CZ297319B6

CZ297319B6 - Polypeptidy s insekticidní úcinností a jejich pouzití

Info

Publication number: CZ297319B6
Application number: CZ0421199A
Authority: CZ
Inventors: Cigan@Amy; H. Czapla@Thomas; Fallis@Lynn; E. Meyer@Terry; A. Mundell@Scott; Sabus@Brian; Schubert@Karel
Original assignee: Pioneer Hi-Bred International Inc.; The Board Of Regents For The University Of Oklahoma
Priority date: 1997-05-29
Filing date: 1998-05-15
Publication date: 2006-11-15
Also published as: CA2290776A1; NZ501218A; WO1998054327A1; SK160099A3; US6339144B1; US6057491A; AR016059A1; SI20214B; BR9809516A; CA2290776C; AU742709B2; SI20214A; EP0986645A1; WO1998054327A9; AU7389198A; CZ421199A3

Abstract

Popisují se polypeptidy a zpusoby potírání skudcu, hlavne hmyzích skudcu. Polypeptidy predstavují proteiny izolované z rostlin celedi Pentaclethra. Rovnez se nabízejí nukleotidové sekvence kódující tyto proteiny. Tyto sekvence se pouzívají pri transformování organismu za úcelem potlacování skudcu.

Description

Popisují se polypeptidy a způsoby potírání škůdců, hlavně hmyzích škůdců. Polypeptidy představují proteiny izolované z rostlin čeledi Pentaclethra. Rovněž se nabízejí nukleotidové sekvence kódující tyto proteiny. Tyto sekvence se používají při transformování organismů za účelem potlačování škůdců.

CO h* σ> CM

N O

Polypeptidy s insekticidní účinností a jejich použití

Oblast techniky

Vynález se týká polypeptidů a způsobů hubení hmyzích škůdců. Kromě toho se vynález týká rostlin a jiných organismů, jež byly polypeptidy podle vynálezu geneticky transformovány.

Dosavadní stav techniky

Četné hmyzí druhy jsou významnými škůdci pro běžné zemědělské plodiny jako jsou kukuřice, sojové boby, hrách, bavlna a podobné potravinářské a textilní suroviny. Základním způsobem hubení těchto škůdců je aplikace syntetických chemických sloučenin. Široké používání chemických sloučenin však vytváří mnoho problémů z hlediska ochrany prostředí, protože tyto sloučeniny jsou neselektivní a hmyz si vůči nim vytváří rezistenci.

Byly zkoušeny jiné přístupy k potírání škůdců, zahrnující použití biologických organismů s charakterem „přírodních predátorů“ vůči druhům, jež je třeba potlačovat. Tito predátoři mohou zahrnovat jiné hmyzí druhy, plísně a bakterie jako je Bacillus thuringiensis'. Alternativně byly vypěstovány v zajetí velké kolonie hmyzích škůdců, sterilizovány a vypuštěny do přírody v naději, že páření mezi sterilizovaným a normálně plodným divokým hmyzem sníží hmyzí populaci. Tyto přístupy měly sice jisté úspěchy, ale na druhé straně byly nákladné a vyznačovaly se řadou nesnází. Je například obtížné použití žijící biologické organismy na velkých rozlohách a docílit toho, aby se delší dobu udržely v této oblasti nebo na takto ošetřených rostlinách. Hmyzí predátoři mohou migrovat a plísně a bakterie mohou být smyty z rostlin nebo odplaveny z ošetřené plochy deštěm. I když má tedy použití této biologické regulace žádoucí charakteristicky a setkává se s určitým úspěchem, v praxi se tyto metody zdají silně omezeny.

Pokroky v biotechnologiích v posledních dvou dekádách přinesly nové možnosti potlačování škůdců pomocí genetického inženýrství. Zejména pokroky v rostlinné genetice ve spojení s určením růstových faktorů hmyzu a v přírodě se vyskytujících ochranných sloučenin nebo činidel rostlin poskytly možnost vytvořit transgenní zemědělské plodiny schopné produkovat taková ochranná činidla a tím chránit rostliny proti napadení hmyzem.

Byly vytvořeny transgenní rostliny rezistentní proti specifickým hmyzím škůdcům použitím genů kódujících endotoxiny Bacillus thuringiensis (BT) nebo rostlinné inhibitory proteázy (PI). Je dokázáno, že transgenní rostliny obsahující geny pro endotoxin Bt jsou účinné pro potírání některých druhů hmyzu. V polních podmínkách však dosud nebyla prokázána účinná ochrana rostlin za pomoci transgenního insertu genetického materiálu PI. I když kultivary exprimující geny BT dnes ukazují odolnost vůči některým druhům hmyzu, odolnost založená na expresi jediného genu může být případně ztracena během vývoje resistence hmyzu vůči Bt. Proto je nutný další výzkum zaměřený na další geny, jež lze vložit do rostlin za účelem ochrany proti hmyzím škůdcům.

Vědci identifikovali několik specifických rostlinných složek nebo sloučenin působících jako ochranné prostředky bránící rostliny před napadením hmyzími škůdci a patogeny. Obvykle jsou sice v různých tkáních rostlin přítomny v malých množstvích, ale koncentrace některých z nich se zvýší po napadení rostlinným škůdcem nebo patogenem. Příklady takových ochranných sloučenin představují alkaloidy, terpeny a různé proteiny jako enzymy, inhibitory enzymů a lektiny. Zvláštní zájem je věnován sloučeninám rostlinného původu, jež mohou blokovat nebo změnit normální biomolekulámí aktivitu a tak inhibovat růst hmyzu nebo jej usmrtit.

Ve Spojených státech je zastoupen rod Diabrotica (bázlivec, čeleď mandelinkovitých, jehož larva poškozující kořeny kukuřice je v USA známa jako „com rootworm; CRW“) třemi druhy: Dia

- 1 CZ 297319 B6 brotica barberi Smith and Lawrence (severní), Diabrotica undecimpunctata howardi Barber (jižní) a Diabrotica virgifera virgifera LeConte (západní). Západní a severní druhy nejvíce přispívají k ekonomickým škodám na kukuřici. Výdaje na ochranu proti škůdcům a ztráty jimi způsobené se odhadují na více než miliardu dolarů ročně. Jak uvedeno výše, hlavním problémem pesticidů na ochranu proti škodám způsobeným larvám bázlivce (CRW) je jejich záporný účinek na prostředí a vývoj rezistence u hmyzu. Střídání plodin se jako způsob ochrany proti CRW stává méně účinným v důsledku delší diapauzy u larev severních bázlivců a pozměněného chování při kladení vajíček larvy bázlivce západního. Tvorba transgenních rostlin s rezistencí vůči CRW by mohla mít významný ekonomický dopad. Bohužel však existuje v transgenních rostlinách málo genů schopných potírat CRW, jsou-li vůbec jaké. Proto trvá potřeba dalších insekticidních účinných látek, zvláště proti CRW.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je v podstatě přečištěný polypeptid zahrnující sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny sestávající z:

(a) sekvence aminokyselin uvedené v SEQ id č. 2;

(b) zbytků 22-408 sekvence uvedené v SEQ id č. 2;

(c) zbytků 29N08 aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ id č. 2;

(d) insekticidně účinného fragmentu sekvence aminokyselin uvedené v SEQ id č. 2;

(e) sekvence aminokyselin, které má alespoň 90% sekvenční identitu se sekvencí aminokyselin SEQ id. č. 2 a má insekticidní účinnost.

Tyto polypeptidy s pesticidní účinností lze izolovat z rostlin rodu Pentaclethra. Nabízí se přečištěný protein stejně jako aminokyselina a genetická informace v podobě sekvence DNA pro bílkoviny s účinností proti larvě bázlivce západního. Sekvence DNA kódující pesticidní proteiny lze užít pro transformování rostlin, bakterií, plísní, kvasinek a dalších organismů pro získání schopnosti ochrany proti škůdcům.

Polypeptidy a způsoby podle vynálezu lze užít v řadě systémů potlačování rostlinných a jiných škůdců, zvláště rostlinných škůdců. Zejména se popisují nové pesticidní proteiny. Proteiny jsou získány přečištěním z čeledi Leguminosae, zvláště z rodu Pentaclethra a speciálně z druhů P. macrophylla a P. macroloba.

Podle vynálezu lze pesticidní proteiny produkované členy rodu Pentaclethra izolovat způsobem v oboru známými. Způsoby izolace proteinů zahrnují konvenční chromatografické metody včetně gelové filtrace, iontově výměnné a imunoafinitní chromatografie při použití vysokoúčinné kapalinové chromatografie s modifikacemi jako je vysokoúčinná kapalinová chromatografie s převrácenými fázemi, iontově výměnná vysokoúčinná kapalinová chromatografie, vylučovací (SEC) vysokoúčinná kapalinová chromatografie, vysokoúčinná chromatofokusace a chromatografie s hydrofobní interakcí ap., elektroforetická separace jako je například jednorozměrná a dvourozměrná gelová elektroforéza a podobně. Viz například Current Protocols in Molecular Biology, sv. 1 a 2, Ausubel a další (eds.), Johm Wiley and Sons, Nový York (1988), zde uvedený jako odkaz.

