata,

Frankliníella fusca, Cephus cinctus, Eriophyes tulipae; Slunečnice: Suleima helianthana, Homeosoma ellectellum, Zygoramma exclamationis, Bothyrus gi bossus , Neolasioptera murtfeldtiana, Cochylis hospes, Rachiplusia nu, Smicronyx fulvus, Cylindrocopturus adspersus; Bavlna: Heliothis vlrescens, Helicoverpa zea, Spodoptera exigua, Pectíonophora gossypiella, Anthonomus grandls, Aphls gossypií,

Pseudatomoscelíš seriatus, Trialeurodes abutilonea, Lygus lineolarís, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentlalis, Thríps tabaci, Franklinkie11a fusca,

Tetranychus cínnabarinus, Tetranychus urticae/ Rýže:

Dlatraea saccharalis, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Colaspis brunnea, Lissorhoptrus oryzophilus, Sitophylus oryzae, Nephotettix nigropictus, Blissus leucopterus, • · · · • · • ·

Acrosternum hilare; Sojové boby; Pseudoplusia includens, Anticarsía gemmatalis, Plathypena scabra, Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Spodoptera exígua, Helíothís virescens, Helicoverpa zea, Epílachna varivestis, Myzus persicae, Empoasca fabae, Acrosternum hilare, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentialís, Delia platura, Sericothrips variabilis, Thrips tabaci, Tetranychus turkestaní, Tetranychus urticae; Ječmen: Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsílon, Schizaphis graminum, Blissus leucopterus, Acrosternum hilare, Eusc-hístus servus, Delia platura, Mayetiola destructor, Petrobia latens; Řepka olejná, Brevícorine brassicae, Phyllotreta spp., Mamestra configurata, Plutella xylostella; Vojtěska: Autographa californica, Otiorhynchus lígustícii, Colias eurytheme, Agronyza frontella, Hypera bruneipeonis, Philaerius spumarius, Theríophís meculata, Hypera punctata, Acyrthosyphon písum, Acyrthosyphor kondoi, Plathypena scabia, Sitona hispidulus, Brachophagus roddi, Lygus lineolaris, Chlorochroa sayi, Anticarsía friegiperda, Hypera postíca, Spodoptera, Empoasca fabae, Psuedolusia includens, Spissistílus festinus; viz například Manya B. Stoetzel (1989), Common Names of Insects and ftelated Organismy, Entomological Society of America, zde zahrnuto jako odkaz.

Nukleotidová sekvence podle vynálezu se může použít pro izolaci jiných homologních (souhlasných) sekvencí v dalších rotlinných druzích, zvláště v jiných druzích luštěnin. Příslušné způsoby jsou v oboru běžné pro hybridizaci sekvencí nukleové kyseliny. Kódující sekvence z jiných rostlin se mohou izolovat dobře známými technikami založenými na jejich sekvenční shodnosti s kódujícími sekvencemi, jež jsou zde popsány. V těchto způsobech se používá známá kódující sekvence buď celá nebo její část jako

sonda, jež selektivně hybridizuje s jinými pesticidními kódujícími sekvencemi přítomnými v populaci klonovaných fragmentů genomové DNA nebo fragmentů cDNA (to znamená knihoven genomů nebo cDNA) zvoleného organismu.

Například celé sekvence pentinu-1 nebo její části se může použít jako sondy schopné specifické hybridizace s kódujícími sekvencemi a mediátorovými RNA. Při realizaci specifické hybridizace za rozmanitých podmínek mají takové sondy zahrnovat sekvence, jež jsou jedinečné a pokud možno máji mít délku asi 10 nukleotidů a ještě výhodněji alespoň 20 nukleotidů. Takové sekvence se mohou použit pro amplifikaci (zmnožení) kódujících sekvencí pentinu-1 ze zvoleného organismu známými způsoby polymerázou katalyzované řetězové reakce (PCR). Tohoto způsobu se může použít pro izolaci dalších kódujících sekvencí z organismu, který nás zajímá, nebo jako diagnostického testu pro stanovení přítomnosti sekvencí kódujících pentin-1 v organismu.

Tyto způsoby zahrnují hybridizační třídění DNA knihoven naočkovaných na plotny (buď v plakách nebo koloniích; viz například Sambrook a další, Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), a amplifikaci technikou PCR za použití oligonukleotidových primerů odpovídajících doménám sekvencí zakonzervovaných mezi sekvencemi aminokyselin (viz například Innis a další, PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, eds., Academie Press (1990)).

Hybridizace takových sekvencí se například může provádět v podmínkách snížené nebo střední přísnosti (stringence) nebo v přísných (stringentních) podmínkách (jde například o přísnost promývání v podmínkách reprezentovaných 35-40% formamidem s 5x Denhardtovým roztokem, 0,5% SDS i/cí/étylsíran sodný) a lx SSPE při 37 °C; v druhém případě o

Μ 4444 • 4 •

• 4

4

44 4 4 • ♦ 4 4 4 4 4 • 4 44 4444 • · · 4 4 4 4 • 4 444 44 4 • 4 4 4 4 4 4

444 «4 44 podmínky přísnosti reprezentované 40-45% formamidem s 5x Denhardtovým roztokem, 0,5% SDS a lx SSPE při 42 ^eC; a konečně přísnost promývání daná 50% formamidem s 5x Denhardtovým roztokem, 0,5% SDS a lx SSPE při 42 °C) s DNA kódující zde popsané insekticidní geny ve standardním provedení hybridizace. Viz Sambrook a další, Molecular Cloning, a Laboratory Manual II. vyd.(1989), Cold Spring Harbor Laboratory.

Termín přísné podmínky nebo přísné hybridizační podmínky znamenají podmínky, za nichž sonda hybridizuje se svou cílovou sekvenci v podstatně větším rozsahu než jiné sekvence (například alespoň dvojnásobně oproti .

Přísnost podmínek závisí na dané sekvenci a za různých okolností je rozdílná. Při řízení přísnosti hybridizace a/nebo podmínek promývání lze nalézt cílové sekvence stoprocentně komplementární se sondou (homologní, shodné sondování). Alternativně se mohou upravit takové podmínky přísnosti, které způsobí chybné párování sekvencí, takže se detekuje na základě nižšího stupně podobnosti (hetero^íxjtoí sondování). Všeobecně platí, že je výhodné, když sonda je kratší než asi 500 nukleotidů, typicky od asi 50 do asi 300 nukleotidů.

V typických případech jsou přísné podmínky takové, v nichž je koncetrace soli menší než asi 1,5 M iontů Na, typicky asi od 0,01 do 1,0 M iontů Na (nebo jiných solí) při pH 70až 8/3 a teplota je nejméně kolem 30 °C pro krátké sondy (například 10 až 50 nukleotidů) a nejméně kolem 60 °C pro dlouhé sondy (například větší než 50 nukleotidů). Přísné podmínky lze též navodit přidáním destabilizujícího činidla jako je formamid. Příklad málo přísných podmínek představuje hybridizace v přítomnosti pufru 30 až 35% roztoku formamidu, 1 M NaCl, 1% SDS při 37 °C a promývání v ’♦ ·♦·· ·« * *· *.

• « « ..»» **·.

• · ·« · ·*** • · ♦ « » *«·««* • · · · » «.·* lx až 2x SSC (20x SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M citrát sodný) při 50 °C až 55 ‘C. Příklad mírně přísných podmínek představuje hybridizace v 40% až 45% formamidu, 1M roztoku NaCl, 1% SDS při 37 °C a promývání v 0, 5x až lx SSC při 55 °C až 60 °C. Příklad podmínek s vysokou přísností představuje hybridizace v 50% roztoku formamidu, 1 M roztoku NaCl, 1% SDS při 37 °C a promývání v 0,lx SSC při 60 °C až 65 °C.

Promývání po hybridizaci je specifickou funkcí a kritickými faktory je £/&? _a teplota finálního promývacího roztoku. Pro hybridy DNA-DNA je možno Tm odhadnout z rovnice Meinkotha a Wahla, Anal. Biochem. sv. 138, ss. 267-284 (1984): Tm = 81,5 C + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% form) - 500/L, kde M je molarita jednomocného kationtu, % GC je procento nukleotidů guanosinu a cytosinu v DNA, % form je procento formamidu v hybridizačním roztoku a L je délka hybridu v párech bází. Tm je teplota (za dané iontové síly a pH) za níž 50 % cílové komplementární sekvence hybridizuje s dokonale párující sondou. Tm se snižuje o 1 °C pro každou 1% chybu v párování; proto se může Tm, podmínky hybridizace a/nebo promývání upravit pro hybridizaci se sekvencemi požadované identity. Jestliže například jsou cílem sekvence s ž:90% identitou, může se Tm snížit o 10 °C. Při definované iotové síle a pH se většinou přísnost podmínek volí taková, aby byly asi 5 °C pod Tm specifické sekvence a její komplementární sekvence. Zvláště přísné podmínky však mohou znamenat hybridizaci a/nebo promývání při teplotách 1, 2, 3, nebo 4 °C pod Tm; mírně přísné podmínky mohou aplikovat hybridizaci a/nebo promývání při 6, 7, 8, 9 nebo 10 °C pod Tm; při nízké přísnosti podmínek hybridizace a/nebo promývání lze užít teplot o 11, 12,13, 14, 15 nebo 20 °C nižších než Tm za pomoci uvedené rovnice v kombinaci podmínek pro hybridizaci ♦♦ ·*·· ·· 99 « « · » « · · · • · · 9 « · · * · ··♦ ·· ·· a promývání, a odborníci chápou, že proměny ve stupni přísnosti při hybridizaci a/nebo složení promývacích roztoků jsou v patentu inherentně obsaženy. Jestliže důsledkem potřebné chyby v párování je Tm pod 45 °C (vodný roztok) nebo 32 °C (roztok formamidu), dává se přednost zvýšení koncentrace SSC, takže lze zvýšit teplotu. Extenzivní návod pro hybridizaci nukleových kyselin lze nalézt v: Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, část I., kapitola 2 Přehled principů hybridizace a strategie pokusů se sondami nukleové kyseliny, Elsevier, New York (1993); a Current Protocols in Molecular Biology, kap. 2, Ausubel a další eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).

Všeobecně platí, že sekvence, které kódují pentin-1 a další insekticidní proteiny podle vynálezu a hybridizují s genem zde popsaným budou asi z 50 % homologní (shodné), homologní z 70 %, homologni až do 85 % nebo až asi z 90 % 95 % homologní s popsanou sekvencí. To znamená, že sekvenční podobnost (similarita) sekvencí se může pohybovat v určitém rozmezí a dosahuje nejméně asi 50%, asi 70%, asi 85% až asi 90 - 95% sekvenční similarity.

Pro popis vztahů mezi dvěma nebo více nukleovými kyselinami nebo polynukleotidy se užívá následujících termínů: (a) referenční sekvence, (b) srovnávací okénko (c) sekvenční totožnost, (d) procento sekvenční tožnosti, (e) poftefo/ná identita.

(a) Zde užitý termín referenční sekvence je definovaná sekvence použitá jako základ pro srovnání sekvenci. Referenční sekvence může být podmnožina nebo celek specifikované sekvence; například jako úsek celé sekvence cDNA nebo úsek sekvence genu nebo jako celistvá sekvence • · φφφφ

ΦΦΦ «Φ ΦΦΦ

99 • Φ Φ Φ • Φ Φ φ • Φ Φ 9 cDNA nebo genu.

(b) Termín srovnávací okénko zde znamená přilehlý a specifikovaný úsek polynukleotidové sekvence, v němž lze polynukleotidový úsek přirovnat k referenčnímu úseku a v němž část polynukleotidové sekvence ve srovnávacím okénku může obsahovat adice nebo delece (to znamená mezery) ve srovnání s referenční sekvencí (jež adice a delece neobsahuje) pro optimální uspořádání obou sekvencí. Obvykle má srovnávací okénko délku nejméně 20 přilehlých sekvencí a v případě přání jich může být i 30, 40, 50, 100 nebo více. Odborníci vědí, že ve snaze vyhnout se vysoké podobnosti s referenční sekvencí v důsledku vkládání mezer do polynukleotidové sekvence se typicky zavádí opravný malus (odečet) na delece (mezery), který se odečítá od počtu správných párů.

Způsoby uspořádání sekvencí pro srovnání jsou odborníkům dobře známy. Optimální uspořádání sekvencí pro srovnání se může řídit algoritmem lokální shodnosti Smithe a Watermanna, Adv. Appl. Math. sv. 2, s. 482 (1981); algoritmem uspořádáni homologie Needlemanna a Wunsche, J. Mol. Biol., sv. 48, s. 443 (1970); postupem zjišťování podobnosti Pearsona a Lipmana, Proč. Nati. Acad. Sci. sv.

85, s. 2444 (1988); počítačovým zpracováním těchto algoritmů včetně (aniž by se však na ně omezovaly): CLUSTAL v programu PC/Gene fy Intelligenetics, Mountain View, Kalifornie, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA a TFASTA ve Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Groups (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA; program CLUSTAL dobře popsali Higgins a Sharp, Gene, sv. 73, s. 237-244 (1988); Higgins a Sharp, CABIOS, sv. 5, s. 151-153 (1989); Corpet a další, Nucleic Acids Research, sv. 16, s. 1088110890 (1988); Huang a další, Computer Applications in the »999

Biosciences, sv. 8, s. 155-165 (1992) a Pearson a další, Methods in Molecular Biology, sv. 24, s. 307-331 (1994). Skupina programů BLAST, jíž lze použít pro průzkum v databázi similarit, zahrnuje: BLASTN pro nukleotidové rozpoznávací sekvence proti nukleotidovým sekvencím; BLASTX pro nukleotidové rozpoznávací sekvence proti sekvencím proteinové databáze; BLASTP pro proteinové rozpoznávací sekvence proti sekvencím proteinové databáze; TBLASTN pro proteinové rozpoznávací sekvence proti sekvencím nukleotidové databáze a TBLASTX pro nukleotidové rozpoznávací sekvence proti sekvencím nukleotidové databáze. Viz Current Protocols in Molecular Biology, kap. 19, Ausubel a další, eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).

Jak chápou odborníci, v programech BLAST se předpokládá, že proteiny lze modelovat jako náhodné sekvence. Mnohé reálné proteiny však obsahují oblasti nenáhodné, jimiž mohou být homopolymerní úseky, krátké repetice nebo oblasti obohacené jednou nebo dvěma aminokyselinami. Takové oblasti s nízkou komplexitou mohou být zařazeny mezi nepříbuznými proteiny i když by ostatní oblasti proteinu byly zcela odlišné. Je možno použít mnoha programů pro vytřídění oblastí s nízkou komplexitou pro jejich snížení. Lze použít mnoha programů pro vytřídění sestav s nízkou komplexitou. Na příklad SEG (Wooten a Eederhen, Comput. Chem. sv. 16, s. 149-163 (1993) a XNU (Claverie a States, Comput. Chem., sv. 17, s. 191-201 (1993), a to samotných nebo v kombinaci.

(c) Při použití zde zahrnuje termín sekvenční identita” nebo identita v kontextu dvou sekvencí nukleových kyselin nebo peptidů odkaz na zbytky ve dvou sekvencích, jež jsou stejné při uspořádání za účelem

9 9 9 • · · · «» · • · 9 9 9 9 •9 999 99 99 maximální shody přes specifikované srovnávací okénko. Když se procento sekvenční identity použije u proteinů, považuje se za dané, že se pozice zbytků, jež nejsou identické, často liší v substitucích konzervativních aminokyselin, v nichž jsou zbytky aminokyselin nahrazeny jinými zbytky aminokyselin s podobnými chemickými vlastnostmi (například náboj nebo hydrofobní charakter) a proto nemění funkční vlastnosti molekuly. Kde se sekvence v konzervativních substitucích liší, procento sekvenční identity se může upravit směrem nahoru za účelem korekce konzervativní povahy substituce. 0 sekvencích lišících se podobnými konzervativními substitucemi se říká, že mají sekvenční similaritu (podobnost) nebo zkráceně similaritu. Odborníkům jsou dobře známy prostředky pro provedení této úpravy. Typicky to zahrnuje hodnocení konzervativní substituce spíše jako částečné chybné párování než jako zcela chybné párování, čímž se zvyšuje procento sekvenční identity. Proto například v případech kdy se identické aminokyselině přidělí známka 1 a nekonzervativní substituci známka 0, konzervativní substituci připadne známka mezi 0 a 1. Známkování konzervativních substitucí se počítá například podle algoritmu Meyerse a Millera, Computer Applic. Biol. Sci., sv. 4, s. 11-17, (1988), jak je realizuje například program PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornie, USA) .

(d) Termín procento sekvenční identity, jak se zde používá, znamená hodnotu stanovenou srovnáním dvou optimálně uspořádaných sekvencí přes srovnávací okénko, přičemž část polynukleotidové frekvence ve srovnávacím okénku může v zájmu optimálního uspořádání těchto dvou sekvenci zahrnovat adice (přídavky) nebo delece (mezery) ve srovnání s referenční sekvencí (jež adice a delece neobsahuje). Toto ·· «·«· »« . <» _#a • · · ··«· ···· • · » · · · · · * procento se počítá stanovením počtu pozic, v nichž se v obou sekvencích vyskytuje identická báze nukleové kyseliny nebo aminokyselinový zbytek, čímž se získá počet správně spárovaných pozic, dělením počtu těchto dobře spárovaných pozic celkovým množstvím pozic ve srovnávacím okénku a násobením 100. Tím se získá procento sekvenční identity.

(e)(1) Termín podstatná identita v polynukleotidových sekvencích znamená, že polynukleotid obsahuje sekvenci, jež má nejméně 70% sekvenční identitu, výhodně alespoň 80%, ještě výhodněji alespoň 90% a nejvýhodněji alespoň 9.5% identitu ve srovnání s referenční sekvencí za použití jednoho z popsaných programů pro uspořádání při standardních parametrech. Odborník nahlédne, že tyto hodnoty lze vhodně upravit pro stanovení odpovídající identity proteinů kódovaných dvěma nukleotidovanými sekvencemi, přičemž je třeba vzít v úvahu kodónovou degeneraci, podobnost aminokyselin, umístění čtecího rámce a podobně. Sekvence aminokyselin jsou pro tyto účely považovány za v podstatě identické při sekvenční identitě nejméně 60 %, raději nejméně 70 %, 80 %, 90 % a nejraději nejméně 95 %.

Jiným důkazem, že nukleotidové sekvence jsou v podstatě identické je když dvě molekuly za přísných podmínek spolu hybridizují. Nukleové kyseliny jež za přísných podmínek spolu nehybridizuji však mohou být v podstatě identické, jsou-li polypeptidy jimi kódované v podstatě identické. K tomu například dochází, když se vytvoří kopie nukleové kyseliny s využitím maximální kodónové degenerace, jakou dovoluje genetický kód. Indicií že dvě sekvence nukleové kyseliny jsou v podstatě identické je, když polypeptid kódovaný první nukleovou kyselinou je imunologicky zkříženě reaktivní s polypeptidem kódovaným druhou nukleovou kyselinou.

(e) (II) Označení v podstatě identický v případě *· 9999 • · 9 • 9 • · • 99 9 9

9 » 9 9 9 • · 9

9 9

999 ·· 99 • 9 « 9 • · · · · · 9 • 9 9 ·

99 peptidů znamená, že peptid obsahuje sekvenci, jež má nejméně 70% sekvenční identitu s referenční sekvencí, výhodněji nejméně 80%, ještě raději 85% a nejraději nejméně 90% nebo 95% sekvenční identitu při srovnání přes specifické srovnávací okénko s referenční sekvencí. Optimální uspořádání se výhodně provede za použití algoritmu homologního uspořádání Needlemana a Wunsche, J.Mol.Biol., sv. 48, s. 443 (1970). Indicií, že dvě peptidové sekvence jsou v podstatě identické je, že jeden peptid je imunologicky reaktivní s protilátkami indukovanými proti druhému peptidu. Proto je peptid v podstatě identický s druhým peptidem například v případě, že se dva peptidy liší pouze konzervativní substitucí. Peptidy jež jsou v /vTÍsíyí podobné sdílejí, jak výše uvedeno, stejné sekvence s tou výjimkou, že pozice zbytků jež nejsou identické, se mohou lišit změnami konzervativních aminokyselin.

Je známo, že pesticidní proteiny mohou být oligomerní a liší se v molekulové hmotnosti, počtu promotorů, zastoupení jednotlivých peptidů, aktivitě proti některým škůdcům a v dalších charateristikách. Proteiny aktivní proti řadě škůdců však lze izolovat a charakterizovat způsoby zde popsanými. Zvláštní pozornost přitahují proteiny aktivní proti larvě bázlivce západního (CRW). Proto jsou purifikované nebo částečně purifikované proteiny podle vynálezu testovány na insekticidní aktivitu proti larvám bázlivou včetně Diabrotica barberi (sev.), D. undecimpunctata howardí (již.) a D. virgifera virgifera (záp.). Tímto způsobem byl Izolován jeden protein označený pěntin-1, který má insekticidní aktivitu proti larvě bázlivce západního. Pentin-1 je glykosylovaný protein s přibližnou molekulovou hmotností 45 až asi 50 kDal.(kilodaltonů). Aminokyselinová a nukleotidová sekvence proteinu pentin-1 je na obrázku 1 a SEQ ID č. 1 a ·· φφφφ * φ φ • · • φ φ

φ φ φ £0

Nej vyšší koncentrace pentinu-T) /ve zralých semenech

Tento protein je tepelně stabilní a má vůči larvě bázlivce západního (CRW) toxickou účinnost LC50 asi 10 pg/ml nutriční dávky.

Pentin-1 a ostatní proteiny podle vynálezu lze různým způsobem měnit včetně substitucí aminokyselin, delecí, zkracování a inzercí. V oboru jsou takové manipulace všeobecně známy. Varianty aminokyselinových sekvencí v pesticidních proteinech lze například připravovat mutacemi v DNA. V oboru jsou dobře známy způsoby mutageneze a změn nukleotidových sekvencí. Viz například Kunkel, T. (1985) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, sv. 82, s. 488-492; Kunkel a další (1987), Methods in Enzymol., sv.154, s.367-382; US Patent č. 4,873.192; Walker a Gaastra (eds.) Techniqúes in Molecular Biology, MacMillan Publishing Comp., New York (1983) a tam citované odkazy. Proto geny a nukleotidové sekvence podle vynálezu zahrnují jak přirozeně se vyskytující sekvence tak i mutantni formy. Podobně proteiny podle vynálezu zahrnují jak přirozeně se vyskytující proteiny, tak i jejich varianty a modifikované formy. Takové varianty totiž i nadále mají potřebnou pesticidní aktivitu. Je zřejmé, že mutace vytvořené v DNA kódující variantu nesmí umístit sekvenci mimo čtecí rámec a je výhodné, když nevytvoří komplementární oblasti, jež by mohly produkovat sekundární struktury mRNA. Viz Evropskou patentovou přihlášku ó. 75.444.

Takto zahrnuje tento vynález pesticidní proteiny stejně jako jejich komponenty (složky) a fragmenty. Uznává se totiž, že lze připravit promotory komponentů, polypeptidů nebo fragmentů proteinů, jež si podrží pesticidní aktivitu. Tyto fragmenty zahrnují zkrácené sekvence stejně jako C• 9 • 9 9 9 9 9 9 9 · 9 9

99 9 9999

9 999 999 99 9

OH 99 9999999 <íU 9999 9 99 ·ί· 99 99 konce, N-konce, vnitřní a vnitřně deletované aminokyselinové sekvence proteinů.

Od většiny delecí, inserci a substitucí proteinové sekvence se neočekává, že způsobí radikální změny v charakteristikách proteinu. I když je však nesnadné předvídat přesný účinek substituce, delece nebo inserce, odborník ocení, že tento účinek lze zjistit rutinními skriningovými testy (tříděním). Aktivitu lze totiž zjistit zkouškami toxicity vůči hmyzu.

Nukleotidových sekvencí lze použít při přeskupováni

DNA. Přeskupení (shufflíng) DNA je proces rekurzivní rekombinace a mutace prováděný náhodnou fragmentací množiny příbuzných genů následovaný opětovným seskupením fragmentů řetězovou reakcí katalyzovanou polymerázou (PCR) bez primeru. Viz například Stemmer, W.P.C. (1994) Proč. Nati.

Acad. Sci. USA sv. 91, s. 10747-10751; Stemmer, W.P.C.

(1994) Nátuře, sv. 370, s. 389-391; Zhang a další (1997)

Proč. Nati. Acad. Sci. USA, sv. 94, s. 4504-4509; a PCT Publication č. 96/19256. Výhodou racionalizace uspořádání DNA tímto přeskupením (rekombinací) je, že může optimalizovat funkci genů bez předběžného stanovení genu limitujícího rychlost děje. Tento vynález nabízí způsoby sekvencovaného přeskupeni za použití polypeptidů podle vynálezu a jím popsaných kompozic.

Obecně řečeno sekvájcované přeskupování (rekombinace sekvenci) poskytuje prostředky pro vytváření knihoven polynukleotidů s požadovanými vlastnostmi, jež lze takto vybírat a třídit. Knihovny rekombinantních polypeptidů se vytvářejí z populací příbuzných polypeptidových sekvencí obsahujících sekvencované oblasti, jež jsou V pcfUtyl i/ sekvenčně identické a mohou se homologicky rekombinovat in vitro nebo in vivo.

Populace sekvenčně rekombinovaných polynukleotidů obsahuje subpopulaci polynukleotidů s žádoucími nebo výhodnými vlastnostmi a může se selektovat vhodnými selekčními nebo třídícími způsoby. Tyto vlastnosti představuje kterákoliv vlastnost nebo atribut, který se může selektovat nebo detekovat třídícím systémem a může zahrnovat vlastnosti jako: kódovaný protein, transkripční prvek, sekvenci řídící transkripci, tvorbu RNA, stabilitu RNA, kondenzaci chromatinu, translaci, nebo jinou vlastnost exprese genu nebo transgenu, prvek replikace, prvek vázající protein a podobně včetně jakéhokoliv znaku, který přispívá k vlastnosti, která je selektovatelná nebo nebo detekovatelná. V některých provedeních může být zvolenou vlastností zvýšená hodnota Km a/nebo Kcat ve srovnáni s přírodní formou proteinu jak zde uvedeno. V jiných provedeních bude mít protein nebo polynukleotid vytvořený sekvecovaným přeskupením (sekvenční rekombinací) větší vazebnou afinitu ligandu než nepřeskupený přírodní polynukleotid. Vzrůst takových vlastností může být nejméně 110%, 120%, 130%, 140% nebo nejméně 150% oproti hodnotě u přírodního polynukleotidů.

Pentin-1 je člen širší genové rodiny esteráz, přesněji lipidacylových hydroláz jak vyplývá z podobnosti sekvencí. Přeskupení genu je způsob, jímž lze zlepšit nebo změnit biologickou aktivitu daného genového produktu. Přeskupení genu lze ve spojení se stategií selekce použít pro zlepšení vlastností jako je specifičnost substrátu, rozpustnost, optimální teplota a pH proteinu nebo enzymu při řízené molekulární evoluci. V případě pentinu-1 je toxicita vůči hmyzu vyjádřená letální koncentrací nejdůležitějšim parametrem.

Genové přeskupení se může použít i u jediného genu, což zavádí do tohoto genu při dané frekvenci mutace. Následným genovým přeskupením lze potom v primární populaci mutantň selektovat kombinace synergických mutací. Tento přístup se může aplikovat u pentinu-1.

Pro genové přeskupení lze alternativně použít různé členy genových rodin již kódované rozdílnými ale příbuznými sekvencemi. Může zde být zahrnut pentin-1 z Pentaclethra a exprimovaná značená sekvence z kukuřice, identifikovaná jako 5C9 kódující cDNA, asi z 57 % identická s pentinem-1 na nukleotidové úrovni, ale není to jediná možnost. Viz souběžnou patentovou přihlášku 08/449.986 z 25.5.1995, zde zahrnutou odkazem. Genovým přeskupením se zavádějí i průvodní mutace, jež rovněž přispívají ke genetické rozmanitosti. Synergické kombinace.fúzí mezi členy genové rodiny a nově zaváděnými mutacemi se mohou selektovat řízenými strategiemi molekulární evoluce.

Lipidacylové hydrolázy tvoří různorodou multigenovou rodinu vyskytující se v mnoha rostlinných druzích. Tyto enzymy mají schopnost hydrolýzy mnohých glykolipidů a fosfolipidů. Substráty zahrnují monogalaktosyldiacylglycerin, acylsterylglukosid, fosfátidylcholin, lysofosfatidylcholin, fosfatidylethanolamín, lysofosfatidylethanolamin, fosfatidylinosit a mnoho dalších lipidových substrátů. Podobně se složení membrán různých druhů hmyzu a rostlin může lišit podle druhů a může být ovlivněno dietou nebo růstovými podmínkami. Proto může aktivita dané lipidacylové hydrolázy ovlivnit specifičnost i účinnost. Změněná specifičnost substrátu může být parametrem pro selekci produktů přeskupení genu.

Rozpustnost a stabilita proteinu může být rovněž vyselektována z produktů přeskupených genů. Insekticidní • * » · · · • · · · ·

999 ·· ·· ···· proteiny jsou aktivní v drsných podmínkách hmyzího střeva. Tyto proteiny jsou štěpeny proteázami a ovlivněny redukčními nebo oxidačními podmínkami, jež se liší u různých testovaných hmyzích druhů. Rozpustnost a stabilita lipidacylových hydroláz v transgenních rostlinách i v hmyzích střevech může ovlivnit jejich biologickou aktivitu a lze ji změnit strategiemi genového přeskupení.

Podmínky enzymatické reakce jako je pH a teplotní optimum může rovněž ovlivnit insekticidní aktivitu pentinu1. Ve střevě larvy bázlivce je pH 5,5-6,0. Selekce produktů přeskupeného genu pentinu-1 z hlediska enzymatické aktivity vůči lipidovým substrátům v tomto rozmezí pH je dalším parametrem, který může ovlivnit toxicitu.

Proto může být použita pentinová sekvence podle tohoto vynálezu v pokusech s přeskupováním genů u dalších lipidových hydroláz jako jsou patatiny a zvláště 5C9.

Proteiny nebo jiné složené polypeptidy zde popsané se mohou pro potlačování různých hmyzích škůdců používat samotné nebo v spojení s jinými proteiny nebo činidly. Ostatní insekticidní proteiny zahrnují proteiny původem z Bacillus včetně δ-endotoxinů a vegetativních insekticidních proteinů a rovněž inhibitorů proteázy (serinového a cysteinového typu) lektinů, α-amyláz, peroxidáz, cholesteroloxidáz a podobně.

V jednom provedení je provázena exprese proteinů podle vynálezu v transgenní rostlině expresí jednoho nebo více δendotoxinu Bacillus thurlngiensis (Bt). Této ko-exprese více než jedné účinné látky v jediné transgenní rostlině lze docílit genetickou manipulací rostliny, aby obsahovala a exprimovala všechny potřebné geny. Alternativně lze přimět rostlinu Rodič 1 prostředky genetického inženýrství k expresi proteinů podle vynálezu. Druhá rostlina Rodič 2 se • · podobně geneticky manipuluje pro expresi dalších účinných látek jako je δ-endotoxin z Bt. Zkřížením Rodiče 1 s Rodičem 2 se mohou získat dceřiné rostliny exprimující všechny geny přítomné v Rodičích 1 a 2.

Tento vynález též zahrnuje nukleotidové sekvence z jiných organismů než je Pentaclethra, v nichž proteiny zkříženě reagují s protilátkami introdukovanými proti proteinům podle vynálezu nebo v nichž jsou nukleotidové sekvence izolovatelné hybridizací s nukleotidovými sekvencemi podle vynálezu. Proteiny izolované nebo kódované těmito nukleotidovými sekvencemi se mohou testovat na pesticidní aktivitu. Izolované proteiny se mohou na pesticidní aktivitu zkoušet způsoby zde popsanými nebo jinými, dobře známými v oboru.

V jiném provedení se mohou proteiny podle vynálezu použít v kombinaci s povlékáním semen v oboru známém. Tímto způsobem se transformovaná semena povlékají za použití komerčně nabízených postřiků nebo prášků. V oboru jsou tyto insekticidy známé. Viz například USA patent č. 5,696.144; 5,695.763; 5,420.318; 5,405.612; 4,596.206; 4, 356.934; 4,886.541 a další, zde zahrnuté ve formě odkazu.

Jakmile byly izolovány nukleotidové sekvence kódující pesticidní proteiny podle vynálezu, mohou se geneticky manipulovat a použít pro expresi proteinu v různých hostitelích včetně dalších organismů jako jsou mikroorganismy a rostliny.

Proteiny podle vynálezu se mohou použít pro ochranu zemědělských plodin a dalších produktů před škůdci zavedením do mikrobiálního hostitele pomocí vhodného vektoru a rozšířením uvedeného hostitele v okolí rostlin. Mikrobiální hostitelé se volí z druhů, o nichž je známo, že osídlují fytosféru, prostředí a povrchy listů a kořenů (fyloplán, • · « · fylosféra, rhizosféra, a/nebo rhizoplán) jedné nebo více plodin, jež chceme chránit. Tyto mikroorganismy se vybírají tak, aby byly schopny úspěšně kompetovat v daném specifickém prostředí přírodním mikroorganismům, zajišťovaly zachování a expresi genů exprimujících polypeptidové pesticidy a podle přání zlepšily ochranu pesticidu před degradačním a desaktivačním vlivem prostředí.

Proteiny podle vynálezu se mohou použít v expresních kazetách pro expresi v kterémkoliv hostiteli našeho zájmu. Takové expresní kazety obsahují iniciační oblast transkripce vázanou na gen kódující sledovaný pesticidní gen. Tato espresní kazeta je opatřena množstvím restrikčních míst pro inzerci sledovaného genu, aby byl pod vlivem řízení transkripce regulačními oblastmi. Expresní kazeta může navíc obsahovat volitelné genové signální znaky (márkery), vhodné pro organismus daného hostitele.