Po izolaci proteinu lze tento protein, nebo polypeptidy z nichž se skládá, charakterizovat a sekvencovat standardními způsoby známými v oboru. Přečištěný protein nebo polypeptidy z nichž se skládá lze fragmentovat bromkyanem nebo některou z proteáz jako je papain, chymotrypsin, trapsin, lysyl-C endopeptidáza atd. (Oike a další (1982), J. Biol. Chem. 257, 9751-9758; Liu a další (1983) Int. J. Pept. protein Res. 21, 209-215). Výsledné peptidy se separují, výhodně

-2CZ 297319 B6 vysokovýkonnou kapalinovou chromatografíí nebo rozpuštěním gelů a westernovým přenosem (elektroblotováním) na membránách PVDF, načež se podrobí sekvencování aminokyselin. Za tímto cílem je výhodné peptidy analyzovat automatizovaným sekvenátorem. Je známo, že lze stanovit aminokyselinové sekvence, vnitřní nebo s N-koncem nebo s C-koncem. Z aminokyselinové sekvence vnitřní nebo s N-koncem nebo s C-koncem. Z aminokyselinové sekvence přečištěného proteinu lze syntetizovat nukleotidovou sekvenci použitelnou jako nukleotidová sonda pomáhající izolovat genu kódujícího pesticidní protein.

Podobně lze použít pro stanovení prostorové a časové distribuce proteinu, který nás zajímá, protilátek vypěstovaných proti částečně purifikovaným nebo purifikovaným pesticidům. Takto lze určit tkáň, v níž je protein nejvíce zastoupen a případně vysoce exprimovaný, a konstruovat expresní knihovny. Způsoby tvorby protilátek jsou v oboru známé. Viz například Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lané (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988), a v něm citované odkazy. Rovněž viz Radka a další (1983), J. Immunol. 128, 2804; a Radka a další (1984), Imunogenetics 19, s. 63. Takových protilátek lze užít pro izolování proteinů s podobnými vazebnými místy a proteinů zkoušených na aktivitu proti hmyzím škůdcům, proti nimž se hledá ochrana.

Pro přečištění proteinu s insekticidní aktivitou lze užít jakékoli kombinace metod. Protože izolační protokol je dán, může se zkoušet pesticidní aktivita každé frakce materiálu získaného po každém purifikačním stupni.

Výsledkem takových purifikačních protokolů bude v podstatě purifikovaná bílkovinná frakce. Termínem „v podstatě přečištěný“ nebo „v podstatě čistý“ se míní protein, který je v podstatě zbaven jakékoliv sloučeniny normálně spojené s tímto proteinem v přírodním stavu. „V podstatě čistý“ proteinový preparát se může hodnotit podle nepřítomnosti dalších detekovatelných proteinových pásů následujících po SDS-PAGE při vizuálním nebo denzitometrickém stanovení. Alternativně může nepřítomnost dalších aminem končících sekvencí nebo dusíkem končících zbytků v čištěném preparátu udávat úroveň čistoty. Čistota se může ověřit opakovanou chromatografií „čistých“ preparátů vykazujících nepřítomnost ostatních píků při iontoměničové nebo kapilární elektroforéze nebo elektroforéze s převrácenými fázemi. Termíny „v podstatě čistý“ nebo „v podstatě přečištěný“ nejsou míněny tak, aby vylučovaly umělé nebo syntetické směsi proteinů s dalšími sloučeninami. Tyto termíny nejsou míněny ani tak, aby vylučovaly přítomnost minoritních nečistot, které neinterferují s biologickou aktivitou proteinu a které mohou být přítomny například vlivem neúplné purifíkace.

Celá nukleotidová sekvence kódující protein se může stanovit z fragmentů proteinu pomocí testů PCR (řetězová reakce katalyzovaná polymerázou). Podobně se mohou fragmenty získané testy PCR použít pro izolaci sekvencí cDNA z expresních knihoven. Viz například Molecular Croning, A Laboratory Manual, druhé vydání, sv. 1 až 3, Sambrook a další (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) a tam uvedené odkazy.

Tímto způsobem se mohou izolovat proteiny a nukleotidové sekvence kódující takové proteiny, jež mají inhibiční nebo toxické účinky vůči určitým hmyzím druhům. Takové proteiny a nukleotidové sekvence podle vynálezu lze použít pro ochranu rostlin proti škůdcům, to znamená lze použít pro ochranu rostlin proti škůdcům, to znamená proti hmyzu, houbám, bakteriím, nematodům, virům a viroidům a podobně, ale zvláště proti hmyzím škůdcům. Zejména lze získat proteiny a nukleotidové sekvence inhibiční nebo toxické proti hmyzím druhům řádu Coleoptera.

Hmyzí škůdci zahrnují hmyzí druhy řádu Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, atd., ale zvláště Coleoptera. Hmyzí druhy podle vynálezu pro nejdůležitější plodiny zahrnují: Kukuřice: Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda, Diatraea grandiosella, Elasmopalpus lignosellus, Diatraea saccharalis, Diabrotica virgifera, Diabrotica barberi, Diabrotica undecimpunctata howardi, Melanotus spp.,

-3CZ 297319 B6

Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Popillia japonica, Chaetocnemu pulicaria, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Anuraphis maidiradicis, Blissus leucopterus, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus sanguinipes, Delia platura, Agromyza parvicornis, Anaphothrips obscurus, Solenopsis milesta, Tetranychus urticae, Busseola fusca, Sesamia calamistis, Eldana sacchharina, Chilo pertellus, Ostrinia furnacalis, Sesamia nonagrioides; Čirok.· Chilo partellus, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Elasmopalpus lignosellus, Agrotis subterranea, Phyllophaga crinita, Eleodes, Conoderus a Aeolus spp., Oulema melanopus, Chaetocnema pulicaria, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Sipha flava, Blissus leucopterus, Contarinia sorgicola, Tetranychus cinnabarinus, Tetranychus urticae, Schizaphis graminum; Žito.' Pseudaletia unipunctata, Spodoptera frugiperda, Elasmopalpus lignosellus, Agrotis orthogonia, Oulema melanopus, Hypera punctata, Diabrotica undecimpunctata howardi, Schizaphis graminum, Sitobion avenae, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentialis, Melanoplus sanguinipes, Mayetiola destructor, Sitodiplosis mosellana, Meromyza americana, Hylemya coarctata, Frankliniella fusca, Cephus cinctus, Eriophyes tulipae; Slunečnice: Suleima helianthana, Homeosoma electellum, Zygoramma exclamationis, Bothyrus gibossus, Neolasioptera murtfeldtiana, Cochylis hospes, Rachiplusia nu, Smicronyx fulvus, Cylindrocopturus adspersus; Bavlna: Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Spodoptera exigua, Pectionophora gossypiella, Anthonomus grandis, Aphis gossypii, Pseudatomoscelis seriatus, Trialeurodes abutilonea, Lygus lineolaris, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentialis, Thrips tabaci, Franklinkiella fusca, Tetranychus cinnabarinus, Tetranychus urticae; Rýže: Diatrea saccharalis, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Colaspis brunnea, Lissorhoptrus oryzophilus, Sitophylus oryzae, Nephotettix nigropictus, Blissus leucopterus, Acrosternum hilare; Sojové boby: Pseudoplusia includens, Anticarsia gemmatalis, Plathypena scabra, Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Spodoptera exigua, Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Epilachna verivestis, Myzus persicae, Empoasca fabae, Acrosternum hilare, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentialis, Delia platura, Sericothrips variabilis, Thrips tabaci, Tetranychus turkestani, Tetranychus urticae; Ječmen: Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Schizaphis graminum, Blissus leucopterus, Acrosternum hilare, Euschistus servus, Delia platura, Mayetiola destructor, Petrobia latens; Řepka olejná: Brevicorine brassicae, Phyllotreta spp., Mamestra configurata, Plutella xyllostella; Vojtěška: Autographa californica, Otiorhynchus ligusticii, Colias eurytheme, Agronyza frontella, Hypera bruneipeonis, Philaerius spumarius, Theriophis meculata, Hypera punctata, Acyrthosyphon pisum, Acyrthosyphor kondoi, Lygus lineolaris, Chlorochroa sayi, Anticarsia friegiperda, Hypera postica, Spodoptera, Empoasca fabae, Psuedolusia includens, Spissistilus festinus; viz například Manya B. Stoetzel (1989), Common Names of Insects and Related Organisms, Entomological Society of America, zde zahrnuto jako odkaz.

Nukleotidová sekvence podle vynálezu se může použít pro izolaci jiných homologních (souhlasných) sekvencí v dalších rostlinných druzích, zvláště v jiných druzích luštěnin. Příslušné způsoby jsou v oboru běžné pro hybridizaci sekvencí nukleové kyseliny. Kódující sekvence z jiných rostlin se mohou izolovat dobře známými technikami založenými na jejich sekvenční shodnosti s kódujícími sekvencemi, jež jsou zde popsány. V těchto způsobech se používá známé kódující sekvence buď celá, nebo její část jako sonda, jež selektivně hybridizuje s jinými pesticidními kódujícími sekvencemi přítomnými v populaci klonovaných fragmentů nebo cDNA) zvoleného organismu.

Například celé sekvence peptinu-1 nebo její části se může použít jako sondy schopné specifické hybridizace s kódujícími sekvencemi a mediátorovými RNA. Při realizaci specifické hybridizace za rozmanitých podmínek mají takové sondy zahrnovat sekvence, jež jsou jedinečné a pokud možno mají mít délku asi 10 nukleotidů a ještě výhodněji alespoň 20 nukleotidů. Takové sekvence se mohou použít pro amplifíkaci (zmnožení) kódujících sekvencí pentinu-1 ze zvoleného organismu známými způsoby polymerázou katalyzované řetězové reakce (PCR). Tohoto způsobu se může použít pro izolaci dalších kódujících sekvencí z organismu, který nás zajímá, nebo jako diagnostického testu pro stanovení přítomnosti sekvencí kódujících pentin-1 v organismu.