Iniciační oblast transkripce, promotor, může být vůči hostiteli nativní (z téhož organismu), nebo může být analogický, nebo cizí nebo heterologní. Podobně může být promotorem přírodní sekvence nebo alternativně syntetická sekvence. Předpokládá se, že iniciační oblast transkripce se nenalézá v hostiteli přírodního typu, do něhož se iniciační oblast transkripce zavádí. Chimérický gen ve smyslu zde použitém obsahuje kódující sekvenci funkčně spojenou s iniciační oblastí transkripce, jež je heterologní ke kódujíc! sekvenci. I když lze použit každý promotor nebo prvek promotoru schopný zahájit expresi kódující sekvence, pro expresi v rostlinách mají zvláštní význam kořenové promotory, (Bevan a další (1993) v Gene Conservation and Exploitation. Proceedings of the 20th Stadler Genetics Symposium. Gustafson a další (eds.) Plenům Press, New York, ss. 109-129; Brears a další (1991) Plant J., sv. 1, ss. 23526

• · · · ·· · · · · · • · * · · · · · · · • 4 · 4 · ·>·· • 44 4 4 4 4 4 4 4

444 4444

4 4 4 «44 44 44

244; Lorenz a další (1993), Plant J., sv. 4, ss. 545-554; Patent USA č. 5,459.252; 5,608.149; 5,599.670), promotory z dřeně (Patent USA č. 5,466.785; 5,451.514; 5,391.725), nebo specifické a konstitutivní promotory z ostatních tkáni (například Patent USA č. 5,608.149; 5,608.144; 5,604.121;

5, 569.597; 5, 466.785; 5, 399.680; 5,268.463; 5, 608.142) zde uváděné jako odkazy.

Kazeta pro transkripci bude mít směr přepisu 5'-3', iniciační oblast transkripce a translace, sekvenci DNA jež nás zajímá a terminační oblast transkripce a translace funkční v rostlinách. Terminační oblast může mít stejný původ jako iniciační oblast transkripce, může mít stejný původ jako sekvence DNA jež nás zajímá, anebo může pocházet z jiného zdroje. Vhodné terminační oblasti lze získat z Tiplasmidu A. tumefaciens jako jsou terminační oblasti oktopinsyntáza a nopalinsyntáza. Viz též Guerineau a další, (1991), Mol.Gen. Genet, sv. 264, s. 141-144; Proutoot (1991) Cell, sv. 64, s. 671-674; Sanfacon a další (1991) Genes Dev., sv. 5, s. 141-149; Mogen a další (1990) Plant Cell, sv. 2, s. 1261-1272; Munroe a další (1990) Gene, sv. 91, s. 151-158; Ballas a další (1989) Nucleic Acid Res., sv. 17, s. 7891-7903; Joshi a další (1987). Nucleic Acid Res., sv. 15, s. 9627-9639.

Nukleotidové sekvence kódující proteiny nebo polypeptidy podle vynálezu jsou zvláště užitečné pro genetickou manipulaci rostlin. V tomto způsobu jsou geny podle vynálezu k dispozici v expresních kazetách pro expresi ve sledovaných rostlinách. Kazeta obsahuje regulační sekvence 5' a 3' operativně vázané na gen který nás zajímá. Navíc může kazeta obsahovat nejméně jeden gen navíc pro společnou transformaci (kotransformaci) nebo navázání a transformování do organismu. Alternativně se může gen (nebo

4 4 4 ·

* 4

4 4 * • 4 4 4

4 4

4 4 4 4 <4 geny) našeho zájmu zajistit v jiné expresní kazetě. Kde je to na místě, může se gen optimalizovat pro zvýšenou expresi v transformované rostlině. Znamená to, že se geny mohou synthetizovat pro zlepšenou expresi použitím kodonů rostlinou preferovaných. V oboru jsou k dispozici způsoby syntézy genů rostlinou preferovaných. Viz například Patent USA č. 5,380.831, 5,436.391 a Murray a další (1989), Nucleic Acids Res. sv. 17, s. 477-498 zde zařazené jako odkazy.

V závislosti na tom, kde má být exprimována sekvence DNA, o niž se zajímáme, může být potřebné syntetizovat sekvenci kodony jež rostlina preferuje nebo alternativně kodony, jež preferuje chloroplast. Kodony rostlinou preferované lze stanovit pomocí kodonů nej častěji se vyskytujících mezi proteiny exprimovanými v největším množství v rostlinných druzích, jež nás zajímají. Viz Evropský patent 0359472; Evropský patent 0385962; WO 91/16432; Perlak a další (1991) Proč. Natl.Acad. Sci. USA sv. 88, s. 3324-3328; a Murray a další (1989) Nucleic Acid Research sv. 17, s. 477-498. Tímto způsobem lze optimalizovat nukleotidové sekvence pro expresi v kterékoliv rostlině. Nahlíží se, že každá nebo kterákoliv část genové sekvence může být optimalizována nebo syntetizována. Takže syntetické nebo částečně optimalizované sekvence se rovněž mohou použít.

Je známo že dodatečné úpravy sekvence zesilují genovou expresi v hostitelské buňce. Týká se to eliminace sekvencí kódujících klamné polyadenylační signály, signály míst sestřihu exonu a intronu, repetic typu transpozónu, a dalších podobných dobře charakterizovaných sekvencí, jež mohou být pro genovou expresi škodlivé. Obsah G-C v sekvenci se může upravit na úroveň v daném buněčném hostiteli průměrnou, což se vypočte ve vztahu ke známým genům

• 9 * · * 9 · «99 99 99 • 9 • 99« 9 exprimovaným v hostitelské buňce. Dle možností lze sekvenci modifikovat, aby nedošlo k nežádoucímu vzniku sekundárních vlásenkových struktur mRNA.

Expresní kazety mohou navíc obsahovat 5'vedoucí sekvence v konstruktu. Takové vedoucí sekvence mohou působit pro zesílení translace. Lídři translace (vedoucí sekvence pro zesílení translace) jsou v oboru známi a zahrnují: lídři typu pikornaviru, například EMCV lídr (encefalomyokarditis 5'nekódující oblast) Elroy-Stein 0., Fuerst T.R., a Moss B., (1989) PNAS USA, sv. 86, s. 6126-6130); lídři typu potyviru, například TEV lídr etchviru tabáku (Allison a další (1986); MDMV lídr (lídr viru trpasličí mozaiky) Virology, sv. 154,s. 9-20; a vazebný protein lidského těžkého imunoglobulinového řetězce (BiP), (Macejak D.G. a Sarnow P. (1991), Nátuře, sv. 353, s. 90-94; netranslatovaný lídr z mRNA plášťového proteinu mozaikového viru vojtěšky (AMV RNA 4), (Jobling S.A. a Gehrke L., (1987), Nátuře sv. 325, s. 622-625); lídr viru tabákové mozaiky (TMV), Gallie D.R. a další (1989) Molecular Biology of RNA, s. 237-256); lídr viru chlorotické skvrnitosti kukuřice (MCMV) (Lommel S.A. a další (1991), Virology, sv. 81, s. 382-385. Viz též Della-Cioppa a další (1987), Plant Physiology, sv. 84, s. 965-968. Lze použít i další způsoby pro zesílení translace, například intronů a podobně.

Geny podle vynálezu se mohou pro expresi zaměřit na chloroplast nebo amyloplast. V tomto případě, pokud není gen našeho zájmu přímo vložen do chloroplastu nebo amyloplastu, expresní kazeta navíc obsahuje gen kódující tranzitní peptid usměrňující gen našeho zájmu do chloroplastů. Tyto tranzitní peptidy jsou v oboru známy. Viz například Von Heijne a další (1991) Plant. Mol. Biol. Rep., sv. 9,s. 104-126; Clark a další (1989) J. Biol. Chem., sv. 264, s. 17544-17550; Della29 * · · · · · · · 9 9 9 9 9 • · · ♦ · «· · · · φ

9 9 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9 9 9

9999 9 · «·· «» 99

Cioppa a další (1987) Plant Physiol., sv. 84, s. 965-968; Romer a další (1993) Biochem. Biophys. Res, Commun., sv.

i 196, s. 1414-1421; a Shah a další (1986) Science, sv. 233,

s. 478-481.

Konstrukt může též obsahovat jakékoliv další potřebné regulátory jako například signály lokalizace v jádru (Kalderon a další (1984) Cell sv.39, s. 499-509 a Lassner a další (1991) Plant Molecular Biology sv. 17, s. 229-234); konvenční sekvence translace v rostlinách (Joshi C.P. (1987) Nucleic Acids Research, sv. 15, s. 6643-6653), introny (Luehrsen a Walbot (1991) Mol. Gen. Genet. sv. 225, s. 8193) a podobně, vhodně vázané na nukleotidové sekvence našeho zájmu.

Je známo, že lze exprimovat protein obsahující nativní (přírodní) signální sekvenci. Viz obrázek 3. Alternativně lze použít další signální sekvence známé v oboru jako například signální sekvence α-amylázy ječmene.

Při přípravě expresní kazety lze manipulovat různé fragmenty DNA s cílem získat sekvence DNA se správnou i orientací a pokud je to na místě, ve vhodném čtecím rámci.

Za tímto účelem lze pro spojování fragmentů DNA použít vhodné adaptéry nebo spojovníky a lze užít dalších manipulací pro zajištění vhodných restrikčních míst, odstranění nadbytečné DNA, odstranění restrikčních míst a podobně. Pro tento účel lze použít mutegeneze in vitro, opravy primeru, restrikce, teplotní hybridizace, resekce, ligace, řetězové reakce katalyzované polymerázou (PCR) a podobně, v nichž mohou být zahrnuty inserce, delece nebo substituce, například transice nebo transverze.

Kompozice podle vynálezu lze užít pro transformaci kterékoliv rostliny. Tímto způsobem lze získat geneticky modifikované rostliny, rostlinné buňky, rostlinnou tkáň, * 4« 44

4 4 » »4 4

4 4 4 4 4 « 4 4 4 4 4 • · 4 4 4 4 «44 44 4« semeno a podobně. Transformační protokoly se mohou lišit v závislosti na typu rostliny nebo rostlinné buňky určené k transformaci, to znamená zda je jednoděložná nebo dvoudšložná. Vhodné způsoby transformace rostlinných buněk zahrnuji mikroinjekce (Crossway a další (1986)

Biotechniques, sv. 4, s. 320-334), elektroporaci (Riggs a další (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. USA sv. 83, s. 56025606, transformace prostřednictvím Agrobacterium (Hinchee a další (1988) Biotechnology, sv. 6, s. 915-921), přímý transfer genů (Paszowski a další (1984) EMBO J., sv. 3, s. 2717-2722), balistické urychlení částic bombardováním částicovým dělem) (viz například Sanford a další, Patent USA 4,945.050; a McCabe a další 1988), Biotechnology, sv. 6, s. 923-926). Též viz Weissinger a další (1988) Annual Rev. Genet., sv. 22, s. 421-477; Sanford a další (1987) Particulate Science and Technology, sv. 5, s. 27-37 (cibule); Christou a další (1988) Plant Physiol., sv. 87, s. 671-674 (sojové boby); Mc Cabe a další (1988)

Bio/Technology, sv. 6, s. 923-926 (sojové boby); Datta další (1990) Biotechnology, sv. 8, s. 736-740 (rýže); Klein a další (1988) Proč. Nat. Acad. Sci. USA, sv. 85, s. 4305-4309 (kukuřice); Klein a další (1988) Biotechnology, sv. 6, s. 559-563 (kukuřice); Klein a další (1988) Plant Physiol. sv. 91, s. 440-444 (kukuřice), Fromm a další (1990), Biotechnology, sv. 8, s. 833-839; Tomeš a další Přímý přenos DNA do intaktních rostlinných buněk bombardováním mikroprojektily v: Gamborg and Phillips (eds) Rostlinné kultury buněčné, tkáňové a orgánové: základní způsoby; Springer-Verlag Berlin, 1995 (kukuřice); Hooydaas-Van Slogteren and Hooykaas (1984), Nátuře (London), sv. 311, s. 763-764; Bytebier a další (1987), Proč. Nat. Acad. Sci. USA, sv. 84, s. 5345-5349 (Liliaceae) De Wet a další (1985) v:

• · · · · · · · • * · ♦ · • · · · ♦ · * · ♦ • 9 9 9

99

9 9 9 • · · · • 9 9 9

9 9 9

9 99

Experimentální manipulace s tkání vajíčka, vyd. G.P.Chapman a další, s. 197-209. Longman, NY (pyly); Kaepler a další (1990) Plant Cell Reports, sv. 9, s. 415-418; a Kaeppler a další (1992) Theor. Appl. Genet., sv. 84, s. 560-566 (transformace zprostředkovaná whiskery)/ D.Haluin a další (1992) Plant Cell, sv. 4, s. 1495-1505 (elektroporace); Li a další (1993) Plant Cell Reports, sv. 12, s. 250-255 a Christou a Ford (1995) Annals of Botany, sv. 75, s. 407-413 (rýže); Osjoda a další (1996) Nátur Biotechnology, sv. 14, s. 745-750 (kukuřice pomocí Agrobacterium tumefaciens), které jsou zde všechny zahrnuty ve formě odkazu.

V případě přání lze rostlinný plastid transformovat přímo. Stabilní transformace plastidů byla popsána u vyšších rostlin, viz například SVAB a další (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA sv. 87, s. 8526-8530; SVAB and Maliga (1993), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, sv. 90, s. 913-917; Staub a Maliga (1993), Embo J. sv. 12, s. 601-606. Způsob spočívá v balistickém předání DNA obsahující volitelný markér ásticovým dělem a zavedení DNA do genomu plastidů homologní rekombinací. Kromě toho lze transformaci plastidů uskutečnit transaktivací tichého transgenu z plastidů tkáňově specifickou expresí v jádru kódované a do plastidů zaměřené RNA polymerázy. O takovém systému referoval McBride a další (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. USA sv. 91, s. 7301-7305.

Transformované buňky se mohou zapěstovat do rostlin známými způsoby. Viz například McCormick a další (1986)

Plant Cell Reports, sv. 5, s. 81-84. Tyto rostliny se potom mohou pěstovat a také opylit tímtéž transformovaným kmenem nebo různými kmeny a výsledné potomstvo s potřebnými fenotypovými vlastnostmi lze identifikovat. Mohou se pěstovat jedna nebo dvě generace, aby se zaručilo, že se fenotypové vlastnosti stabilně udržují a dědí a potom se «· ·»»* ·· · »· «· • · · 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 · 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 9 99 999 ·· ♦« semena sklidí pro kontrolu, že se docílilo požadovaného fenotypu nebo jiných vlastností.

Protein se exprimuje do transformovaných organismů v takovém množství, aby byly toxické pro zájmové druhy hmyzu nebo inhibovaly jeho růst.

Následující příklady se podávají jako ilustrace a nemají za cil limitovat rozsah platnosti patentu.

I když byl uvedený patent popisem do podrobnosti ilustrován a uvedeny příklady za účelem srozumitelnosti, je zřejmé, že v rozsahu popsaného patentu lze uskutečnit určité změny a modifikace.

Příklady provedeni vynálezu

Čištění pentinu-1

Semena 1. macroloba.se sebrala v nížinných dešťových pralesích Kostariky a dopravila do laboratoří přihlašovatele, kde se před použitím dezintegrovala, lyofilizovala a skladovala při -20 *C. Zmrzlá semena se rozsekala na malé kousky a homogertizovala pomocí Brinkmannova homogenizátoru. Při typickém provedení se 10 g materiálu ze semen homogenizovalo s 1-2 g nerozpustného polyvinylpyrrolidonu a 50-100 ml 10 mM roztoků pufru fosforečnanu sodného s pH 7,5. Homogenát se potom míchal při 4 °C 8-10 hodin a odstřeďoval 15 minut při 5000 otáčkách za minutu. Kalová voda (supernatant) se opatrně dekantovala, prolila jednou vrstvou Miracloth a shromáždila tak, aby nedošlo k transferu do extraktu lipidických materiálů, které se při odstřeďování na povrchu odělily a ztuhly. Tyto pelety se odložily do odpadu a shromážděná kapalina dosud poněkud zakalená se podruhé 30 minut odstřeďovala při 18.000 otáčkách za minutu na rotačním zařízení Sorwall SS-34 nebo «999 99

9 9 9 9 9 • 9 9 · «9 • 9 9 • · ·

9 9 9 9

9999 9 9« 999 • 9 9

9« 99 podobném. Slabě zakalená kalová voda, nyní označovaná jako surový extrakt, se shromáždila a pelety se poslaly do odpadu. Vzorek surového extraktu se odložil pro zkoušky a zbytek se dialyzoval pomocí separační membrány s mezí prostupnosti na molekulové hmotnosti (MWCO) 3.500 při pěti výměnách pufru fosforečnanu sodného v roztoku 10 mM, pH 7,5 a teplotě 3-4 °C. Poměr dialyzní kapaliny k etraktu byl nejméně 20 : 1. Dialýza pokračovala při výměnách pufru 8-16 hodin. V důsledku vysrážení proteinu se extrakt během dialýzy zcela zakalil. Proto se dialyzovaný extrakt vyčeřil odstředěním při 18 otáčkách za minutu během 30 minut. Výsledný materiál po odstředění je v dalším nazýván surový dialyzovaný extrakt. Surový extrakt a surový dialyzovaný extrakt se analyzovaly na proteinové složení nebo obsah a při biologických testech bylo zjištěno, že obsahují látku insekticidní proti larvě bázlivce západního (CRW) . Bylo zjištěno, že insekticid je protein nebo látka bílkovinného charakteru.

Vzorek 100 ml dialyzovaného surového extraktu se zahříval při asi 80 °C ve vodní lázni asi 5 minut. Zahřátý extrakt se potom ochladil pod 25 °C pomocí ledové lázně a po ochlazení se odstřeďoval 15-30 minut při 18.000 otáčkách pomocí rotačního přístroje Sorval SS-34. Čirý supernatant (kalová voda) se potom oddělil, uložil a v dalším označoval jako tepelně zpracovaný extrakt. Peletizovaný pevný materiál se zlikvidoval. Zjistilo se, že tepelně zpracovaný extrakt někdy vykazuje tendenci gelovat. Tepelně zpracovaný extrakt se testoval na obsah proteinu Bradfordovým způsobem pomocí BSA jako standardu a zjistilo se v biologických testech, že má insekticidní aktivitu proti CRW.

V-zorek teplem zpracovaného extraktu se frakcionoval a zahustil pomocí síranu amonného. Vzorek se ochladil za »444 • · 4 • 4 • ·

4

4444 4 *♦ · 44 44

4 44 4 4 4 4 • · 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

444 44 4« pomoci ledové lázně a za míchání se pomalu přidalo 0,6 g/ml práškového síranu amonného. Po tomto přidání síranu amonného se vzorek udržoval na teplotě ledové lázně dalších asi 30 minut. Potom se vzorek 20 minut odstřeďoval při 4 °C a 18.000 otáčkách za minutu na rotačním přístroji Sorval SS34. Kalová voda a peletizovaný materiál se oddělily a peletizovaný materiál, se opět rozpustil v minimálním množství pufru fosforečnanu sodného koncentrace 10 mM s pH 7,5. Kalová voda a znovu rozpuštěný peletizovaný materiál byly zkoušeny na obsah proteinu Bradfordovou methodou s BSA jako standardem a testovány na biologickou aktivitu proti larvě bázlivce západního (CRW) . Většina pentinu-1 se nalezla v peletizovaném materiálu, který byl insekticidní proti CRW. Alternativně se zmenšil objem teplem zpracovaného extraktu zahuštěním odstředěním pomocí přístroje Centricon™ nebo podobného zařízení podle směrnic výrobce.

Proteiny se též frakcionovaly vylučovací chromatografií (SEC) bud’ na koloně Pharmacia Sephacryl S-200 nebo Pharmacia Superose 12. V závislosti na množství proteinu v analyzovaném vzorku se užívalo různých kolon. Všeobecně platí, že objem vzorku nepřesahoval 0,5-1 % (obj.) objemu kolony. Před vložením vzorku do kolony se kolona přivedla do rovnovážného stavu s pufrem fosforečnanu sodného koncentrace 10 mM s pH 7,5 v množství dvoj- až trojnásobku objemu kolony. Proteiny se eluovaly z kolony pufrem fosforečnanem sodným s pH 7,5 v koncentraci 10 mM. Frakce se zkoušely na obsah proteinu Bradfordovou methodou s BSA jako standardem a biologicky se testovaly na larvy bázlivce západního. Tímto způsobem lze chromatografovat surové nebo dialyzované extrakty, teplem zpracované extrakty, resolubilizované frakce po vysrážení síranu amonného a extrakty a frakce zahuštěné jinými způsoby. Biologicky aktivní materiál se ···* 44 * 44 44 ·» · 4··· · « · * • 4 44 4 4 4 *4 • · 444 4*44*4

4 *44 4**4

4444 4 *4 4*4 *4 «« eluoval hned po průchodu kapaliny nevázané na sorbent v množství odpovídajícím volnému objemu, což svědčí, že aktivní materiál má mírně vysokou (moderately high) molekulovou hmotnost. Tento výsledek je konzistentní s výsledky zkoušek s rozmanitými rozsahy molekulových hmotností získanými s filtračním přístrojem Centricon™ . Takto se zjistilo, že aktivní materiál má v přírodním stavu molekulovou hmotnost nad 100 kDa, což je pravděpodobně výsledek spojení většího množství podjednotek s molekulovou hmotností 40-55 ± 5 kDa. Čistota frakcí se určovala po stanovení molekulové hmotnosti s použitím níže popsané SDSPAGE. Tyto frakce byly převážně čisté při jednom detekovaném primárním pásu a stanovené molekulové hmotnosti podjednotky v rozmezí 40-55 ± 5 kDa.

Tepelně zpracované vzorky nebo vzorky, jež se podrobily vylučovací chromatografii se frakcionovaly anexovou chromatografií za použití buď kolony Pharmacia Q Sepharose nebo kolony Pharmacia Resource Q. Před umístěním vzorku v koloně se kolona promyla roztokem 25 mM Tris-HCl nebo vhodným pufrem obsahujícím NaCl v koncentraci 1 M a potom se přivedla do rovnovážného stavu stejným pufrem bez NaCl.

Pufry použité při chromatografii měly pH v rozmezí 4-10. Pro ilustraci použitých způsobů se zde popisuje chromatografie používající pufru Tris-HCl v koncentraci 25 mM s pH 9,0.

Před vstříknutím vzorku do kolony se vzorek dialyzoval pomocí membrány s 3.500 MWCO s dvěma až třemi výměnami pufru Tris-HCl koncentrace 25 mM bez 1 M roztoku NaCl. Po umístění do kolony se průtok shromáždil a kolona se promyla TrisHCl v koncentraci 25 mM s pH 9,0. Promývací voda se rovněž shromáždila. Potom se kolona eluovala roztokem 25 mM TrisHCl při pH 9,0 se stoupajícím obsahem NaCl od 0 M do 1 M. Všechny shromážděné frakce se dialyzovaly s nejméně dvěma ·· *·»·

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 9 99 999 99 99 výměnami pufru proti fosforečnanu sodnému v koncentraci 10 mM s pH 7,5. Průtok, promývací roztok a frakce eluované solemi se zkoušely na protein Bradfordovou methodou s BSA jako standardem a biologicky testovaly proti larvě bázlivce západního. Aktivní materiál se zjistil v průtoku a ve frakcích eluovaných roztoky mezi 0,2 a 0,5 M NaCl. Pro zjištění, zda došlo k překročení kapacity kolony, jehož výsledkem by byl průchod materiálů kolonou bez vazby na sorbent, prošel aktivní materiál v průtoku po opětovném dosažení rovnováhy v koloně ještě jednou kolonou. Většina materiálu absorbujícího v pásmu UV 289 nm prošla kolonou. Z těchto pozorování vyplývá, že tento materiál má odlišné vlastnosti než materiál, který se v koloně vázal a byl eluován při vzrůstajícím přírůstku NaCl. Jak je známo odborníkům, další použité pufry jsou rovněž pro anexovou chromatografii vhodné. Aktivní materiál se může rovněž purifikovat katexovou chromatografií.

Materiál pentin-1 se přečistil na úroveň blízkou homogenitě vylučovací chromatografií nebo anexovou chromatografií. Minoritní proteinové pásy se odstranily vysokoúčinnou kapalnou chromatografií (HPLC) za použití kolony s převrácenými fázemi před určením aminokyseliny a před stanovením sekvence aminokyselinové sekvence.

Čistota vzorků a molekulová hmotnost podjednotky se stanovily pomocí SDS-PAGE za použití 1.2% polya kryl amidových gelů, zpravidla způsobem podle Laemmli, Nátuře, sv. 227, s. 680-685 (1970). Gely byly značeny buď Coomassie Blue R250 při standardním protokolu (postupu) nebo stříbrem (Hammer a další, Phytochemistry, sv. 28, s. 3019-3026 (1989)). Pomocí SDS-PAGE se zjistilo, že molekulová hmotnost podjednotky aktivní substance je mezi 40-55.000 ± 5.000 Daltonů.

Kromě výše popsaných způsobů se pro oddělení aktivní

»» · ·· · látky od surového extraktu semen může použít i jiných způsobů. Například lze extrakt podrobit isoelektrické fokusaci (IEF) systémem Rotofor (Bio-Rad). Rotofor separuje molekuly na základě jejich isoelektrického bodu pí. Každá molekula má při určitém pH specifický náboj, pozitivní nebo negativní. Rotofor za pomoci elektrického proudu nutí molekuly k pohybu ve směru pH gradientu až dosáhnou svého pí, to znamená pH ve kterém mají nulový náboj. Na svém pí se molekula zastaví, protože ji elektrický proud neovlivňuje. Fokusační komora Rotoforu je rozdělena do dvaceti malých komůrek permeabilními membránami. Těchto dvacet vzorků se z komůrek průběžně odstraňuje aby se omezilo jejich smíšení.

V typickém případě se vzorek vloží do fokusačního média, pufrovaného roztoku (viz instrukce výrobce), který obsahuje 12,5 % (hmotnost/objem) glycerinu a 2,5 % amfolytů s pH 3-10 (Bio-Rad). Po fokusaci se frakce shromáždí, stanoví se. pH každé a každá frakce se dialyzuje proti NaCl koncentrace 1 M pomocí membrány s 3,500 MWCO pro odstranění amfolytů. Potom se vzorky dialyzují proti deionizované vodě pro odstranění NaCl. Každá frakce se lyofilizuje a resuspenduje v 0,4 ml 10 mM NaCl. Frakce z Rotoforu obsahující aktivní materiál se mohou analyzovat na proteiny a biologickými testy s larvami hmyzu. Frakce z Rotoforu se potom mohou podrobit další úpravě nebo separaci jak popsáno výše.

Biologické testy

Biologické testy se prováděly pomocí nově narozených larev bázlivce západního (CRW) chovaných na umělých výživách obsahujících pentin-1 získaný z P. macroloba podle popisu. Pentin-1 může být ze surového extraktu nebo získán přečištěním jak zde popsáno. Pentin-1 se může buď aplikovat zevně na povrch výživy, nebo se vpraví do výživy viz Czapla a Lang, J.Econo. Ento., sv. 83 (6), s. 2480-2485 (1990) .

•Φ *·*· *· * ·· ·· • · * · · ·· · · · · • · · » · · · « · • · ♦ · · ·····* • · · · « ··«· ···· · ·· ·♦· ·· ··

Kultivační misky použité při biologických zkouškách se rozdělily do skupin podle způsobu zpracování. Jeden nebo více preparátů pentinu-1 nebo frakcí z různých separací se roztřídilo do každé misky, přičemž se každý preparát nebo frakce aplikovaly do většího množství komůrek. Každá komůrka byla osazena jednou nebo dvěma nově narozenými larvami. Na horní část každé misky se upevnila folie Mylar s ventilačními otvory zabraňující úniku a umožňující výměnu vzduchu.

Pro zevní (povrchové) aplikace se připravil 2% roztok pentinu-1 v solance (PBS) pufrované 0,1 M fosforečnanem s pH 7,8. Do každé komůrky se na Stonevillovo živné médium pipetovalo sedmdesátpět mikrolitrů pufru v roztoku s pentinem-1. Kultivační miska se otáčela, aby se roztok pentinu-1 na výživném substrátu rovnoměrně distribuoval. Komůrky se osadily parazitem a uzavřely jak popsáno výše. Kontrolní vzorek obsahoval na komůrku pouze 75 μΐ 0,1 M roztoku PBS.

Při aplikaci účinné látky uvnitř živné půdy se Stonevillovo médium připravilo běžným způsobem, ale s pouhými 90 % předepsané vody. Pentin-1 se přidal tak, že ho živná půda obsahovala množství v rozmezí 1-5 Hg/g. Kontrolní vzorek sestával z 0,9 ml pufru PBS přidaného k 8,1 g média. Médium se vlilo do komůrek a pomůrky se zamořily larvami a přikryly, jak popsáno výše. Hmotnost hmyzu se zjištovala 7. den a uvádí se v tabulce.

Tabulka A

Účinky pentinu-1 na larvu bázlivce jižního.

Vzorek__Koncentrace pg/ml výživy_% úmrtnosti

Kontrolní ·» ···» • · · • » • · · ··’· · ·· • · · · • · · ·

Surový			1000	100
Surový			400	15
AS 75			400	60
Velikostní	frakce	17	8	14
Velikostní	frakce	18	8	45
Velikostní	frakce	19	8	29
Poznámka: AS 75 =	populace	v 75% síranu amonném

Po přečištění pentinu-1 a určeni jeho insekticidní aktivity se přistoupilo ke klonováni. Prvním stupněm bylo zjištění časové a prostorové distribuce pentinu-1 westernovým přenosem pro identifikaci tkáně, nebo tkání v rostlině nebo semenu nejpraděpodobněji exprimující tento protein. Protože pentin-1 nebyl izolován v množství potřebném pro tvorbu protilátek, byl protein sekvencován pro vytvořeni peptidů pro syntézu. Údaje o sekvencích sminokyselin pro pentin-1 jsou uvedeny dále v obrázku 1. C0₂-konec a vnitřní sekvence odpovídajíc! přibližně 40 % peptidů pentinu-1 se shromáždily z 15 peptidů přečištěných po štěpeni přečištěného pentinu-1 pomoci CNBr a LysC. Sekvence s NH₂-koncem nebyla při této proceduře identifikována.

Proti pěti z těchto peptidů se vypěstovaly protilátky. Dále jsou uvedeny syntetické peptidy použité pro vytvořeni protilátek.

Syntetický peptid č. 1 (SEQ id. č. 5)

Met Ser Thr Ser Ala Ala Pro Ile Val Phe Pro Pro Tyr Tyr Phe Lys

Poznámka: odpovídá aminokyselinám č. 213-228 v obrázku 1.

Syntetický peptid č. 2 (SEQ id. č. 6)

Ala Leu Gin Pro Gin Asn Asn Tyr Leu Arg Gin Glu Try Asp Leu Asp

Poznámka: odpovídá aminokyselinám č. 344-360 v obrázku 1.

Syntetický peptid č. 3 (SEQ id. č. 7)

Pro Asp Trp Val Val Ile Arg Ser Glu Ser Val Gly Lys

Poznámka: žádný vztah k aminokyselinám v obrázku 1.

Syntetický peptid č. 4 (SEQ id. č. 8)

Lys Ala Phe Val Asn Gly Val Tyr Phe Ile Asn Thr Tyr Asp Ser Ala

Poznámka: žádný vztah k aminokyselinám v obrázku 1.

Syntetický peptid KS (SEQ id. č. 9)

Asn Asn Tyr Leu Arg Ile Gin Glu Tyr Asp Leu Pro Pro Ala Leu

Poznámka: odpovídá aminokyselinám č. 349-363 v obrázku 1.

Skvrny na membráně vzniklé westernovým přenosem pentinu-1 ze syntetických peptidů a experimentálního proteinu označovaného 5C9 se inkubovaly s každou z protilátek. Výsledky inkubace ukázaly, že protilátka vypěstovaná proti syntetickému peptidu KS (protilátka antiKS) a protilátka vypěstovaná proti syntetickému peptidu 2 (protilátka anti-2) rozeznávaly pentin-1. Skvrny po westernovém přenosu tkáňových extraktů Pentaclethra macroloba ve styku s protilátkami prokázaly, že k největšímu rozpoznávání došlo v případě zralých semen průměru 30-40 mm a větších. Z těchto semen byla izolována veškerá RNA.

Po izolaci genomové DNA se použilo kodónem degenerovaných oligonukleotidů na bázi peptidů pro amplifikaci genomových fragmentů řetězovou reakcí katalyzovanou polymerázou PCR. Pro provedení RT-PCR se specifickými oligonukleotidy se použilo exonové sekvence výsledných klonů a potom se provedly zkoušky s RT-PCR s

Φ Φ t φφφφ φφφφ • · φ φ · φφφφ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ • V ΦΦΦ «φφφ cílem získat alespoň částečnou cDNA pentinu-1 pro provedení sondy expresní knihovny. Informace získaná ze sekvencování náhodných klonů cDNA z knihovny nezralého semene P. macroloba se použila pro vytvořeni tabulky použití kodónu ve stavu zrodu. Získané údaje ukázaly, že dřevina P. niacroloba nemá silnou tendenci k užití kodónu a že obsah GC je mírný. Pro použití se zvolila matrice degenerovaných primerů zepředu a zezadu genů odpovídajících peptidům pentinu-1. Sekvence primeru zepředu byla WKRLAGYFDV (pentín-1, aminokyseliny č. 76-86: Val Val Lys Aí^| Leu Ala Gly Tyr Phe Asp Val) (SEQ id. č. 10) a sekvence primeru zezadu byla ENMENLEK, (aminokyseliny pentinu-1 č. 372-379 : Glu Asn Met Glu Asn Leu Glu Lys)(SEQ id. č. 11). Kvůli malému množství získané tkáně se testování iniciačního primeru provádělo pomocí genomové DNA odvozené od listů P. macroloba. Jedna ze šedesáti čtyř možných kombinací primeru poskytla fragment 3,0 kb, který kódoval· peptidové sekvence pentinu-1. Dvojice primerů zepředu a zezadu se potom použila pro amplikfikaci cDNA fragmentu s 0,8 kb z celé RNA izolované ze zralých semen o průměru 30-40 mm. Následné třídění expresní knihovny zralého semene pomoci této sondy cDNA s 0,8 kb poskytlo několik příbuzných klonů, jedním z nich je klon s 1,4 kb kódující dvanáct z patnácti peptidových sekvencí pentinu-1 (SEQ id. č. 1).

Westernové přenosy se prováděly s pentinem-1, syntetickými peptidy pentinu-1, s 5C9 a proteiny BSA po expozici vybraným protilátkám. Přenosy se kontaktovaly s protilátkami vypěstovanými proti všem peptidům a 5C9, vše ve zředění 1:10.000. Každá protilátka rozpoznávala svůj antigen bez detekovatelného projevu zkřížené reaktivity s BSA jako negativní kontrolou. Všechny protilátky rozpoznávaly 1,0 mikrogramů 5C9, s výjimkou těch, které se íntrodukovaly

proti syntetickému peptidu č. 1. Ačkoliv byly syntetické peptidy KS a č. 2 z 74 % identické, anti-2 protilátka nerozpoznávala KS, ale detekovala Pentin-1 a 5C9.