-4CZ 297319 B6

Tyto způsoby zahrnují hybridizační třídění DNA knihoven naočkovaných na plotny (buď v plakách, nebo koloniích; viz například Sambrook a další, Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), a amplifíkaci technikou PCR za použití oligonukleotidových primerů odpovídajících doménám sekvencí zakonzervovaných mezi sekvencemi aminokyselin (viz například Innis a další, PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, eds., Academie Press (1990)).

Hybridizace takových sekvencí se například může provádět v podmínkách snížené nebo střední přísnosti (stringence) nebo v přísných (stringentních) podmínkách (jde například o příslušnost promývání v podmínkách reprezentovaných 35 až 40% formamidem s 5x Denhardtovým roztokem, 0,5% SDS dodecylsíran sodný) a lx SSPE při 37 °C; v druhém případě o podmínky přísnosti reprezentované 40 až 45% formamidem s 5x Denhardtovým roztokem, 0,5% SDS a lx SSPE při 42 °C; a konečně přísnost promývání daná 50% formamidem s 5x Denhardtovým roztokem, 0,5% SDS a lx SSPE při 42 °C sDNA kódující zde popsané insekticidní geny ve standardním provedení hybridizace. Viz Sambrook a další, Molecular Cloning, a Laboratory Manual II. vyd. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory.

Termín „přísné podmínky“ nebo „přísné hybridizační podmínky“ znamenají podmínky, za nichž sonda hybridizuje se svou cílovou sekvencí v podstatě větším rozsahu než jiné sekvence (například alespoň dvojnásobně oproti pozadí). Přísnost podmínek závisí na dané sekvenci a za různých okolností je rozdílná. Při řízení přísnosti hybridizace a/nebo podmínek promývání lze nalézt cílové sekvence stoprocentně komplementární se sondou (homologní, shodné sondování). Alternativně se mohou upravit takové podmínky přísnosti, které způsobí chybné párování sekvencí, takže se detekuje na základě nižšího stupně podobnosti (heterologní sondování). Všeobecně platí, že je výhodné, když sonda je kratší než asi 500 nukleotidů, typicky od asi 50 do asi 300 nukleotidů.

V typických případech jsou přesné podmínky takové, v nichž je koncentrace soli menší než asi 1,5 M iontů Na, typicky asi od 0,01 do 1,0 M iontů Na (nebo jiných solí) při pH 7,0 až 8,3 a teplota je nejméně kolem 30 °C pro krátké sondy (například 10 až 50 nukleotidů) a nejméně kolem 60 °C pro dlouhé sondy (například větší než 50 nukleotidů). Přísné podmínky lze též navodit přidáním destabilizujícího činidla jako je formamid. Příklad málo přísných podmínek představuje hybridizace v přítomnosti pufru 30 až 35% roztoku formamidu, 1 M NaCl, 1% SDS při 37 °C a promývání v lx až 2x SSC lx až 2x SSC (20x SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M citrát sodný) při 50 až 55 °C. Příklad mírně přísných podmínek představuje hybridizaci v 40 až 45% formamidu, 1M roztoku NaCl, 1% SDS při 37 °C a promývání v 0,lx SSC při 60 až 65 °C.

Promývání po hybridizaci je specifickou funkcí a kritickými faktory je iontová síla a teplota finálního promývacího roztoku. Pro hybridy DNA-DNA je možno Tm odhadnout z rovnice Meinkotha a Wahla, Anal. Biochem. sv. 138, ss, 267-284 (1984): Tm = 81,5 + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) — 0,61 (% form) — 500/L, kde M je molarita jednomocného kationtu, % GC je procento nukleotidů guanosinu a cytosinu v DNA, % form je procento formamidu v hybridizačním roztoku a L je délka hybridu v párech bází. Tm je teplota (za dané iontové síly v pH) za níž 50 % cílové komplementární sekvence hybridizuje s dokonale párující sondou. Tm se snižuje o 1 °C pro každou 1% chybu v párování; proto se může Tm, podmínky hybridizace a/nebo promývání upravit pro hybridizaci se sekvencemi požadované identity. Jestliže například jsou cílem sekvence s >90% identitou, může se Tm snížit o 10 °C. Při definované iontové síle a Ph se většinou přísnost podmínek volí taková, aby byly asi 5 °C pod Tm specifické sekvence a její komplementární sekvence. Zvláště přísné podmínky však mohou znamenat hybridizaci a/nebo promývání při teplotách 1, 2, 3 nebo 4 °C pod Tm; mírně přísné podmínky mohou aplikovat hybridizaci a/nebo promývání při 6, 7, 8, 9 nebo 10 °C pod Tm; při nízké přísnosti podmínek hybridizace a/nebo promývání lze užít teplot o 11, 12, 13, 14, 15 nebo 20 °C nižších než Tm za pomoci uvedené rovnice v kombinaci podmínek pro hybridizaci a promývání, a odborníci chápou, že proměny ve stupnici přísnosti při hybridizaci a/nebo složení promývacích roztoků jsou v patentu inherentně obsaženy. Jestliže důsledkem potřebné chyby v párování je Tm pod 45 °C (vodný roztok) nebo 32 °C (roztok formamidu), dává se přednost zvýšení koncentrace SSC, takže lze

-5CZ 297319 B6 zvýšit teplotu. Extenzivní návod pro hybridizací nukleových kyselin lze nalézt v: Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molekular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, část I., kapitola 2 „Přehled principů hybridizace a strategie pokusů se sondami nukleové kyseliny“, Elsevier, New York (1993); a Current Protocols in Molecular Biology, kap. 2, Ausubel a další eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).

Všeobecně platí, že sekvence, které kódují pentin-1 a další insekticidní proteiny podle vynálezu a hybridizují se genem zde popsaným budou asi z 50 % homologní (shodné), homologní z 70 %, homologní až do 85 % nebo až asi z 90 až 95 % homologní s popsanou sekvencí. To znamená, že sekvenční podobnost (similarita) sekvencí se může pohybovat v určitém rozmezí a dosahuje nejméně asi 50 %, asi 70%, asi 85% až asi 90 až 95% sekvenční similarity.

Pro popis vztahů mezi dvěma nebo více nukleovými kyselinami nebo polynukleotidy se užívá následujících termínů: (a) „referenční sekvence“, (b) „srovnávací okénko“ (c) „sekvenční totožnost“, (d) „procento sekvenční totožnosti“, (e) „podstatná identita“.

(a) Zde užitý termín „referenční sekvence“ je definovaná sekvence použitá jako základ pro srovnání sekvencí. Referenční sekvence může být podmnožina nebo celek specifikované sekvence; například jako úsek celé sekvence cDNA nebo úsek sekvence genu nebo jako celistvá sekvence cDNA nebo genu.

(b) Termín „srovnávací okénko“ zde znamená přilehlý a specifikovaný úsek polynukleotidové sekvence, v němž lze polynukleotidový úsek přirovnat k referenčnímu úseku a v němž část polynukleotidové sekvence ve srovnávacím okénku může obsahovat adice nebo delece (to znamená mezery) ve srovnání s referenční sekvencí (jež adice a delece neobsahuje) pro optimální uspořádání obou sekvencí. Obvykle má srovnávací okénko délku nejméně 20 přilehlých sekvencí a v případě přání jich může být i 30, 40, 50, 100 nebo více. Odborníci vědí, že ve snaze vyhnout se vysoké podobnosti s referenční sekvencí v důsledku vkládání mezer do polynukleotidové sekvence se typicky zavádí opravný malus (odečet) na delece (mezery), který se odečítá od počtu správných párů.

Způsoby uspořádání sekvencí pro srovnání jsou odborníkům dobře známy. Optimální uspořádání sekvencí pro srovnání se může řídit algoritmem lokální shodnosti Smithe a Watermanna, Adv. Appl, Math. sv. 2, s. 4828 (1981); algoritmem uspořádání homologie Needlemanna a Wunsche, J. Mol. Biol., sv. 48, s. 443 (1970); postupem zjišťování podobnosti Pearsona a Lipmana, zpracováním těchto algoritmů včetně (aniž by se však na ně omezovaly): CLUSTAL v programu PC/Gene fy fntelligenetics, Mountain View, Kalifornie, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA aTFASTA ve Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Groups (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA; Program CLUSTAL dobře popsali Higgins s Sharp, Gene, sv. 73, s. 237-244 (1988); Higgins a Sharp, CABIOS, sv. 5, s. 151-153 (1989); Corpet a další, Nucleic Acids Research, sv. 16, s. 10881-10890 (1988); Huang a další, Computer Applications in the Biosciences, sv. 8, s. 155-165 (1992) a Pearson a další, Methods in Molecular Biology, sv. 24, s. 307-331 (1994). Skupina programů BLAST, jíž lze použít pro průzkum v databázi similarit, zahrnuje: BLASTN pro nukleotidové rozpoznávací sekvence proti nukleotidovým sekvencím; BLASTX pro nukleotidové rozpoznávací sekvence proti sekvencím proteinové databáze; BLASTP pro proteinové rozpoznávací sekvence proti sekvencím proteinové databáze; TBLASTN pro proteinové rozpoznávací sekvence proti sekvencím nukleotidové databáze aTBLASTX pro nukleotidové rozpoznávací sekvence proti sekvencím nukleotidové databáze. Viz Current Protocols in Molecular Biology, kap. 19, Ausubel a další, eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).

Jak chápou odborníci, v programech BLAST se předpokládá, že proteiny lze modelovat jako náhodné sekvence. Mnohé reálné proteiny však obsahují oblast náhodné, jimiž mohou být homopolymemí úseky, krátké repetice nebo oblasti obohacené jednou nebo dvěma aminokyselinami. Takové oblasti s nízkou komplexitou mohou být zařazeny mezi nepříbuznými proteiny i když by

-6CZ 297319 B6 ostatní oblasti proteinu byly zcela odlišné. Je možno použít mnoha programů pro vytřídění oblasti s nízkou komplexitou pro jejich snížení. Lze použít mnoha programů pro vytřídění sestav s nízkou komplexitou. Na příklad SEG (Wooten a Federhen, Comput. Chem. sv. 16, s. 149-163 (1993) a XNU (Claverie a States, Comput. Chem., sv. 17, s. 191-201 (1993), a to samotných nebo v kombinaci.