Sekvence nukleové kyseliny v klonu pentinu-1 se určila standardním způsobem známým v oboru. Sekvence cDNA a předvídaná proteinová sekvence pentinu-1 se ukazuje v obrázku 1 a SEQ id. č. 1.

Biotesty klonovaného materiálu Proti larvě bázlivce západního (CRW) se uskutečnily biologické testy za použití ultrazvukem ošetřené E. coli jež se transformovala s jedním nebo několika plasmidy uvedenými v seznamu (tabulka 1). Transformované buňky se pěstovaly v 25-35 ml bujónu TB. Po 24 hodinách se buňky izolovaly odstředěním. Pelety se opětovně suspendovaly v přibližně 1 ml pufru PBS a ošetřily ultrazvukem. Výsledná směs se potom nanesla na povrch živné půdy a osadila nově narozenými larvami bázlivce západního. Po čtyřech dnech se zaznamenávala mortalita. Pozitivní výsledek udával 100% úmrtnost. Negativní výsledek udával méně než 10% úmrtnost. Podobný test se provedl s použitím transformovaných buněk vypěstovaných na agarové plotně. Po uspokojivém růstu se buňky seškrábly, suspendovaly v malém množství pufru PBS a potom se roztok inkorporoval do výživy hmyzu.I zde se úmrtnost zaznamenávala po 4 dnech.

Tabulka 1 ukazuje výsledky dvakrát opakovaných biologických zkoušek. Žádné buňky transformované s údajně negativními plasmidy (geny nelethální vůči larvám bázlivce západního) nezpůsobily larvální úmrtnost v žádném testu.

Tyto plasmidy jsou P7725, P88126 a P11426. Dva plasmidy obsahující kódující sekvenci pro pentin-1, ale žádné promotory pro tvorbu skutečného proteinu, PGEM a P11394,

nevykazovaly žádnou ak^tivitu vůči larvám bázlivce západního. Avšak všechny plasmidy obsahující kódující oblast pro pentin-1 (SEQ id. č. 1) a funkční expresní kazetu vykazovaly vynikající aktivitu proti larvám bázlivce západního. Všechny tyto zkoušky vykázaly 100% úmrtnost. Předběžný rozbor pomocí analýzy typu westernového přenosu ukázal, že protein velikostí podobný pentinu-1 byl přítomen ve všech buněčných extraktech, ale ne v negativních kontrolních vzorcích. Aktivita se projevovala při obou způsobech přípravy buněk a biotestů.

• · ···· ·» • · · · · • · · 9 9 4 · 4

9 9 9

9 99 > 4 4

9 9 9 9

4 · · 4 • 4 · · · ♦ · 9 9 9 4

4*44

4 «4 4 4

TABULKA

	tm tm O 0 2 3	tm tm 0) 0) 2 2	tm tm ω o) 2 a	N/A N/A	2 2	< 2
Výsledek i kontroly biotestu	+-> -o Π3 rcS tm tm <L> <D 2 2	Negat. Negat.	4-1 4-1 (0 (í tm tm O <L> 2 2	Posít. Posit.	Posit. Posit.	Posit.
Typ biotestu	mikroinkorp. svrchním nanášením	mikroinkorp. svrchním nanášením	mikroinkorp. svrchním nanášením	mikroinkorp. svrchním nanášením	mikroinkorp. svrchním nanášením	mikroincorp.
Provedení	Plotna s živným bujónem	Plotna s živným bujónem	Plotna s živným bujónem	Plotna s živným bujónem	Plotna s živným bujónem	Plotna s.
Obsah konstruktu	UBI-Bt	Bt		UBI-full cDNA pentinu-1 z knihovny klonovaného pin II	UBI mod. pentin (ATG-TGA) -Pin II (modif. z pův. klonu, ale patrně nezralý)	cDNA pentinu-1 v pBK-CMV
Plasmid	P7725	P8812	moPentin/PGEM	P11184	P11335	P11361

Transformace protoplastů izolovaných z buněk kukuřičné suspenze se třemi genovými konstrukty pentínu-1 pro genovou expresi a biotesty na larvu bázlívce západního (CRW)

I. Protokol transformace protoplastů

Pro přípravu protoplastů se použily buňky stabilizované suspenze HíII (GS3). Buňky se shromáždily 3-4 dny po kultivaci.

Štěpení buněk: buňky se štěpily 3-5 hodin v roztoku enzymu při 27 °C při rychlosti třepání 50-60 otáček za minutu. Buněčná stěna se štěpila celulázou a pektolyázou.

Získávání protoplastů: biologický materiál po štěpení procházel filtrem délky 30 mm a protoplasty se získaly desetiminutovým odstřeďováním filtrátu při 1000 otáčkách za minutu.

Pelety protoplastů se resuspendovaly v 20 ml nebo 40 ml roztoku KMC. Hustota protoplastů a jejich celkový výtěžek se stanovily počítáním protoplastů hemacytometrem. Suspenze se odstředila za účelem peletizace protoplastů. Peletky protoplastů se suspendovaly v transformačním roztoku MaMg v koncentraci 2 miliony protoplastů na ml.

ml roztoku (asi 4 miliony protoplastů) se přemístily do zkumavek délky 15 ml s kulatým dnem. Každá zkumavka představovala replikaci (všechny byly identické). Pro každý genový konstrukt pentinu-1 se použily nejméně tři replikace. Každý konstrukt obsahoval jak přírodní pentin-1, tak i optimalizovanou sekvenci pentinu-1. Viz SEQ id. č. 1 a 3. K suspenzi protoplastů ve zkumavkách se přidal plasmid DNA (15 mg plasmidu DNA/milion protoplastů) a smíchal.

Po pěti minutách inkubace se ke směsi protoplast/DNA přidaly 2 ml 40% polyethylenglykolu (PEG-8000, Sigma, konečná koncentrace PEG je asi 20 %) a smíchaly několikerým « » · · · · 9 • · · » « » · « · * · · * • · 9 · 9 9 · .99 9 9 9 9 ···· · *· ··· ·· ·· obrácením zkumavky a inkubovaly 20-30 minut při teplotě místnosti.

Do každé zkumavky se přidaly asi 3 ml roztoku soli W5. Zkumavky se přikryly a jemně obrátily. Toto se opakovalo dvakrát až finální objem dosáhl 13-14 ml. Suspenze se odstřeďovala při 1.000 otáčkách za minutu 8 minut. Pro resuspendování protoplastů se použily 3 ml média FW (viz dole). Za pomoci plastové stiskací Pasteurovy pipety se do dvou jamek šestijamkové kultivační plotny rozmístila jedna dávka třímililitrové suspenze z jednoho experimentu, uzavřela parafinem a 24-48 hodin inkubovala v temnu při 28 °C.

Po kultivaci se protoplasty přenesly pomocí plastové stiskací Pasteurovy pipety do zkumavky objemu 15 ml a 8 minut odstřeďují při 500 otáčkách za minutu s cílem peletizovat protoplasty.

Rozbor proteinu a biotesty: jedna pětina až jedna čtvrtina pelet protoplastů v každé replikaci pro každý transformační experiment se vzorkovala pro analýzu exprese pentinu-1 westernovým přenosem. Zbytek pelet protoplastů se použil pro biotesty. Všechny replikační vzorky z téhož transformačního experimentu transformované tímtéž konstruktem pentinu-1 se spojily a přimíchaly do nutriční dávky pro biotesty s larvou bázlivce západního. Tabulka 2 ukazuje výsledky těchto biologických zkoušek.

TABULKA II

Účinek pentinu-1 proti larvám bázlivce západního při přechodné expresí do protoplastů kukuřice. Údaje byly získány v 6 pokusech průběžně opakovaných. Protoplasty byly ošetřeny ultrazvukem a celá směs byla potom přimíchána do diety.

Plasmid #	Obsah konstruktu	Westernový přenos	Biotest na pentin	Kontrola úmrtnosti
P11148 1	UBI-celá C.DNA pentinu-1 z knihovny klonovaného pin II	pozitivní	32 %	N/A
P11335	UBI modif. pentin (ATG- TGA)-pin II N/A (modif. z plného klonu, ale patrně nezralý)	slabě pozitivní	0 %	N/A
P11443	UBI-moPentín-l-Pin II	silně požit.	5 %	N/A
P8126	UBI-Bt	negat.	0 %	negat. kontrola
P3953	UBI-Gus	negat.	0 S	negat. kontrola

ψ...................... ...... I II II. HI. .. ............. ...1, 1,—ιι· ..1,1.,1,

Ρ11184 se použil pouze v posledních 4 pokusech

II. Genové konstrukty pentinu-1 pro transformaci

Pil184 - Ubi promotor P11335 - Ubi promotor P11443 - Ubi promotor pentin-1 pentin-1 pentin-1 (původní klon v plné délce) (částečně modifikovaný gen) (optimalizovaný gen)

Roztoky a média použitá pro transformaci

Roztok KMC - 1000 ml

KC1	8, 65 g
MgClz-6 H2O	16,47 g
CaCl2 - 2 H20	12,50 g
MES 0,5%	5, 0 g

pH s KOH 5,8

Sterilizovat ultrafiltrací

Transformační roztok MaMg

• · · 9 9 ·	• · ·	• ·	99
• · ·	• · · ·	* »	9 9
• ·	• · ·	• ·	9 9
• ·	• » ·	* 9	9 9
• · ·· 9	• · * · ·	• 9	9 9

M manit 108,1 g 15 mM MgCl₂ - 6 H₂O 3,05 g 10 mM MES 1, 95 g pH 5,7

Sterilizovat ultrafiltrací

40% PEG - 100 ml

Přidá se 40 g PEG k 60 ml transformačního roztoku MaMg. K rozpuštění PEG se krátce použije mikrovln. Přidá se další roztok MaMg až do finálního objemu 100 ml. Upraví se pH na 7,0. Sterilizovat ultrafiltrací.

Roztok enzymu pro štěpení buněk v suspenzi (roztok enzymů)

Roztok enzymů obsahuje 3 % celulázy RS a 0,3 % pektolyázy Y23 v roztoku protoplastu.

Roztok protoplastu - 1000 ml

M manit. 108, 1 g mM MES 1,95 g mM CaCl*. - 2 H₂0 147 mg mM MgCl₂ - 6 H₂O 203 mg

1% BSA (podle volby) 1 g pH 5,7

Sterilizovat ultrafiltrací

Roztok soli W5 - 1000 ml

154 mM NaCl

125 mM CaCl₂ - 2 H₂0 5 mM KC1 5 mM glukóza pH s KOH 5,5

9,0 g 18,56 g 0,373 g 0,901 g

Sterilizovat ultrafiltrací ji^Λ'.ίνΜ,'Μ'.ίΙ,Ιί^Β.ίΒΐΗ^ΙΟΒ,ι «···»· *· · · · «4 • 4 4 4 · · 4 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 9 99 ·99 99 99

Médium FW - 1000 ml soli MS (Sigma M5519) 4,3 g sacharóza 30,0 g manit 54,0 g Proline 1,5 g 2,4-D 3,0 mg vitaminy B5 ΙΟΟΟχ 1 ml pH 5, 8

Sterilizovat ultrafiltrací

Transformace a regenerace kukuřičného tumoru (callus)

Nezralé zárodky kukuřice z rostlinných skleníkových donorů se bombardují plasmidem obsahujícím tři konstrukty pentinu-1 a plasmidem obsahujícím selektovatelný gen s funkcí signálního znaku, PAT, (Wohlleben, W., Arnold W., Broer I., Hilleman D., Strauch E. a Puehler A.:

Nukleotidová sekvence genu fosfinothricin-Nacetyltransferázy ze Streptomyces viridochromogenes Tue 494 > a její exprese v Nicotiana tabacum, Gene, sv. 70, s. 25-37 (1988), vnášející rezistenci do herbicidu Bialophos následujícím způsobem:

(Poznámka: všechny předpisy medií jsou v Příloze.) «

Příprava cílové tkáně:

Klasy se 20 minut povrchově sterilizují 30% roztokem bělícího činidla Chlorox s přísadou 0,5% detergentu Micro a dvakrát opláchnou sterilizovanou vodou. Nezralá embrya se vyříznou a umístí v počtu 25 embryí na plotnu osovou stranou dolů (scutellum nahoru). Kultivují se v temnu v médiu 560L 4 dny před bombardováním. V den bombardování se embrya přenesou na 4 hodiny do média 560Y a umístí v cílovém pásmu • 4 (2,5 cm) .

Příprava DNA:

100 μΐ připravených wolframových částic ve vodě 10 μΐ (1 μς) DNA v pufru TrisEDTA (celkem 1 pg)

100 μΐ 2,5 M CaCl₂ μΐ 0,1 M spermidin

Všechna reakční činidla se postupně přidávají k suspenzi wolframových částic na vortexu pro více zkumavek. Plasmidy se upraví pro finální poměr 1:1 na základě rozměrů. Na konečnou směs se krátce působí ultrazvukem a ponechá se deset minut inkubovat za stálého otáčení. Po vysrážení se zkumavky krátce odstředí, kapalina se odstraní, promyje 500 ml 100% ethanolu a 30 vteřin se odstřeďuje. Kapalina se opět odstraní a k peletám wolframových částic se přidá 105 μΐ 100% ethanolu. Pro bombardování částicovým dělem se částice wolfram/DNA zpracují ultrazvukem a po 10 μΐ vnášejí do středu každého makronosiče a před bombardováním se nechají 2 minuty schnout.

Ožiti částicového děla:

Plotny se vzorky se bombardovaly intenzitou #4 v částicovém dělu #HE34-1 nebo #HE34-2. Všechny vzorky dostaly jednotlivý zásah při 650 psi, přičemž šlo celkem o 10 aliquotů vyjmutých ze všech zkumavek s připravenými systémy částice/DNA.

Následné zpracování:

Po bombardování se embrya udržují 2 dny na médiu 560Y a potom se přenesou do selekčního média 560R obsahujícího 3 mg/1 Biaiophos a každé 2 týdny subkultivuji. Po přibližně 10 , .. .. - .. .. - 99 9<mq • 9 9999 99 · 99 99

9 9 9 9 9 9999

999 9999

9 999 999999

9 999 9999

9999 9 9» 999 99 99 týdnech selekce se z klonů nádoru odolných vůči selekci vybraly vzorky pro PCR (řetězovou reakci katalyzovanou polymerázou) a analýzu TLC aktivity vůči fumonisinesteráze. Pozitivní linie se přenesly do média 288J za účelem regenerace rostlin. Po dozrání somatického embrya (2-4 týdny) se dobře vyvinutá somatická embrya přenesou do média pro klíčení a v něm do osvětleného kultivačního prostoru. Přibližně po 7-10 dnech se vyvíjející se rostlinky přenesou do média ve zkumavkách na 7-10 dní, dokud se rostlinky dobře nevyvinou. Potom se rostliny přenesou do plochých dělených sadbovačů (odpovídajících květináčům 2,5 palců) obsahujících zahradní zem a nechají se 1 týden růst ve fytotronu, potom další 1-2 týdny ve skleníku a potom se přenesou do klasických květináčů (600) s obsahem 1,6 galonu (ca 4 1), kde rostou do zralosti.

PŘÍLOHA

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizovaná voda	900,000	ml
Základní soli CHU (N6) (SIGMA C-1416)	1,600	g
Makroživiny N6, lOx zás. roztok # #	60,000	ml
Dusičnan draselný	1, 680	g
Minoritní soli B5H, lOOOx # # #	0, 600	ml
B5H FeNa EDTA, lOOx # # # #	6, 000	ml
Vitaminová směs Eriksson, (lOOOx SIGMA- 1511)	0,400	ml
Vitaminová směs S & H, lOOx zás. roztok (S3766)	6, 000	ml
Thiamin.HCl, 0,4 mg/ml	0,500	g
L-Prolin	1, 980	g
Hydrolyzát kaseinu (kyselý)	0,300	g

9999 *· · ·» ·· • · · 9 9 9 9 · « 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 9 99 999 99 99

Sacharóza	20,000	g
Glukóza	0, 600	g
2,4-D 0,5 mg/ml	1, 600	ml
Gelrite @	2,000	g
Dicamba 1 mg/ml #	1,200	ml
Dusičnan stříbrný 2 mg/ml #	1,700	ml

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

# = Přidej po sterilizaci a ochlazení na teplotu.

Rozpusť přísady postupně ve vyčištěné deionizované vodě. Uprav pH na 5,8.

Po úpravě pH doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou. Sterilizuj a ochlaď na 60 °C.

# # = Rozpusť 1,660 g dihydrátu chloridu vápenatého v 950,000 ml vyčištěné deionizované vody. Potom postupně rozpusť 4,629 g síranu amonného, 4,000 dihydrogenfosforečnanu draselného KH₂PO₄, 1,850 g síranu hořečnatého MgS0₄ .7H₂O a 28,300 g dusičnanu draselného.

Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodou.

# # # = Rozpusť postupně 3,000 g kyseliny borité, 10,000 g monohydrátu síranu hořečnatého^0,250 g molybdenanu sodného dihydrátu a 0,750 g jodidu draselného ve vyčištěné deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodou.

# # # # = Rozpusť 3,700 g dihydrátu EDTA disodného a 2,790 g heptahydrátu síranu železnatého v deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou. Celkový objem (L) = 1,00.