(c) Při použití zde zahrnuje termín „sekvenční identita“ nebo „identita“ v kontextu dvou sekvencí nukleových kyselin nebo peptidů odkaz na zbytky ve dvou sekvencích, jež jsou stejné při uspořádání za účelem maximální shody přes specifikované srovnávací okénko. Když se procento sekvenční identity použije u proteinů, považuje se za dané, že se pozice zbytků, jež nejsou identické, často liší v substitucích konzervativních aminokyselin, v nichž jsou zbytky aminokyselin nahrazeny jinými zbytky aminokyselin s podobnými chemickými vlastnostmi (například náboj na hydrofobní charakter) a proto nemění funkční vlastnosti molekuly. Kde se sekvence v konzervativních substitucích liší, procento sekvenční identity se může upravit směrem nahoru za účelem korekce konzervativní povahy substituce. O sekvencích lišících se podobnými konzervativními substitucemi se říká, že mají „sekvenční similaritu (podobnost)“ nebo zkráceně „similaritu“. Odborníkům jsou dobře známy prostředky pro provedení této úpravy. Typicky to zahrnuje hodnocení konzervativní substituce spíše jako částečné chybné párování než jako zcela chybné párování, čímž se zvyšuje procento sekvenční identity. Proto například v případech kdy se identické aminokyselině přidělí známka 1 a nekonzervativní substituci známka 0, konzervativní substituci připadne známka mezi 0 a 1. Známkování konzervativních substitucí se počítá například podle algoritmu Meyerse a Millera, Computer Applic. Biol. Sci., sv. 4, s. 11-17, (1988), jak je realizuje například program PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornie, USA).

(d) Termín „procento sekvenční identity“, jak se zde používá, znamená hodnotu stanovenou srovnáváním dvou optimálně uspořádaných sekvencí přes srovnávací okénko, přičemž část polynukleotidové frekvence ve srovnávacím okénku může v zájmu optimálního uspořádání těchto dvou sekvencí zahrnovat adice (přídavky) nebo delece (mezery) ve srovnání s referenční sekvencí (jež adice a delece neobsahuje). Toto procento se počítá stanovením počtu pozic, v nichž se v obou sekvencích vyskytuje identická báze nukleové kyseliny nebo aminokyselinový zbytek, čímž se získá počet správně spárovaných pozic, dělením počtu těchto dobře spárovaných pozic celkovým množstvím pozic ve srovnávacím okénku a násobením 100. Tím se získá procento sekvenční identity.

(e) (1) Termín „podstatná identita“ v polynukleotidových sekvencích znamená, že polynukleotid obsahuje sekvenci, jež má nejméně 70% sekvenční identitu, výhodně alespoň 80%, ještě výhodněji alespoň 90% a nejvýhodněji alespoň 95% identitu ve srovnání s referenční sekvencí za použití jednoho z popsaných programů pro uspořádání při standardních parametrech. Odborník nahlédne, že tyto hodnoty lze vhodně upravit pro stanovení odpovídající identity proteinů kódovaných dvěma nukleotidovými sekvencemi, přičemž je třeba vzít v úvahu kodonovou degeneraci, podobnost aminokyselin, umístění čtecího rámce a podobně. Sekvence aminokyselin jsou pro tyto účely považovány za v podstatě identické při sekvenční identitě nejméně 60 %, raději nejméně 70 %, 80 %, 90 % a nejraději nejméně 95 %.

Jiným důkazem, že nukleotidová sekvence jsou v podstatě identická je když dvě molekuly za přísných podmínek spolu hybridizují. Nukleové kyseliny jež za přísných podmínek spolu nehybridizují však mohou být v podstatě identické. K tomu například dochází, když se vytvoří kopie nukleové kyseliny s využitím maximální kodonové degenerace, jakou dovoluje genetický kód. Indicií že dvě sekvence nukleové kyseliny jsou v podstatě identické je, když polypeptid kódovaný první nukleovou kyselinou je imunologicky zkříženě reaktivní s polypeptidem kódovaným druhou nukleovou kyselinou.

(e) (II) Označení „v podstatě identický“ v případě peptidů znamená, že peptid obsahuje sekvenci, jež má nejméně 70% sekvenční identitu s referenční sekvencí, výhodněji nejméně 80%, ještě raději 85% a nejraději nejméně 90% nebo 95% sekvenční identitu při srovnání přes specifické

-7CZ 297319 B6 srovnávací okénko s referenční sekvencí. Optimální uspořádání se výhodně provede za použití algoritmu homologního uspořádání Needlemana a Wunsche, J. Mol. Biol., sv. 48, s. 443 (1970). Indicií, že dvě peptidové sekvence jsou v podstatě identické je, že jeden peptid je imunologicky reaktivní s protilátkami indukovanými proti druhému peptidů. Proto je peptid v podstatě identický s druhým peptidem například v případě, že se dva peptidy liší pouze konzervativní substitucí. Peptidy jež jsou „v podstatě podobné“ sdílejí, jak výše uvedeno, stejné sekvence s tou výjimkou, že pozice zbytků jež nejsou identické, se mohou lišit změnami konzervativních aminokyselin.

Je známo, že pesticidní proteiny mohou být oligomemí a liší se v molekulové hmotnosti, počtu promotorů, zastoupení jednotlivých peptidů, aktivitě proti některým škůdcům, a v dalších charakteristikách. Proteiny aktivní proti řadě škůdců však lze izolovat a charakterizovat způsoby zde popsanými. Zvláštní pozornost přitahují proteiny aktivní proti larvě bázlivce západního (CRW). Proto jsou purifíkované nebo částečně purifíkované proteiny podle vynálezu testovány na insekticidní aktivitu proti larvám bázlivců včetně Diabrotica barberi (serv.), D. undecimpunctata howardi (již.) a D. virgifera virgifera (záp.). Tímto způsobem byl izolován jeden protein označený pentin-1, který má insekticidní aktivitu proti larvě bázlivce západního. Pentin-1 je glykosylovaný protein s přibližnou molekulovou hmotností 5 až asi 50 kDal. (kilodaltonů). Aminokyselinová a nukleotidová sekvence proteinu pentin-1 je na obrázku 1 a SEQ ID č. 1 a 2.

Nejvyšší koncentrace pentinu-1 se zdá být ve zralých semenech. Tento protein je tepelně stabilní a má vůči larvě bázlivce západního (CRW) toxickou účinnost LC50 asi 10 pg/ml nutriční dávky.

Pentin-1 a ostatní proteiny podle vynálezu lze různým způsobem měnit včetně substitucí aminokyselin, delecí, zkracování a inzercí. V oboru jsou takové manipulace všeobecně známy. Varianty aminokyselinových sekvencí v pesticidních proteinech lze na příklad připravovat mutacemi v DNA. V oboru jsou dobře známy způsoby mutageneze a změn nukleotidových sekvencí. Viz například Kunkel, T. (1985) Proč. Nati, Acad. Sci. USA, sv. 82, s. 488^492; Kunkel a další (1987), Methods in Enzymol., sv. 154, s. 367-382; US Patent č. 4,873.192; Walker a Gaastra (eds.) Techniques in Molecular Biology, MacMillan Publishing Comp., New York (1983) a tam citované odkazy. Proto geny a nukleotidové sekvence podle vynálezu zahrnují jak přirozeně se vyskytující sekvence, tak i mutantní formy. Podobně proteiny podle vynálezu zahrnují jak přirozeně se vyskytující proteiny, tak i jejich varianty a modifikované formy. Takové varianty totiž i nadále mají potřebnou pesticidní aktivitu. Je zřejmé, že mutace vytvořené v DNA kódující variantu nesmí usmístit sekvenci mimo čtecí rámec a je výhodné, když nevytvoří komplementární oblasti, jež by mohly produkovat sekundární struktury mRNA. Viz Evropskou patentovou přihlášku 75.444.

Takto zahrnuje tento vynález pesticidní proteiny stejně jako jejich komponenty (složky) a fragmenty. Uznává se totiž, že lez připravit promotory komponentů, polypeptidů nebo fragmentů proteinů, jež si podrží pesticidní aktivitu. Tyto fragmenty zahrnují zkrácené sekvence stejně jako Ckonce, N-konce, vnitřní a vnitřně deletované aminokyselinové sekvence proteinů.

Od většiny delecí, insercí a substitucí proteinové sekvence se neočekává, že způsobí radikální změny v charakteristikách proteinu. I když je však nesnadné předvídat přesný účinek substituce, delece nebo inserce, odborník ocení, že tento účinek lze zjistit rutinními skríningovými testy (tříděním). Aktivitu lze totiž zjistit zkouškami toxicity vůči hmyzu.

Nukleotidových sekvencí lze použít při „přeskupování“ DNA. přeskupení („shuffling“) DNA je proces rekurzivní rekombinace a mutace prováděný náhodnou fragmentací množiny příbuzných genů následovaný opětovným seskupením fragmentů řetězovou reakcí katalyzovanou polymerázou (PCR) bez primeru. Viz například Stemmer, W.P.C. (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. USA sv. 91, s. 10747-10751; Stemmer, W.P.C. (1994) Nátuře, sv. 370, sv. 389-391; Zhang a další (1997) Proč. Nati. Scad. Sci. USA, sv. 94, sv. 4504-4509; a PCT Publication č. 96/19256. Výhodou racionalizace uspořádání DNA tímto přeskupením (rekombinací) je, že může optimalizovat funk

-8CZ 297319 B6 ci genů bez předběžného stanovení genu limitujícího rychlost děje. Tento vynález nabízí způsoby sekvencovaného přeskupení za použití polypeptidů podle vynálezu a jím popsaných kompozic.