604 A ·> *·«· • « · • 9

9 99 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 99 99 9 9

9 9 9

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizované voda	900,000	ml
Základní soli CHU (N6) (SIGMA C-1416)	1, 600	g
Makroživiny N6 lOx zás. roztok # #	60,000	ml
Dusičnan draselný	1, 680	g
Minoritní soli B5H lOOOx # # #	0, 600	ml
B5H FeNa EDTA lOOx # # # #	6,000	ml
Vitaminová směs Eriksson (lOOOx SIGMA- 1511)	0,400	ml
Vitaminová směs S & H lOOx zás. roztok (S3766)	6, 000	ml
Thiamin.HCl, 0,4 mg/ml	0,500	g
L-Prolin	1, 980	g
Hydrolyzát kaseinu (kyselý)	0,300	g
Sacharóza	20,000	g
Glukóza	0,600	g
2,4-D 0,5 mg/ml	1,600	ml
Gelrite @	2, 000	g
Dicamba 1 mg/ml #	1,200	ml
Dusičnan stříbrný 2 mg/ml #	1,700	ml
Bialaphos 1 mg/ml #	3,000	ml

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

# = Přidej po sterilizaci a ochlazení na teplotu.

Rozpusť přísady postupně ve vyčištěné deionizované vodě. Uprav pH na 5,8.

Po úpravě pH doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou. Sterilizuj a ochlaď na 60 °C.

# # = Rozpusť 1,660 g dihydrátu chloridu vápenatého v 950,000 ml vyčištěné deionizované vody. Potom postupně φφ φ · * · φ · φφφφ φ rozpusť 4,629 síranu amonného, 4,000 dihydrogenfosforečnanu draselného KH₂PO₄, 1,850 g síranu horečnatého MgSO₄ 7H₂O, a

28,300 g dusičnanu draselného. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodou.

# # # = Rozpusť postupně 3,000 kyseliny borité, 10,000 g monohydrátu síranu horečnatého, 0,250 g dihydrátu molybdenanu sodného, a 0,750 g jodidu draselného ve vyčištěné deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem vyištěnou deionizovanou vodou.

# # # # = Rozpusť 3,700 g dihydrátu EDTA disodného a 2,790 g heptahydrátu síranu železnatého v deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou. Celkový objem (L) = 1,00.

605 J

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizované voda	900,000	ml
Základní soli CHU (N6) (SIGMA C-1416)	1,600	g
Makroživiny N6 lOx zás. roztok # #	60,000	ml
Dusičnan draselný	1,680	g
Minoritní soli B5H lOOOx # # #	0, 600	ml
B5H FeNa EDTA lOOx # # # #	6, 000	ml
Vitaminová směs Eriksson (lOOOx SIGMA- 1511)	0,400	ml
Vitaminová směs S & H lOOx zás. roztok (S3766)	6, 000	ml
Thiamin.HCl, 0,4 mg/ml	0,500	g
Sacharóza	20,000	g
Glukóza	0,600	g
2,4-D 0,5 mg/ml	1, 600	ml
Gelrite @	2,000	g

·· ·♦·· ·· 9 ·· ·· • · Φ · » · · · · · * • · Φ · Φ ΦΦΦΦ • · · · · ΦΦΦΦΦΦ

Dicamba 1 mg/ml #	1,200	ml
Dusičnan stříbrný 2 mg/ml #	0, 425	ml
Bialaphos 1 mg/ml #	3,000	ml

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

# = Přidej po sterilizaci a ochlazení na teplotu.

Rozpusť přísady postupně ve vyčištěné deionizované vodě Uprav pH na 5,8.

Po úpravě pH doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou Sterilizuj a ochlaď na 60 °C.

# # ~ Rozpusť 1,660 g dihydrátu chloridu vápenatého v 950,000 ml vyčištěné deionizované vody. Potom postupně rozpusť 4,629 síranu amonného, 4,000 dihydrogenfosforečnanu draselného KH₂PO₄, 1, 850 g síranu hořečnatého MgSO₄ .7H₂O, a

28,300 g dusičnanu draselného. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodou.

# # # = Rozpusť postupně 3,000 kyseliny borité, 10,000 g monohydrátu síranu hořečnatého, 0,250 g molybdenanu sodného dihydrátu, a 0,750 g jodidu draselného ve vyčištěné deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodou.

# # # # = Rozpusť 3,700 g dihydrátu EDTA disodného a 2,790 g heptahydrátu síranu železnatého v deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou. Celkový objem (L) 1,00.

406 S

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizované voda	800,000	ml
Základní soli CHU (N6) (SIGMA C-1416)	1, 600	g

···· ·>· · «· «·

9 9 · 9 9 9 9··» • 9 *99 99··

9 999 999999

9 999 9999

9999 9 99 999 99 99

Makroživiny N6 lOx zás. roztok # #	60,000	ml
Dusičnan draselný	1, 680	g
Minoritní soli B5H lOOOx zás. rozt. # # #	0,600	ml
B5H Fe Na EDTA lOOx # # # # ’	6,000	ml
Vitaminová směs Eriksson (lOOOx SIGMA- 1511)	0,400	ml
Vitaminová směs S & H lOOx zás. roztok (S3766)	6, 000	ml
Thiamin.HCl, 0,4 mg/ml	0,500	ml
L-Prolin	1.980	g
Hydrolyzát kaseinu (kyselý)	0,300	g
Sacharóza	120.000	g
Glukóza	0, 600	g
2,4-D 0,5 mg/ml	1, 600	ml
Gelrite @	2,000	g
Dicamba 1 mg/ml #	1,200	ml
Dusičnan stříbrný 2 mg/ml #	1,700	ml

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

# = Přidej po sterilizaci a ochlazení na teplotu.

Rozpusť přísady postupně ve vyčištěné deionizované vodě. Uprav pH na 5,8.

Po úpravě pH doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou. Sterilizuj a ochlaď na 60 °C.

# # = Rozpusť 1,660 g dihydrátu chloridu vápenatého v 950,000 ml vyčištěné deionizované vody. Potom postupně rozpusť 4,629 síranu amonného, 4,000 dihydrogenfosforečnanu draselného KH₂PO₄, 1,850 g síranu hořečnatého MgSO₄ .7H2O a

28.300 g dusičnanu draselného. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodou.

»··» 9« · 99 99 • 9 » 9999 9999

9 99 9 9999

9 999 99999 9

9 999 9999

9999 9 ·* 999 «9 «9 # # # = Rozpusť postupně 3,000 kyseliny borité, 10,000 g monohydrátu síranu horečnatého, 0,250 g molybdenanu sodného dihydrátu a 0,750 g jodidu draselného ve vyčištěné deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodou.

# # # # = Rozpusť 3,700 g dihydrátu EDTA disodného a 2,790 g heptahydrátu síranu železnatého v deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou. Celkový objem (L) = 1,00.

272 V

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizované voda	950,000	ml
Soli MS (Gibco 11117-074)	4,300	g
Myo-inosit	0,100	g
Zásobní roztok vitaminů MS # #	5, 000	ml
Sacharóza	40,000	g
Bacto-agar @	6,000	g

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

Rozpusť přísady postupně ve vyčištěné deionizované vodě. Uprav pH na 5,6.

Po úpravě pH doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodou.

Sterilizuj a ochlaď na 60 °C.

# # = Rozpusť postupně 0,100 g kyseliny nikotinové, 0,020 g thiaminhydrochloridu, 0,100 g pyridoxinhydrochloridu a 0,400 g glycinu v 875,00 ml vyčištěné deionizované vody. Rozděl do dávek po 400 ml. Thiaminhydrochlorid a pyridoxinhydrochlorid se uchovávají v zatemněném exsikátoru. Skladovat 1 měsíc, ·· ···· 9* · ·« ··'”' • · · ··«· ··· · • · · · · tr · · · • · «·· · · · · ·«·» · »» ··· ·· »» pokud nedojde ke kontaminaci nebo vysrážení, potom se zásoba obnoví.

Celkový objem (L) = 1,00

288 J

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizované voda	950,000	ml
Soli MS	4, 300	g
Myo-inosit	0,100	g
Zásobní roztok vitaminů MS # #	5,000	ml
Zeatin, 5 mg/ml	1,000	ml
Sacharóza	60,000	g
Gelrite @	3,000	g
Indoloctová kyselina 0,5 mg/ml #	2,000	ml
Abscisová kyselina, 0,1 mM roztok	1,000	ml
Bialaphos 1 mg/ml #	3, 000	ml

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

Rozpusť přísady postupně ve vyčištěné deionizované vodě. Uprav pH na 5,6.

Po úpravě pH doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou. Sterilizuj a ochlad’ na 60 °C.

Přidej 3,5 g/1 Gelrite v biologickém zájmu buněk.

# # = Rozpusť postupně 0,100 g kyseliny nikotinové, 0,020 g thiaminhydrochioridu, 0,100 g pyridoxinhydrochloridu a 0,400 g glycinu v 875,00 ml vyčištěné deionizované vody. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodou. Rozděl do dávek po 400 ml. Thiaminhydrochlorid a pyridoxinhydrochlorid se uchovávají v zatemněném exsikátoru. Skladovat 1 měsíc, • · • · • · pokud nedojde ke kontaminaci nebo vysrážení, potom se zásoba obnoví.

Celkový objem (L) = 1,00

560L

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizovaná voda filtrovaná	950,000	ml
Základní soli CHU (N6) (SIGMA C-1416)	4,000	g
Vitaminová směs Eriksson (lOOOx SIGMA- 1511)	0,400	ml
Thiamin.HCl, 0,4 mg/ml	1,250	g
Sacharóza	20,000	g
2,4-D 0,5 mg/ml	2,000	ml
L-Prolin	2,880	g
Gelrite @	2,000	g
Dusičnan stříbrný 2 mg/ml #	4,250	ml

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

# = Přidej po sterilizaci a ochlazení na potřebnou teplotu. Rozpusť přísady postupně v deionizované vodě.

Uprav pH na 5,8 pomocí KOH.

Doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou.

Sterilizuj a ochlaď na teplotu místnosti.

Celkový objem (L) = 1,00

560R

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizovaná voda filtrovaná	950,000	ml
Základní soli CHU (N6) (SIGMA C-1416)	4,000	g

• · · · · · · • · · 4 · · · ·

I· · · · · · · · * · 9 9

9 9 · 9 9 ·

999 9 9 99

Vitaminová směs Eriksson (lOOOx SIGMA- 1511)	1,000	ml
Thiamin.HCl, 0,4 mg/ml	1,250	g
Sacharóza	30,000	g
2,4-D 0,5 mg/ml	4,000	ml
Gelrite @	3,000	g
Dusičnan stříbrný 2 mg/ml #	0, 425	ml
Bialaphos 1 mg/ml #	3,000	ml

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

# = Přidej po sterilizaci a ochlazení na teplotu. Rozpusť přísady postupně v deionizované vodě. Uprav pH na 5,8 pomocí KOH.

Doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou. Sterilizuj a ochlaď na teplotu místnosti.

Celkový objem (L) = 1,00.

560Y

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizovaná voda filtrovaná	950,000	ml
Základní soli CHU (N6) (SIGMA C-1416)	4,000	g
Vitaminová směs Eriksson (lOOOx SIGMA- 1511)	1,000	ml
Thiamin.HCl, 0,4 mg/ml	1,250	g
Sacharóza	120,000	g
2,4-D 0,5 mg/ml	2,000	ml
L-Proline	2,880	g
Gelrite @	2,000	g
Dusičnan stříbrný 2 mg/ml #	4,250	ml

¹ v ί'Ι W-¾ ·· ·«· · · · 9 ♦ · · · • · · · · · · · · · ·

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

# = Přidej po sterilizaci a ochlazení na teplotu.

Rozpusť přísady postupně v deionizované vodě.

Uprav pH na 5,8 pomocí KOH.

Doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou.

Sterilizuj a ochlaď na teplotu místnosti.

** Autoklávovat kratší dobu kvůli zvýšenému obsahu sacharózy.

Celkový objem (L) = 1,00.

Plasmidy PHP11361 a PHP11511 byly uloženy v Type Culture Collection, Bethesda, Maryland a mají přírůstková čísla 209026 a 209025. PHP 11361 obsahuje nukleotidovou sekvenci přírodního pentinu-1. PHP11511 obsahuje optimalizovanou sekvenci pentinu-1.

Všechny publikace a patentové přihlášky zmíněné v této specifikaci odpovídají odborné úrovni pracovníků oboru, kterým je patent určen. Všechny publikace a patentové přihlášky jsou zde zahrnuty odkazy ve stejném rozsahu, jako kdyby byla každá individuální publikace nebo patentová přihláška specificky a individuálně zahrnuta odkazem.

Třebaže uvedený vynález byl detailně popsán ilustracemi a příklady pro snazší pochopení a zvýšení srozumitelnosti, je zřejmé, že v rozsahu předložených nároků lze uskutečnit určité změny a modifikace.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) Všeobecné informace:

(I) Přihlašovatel: Cigaň, Amy L

Czapla, Thomas H

φ· ΦΦΦΦ «: ·

Φ ΦΦΦ • · 1 · « φ φ I φ

5 φ · ••ο 4 φ«

Fallis, Lynn Meyer, Terry E Mundell, Scott A Sabus, Brian Schubert, Karel (II) Název vynálezu: Proteiny s insekticidnírai účinky a způsoby jejich užití (III) Počet sekvencí: 11 (IV) Adresa pro korespondenci:

(A) Adresát: W.Murray Spruill (Alston & Bird, LLP) (B) Ulice: 3605 Glenwood Ave.

(C) Město: Raleigh (D) Stát: NC (Severní Karolina) (E) Země: USA (F) ZIP (PSČ): 27622 (V) Počítačem čitelné provedení:

(A) Médium: Disketa 3,5 (B) Počítač: kompatibilní s IBM PC (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1,0, verze #1,30 (VI) Údaje o přihlášce:

(A) Číslo přihlášky:

(B) Datum registrace:

(C) Klasifikace:

(VIII) Informace o patentovém právníkovi/agentu:

(A) Jméno: Spruill, W. Murray (B) Registrační číslo: 32.943 (C) Číslo spisu: 5718-9 (IX) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 919 420 2202 (B) Telefax: 919 881 3175 (2) Informace pro SEQ id. č.l:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1469 bp (B) Typ: nukleová kyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: cDNA (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (IX) Znak:

(A) Klíčové označení: CDS (B) Lokace: 31...1257 (XI) Popis sekvence: SEQ id. č. 1:

CGGCACGAGC TCGTACAGAT TCTATCCATT ATG AAG TCG AAA ATG GCC ATG CTC 54

Met Lys Ser Lys Met Ala Met Leu

5

CTT Leu

TTG Leu 10

TTA Leu

TTT Phe

TGT GTG TTA

TCT AAT Ser Asn

CAG CTA GTG GCA GCA TTT

TCC Ser

Cys

Val

Leu 15

Gl'n

Leu

Val 20

Ala

Ala

Phe

ACA

CAA

GCG

AAA

GCT

TCT

AAA

GAT

GGA

AAC

TTA

GTC

ACA

GTT

CTT

GCC

Thr

Gin

Ala

Lys

Ala

Ser

Lys

Asp

Gly

Asn

Leu

Val

Thr

Val

Leu

Ala

25

30

35

40

65

4

« · · ·

9 · • 9 • · • • ·

• • * ·> 9 9 i : • ··

• · · · • * « * » « • · · » * · · »· ·»

« 9 • 9 99

• • • • •

ATT

GAT

GGA

GGT

GGT

ATC

AGA

GGA

ATT

ATC

CCC

GGA

GTT

ATT

CTC

AAA

198

Ile

Asp

Gly

Gly

Gly

Ile

Arg

Gly

Ile

Ile

Pro

Gly

Val

Ile

Leu

Lys

45

50

55

CAA

CTA

GAA

GCT

ACT

CTT

CAG

AGA

TGG

GAC

TCA

AGT

GCA

AGA

CTA

GCA

246

Gin

Leu

Glu

Ala

Thr

Leu

Gin

Arg

Trp

Asp

Ser

Ser

Ala

Arg

Leu

Ala

60

65

70

GAG

TAT

TTT

GAT

GTG

GTT

GCC

GGG

ACG

AGC

ACT

GGA

GGG

ATT

ATA

ACT

294

Glu

Tyr

Phe

Asp

Val

Val

Ala

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Gly

Ile

Ile

Thr

75

80

85

GCC

ATT

CTA

ACT

GCC

CCG

GAC

CCA

CAA

AAC

AAG

GAC

CGT

CCT

TTG

TAT

342

Ala

Ile

Leu

Thr

Ala

Pro

Asp

Pro

Gin

Asn

Lys

Asp

Arg

Pro

Leu

Tyr

90

95

100

GCT

GCC

GAA

GAA

ATT

ATC

GAC

TTC

TAC

ATA

GAG

CAT

GGT

CCT

TCC

ATT

390

Ala

Ala

Glu

Glu

Ile

Ile

Asp

Phe

Tyr

Ile

Glu

His

Gly

Pro

Ser

Ile

105

110

115

120

TTT

AAT

AAA

TCC

ACC

GCC

TGC

TCG

TTG

CCT

GGT

ATC

TTT

TGT

CCA

AAG

438

Phe

Asn

Lys

Ser

Thr

Ala

Cys

Ser

Leu

Pro

Gly

Ile

Phe

Cys

Pro

Lys

125

130

135

TAT

GAT

GGG

AAG

TAT

TTA

CAA

GAA

ATA

ATA

AGC

CAG

AAA

TTG

AAT

GAA

486

Tyr

Asp

Gly

Lys

Tyr

Leu

Gin

Glu

Ile

Ile

Ser

Gin

Lys

Leu

Asn

Glu

140

145

150

ACA

CTA

CTA

GAC

CAG

ACA

ACA

ACA

AAT

GTT

GTT

ATC

CCT

TCC

TTC

GAC

534

Thr

Leu

Leu

Asp

Gin

Thr

Thr

Thr

Asn

Val

Val

Ile

Pro

Ser

Phe

Asp

155

160

165

ATC

AAG

CTT

CTT

CGT

CCA

ACC

ATA

TTC

TCA

ACT

TTC

AAG

TTA

GAG

GAA

582

Ile

Lys

Leu

Leu

Arg

Pro

Thr

Ile

Phe

Ser

Thr

Phe

Lys

Leu

Glu

Glu

170

175

180

GTT

CCT

GAG

TTA

AAT

GTC

AAA

CTC

TCC

GAT

GTA

TGC

ATG

GGA

ACT

TCA

630

Val

Pro

Glu

Leu

Asn

Val

Lys

Leu

Ser

Asp

Val

Cys

Met

Gly

Thr

Ser

18 5

190

195

200

GCA

GCA

CCA

ATC

GTA

TTT

CCT

CCC

TAT

TAT

TTC

AAG

CAT

GGA

GAT

ACT

678

Ala

Ala

Pro

Ile

Val

Phe

Pro

Pro

Tyr

Tyr

Phe

Lys

His

Gly Asp

Thr

205

210

215

GAA

TTC

AAT

CTC

GTT

GAT

GGT

GCA

ATC

ATC

GCT

GAT

ATT

CCG

GCC

CCG

726

Glu

Phe

Asn

Leu

Val

Asp

Gly

Ala

Ile

Ile

Ala

Asp

Ile

Pro

Ala

Pro

220

225

230

GTT

GCT

CTC

AGC

GAG

GTG

CTC

CAG

CAA

GAA

AAA

TAC

AAG

AAT

AAA

GAA

774

Val

Ala

Leu

Ser

Glu

Val

Leu

Gin

Gin

Glu

Lys

Tyr

Lys

Asn

Lys

Glu

235

240

245

ATC

CTT

TTG

CTG

TCT

ATA

GGA

ACT

GGA

GTT

GTA

AAA

CCT

GGT

GAG

GGT

822

Ile

Leu

Leu

Leu

Ser

Ile

Gly

Thr

Gly

Val

Val

Lys

Pro

Gly

Glu

Gly

250

255

260

«« 9 99 9

Z /* ········»··

V Ο ·· · 1 · · · · i

- ···· 9 9 9 99 9 9 9 99

TAT TCT GCT AAT CGT

ACT Thr 270

TGG Trp

ACT Thr

ATT TTC GAT TGG AGT AGT GAA ACT

870

Tyr 265

Ser Ala

Asn

Arg

Ile

Phe

Asp 275

Trp

Ser

Ser

Glu

Thr 280

TTA

ATC

GGG

CTT

ATG

GGT

CAT

GGA

ACG

AGA

GCC

ATG

TCT

GAT

TAT

TAC

918

Leu

Ile

Gly

Leu

Met

Gly

His

Gly

Thr

Arg

Ala

Met

Ser

Asp

Tyr

Tyr

285

290

295

GTT

GGC

TCA

CAT

TTC

AAA

GCC

CTT

CAA

CCC

CAG

AAT

AAC

TAC

CTC

CGA

966

Val

Gly

Ser

His

Phe

Lys

Ala

Leu

Gin

Pro

Gin

Asn

Asn

Tyr

Leu

Arg

300

305

310

ATT

CAG

GAA

TAC

GAT

TTA

GAT

CCG

GCA

CTG

GAA

AGC

ATT

GAT

GAT

GCT

1014

Ile

Gin

Glu

Tyr

Asp

Leu

Asp

Pro

Ala

Leu

Glu

Ser

Ile

Asp

Asp

Ala

315

320

325

TCA

ACG

GAA

AAC

ATG

GAG

AAT

CTG

GAA

AAG

GTA

GGA

CAG

AGT

TTG

TTG

1062

Ser

Thr

Glu

Asn

Met

Glu

Asn

Leu

Glu

Lys

Val

Gly

Gin

Ser

Leu

Leu

330

335

340

AAC

GAA

CCA

GTT

AAA

AGG

ATG

AAT

CTG

AAT

ACT

TTT

GTC

GTT

GAA

GAA

1110

Asn

Glu

Pro

Val

Lys

Arg

Met

Asn

Leu

Asn

Thr

Phe

Val

Val

Glu

Glu

.345

350

355

360

ACA

GGT

GAA

GGT

ACC

AAT

GCA

GAA

GCT

TTA

GAC

AGG

CTG

GCT

CAG

ATT

1158

Thr

Gly

Glu

Gly

Thr

Asn

Ala

Glu

Ala

Leu

Asp

Arg

Leu

Ala

Gin

Ile

365

370

375

CTT

TAT

GAA

GAA

AAG

ATT

ACT

CGT

GGT

CTC

GGA

AAG

ATA

TCT

TTG

GAA

1206

Leu

Tyr

Glu

Glu

Lys

Ile

Thr

Arg

Gly

Leu

Gly

Lys

Ile

Ser

Leu

Glu

380

385

390

GTG

GAT

AAC

ATT

GAT

CCA

TAT

ACT

GAA

CGT

GTT

AGG

AAA

CTG

CTA

TTC

1254

Val

Asp

Asn

Ile

Asp

Pro

Tyr

Thr

Glu

Arg

Val

Arg

Lys

Leu

Leu

Phe

395

400

405

TGA TACGAATTGA AGTTGTTTCC TCCTTGCCAT ATAGCCTCAC TTTGTTTGGC 1307 ★

AATAAATAAA	TAAATAAATG	TAATCGTTTG	GTTTGATGTC	CTTGACTTTG	TCATATATGC	1367
TGGCTCTATA	AGAAGCACCA	GCAGATAAAT	AAAGGTTAAT	GTTTGAGGTA	TWAARWAAAA	1427
AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAACTC	GA		1469

(2) Informace pro SEQ id. č. 2: (I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 409 aminokyselin • · · » ·* · 9 · · · 9 · · · 9 • · 9 « 9 *99» * 9 9 9 9 «99999

9 999 «999

9999 9 9· 9 9» «9 99 (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (III) Typ molekuly: protein (XI): Popis sekvence: SEQ id. č. 2

Met

Lys

Ser

Lys

Met

Ala

Met

Leu

Leu

Leu

Leu

Phe

Cys

Val

Leu

Ser

1

5

10

15

Asn

Gin

Leu

Val

Ala

Ala

Phe

Ser

Thr

Gin

Ala

Lys

Ala

Ser

Lys

Asp

20

25

30

Gly

Asn

Leu

Val

Thr

Val

Leu

Ala

Ile

Asp

Gly

Gly

Gly

Ile

Arg

Gly

40 45

Ile

Ile 50

Pro

Gly

Val

Ile

Leu 55

Lys

Gin

Leu

Glu Ala Thr Leu 60

Gin

Arg

Trp

Asp

Ser

Ser

Ala

Arg

Leu

Ala

Glu

Tyr

Phe

Asp

Val

Val

Ala

Gly

65

70

75

80

Thr

Ser

Thr

Gly

Gly

Ile

Ile

Thr

Ala

Ile

Leu

Thr

Ala

Pro

Asp

Pro

85

90

95

Gin

Asn

Lys

Asp

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ala

Ala

Glu

Glu

Ile

Ile

Asp

Phe

100

105

110

Tyr

Ile

Glu

His

Gly

Pro

Ser

Ile

Phe

Asn

Lys

Ser

Thr

Ala

Cys

Ser

115

120

125

Leu

Pro

Gly

Ile

Phe

Cys

Pro

Lys

Tyr

Asp

Gly

Lys

Tyr

Leu

Gin

Glu

130

135

140

Ile

Ile

Ser

Gin

Lys

Leu

Asn

Glu

Thr

Leu

Leu

Asp

Gin

Thr

Thr

Thr

145

150

155

160

Asn

Val

Val

Ile

Pro

Ser

Phe

Asp

Ile

Lys

Leu

Leu

Arg

Pro

Thr

Ile

165

170

175

«

Phe

Ser

Thr

Phe

Lys

Leu

Glu

Glu

Val

Pro

Glu

Leu

Asn

Val

Lys

Leu

180

185

190

Ser

Asp

Val

Cys

Met

Gly

Thr

Ser

Ala

Ala

Pro

Ile

Val

Phe

Pro

Pro

195

200

205

Tyr

Tyr

Phe

Lys

His

Gly

Asp

Thr

Glu

Phe

Asn

Leu

Val

Asp

Gly

Ala

210

215

220

Ile

Ile

Ala

Asp

Ile

Pro

Ala

Pro

Val

Ala

Leu

Ser

Glu

Val

Leu

Gin

225

230

235

240

Gin Glu Lys Tyr Lys Asn Lys Glu Ile Leu Leu Leu Ser Ile Gly Thr 245 250 255

K

Glý Val Val

Lys 260

Pro

Gly Glu Gly Tyr Ser Ala Asn Arg Thr Trp

Thr

265

270

-

Ile

Phe

Asp

Trp

Ser

Ser

Glu

Thr

Leu

Ile

Gly

Leu

Met

Gly

His

Gly

275

280

285

Thr

Arg

Ala

Met

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Val

Gly

Ser

His

Phe

Lys

Ala

Leu

290

295

300

Gin

Pro

Gin

Asn

Asn

Tyr

Leu

Arg

Ile

Gin

Glu

Tyr

Asp

Leu

Asp

Pro

305

310

315

320

Ala

Leu

Glu

Ser

Ile

Asp

Asp

Ala

Ser

Thr

Glu

Asn

Met

Glu

Asn

Leu

325

330

335

Glu

Lys

Val

Gly

Gin

Ser

Leu

Leu

Asn

Glu

Pro

Val

Lys

Arg

Met

Asn

340

345

350

Leu

Asn

Thr

Phe

Val

Val

Glu

Glu

Thr

Gly

Glu

Gly

Thr

Asn

Ala

Glu

3 55

360

365

Ala

Leu

Asp

Arg

Leu

Ala

Gin

Ile

Leu

Tyr

Glu

Glu

Lys

Ile

Thr

Arg

370

375

380

Gly

Leu

Gly

Lys

Ile

Ser

Leu

Glu

Val

Asp

Asn

Ile

Asp

Pro

Tyr

Thr

385

390

395

400

Glu

Arg

Val

Arg

Lys

Leu

Leu

Phe

★

405 (2) Informace pro SEQ id. č. 3:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1227 bp (B) Typ: nukleová kyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: jiná molekulová kyselina (A) Popis: /popis = cDNA pentinu-1 optimalizovaná pro « · * * ♦ · zesílenou expresi (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (IX) Znak:

(A) Klíčové jméno: CDS (B) Poloha: 1...1227 (XI) Popis sekvence: SEQ id. č. 3:

ATG

AAG

TCC

AAG

ATG

GCC

ATG

CTC

CTC

CTC

CTC

TTC

TGC

GTG

CTC

TCC

Met

Lys

Ser

Lys

Met

Ala

Met

Leu

Leu

Leu

Leu

Phe

Cys

Val

Leu

Ser

410

415

420

425

AAC

CAG

CTC

GTG

GCC

GCG

TTC

TCC

ACC

CAG

GCC

AAG

GCC

TCC

AAG

GAC

Asn

Gin

Leu

Val

Ala

Ala

Phe

Ser

Thr

Gin

Ala

Lys

Ala

Ser

Lys

Asp

430

435

440

GGC

AAC

CTC

GTG

ACC

GTG

CTC

GCC

ATC

GAC

GGC

GGC

GGC

ATC

CGC

GGC

Gly

Asn

Leu

Val

Thr

Val

Leu

Ala

Ile

Asp

Gly

Gly

Gly

Ile

Arg

Gly

445

450

455

ATC

ATC

CCG

GGC

GTG

ATC

CTC

AAG

CAG

CTC

GAG

GCG

ACC

CTC

CAG

AGG

Ile

Ile

Pro

Gly

Val

Ile

Leu

Lys

Gin

Leu

Glu

Ala

Thr

Leu

Gin

Arg

460

465

470

TGG

GAC

TCC

AGC

GCC

AGG

CTC

GCG

GAG

TAC

TTC

GAC

GTG

GTG

GCC

GGC

Trp

Asp

Ser

Ser

Ala

Arg

Leu

Ala

Glu

Tyr

Phe

Asp

Val

Val

Ala

Gly

475

480

485

ACC

TCC

ACC

GGC

GGC

ATC

ATC

ACC

GCC

ATC

CTC

ACC

GCC

CCG

GAC

CCG

Thr

Ser

Thr

Gly

Gly

Ile

Ile

Thr

Ala

Ile

Leu

Thr

Ala

Pro

Asp

Pro

490

495

500

505

CAG

AAC

AAG

GAC

CGC

CCG

CTC

TAC

GCC

GCC

GAG

GAG

ATC

ATC

GAC

TTC

Gin

Asn

Lys

Asp

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ala

Ala

Glu

Glu

Ile

Ile

Asp

Phe

510

515

520

TAC

ATC

GAG

CAC

GGC

CCG

TCC

ATC

TTC

AAC

AAG

TCC

ACC

GCC

TGC

TCC

Tyr

Ile

Glu

His

Gly

Pro

Ser

Ile

Phe

Asn

Lys

Ser

Thr

Ala

Cys

Ser

525

530

535

CTC

CCG

GGC

ATC

TTC

TGC

CCG

AAG

TAC

GAC

GGC

AAG

TAC

CTC

CAG

GAG

Leu

Pro

Gly

Ile

Phe

Cys

Pro

Lys

Tyr

Asp

Gly

Lys

Tyr

Leu

Gin

Glu

540

545

550

ATC

ATC

TCC

CAG

AAG

CTC

AAC

GAG

ACC

CTC

CTC

GAC

CAG

ACC

ACC

ACC

Ile

Ile

Ser

Gin

Lys

Leu

Asn

Glu

Thr

Leu

Leu

Asp

Gin

Thr

Thr

Thr

555 560 565

144

192

240

288

336

384

432

480 · · · *

9 : ϊ :

«9 « » 9

AAC Asn 570

GTG GTG

ATC Ile

CCG Pro

TCC Ser 575

TTC Phe

GAC Asp

ATC AAG CTC

CTC CGC Leu Arg

CCG ACC ATC

528

Val

Val

Ile

Lys

Leu 580

Pro

Thr

Ile 585

TTC

TCC

ACC

TTC

AAG

CTC

GAG

GAG

GTG

CCG

GAG

CTC

AAC

GTG

AAG

CTC

576

Phe

Ser

Thr

Phe

Lys

Leu

Glu

Glu

Val

Pro

Glu

Leu

Asn

Val

Lys

Leu

590

595

600

TCC

GAC

GTG

TGC

ATG

GGC

ACC

TCC

GCC

GCC

CCG

ATC

GTG

TTC

CCG

CCG

624

Ser

Asp

Val

Cys

Met

Gly

Thr

Ser

Ala

Ala

Pro

Ile

Val

Phe

Pro

Pro

605

610

615

TAC

TAC

TTC

AAG

CAC

GGC

.GAC

ACC

GAG

TTC

AAC

CTC

GTC

GAC

GGC

GCG

672

Ťyr

Tyr

Phe

Lys

His

Gly

Asp

Thr

Glu

Phe

Asn

Leu

Val

Asp

Gly

Ala

620

625

630

ATC

ATC

GCG

GAC

ATC

CCA

GCC

CCG

GTG

GCC

CTC

TCC

GAG

GTG

CTC

CAG

720

Ile

Ile

Ala

Asp

Ile

Pro

Ala

Pro

Val

Ala

Leu

Ser

Glu

Val

Leu

Gin

635

640

645

CAG

GAG

AAG

TAC

AAG

AAC

AAG

GAG

ATC

CTC

CTC

CTG

AGC

ATC

GGC

ACC

768

Gin

Glu

Lys

Tyr

Lys

Asn

Lys

Glu

Ile

Leu

Leu

Leu

Ser

Ile

Gly

Thr

650

655

660

665

GGC

GTG

GTG

AAG

CCG

GGC

GAG

GGC

TAC

TCC

GCC

AAC

CGC

ACC

TGG

ACC

816

Gly

Val

Val

Lys

Pro

Gly

Glu

Gly

Tyr

Ser

Ala

Asn

Arg

Thr

Trp

Thr

670

675

680

ATC

TTC

GAC

TGG

TCC

TCC

GAG

ACC

CTC

ATC

GGC

CTC

: ATG

1 GGG

1 CAC

1 GGC

864

Ile

Phe

Asp

Trp

Ser

Ser

Glu

Thr

Leu

Ile

Gly

Leu

Met

Gly

His

Gly

685

690

695

ACC

CGC

GCC

ATG

TCC

GAC

TAC

TAC

GTG

GGC

TCC

CAC

TTC

AAG

GCC

CTC

912

Thr

Arg

Ala

Met

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Val

Gly

Ser

His

Phe

Lys

Ala

Leu

700

705

710

CAG

CCG

CAG

AAC

AAC

TAC

CTC

CGC

ATC

CAG

GAG

TAC

GAC

CTC

GAC

CCG

960

Gin

Pro

Gin

Asn

Asn

Tyr

Leu

Arg

Ile

Gin

Glu

Tyr

Asp

Leu

Asp

Pro

715

720

725

GCC

CTC

GAG

TCC

ATC

GAC

GAC

GCC

TCC

ACC

GAG

AAC

ATG

GAG

AAC

CTC

1008

Ala

Leu

Glu

Ser

Ile

Asp

Asp

Ala

Ser

Thr

Glu

Asn

Met

Glu

Asn

Leu

730

735

740

745

GAG

AAG

GTG

GGC

CAG

TCC

CTC

CTC

AAC

GAG

CCG

GTG

AAG

CGC

ATG

AAC

1056

Glu

Lys

Val

Gly

Gin

Ser

Leu

Leu

Asn

Glu

Pro

Val

Lys

Arg

Met

Asn

750

755

760

CTC

AAC

ACG

TTC

GTC

GTG

GAG

GAG

ACC

GGC

GAG

GGG

ACC

AAC

GCC

GAG

1104

Leu

Asn

Thr

Phe

Val

Val

Glu

Glu

Thr

Gly

Glu

Gly

Thr

Asn

Ala

Glu

765

770

775

GCG

CTC

GAC

CGC

CTC

GCC

CAG

ATC

CTC

TAC

GAG

GAG

AAG

ATC

ACC

CGC

1152

Ala

Leu

Asp

Arg

Leu

Ala

Gin

Ile

Leu

Tyr

Glu

Glu

Lys

Ile

Thr

Arg

780

785

790

GGC

CTC

GGC

AAG

ATC

TCC

CTC

GAG

GTG

GAC

AAC

ATC

GAC

CCG

TAC

ACC

1200

Gly

Leu

Gly

Lys

Ile

Ser

Leu

Glu

Val

Asp

Asn

Ile

Asp

Pro

Tyr

Thr

795

800

805

GAG

CGC i

GTG

CGC .