Obecně řečeno sekvencované přeskupování (rekombinace sekvencí) poskytuje prostředky pro vytváření knihoven polynukleotidů s požadovanými vlastnostmi, jež lze takto vybírat a třídit. Knihovny rekombinantních polypeptidů se vytvářejí z populací příbuzných polypeptidových sekvencí obsahujících sekvencované oblasti, jež jsou v podstatě sekvenčně identické a mohou se homologicky rekombinovat in vitro nebo in vivo.

Populace sekvenčně rekombinovaných polynukleotidů obsahuje subpopulaci polynukleotidů s žádoucími nebo výhodnými vlastnostmi a může se selektovat vhodnými selekčními nebo třídicími způsoby. Tyto vlastnosti představuje kterákoliv vlastnost nebo atribut, který se může selektovat nebo detekovat třídicím systémem a může zahrnovat vlastnosti jako: kódovaný protein, transkripční prvek, sekvenci řídící transkripci, tvorba RNA, stabilitu RNA, kondenzaci chromatinu, translaci, nebo jinou vlastnost exprese genu nebo transgenu, prvek replikace, prvek vázající protein a podobně včetně jakékoliv znaku, který přispívá k vlastnosti, která je selektovatelná nebo detekovatelná. V některých provedeních může být zvolenou vlastností zvýšená hodnota Km a/nebo Kcat ve srovnání s přírodní formou proteinu jak zde uvedeno. V jiných provedeních bude mít protein nebo polynukleotid vytvořený sekvencovaným přeskupením (sekvenční rekombinací) větší vazebnou afinitu ligandu než nepřeskupený přírodní polynukleotid. Vzrůst takových vlastností může být nejméně 110%, 120 %, 130 %, 140 % nebo nejméně 150 % oproti hodnotě u přírodního polynukleotidů.

Pentin-1 je člen širší genové rodiny esteráz, přesněji lipidacylových hydroláz jak vyplývá z podobnosti sekvencí. Přeskupení genu je způsobe, jímž lze lepšit nebo změnit biologickou aktivitu daného genového produktu. Přeskupení genu lze ve spojení ve strategii selekce použít pro zlepšení vlastností jako je specifičnost substrátu, rozpustnost, optimální teplota a pH protein nebo enzymu při řízené molekulární evoluci. V případě pentinu-1 je toxicita vůči hmyzu vyjádřená letální koncentrací nej důležitějším parametrem.

Genové přeskupení se může použít i u jediného genu, což zavádí do tohoto genu při dané frekvenci mutace. Následným genovým přeskupením lze potom v primární populaci mutantů selektovat kombinace synergických mutací. Tento přístup se může aplikovat u pentinu-1.

Pro genové přeskupení lze alternativně použít různé členy gelových rodin již kódované rozdílnými ale příbuznými sekvencemi. Může zde být zahrnut pentin-1 z Pentaclethra a exprimovaná značená sekvence z kukuřice, identifikovaná jako 5C9 kódující cDNA, asi z 57% identická s pentinem-1 na nukleotidové úrovni, ale není to jediná možnost. Viz souběžnou patentovou přihlášku 08/449.986 z 25.5. 1995, zde zahrnutou odkazem. Genovým přeskupením se zavádějí i průvodní mutace, jež rovněž přispívají ke genetické rozmanitosti. Synergické kombinace fúzí mezi členy genové rodiny a nově zaváděnými mutacemi se mohou selektovat řízenými strategiemi molekulární evoluce.

Lipidacylové hydrolázy tvoří různorodou multigenovou rodinu vyskytující se v mnoha rostlinných druzích. Tyto enzymy mají schopnost hydrolýzy mnohých glykolipidů a fosfolipidů. Substráty zahrnují monogalaktosyldiacylgiycerin, acylsterylglukosid, fosfatidylcholin, lysofosfatidylcholin, fosfatidylethanolamin, lysofosfatidylethanolamin, fosfatidylinosit a mnoho dalších lipidových substrátů. Podobně se složení membrán různých druhů hmyzu a rostlin může lišit podle druhů a může být ovlivněno dietou nebo růstovými podmínkami. Proto může aktivita dané lipidacylové hydrolázy ovlivnit specifičnost i účinnost. Změněná specifičnost substrátu může být parametrem pro selekci produktů přeskupení genu.

Rozpustnost a stabilita proteinu může být rovněž vyselektována z produktů přeskupených genů. Insekticidní proteinu jsou aktivní v drsných podmínkách hmyzího střeva. Tyto proteiny jsou štěpeny proteázami a ovlivněny redukčními nebo oxidačními podmínkami, jež se liší u různých

-9CZ 297319 B6 testovaných hmyzích druhů. Rozpustnost a stabilita lipidacylových hydroláz v transgenních rostlinách i v hmyzích střevech může ovlivnit jejich biologickou aktivitu a lze ji změnit strategiemi genového přeskupení.

Podmínky enzymatické reakce jako je pH a teplotní optimum může rovněž ovlivnit insekticidní aktivitu pentinu-1. Ve střevě larvy bázlivce je pH 5,5 až 6,0. Selekce produktů přeskupeného genu pentinu-1 z hlediska enzymatické aktivity vůči lipidovým substrátům v tomto rozmezí pH je dalším parametrem, který může ovlivnit toxicitu.

Proto může být použita pentinová sekvence podle tohoto vynálezu v pokusech s přeskupováním genů u dalších lipidových hydroláz jako jsou patatiny a zvláště C59.

Proteiny nebo jiné složené polypeptidy zde pospané se mohou pro potlačování různých hmyzích škůdců používat samotné nebo v spojení s jinými proteiny nebo činidly. Ostatní insekticidní proteiny zahrnují proteiny původem zBacillus včetně δ-endotoxinů a vegetativních insekticidních proteinů a rovněž inhibitorů proteázy (serinového a cysteinového typu) lektinů, cc-amyláz, peroxidáz, cholesteroloxidáz a podobně.

V jednom provedení je provázena exprese proteinů podle vynálezu v transgenní rostlině exprese jednoho nebo více δ-endotoxinu Bacillus thuringiensis (Bt). Této ko-exprese více než jedné účinné látky v jediné transgenní rostlině lze docílit genetickou manipulací rostliny, aby obsahovala a exprimovala všechny potřebné geny. Alternativně lze přimět rostlinu Rodič 1 prostředky genetického inženýrství k expresi proteinů podle vynálezu. Druhá rostlina Rodič 2 se podobně geneticky manipuluje pro expresi dalších účinných látek jako je δ-endotoxín z Bt. Zkřížením Rodiče 1 s Rodičem 2 se mohou získat dceřiné rostliny exprimující všechny geny přítomné v Rodičích 1 a 2.

Tento vynález též zahrnuje nukleotidové sekvence zjiných organismů než je Pentaclethra, v nichž proteiny zkříženě reagují s protilátkami introdukovanými proti proteinům podle vynálezu nebo v nichž jsou nukleotidové sekvence izolovatelné hybridizací s nukleotidovými sekvencemi podle vynálezu. Proteiny izolované nebo kódované těmito nukleotidovými sekvencemi se mohou testovat na pesticidní aktivitu. Izolované proteiny se mohou na pesticidní aktivitu zkouše způsoby zde popsanými nebo jinými, dobře známými v oboru.

V jiném provedení se mohou proteiny podle vynálezu použít v kombinaci spovlékáním semen v oboru známém. Tímto způsobem se transformovaná semena povlékají za použití komerčně nabízených postřiků nebo prášků. V oboru jsou tyto insekticidy známé. Viz například patent US 5 696 144; US 5 695 763; US 5 420 318; US 5 405 612; US 4 596 206; US 4 356 934; US 4 886 541 a další, zde zahrnuté ve formě odkazu.

Jakmile byly izolovány nukleotidové sekvence kódující pesticidní proteiny podle vynálezu, mohou se geneticky manipulovat a použít pro expresi proteinu v různých hostitelích včetně dalších organismů jako jsou mikroorganismy a rostliny.

Proteiny podle vynálezu se mohou použít pro ochranu zemědělských plodin a dalších produktů před škůdci zavedením do mikrobiálního hostitele pomocí vhodného vektoru a rozšířením uvedeného hostitele v okolí rostlin. Mikrobiální hostitelé se volí z druhů, o nichž je známo, že osídlují fytosféru, prostředí a povrchy listů a kořenů (fyloplán, fylosféra, rhizosféra, a/nebo rhizoplán) jedné nebo více plodin, jež chceme chránit. Tyto mikroorganismy se vybírají tak, aby byly schopny úspěšně kompletovat v daném specifickém prostředí přírodním mikroorganismům, zajišťovaly zachování a expresi genů exprimujících polypeptidové pesticidy a podle přání zlepšily ochranu pesticidu před degradačním a desaktivačním vlivem prostředí.

Proteiny podle vynálezu se mohou použít v expresních kazetách pro expresi v kterémkoliv hostiteli našeho zájmu. Takové expresní kazety obsahují iniciační oblast transkripce vázanou na gen

-10CZ 297319 B6 kódující sledovaný pesticidní gen. Tato expresní kazeta je opatřena množstvím restrikčních míst pro inzerci sledovaného genu, aby byl pod vlivem řízení transkripce regulačními oblastmi. Expresní kazeta může navíc obsahovat volitelné genové signální znaky (márkery), vhodné pro organismus daného hostitele.

Iniciační oblast transkripce, promotor, může být vůči hostiteli nativní (z téhož organismu), nebo může být analogický, nebo cizí nebo heterologní. Podobně může být promotorem přírodní sekvence nebo alternativně syntetická sekvence. Předpokládá se, že iniciační oblast transkripce se nenalézá v hostiteli přírodního typu, do něhož se iniciační oblast transkripce zavádí. Chimérický gen ve smyslu zde použitém obsahuje kódující sekvenci funkčně spojenou s iniciační oblastí transkripce, jež je heterologní ke kódující sekvencí. I když lze použít každý promotor nebo prvek promotoru schopný zahájit expresi kódující sekvence, pro expresi v rostlinách mají zvláštní význam kořenové promotory, (Bevan a další (1993) v Gene Conservation and Exploitation. Proceedings of the 20th Stadler Genetics Symposium. Gustafson a další (eds.) Plenům Press, New York, ss. 109-129; Brears a další (1991) Plant J., sv. 1, ss. 235-244; Lorenz a další (1993), Plant J„ sv. 4, ss. 545-554; Patent US 5 459 252; US 5 608 149; US 5 599 670), promotory z dřeně (Patent US 5 466 785; US 5 451 514; US 5 391 725), nebo specifické a konstitutivní promotory z ostatních tkání (například Patent US 5 608 149; US 5 608 144; US 5 604 121; US 5 569 597; US 5 466 785; US 5 399 680; US 5 268 463; US 5 608 142) zde uváděné jako odkazy.

Kazeta pro traskripci bude mít směr přepisu 5'-3', iniciační oblast transkripce a translace, sekvenci DNA jež nás zajímá a terminační oblast transkripce a translace funkční v rostlinách. Terminační oblast může mít stejný původ jako iniciační oblast transkripce, může mít stejný původ jako iniciační oblast transkripce, může mít stejný původ jako sekvence DNA jež nás zajímá, anebo může procházet z jiného zdroje. Vhodné terminační oblasti lze získat zTiplazmidu A. tumefaciens jako jsou terminační oblasti oktapinsyntáza a nopalinsyntáza. Viz též Guerineau a další (1991), Mol. Gen. Genet, sv. 264, s. 141-144; Proufoot (1991) Cell, sv. 64, s. 671-674; Sanfacon a další (1991) Genes Des., sv. 5, s. 141-149; Mogen a další (1990) Plant Cell sv. 2, s. 1261— 1272; Munroe a další (1990) Gene, sv. 91, s. 151-158; Ballas a další (1989) Nucleic Acid Res., sv. 17, s. 7891-7903; Joshi a další (1987) Nucleic Acid Res., sv. 15, s. 9627-9639.

Nukleotidové sekvence kódující proteiny nebo polypeptidy podle vynálezu jsou zvláště užitečné pro genetickou manipulaci rostlin. V tomto způsobu jsou geny podle vynálezu k dispozici v expresních kazetách pro expresi ve sledovaných rostlinách. Kazeta obsahuje regulační sekvence 5' a 3' operativně vázané na gen který nás zajímá. Navíc může kazeta obsahovat nejméně jeden gen navíc pro společnou transformaci (kotransformaci) nebo navázání a transformování do organismu. Alternativně se může gen (nebo geny) našeho zájmu zajistit v jiné expresní kazetě. Kde je to na místě, může se gen optimalizovat pro zvýšenou expresi v transformované rostlině. Znamená to, že se geny mohou syntetizovat pro zlepšenou expresi použitím kodonů rostlinou preferovaných. V oboru jsou k dispozici způsoby syntézy genů rostlinou preferovaných. Viz například Patent US 5 380 831, US 5 436 391 a Murray a další (1989), Nucleic Acid Res. sv. 17, s. 477498 zde zařezané jako odkazy.

V závislosti na tom, kde má být exprimována sekvence DNA, o niž se zajímáme, může být potřebné syntetizovat sekvenci kodony jež rostlina preferuje nebo alternativně kodony, jež preferuje chloroplast. Kodony rostlinou preferované lze stanovit pomocí kodonů nej častěji se vyskytujících mezi proteiny exprimovanými v největším množství v rostlinných druzích, jež nás zajímají. Viz Evropský patent 0359472; Evropský patent 0385962; WO 91/16432; Perlak a další (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA sv. 88, s. 3324-3328; a Murray a další (1989) Nucleic Acid Research sv. 17, s. 477^198. Tímto způsobem lze optimalizovat nukleotidové sekvence pro expresi v kterékoliv rostlině. Nahlíží se, že každá nebo kterákoliv část genové sekvence může být optimalizována nebo syntetizována. Takže syntetické nebo částečně optimalizované sekvence se rovněž mohou použít.

-11 CZ 297319 B6

Je známo že dodatečné úpravy sekvence zesilují genovou expresi v hostitelské buňce. Týká se to eliminace sekvencí kódujících klamné polyadenylační signály, signály míst sestřihu exonu a intronu, repetic typu transpozónu, a dalších podobných dobře charakterizovaných sekvencí, jež mohou být pro genovou expresi škodlivé. Obsah G-C v sekvenci se může upravit na úroveň v daném buněčném hostiteli průměrnou, což se vypočte ve vztahu ke známým genům exprimovaným v hostitelské buňce. Dle možnosti lze sekvenci modifikovat, aby nedošlo k nežádoucímu vzniku sekundárních vlásenkových struktur mRNA.

Expresní kazety mohou navíc obsahovat 5' vedoucí sekvence v konstruktu. Takové vedoucí sekvence mohou působit pro zesílení translace. Lídři translace (vedoucí sekvence pro zesílení translace) jsou v oboru známi a zahrnují: lídři typu pikomaviru, například EMCV lídr (encefalomyokarditis 5' nekódující oblast) Elroy-Stein O., Fuerst T. R., a Moss B., (1989) PNAS USA, sv. 86, s. 6126-6130); lídři typu potyviru, například TEV lídr etchviru tabáku (Allison a další (1986); MDMV lídr (lídr viru trpasličí mozaiky) Virology, sv. 154, s. 9-20; a vazebný protein lidského těžkého imunoglobulinového řetězce (BiP), (Macejak D.G. a Samow P. (1991), Nátuře, sv. 353, s. 90-94; netranslatovaný lídr z mRNA plášťového proteinu mozaikového viru vojtěšky (AMV RNA 4), (Jobling S.A. a Gehrke L., (1987), Nátuře sv. 325, s. 622-625); lídr viru tabákové mozaiky (TMV), Gallie D.R. a další (1989) Molecular Biology of RNA, s. 237-256); lídr viru chlorotické skvrnitosti kukuřice (MCMV) (Lommel S.A. a další (1991), Virology, sv. 81, s. 382385. Viz též Della-Cioppa a další (1987), Plant Physiology, sv. 84, s. 965-968. Lze použít i další způsoby pro zesílení translace, například intronů a podobně.

Geny podle vynálezu se mohou pro expresi zaměřit na chloroplast nebo amyloplast. V tomto případě, pokud není gen našeho zájmu přímo vložen do chloroplastu nebo amyloplastu, expresní kazeta navíc obsahuje gen kódující tranzitní peptid usměrňující gen našeho zájmu do chloroplastů. Tyto tranzitní peptidy jsou v oboru známy. Viz například Von Heijne a další (1991) Plant Mol. Biol. Rep., sv. 9, s. 104-126; Clark a další (1989) J. Biol. Chem., sv. 264, s. 17544-17550; Della-Cioppa a další (1987) Plant Physiol., sv. 84, s. 965-968; Romer a další (1993) Biochem. Biophys. Res, Commun., sv. 196, s. 1414-1421; a Shah a další (1986) Science, sv. 233, s. 478481.

Konstrukt může též obsahovat jakékoliv další potřebné regulátory jako například signály lokalizace v jádru (Kalderon a další (1984) Cell sv. 39, s. 499-509 a Lassner a další (1991) Plant Molecular Biology sv. 17, s. 229-234); konvenční sekvence translace v rostlinách (Joshi C.P. (1987) Nucleic Acids Research, sv. 15, s. 6643-6653), introny (Luehrsen a Walbot (1991) Mol. Gen. Genet. sv. 225, s. 81-93) a podobně, vhodně vázané na nukleotidové sekvence našeho zájmu.

Je známo, že lze exprimovat protein obsahující nativní (přírodní) signální sekvenci. Viz obrázek 3. Alternativně lze použít další signální sekvence známé v oboru jako například signální sekvence a—amylázy ječmene.

Při přípravě expresní kazety lze manipulovat různé fragmenty DNA s cílem získat sekvence DNA se správnou orientací a pokud je to na místě, ve vhodném čtecím rámci. Za tímto účelem lze pro spojování fragmentů DNA použít vhodné adaptéry nebo spojovníky a lze užít dalších manipulací pro zajištění vhodných restrikčních míst, odstranění nadbytečné DNA, odstranění restrikčních míst a podobně. Pro tento účel lze použít mutageneze in vitro, opravy primeru, restrikce, teplotní hybridizace, resekce, ligace, řetězové reakce katalyzované polymerázou (PCR) a podobně, v nichž mohou být zahrnuty inserce, delece nebo substituce, například transice nebo transverze.

Kompozice podle vynálezu lze užít pro transformaci kterékoliv rostliny. Tímto způsobem lze získat geneticky modifikované rostliny, rostlinné buňky, rostlinnou tkáň, semeno a podobně. Transformační protokoly se mohou lišit v závislosti na typu rostliny nebo rostlinné buňky určené k transformaci, to znamená zda je jednoděložná nebo dvouděložná. Vhodné způsoby transformace rostlinných buněk zahrnují mikroinjekce (Crossway a další (1986) Biotechniques, sv. 4, s.