PAG -

CTC

CTC

TTC

TGA

1227

Glu .

Arg

Val .

Arg

Lys

Leu

Leu

Phe

★

810 815 φ φ

ΦΦΦΦ 9 «Φ Φ • 9 Φ Φ • Φ Φ » • ΦΦΦ

Φ « « Φ (2) Informace pro SEQ id. č. 4:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 409 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: protein

(XI	) :	Popis sekvence:	SEQ	id	. č.	. 4
Met 1	Lys	Ser Lys Met Ala Met 5	Leu	Leu	Leu 10	Leu Phe Cys Val Leu Ser 15
Asn	Gin	Leu Val Ala Ala Phe 20	Ser	Thr 25	Gin	Ala Lys Ala Ser Lys Asp 30
Gly	Asn	Leu Val Thr Val Leu 35	Ala 40	Ile	Asp	Gly Gly Gly Ile Arg Gly 45
Ile	Ile 50	Pro Gly Val Ile Leu 55	Lys	Gin	Leu	Glu Ala Thr Leu Gin Arg 60
Trp 65	Asp	Ser Ser Ala Arg Leu 70	Ala	Glu	Tyr	Phe Asp Val Val Ala Gly 75 80
Thr	Ser	Thr Gly Gly Ile Ile 85	Thr	Ala	Ile 90	Leu Thr Ala Pro Asp Pro 95
Gin	Asn	Lys Asp Arg Pro Leu 100	Tyr	Ala 105	Ala	Glu Glu Ile Ile Asp Phe 110
Tyr	Ile	Glu His Gly Pro Ser 115	Ile 120	Phe	Asn	Lys Ser Thr Ala Cys Ser 125
Leu	Pro 130	Gly Ile Phe Cys Pro 135	Lys	Tyr	Asp	Gly Lys Tyr Leu Gin Glu 140
Ile 145	Ile	Ser Gin Lys Leu Asn 150	Glu	Thr	Leu	Leu Asp Gin Thr Thr Thr 155 160
Asn	Val	Val Ile Pro Ser Phe 165	Asp	Ile	Lys 170	Leu Leu Arg Pro Thr Ile 175
Phe	Ser	Thr Phe Lys Leu Glu 180	Glu	Val 185	Pro	Glu Leu Asn Val Lys Leu 190
Ser	Asp	Val Cys Met Gly Thr 195	Ser 200	Ala	Ala	Pro Ile Val Phe Pro Pro 205

|· φφφφ

72

• • ·«

9 • 9 • 9 9 9

» 9 9

• · » · • » 9 9 9 9

Φ · • Φ Φ φ φ Φ

* Φ φ * Φ Φ

Tyr

Tyr

Phe

Lys

His

Gly

Asp

Thr Glu

Phe

Asn

Leu

Val

Asp

Gly

Ala

210

215

220

Ile

Ile

Ala

Asp

Ile

Pro

Ala

Pro Val

Ala

Leu

Ser

Glu

Val

Leu

Gin

225

230

235

240

Gin

Glu

Lys

Tyr

Lys

Asn

Lys

Glu Ile

Leu

Leu

Leu

Ser

Ile

Gly

Thr

245

250

255

Gly

Val

Val

Lys

Pro

Gly

Glu

Gly Tyr

Ser

Ala

Asn

Arg

Thr

Trp

Thr

260

265

270

Ile

Phe

Asp

Trp

Ser

Ser

Glu

Thr Leu

Ile

Gly

Leu

Met

Gly

His

Gly

275

280

285

Thr

Arg

Ala

Met

Ser

Asp

Tyr

Tyr Val

Gly

Ser

His

Phe

Lys

Ala

Leu

290

295

300

Gin

Pro

Gin

Asn

Asn

Tyr

Leu

Arg Ile

Gin

Glu

Tyr

Asp

Leu

Asp

Pro

305

310

315

320

Ala

Leu

Glu

Ser

Ile

Asp

Asp

Ala Ser

Thr

Glu

Asn

Met

Glu

Asn

Leu

325

330

335

Glu

Lys

Val

Gly

Gin

Ser

Leu

Leu Asn

Glu

Pro

Val

Lys

Arg

Met

Asn

340

345

350

Leu

Asn

Thr

Phe

Val

Val

Glu

Glu Thr

Gly

Glu

Gly

Thr

Asn

Ala

Glu

355

360

365

Ala

Leu

Asp

Arg

Leu

Ala

Gin

Ile Leu

Tyr

Glu

Glu

Lys

Ile

Thr

Arg

370

375

380

Gly

Leu

Gly

Lys

Ile

Ser

Leu

Glu Val

Asp

Asn

Ile

Asp

Pro

Tyr

Thr

385

390

395

400

Glu

Arg

Val

Arg

Lys

Leu

Leu

Phe *

φφ φφ φ φ <

φ φ 4 φ φ <

φ φ « φ φ»

405 (2) Informace pro SEQ id. č. 5: (I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Seřetězeni: jednotlivá (D) Topologie: lineární • ·

9 9 ··«· 9 9 9 · ft · 9 · 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 •9999 9· ··· 99 99

9· 9 9·· (II) Typ molekuly: peptid (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (XI): Popis sekvence: SEQ id. č. 5

Met Ser Thr Ser Ala Ala Pro lle Val Phe Pro Pro Tyr Tyr Phe Lys 15 10 15 (2) Informace pro SEQ id. č. 6:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: peptid (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (XI): Popis sekvence: SEQ id. č. 6

Ala Leu Gin Pro Gin Asn Asn Tyr Leu Arg Gin Glu Tyr Asp Leu Asp 15 10 ¹⁵ (2) Informace pro SEQ id. Č. 7: (I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 13 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární • · Λ 9 9 9 9 9 9

999* 9 99 999 9« «9 (II) Typ molekuly: peptid (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (XI): Popis sekvence: SEQ id. č. 7

Pro Asp Trp Val Val Ile Arg Ser Gin Ser Val Gly Lys 1 5 10 (2) Informace pro SEQ id. č. 8:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: peptid (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (XI): Popis sekvence: SEQ id. č. 8

Lvs Ala Phe Val Asn Gly Val Tyr Phe Ile Asn Thr Tyr Asp Ser Ala 1 5 10 ¹⁵ (2) Informace pro SEQ id. č. 9:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární

444 4444

4 4·4 444444

4 < 4 4 4444 «444 4 ·· ··· 4« 44 (II) Typ molekuly: peptid (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (XI): Popis sekvence: SEQ id. č. 9

(2) Informace pro SEQ id. č. 10: (I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: peptid (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (XI): Popis sekvence: SEQ id č. 10

Val Val Lys Arg Leu Ala Gly Tyr Phe Asp Val 1 5 10 (2) Informace pro SEQ id. č. 11: (I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 8 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární

4····· · * * · · 4 4 • 4 4 · · 4 4 444·

444 4444

4 44 4 444 44 *

4 *** *444

444· 4 ·· 4*4 44 44 (II) Typ molekuly: peptid (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (XI): Popis sekvence: SEQ ID č. 11

Glu Asn Met Glu Asn Leu Glu Lys

5

• 9 • 9

- Ίηι (Afčý

Claims (32)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. V podstatě přečištěný protein izolovaný z rodu Pentaclethra, mající insekticidní vlastnosti.
2. 2. V podstatě přečištěný polypeptid, zahrnující sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny sestávající z:

   (a) sekvence aminokyselin uvedené v SEQ id. č. 2;

   (b) zbytků 22-409 sekvence uvedené v SEQ id. č. 2;

   (c) zbytků 29-409 aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ id. č. 2; a (d) pesticidně účinného fragmentu sekvence aminokyselin uvedené v SEQ id. č. 2;
3. 3. Polypeptid s insekticidní účinností proti Diabrotica, kde tento polypeptid obsahuje variaci sekvence aminokyselin vybrané ze skupiny, sestávající z:

   (a) sekvence aminokyselin uvedené v SEQ id. č. 2;

   (b) zbytků 22-409 sekvence uvedené v SEQ id. č. 2; a (c) zbytků 29-409 aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ id. č. 2, přičemž uvedená variace zahrnuje nejméně jednu substituci aminokyseliny, zkrácení, vnitřní deleci nebo inzerci aminokyseliny.
4. 4. Protein podle nároku 1, kde uvedený protein má sekvenci aminokyselin jak ukazuje obrázek 1 a SEQ id. č. 1 a

   2.
5. 5. V podstatě přečištěný protein s insekticidní účinností, kde tento protein obsahuje sekvenci aminokyselin uvedenou v obrázku 1 a SEQ id. č. 1 a 2.

   ·· ·· ► 9 9 · » 9 · *
6. 6. Sekvence DNA, kódující protein podle nároku 5.
7. 7. Vektor, obsahující sekvenci DNA podle nároku 6.
8. 8. Isolovaná nukleotidová sekvence kódující polypeptid s insekticidní účinností pro Diabrotica, kde uvedená nukleotidová sekvence kóduje polypeptid vybraný ze skupiny složené z:

   (a) sekvence aminokyselin uvedené v SEQ id. č. 2;

   (b) zbytků 22-409 sekvence uvedené v SEQ id. č. 2;

   (c) zbytků 29-409 aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ id. č. 2;

   (d) polypeptidu obsahujícího variaci (a), (b) nebo (c) , přičemž uvedená variace obsahuje nejméně jednu substituci aminokyseliny, zkrácení, vnitřní deleci nebo inzerci aminokyseliny.
9. 9. Izolovaná nukleotidová molekula kódující polypeptid s insekticidní účinností, kde uvedená molekula má sekvenci vybranou ze skupiny složené z :

   (a) sekvence uvedené na obrázku 1 a SEQ id. č. 1;

   (b) nukleotidových sekvencí kódujících polypeptid s insekticidní účinností a hybridizujících se sekvencemi výše uvedenými pod (a) za přísných podmínek definovaných přísností promývání roztoky 0,3 M NaCl, 0,03 M citrátu sodného, 0,1% SDS při 70 °C;

   (c) nukleotidových sekvencí kódujících polypeptid s insekticidní účinností, které se liší od sekvencí (a) a (b) v důsledku degenerace genetického kódu.
10. 10. Organismus transformovaný účinkem vektoru podle nároku 7.
11. 11. Isolovaná nukleotidová sekvence kódující protein

    99 9999 99 9 ·♦ 99 »9 9 9999 9999 • 9 9·· · 9 9 · • 9 999 999999

    9 9 999 9999

    9999 9 99 999 99 99 uvedený na obrázku 1.
12. 12. Nukletidová sekvence podle nároku 11, kde uvedená nukleotidová sekvence je sekvence uvedená na obrázku 1 a v SEQ id. č. 1.
13. 13. Sekvence DNA podle nároku 11, kde uvedená sekvence je syntetická sekvence.
14. 14. Sekvence DNA podle nároku 13, kde uvedená sekvence byla optimalizována pro expresi v kukuřici.
15. 15. Rostlina, která je stabilně transformována expresní kazetou obsahující promotor, který řídí expresi v rostlinné buňce, funkčně připojený k nukleotidové sekvenci kódující insekticidní protein, kde uvedený protein je vybrán ze skupiny složené z:

    (a) aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ id. č. 2;

    (b) zbytků 22-409 sekvence uvedené v SEQ id. č. 2;

    (c) zbytků 29-409 aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ id. č. 2;

    (d) polypeptidů obsahujícího variaci (a), (b) nebo (c), přičemž uvedená variace obsahuje nejméně jednu substituci aminokyseliny, zkrácení, vnitřní deleci nebo inzerci aminokyseliny.
16. 16. Rostlina podle nároku 15, kde uvedenou rostlinou je kukuřice.
17. 17. Semeno rostliny podle nároku 15 nebo 16.
18. 18. Rostlina podle nároku 15, kde uvedená nukleotiodová sekvence kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku 1 a SEQ id. č. 1 a 2.

    ·· ··»· • · · 99 9 * • · * • • 9 9 9 9 • • • · • • 9 9 9 • • 9 • · • 9 9 9 9 • 9 9 99 · ♦ ·· 999 9 9 • *
19. 19. Rostlina podle nároku 15, kde uvedená nukleotiodvá sekvence je sekvence uvedená na obrázku 1 a SEQ id. č. 1.
20. 20. Rostlina podle nároku 15, kde uvedená nukleotidová sekvence je funkčně vázána na preferenční kořenový promotor.
21. 21. Rostlina podle nároku 18, kde uvedená nukleotidová sekvence je funkčně vázána na preferenční kořenový promotor.
22. 22. Rostlina podle nároku 19, kde uvedená nukleotidová sekvence je funkčně vázána na preferenční kořenový promotor.
23. 23. Způsob potírání Diabrotica, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje: transformování rostlinné buňky expresní kazetou obsahující promotor, který řídí expresi v rostlinné buňce, funkčně spojený s nukleotidovou sekvencí kódující insekticidní protein, kde uvedený protein je vybrán ze skupiny složené z:

    (a) aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ id. č. 2;

    (b) zbytků 22-409 sekvence uvedené v SEQ id. č. 2;

    (c) zbytků 29-409 aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ id. č. 2;

    (d) polypeptidů obsahujícího variaci (a), (b) nebo (c), přičemž uvedená variace obsahuje nejméně jednu substituci aminokyseliny, zkrácení, vnitřní deleci nebo inzerci aminokyseliny.
24. 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že uvedený promotor je preferenční kořenový promotor.
25. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedená nukleotidová sekvence má sekvenci vybranou ze skupiny složené z :

    (a) sekvence uvedené na obrázku 1 a SEQ id. č. 1;

    ·· · *· ·· • · · · * · · · • · · · · · ♦ • · ··«*·« « · · · ♦ · ♦ ·· ··· ·· ·· ·· ···« • · ♦ /7 (b) nukleotidové sekvence kódující polypeptid s insekticidní účinností a hybridizující se sekvencemi výše uvedenými pod (a) za přísných podmínek a (c) nukleotidových sekvencí kódujících polypeptid s insekticidní účinností, které se liší od sekvencí (a) a (b) v důsledku degenerace genetického kódu.
26. 26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedená rostlinná buňka je z jednoděložné rostliny.
27. 27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že uvedená jednoděložná rostlina je kukuřice.
28. 28. Rostlinná buňka, která je stabilně transformována expresní kazetou obsahující promotor, který řídí expresi v rostlinné buňce, funkčně připojený k nukleotidové sekvenci kódující insekticidní protein, kde uvedený protein je vybrán ze skupiny složené z:

    (a) aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ id. č. 2;

    (b) zbytků 22-409 sekvence uvedené v SEQ id. č. 2;

    (c) zbytků 29-409 aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ id. č. 2;

    (d) polypeptidu zahrnujícího variaci (a), (b) nebo (c), přičemž uvedená variace obsahuje nejméně jednu substituci aminokyseliny, zkrácení, vnitřní deleci nebo inzerci aminokyseliny.
29. 29. Rostlinná buňka podle nároku 28, kde uvedený promotor je preferenční kořenový promotor.
30. 30. Rostlinná buňka podle nároku 29, kde uvedená nukleotidové sekvence má sekvenci vybranou ze skupiny složené z:

    99 9 ·♦ *· (a) sekvence ukázané v obrázku 1 a SEQ id. č. 1;

    (b) nukleotidových sekvencí kódujících polypeptid s insekticidní účinností a hybridizujících se sekvencemi výše uvedenými pod (a) za přísných podmínek definovaných přísností promývání roztoky 0,3 M NaCl, 0,03 M citrátu sodného, 0,1% SDS při 70 °C a (c) nukleotidových sekvencí kódujících polypeptid s insekticidní účinností, které se liší od sekvencí (a) a (b) v důsledku degenerace genetického kódu.
31. 31. Rostlinná buňka podle nároku 30, kde uvedená rostlinná buňka je z jednoděložné rostliny.
32. 32. Rostlina podle nároku 31, kde uvedená jednoděložná rostlina je kukuřice.