- 12CZ 297319 B6

320-334), elektroporaci (Riggs a další (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. USA sv. 83, s. 5602-5606, transformace prostřednictvím Agrobacterium (Hinchee a další (1988) Biotechnology, sv. 6, s. 915-921), přímý transfer genů (Paszowski a další (1984) EMBO J., sv. 3, s. 2717-2722), balistické urychlení částic bombardováním částicovým dělem (viz například Sanford a další, Patent US 4 945 050; a McCabe a další 1988), Biotechnology, sv. 6, s. 923-926). Též viz Weissinger a další (1988) Annual Rev. Genet., sv. 22, s. 421-477; Sanford a další (1987) Particulate Science and Technology, sv. 5, s. 27-37 (cibule); Christou a další (1988) Plant Physiol., sv. 87, sv. 671-674 (sojové boby); Mc Cabe a další (1988) Bio/Technology, sv. 6, s. 923-926 (sojové boby); Datta další (1990) Biotechnology, sv. 8, s. 736-740 (rýže); Klein a další (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, sv. 85, s. 4305—4309 (kukuřice); Klein a další (1988) Biotechnology, sv. 6, sv. 559-563 (kukuřice), Fromm a další (1990), Biotechnology, sv. 8, s. 833-839; Tomeš a další „Přímý přenos DNA do intaktních rostlinných buněk bombardováním mikroprojektily“ v: Gamborg and Phillips (eds) Rostlinné kultury buněčné, tkáňové a orgánové: základní způsoby; Springer-Verlag Berlin, 1995 (kukuřice); Hooydaas-Van Slogteren andHooykaas (1984), Nátuře (London), sv. 311, s. 763-764; Bytebier a další (1987), Proč. Nat. Acad. Sci. USA, sv. 84, s. 5345-5349 (Liliaceae) De Wet a další (1985) v: Experimentální manipulace a tkání vajíčka, vyd. G.P. Chapman a další, s. 197-209. Longman, NY (pyly); Kaepler a další (1990) Plant Cell Reports, sv. 9, s. 415-418; a Kaeppler a další (1992) Theor. Appl. Genet., sv. 84, s. 560-566 (transformace zprostředkovaná whiskery); D. Haluin a další (1992) Plant Cell, sv. 4, s. 1495-1505 (elektroporace); Li a další (1993) Plant Cell Reports, sv. 12, s. 250-255 a Christou a Ford (1995) Annals of Botany, sv. 75, s. 407^113 (rýže); Osjoda a další (1996) Nátur Biotechnology, sv. 14, s. 745-750 (kukuřice pomocí Agrobacterium tumefaciens), které jsou zde všechny zahrnuty ve formě odkazu.

V případě přání lze rostlinný plastid transformovat přímo. Stabilní transformace plastidů byla popsána u vyšších rostlin, viz například SVAB a další (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA sv.87, s. 8526-8530; SVAB and Maliga (1993), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, sv. 90, s. 913-917; Staub a Maliga (1993), Embo J. sv. 12, s. 601-606. Způsob spočívá v balistickém předání DNA obsahující volitelný markér částicovým dělem a zavedení DNA do genomu plastidů homologní rekombinací. Kromě toho lze transformaci plastidů uskutečnit transaktivací tichého transgenu z plastidů tkáňově specifickou expresí v jádru kódované a do plastidů zaměřené RNA polymerázy. O takovém systému referoval McBride a další (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. USA sv. 91, s. 7301-7305.

Transformované buňky se mohou zapěstovat do rostlin známými způsoby. Viz například McCormick a další (1986) Plant Celle Reports, sv. 5, s. 81-84. Tyto rostliny se potom mohou pěstovat a také opylit tímtéž transformovaným kmenem nebo různými kmeny a výsledné potomstvo s potřebnými fenotypovými vlastnostmi lze identifikovat. Mohou se pěstovat jedna nebo dvě generace, aby se zaručilo, že se fenotypové vlastnosti stabilně udržují a dědí a potom se semena sklidí pro kontrolu, že se docílilo požadovaného fenotypu nebo jiných vlastností.

Protein se exprimuje do transformovaných organismů v takovém množství, aby byly toxické pro zájmové druhy hmyzu nebo inhibovaly jeho růst.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje aminokyselinovou a nukleotidovou sekvenci cDNA sekvence účinné složky proti larvě bázlivce (CRW) pentinu-1 z Pentaclethra SEQ ID č. 1 a 2.

Obrázek 2 ukazuje aminokyselinovou a nukleotidovou sekvenci sekvence cDNA účinné složky pentinu-1, optimalizovanou pro zesílenou expresi SEQ ID č. 3 a 4.

Obrázek 3 ukazuje aminokyselinovou sekvenci proteinu pentinu-1 s podtrženým úsekem představujícím předpokládanou signální sekvenci. Zbytky AFS bezprostředně následující za signální sekvencí jsou první tři zbytky zralého proteinu. Zbytky ASK začínají pět zbytků od AFS startu

- 13CZ 297319 B6 zralého proteinu označují oblast zřejmého zralého amino-konce pentinu-1 exprimovaného jako protein v plné délce a proteolyzovaného v kořenech kukuřice.

Obrázek 4 ukazuje expresní kazetu pro expresi sekvencí pentinu-1.

Následující příklady se podávají jako ilustrace a nemají za cíl limitovat rozsah platnosti patentu.

I když byl vynález popisem do podrobností ilustrován a uvedeny příklady za účelem srozumitelnosti, je zřejmé, že v rozsahu popsaného patentu lze uskutečnit určité změny a modifikace.

Příklady provedení vynálezu

Čištění pentinu-1

Semena P. macrologa se sebrala v nížinných dešťových pralesích Kostariky a dopravila do laboratoří přihlašovatele, kde se před použitím dezintegrovala, lyofilizovala a skladovala při -20 °C. Zmrzlá semena se rozsekala na malé kousky a homogenizovala pomocí Brinkmannova homogenizátoru. Při typickém provedení se 10 g materiálu ze semen homogenizovalo s 1 a 2 g nerozpustného polyvinylpyrolidonu a 50 až 100 ml 10 mM roztoku pufru fosforečnanu sodného s pH 7,5. Homogenát se potom míchal při 4 °C 8 až 10 hodin a odstřeďoval 15 minut při 5000 otáčkách za minutu. Kalová voda (supematant) se opatrně dekantovala, prolila jednou vrstvou Miracloth a shromáždila tak, aby nedošlo k transferu do extraktu lipidických materiálů, které se při odstřeďování na povrchu oddělily a ztuhly. Tyto pelety se odložily do odpadu a shromážděná kapalina dosud poněkud zakalená se podruhé 30 minut odstřeďovala při 18.000 otáčkách za minutu na rotačním zařízení Sorwall SS-34 nebo podobném. Slabě zakalená kalová voda, nyní označovaná jako surový extrakt, se shromáždila a pelety se poslaly do odpadu. Vzorek surového extraktu se odložil pro zkoušky a zbytek se dialyzoval pomocí separační membrány s mezí prostupnosti na molekulové hmotnosti (MWCO) 3.500 při pěti výměnách pufru fosforečnanu sodného v roztoku 10 mM, pH 7,5 a teplotě 3 až 4 °C. Poměr dialyzní kapaliny k extraktu byl nejméně 20:1. Dialýza pokračovala při výměnách pufru 8 až 16 hodin. V důsledku vysrážení proteinu se extrakt během dialýzy zcela zakalil. Proto se dialyzovaný extrakt vyčeřil odstředěním při 18 otáčkách za minutu během 30 minut. Výsledný materiál po odstředění je v dalším nazýván surový dialyzovaný extrakt. Surový extrakt a surový dialyzovaný extrakt se analyzovaly na proteinové složení nebo obsah a při biologických testech bylo zjištěno, že obsahují látku insekticidní proti larvě bázlivce západního (CRW). Bylo zjištěno, že insekticid pro protein nebo látka bílkovinného charakteru.

Vzorek 100 ml dialyzovaného surového extraktu se zahříval při asi 80 °C ve vodní lázni asi 5 minut. Zahřátý extrakt se potom ochladil pod 25 °C pomocí ledové lázně a po ochlazení se odstřeďoval 15 až 30 minut při 18.000 otáčkách pomocí rotačního přístroje Sorval SS-34. Čirý supematant (kalová voda) se potom oddělil, uložil a v dalším označoval jako tepelně zpracovaný extrakt. Peletizovaný pevný materiál se zlikvidoval. Zjistilo se, že tepelně zpracovaný extrakt se testoval na obsah proteinu Bradfordovým způsobem pomocí BSA jako standardu a zjistilo se v biologických testech, že má insekticidní aktivitu proti CRW.

Vzorek teplem zpracovaného extraktu se frakcionoval a zahustil pomocí síranu amonného. Vzorek se ochladil za pomoci ledové lázně a za míchání se pomalu přidalo 0,6 g/ml práškového síranu amonného. Po tomto přidání síranu amonného se vzorek udržoval na teplotě ledové lázně dalších asi 30 minut. Potom se vzorek 20 minut odstřeďoval při 4 °C a 18.000 otáčkách za minutu na rotačním přístroji Sorval SS-34. Kalová voda a peletizovaný materiál se oddělily a peletizovaný materiál se opět rozpustil v minimálním množství pufru fosforečnanu sodného koncentrace 10 mM s pH 7,5. Kalová voda a znovu rozpuštěný peletizovaný materiál byly zkoušeny na obsah proteinu Brandfordovou metodou s BSA jako standardem a testovány na biologickou aktivitu proti larvě bázlivce západního (CRW). Většina pentinu-1 se nalezla v peletizovaném materiálu,

- 14CZ 297319 B6 který byl insekticidní proti CRW. Alternativně se zmenšil objem teplem zpracovaného extraktu zahuštěním odstředěním pomocí přístroje Centricon™ nebo podobného zařízení podle směrnic výrobce.

Proteiny se též frakcionovaly vylučovací chromatografií (SEC) buď na koloně Pharmacia Sephacryl S-200, nebo Pharmacia Superose 12. V závislost na množství proteinu v analyzovaném vzorku se užívalo různých kolon. Všeobecně platí, že objem vzorku nepřesahoval 0,5 až 1 % (obj.) objemu kolony. Před vložením vzorku do kolony se kolona přivedla do rovnovážného stavu s pufrem fosforečnanu sodného koncentrace 10 mM s pH 7,5 v množství dvoj- až trojnásobku objemu kolony. Proteiny se eluovaly z kolony pufrem fosforečnanem sodným s pH 7,5 v koncentraci 10 mM. Frakce se zkoušely na obsah proteinu Bradfordovou metodou s BSA jako standardem a biologicky se testovaly na larvy bázlivce západního. Tímto způsobem lze chromatografovat surové nebo dialyzované extrakty, teplem zpracované extrakty, resolubilizované frakce po vysrážení síranu amonného a extrakty a frakce zahuštěné jinými způsoby. Biologicky aktivní materiál se eluoval hned po průchodu kapaliny navázané na sorbent v množství odpovídajícím volnému objemu, což svědčí, že aktivní materiál má mírně vysokou (moderately high) molekulovou hmotnost. Tento výsledek je konzistentní s výsledky zkoušek s rozmanitými rozsahy molekulových hmotností získanými s filtračním přístrojem Centricon™. Takto se zjistilo, že aktivní materiál má v přírodním stavu molekulovou hmotnost nad 100 kDa, což je pravděpodobně výsledek spojení většího množství podjednotek s molekulovou hmotností 40 až 55 ± 5 kDa. Čistota frakcí se určovala po stanovení molekulové hmotnosti s použitím níže popsané SDS-PAGE. Tyto frakce byly převážně čisté při jednom detekovaném primárním pásu a stanovené molekulové hmotnosti podjednotky v rozmezí 40 až 55 ± 5 kDa.

Tepelně zpracované vzorky nebo vzorky, jež se podrobily vylučovací chromatografií se frakcionovaly anexovou chromatografií za použití buď kolony Pharmacia Q Sepharose, nebo kolony Pharmacia Resource Q. Před umístěním vzorku v koloně se kolona promyla roztokem 25 mM Tris-HCl nebo vhodným pufrem obsahujícím NaCl v koncentraci 1 M a potom se přivedla do rovnovážného stavu stejným pufrem bez NaCl. Pufry použité při chromatografií měly pH v rozmezí 4 až 10. Pro ilustraci použitých způsobů se zde popisuje chromatografie používající pufru Tris-HCl v koncentraci 25 mM s pH 9,0. Před vstříknutím vzorku do kolony se vzorek dialyzoval pomocí membrány s 3.500 MWCO s dvěma až třemi výměnami pufru Tris-HCl koncentrace 25 mM bez 1 M roztoku NaCl. Po umístění do kolony se průtok shromáždil a kolona se promyla Tris-HCl v koncentraci 25 mM s pH 9,0. Promývací voda se rovněž shromáždila. Potom se kolona eluovala roztokem 25 mM Tris-HCl při pH 9,0 se stoupajícím obsahem NaCl od 0 M do 1 M. Všechny shromážděné frakce se dialyzovaly s nejméně dvěma výměnami pufru fosforečnanu sodného v koncentraci 10 mM s pH 7,5. Průtok, promývací roztok a frakce eluované solemi se zkoušely na protein Bradfordovou metodou s BSA jako standardem a biologicky testovaly proti larvě bázlivce západního. Aktivní materiál se zjistil v průtoku a ve frakcích eluovaných roztoky mezi 0,2 a 0,5 M NaCl. Pro zjištění, zda došlo k překročení kapacity kolony, jehož výsledkem by byl průchod materiálů kolonou bez vazby na sorbent, prošel aktivní materiál v průtoku po opětovném dosažení rovnováhy v koloně ještě jednu kolonou. Většina materiálu obsahujícího v pásmu UV 289 nm prošla kolonou. Z těchto pozorování vyplývá, že tento materiál má odlišné vlastnosti než materiál, který se v koloně vázal a byl eluován při vzrůstajícím přírůstku NaCl. Jak je známo odborníkům, další použité pufry jsou rovněž pro anexovou chromatografií vhodné. Aktivní materiál se může rovněž purifikovat katexovou chromatografií.

Materiál pentin-1 se přečistil na úroveň blízkou homogenitě vylučovací chromatografií nebo anexovou chromatografií. Minoritní proteinové pásy se odstranily vysokoúčinnou kapalnou chromatografií (HPLC) za použití kolony s převrácenými fázemi před určením aminokyseliny a před stanovením sekvence aminokyselinové sekvence.

Čistota vzorků a molekulová hmotnost podjednotky se stanovily pomocí SDS-PAGE za použití 12% polyakrylamidových gelů, zpravidla způsobem podle Laemmli, Nátuře, sv. 227, s. 680-685 (1970). Gely byly značeny buď Coomassie Blue R250 při standardním protokolu (postupu),

-15CZ 297319 B6 nebo stříbrem (Hammer a další, Phytochemistry, sv. 28, s. 3019-3026 (1989)). Pomocí SDSPAGE se zjistilo, že molekulová hmotnost podjednotky aktivní substance je mezi 40 až 55.000 ± 5.000 Daltonů.

Kromě výše popsaných způsobů se pro oddělení aktivní látky od surového extraktu semen může použít i jiných způsobů. Například lze extrakt podrobit isoelektrické fokusaci (IEF) systémem Rotofor (Bio-Rad). Rotofor separuje molekuly na základě jejich isoelektrického bodu pí. Každá molekula má při určitém pH specifický náboj, pozitivní nebo negativní. Rotofor za pomoci elektrického proudu nutí molekuly k pohybu ve směru pH gradientu až dosáhnou svého pí, to znamená pH ve kterém mají nulový náboj. Na svém pí se molekula zastaví, protože ji elektrický proud neovlivňuje. Fokusační komora Rotoforu je rozdělena do dvaceti malých komůrek permeabilní membránami. Těchto dvacet vzorků se z komůrek průběžně odstraňuje aby se omezilo jejich smíšení.

V typickém případě se vzorek vloží do fokusačního média, pufrovaného roztoku (viz instrukce výrobce), který obsahuje 12,5% (hmotnost/objem) glycerinu a 2,5% amfolytů spH 3 až 10 (Bio-Rad). Po fokusaci se frakce shromáždí, stanoví se pH každé a každá frakce se dialyzuje proti NaCl koncentrace 1 M pomocí membrány s 3,500 MWCO pro odstranění amfolytů. Potom se vzorky dialyzují proti deionizované vodě pro odstranění NaCl. Každá frakce se lyofilizuje a resuspenduje v 0,4 ml 10 mM NaCl. Frakce z Rotoforu obsahující aktivní materiál se mohou analyzovat na proteiny a biologickými testy s larvami hmyzu. Frakce z Rotoforu se potom mohou podrobit další úpravě nebo separaci jak popsáno výše.

Biologické testy

Biologické testy se prováděly pomocí nově narozených larev bázlivce západního (CRW) chovaných na umělých výživách obsahujících pentin-1 získaný z P. macroloba podle popisu. Pentin-1 může být ze surového extraktu nebo získán přečištěním jak zde popsáno. Pentin-1 se může buď aplikovat zevně na povrch výživy, nebo se vpraví do výživy viz Czapla a Lang, J. Econo. Ento., Sv. 83 (6), s. 2480-2485 (1990). Kultivační misky použité při biologických zkouškách se rozdělily do skupin podle způsobu zpracování. Jeden nebo více preparátů pentinu-1 nebo frakce z různých separací se roztřídilo do každé misky, přičemž se každý preparát nebo frakce aplikovaly do většího množství komůrek. Každá komůrka byla osazena jednou nebo dvěma nově narozenými larvami. Na horní části každé misky se upevnila fólie Mylar s ventilačními otvory zabraňující úniku a umožňující výměnu vzduchu.

Pro zevní (povrchové) aplikace se připravil 2% roztok pentinu-1 v solance (PBS) pufrované 0,1 M fosforečnanem s pH 7,8. Pro každé komůrky se na Stonevillovo živné médium pipetovalo sedmdesátpět mikrolitrů pufru v roztoku s pentinem-1. Kultivační miska se otáčela, aby se vzorek pentinu—1 na výživném substrátu rovnoměrně distribuoval. Komůrky se osadily parazitem a uzavřely jak popsáno výše. Kontrolní vzorek obsahoval na komůrku pouze 75 μΙ 0,1 M roztoku PBS.

Při aplikaci účinné látky uvnitř živné půdy se Stonevillovo médium připravilo běžným způsobem, ale s pouhými 90 % předepsané vody. Pentin-1 se přidal tak, že ho živná půda obsahovala množství v rozmezí 1 až 5 pg/g. Kontrolní vzorek sestával z 0,9 ml pufru PBS přidaného k 8,1 g média. Médium se vlilo do komůrek a komůrky se zamořily larvami a přikryly, jak popsáno výše. Hmotnost hmyzu je zjišťovala 7. den a uvádí se v tabulce.

-16CZ 297319 B6

Tabulka A

Účinky pentinu-1 na larvu bázlivce jižního.

Vzorek	Koncentrace pg/ml výživy	% úmrtnosti
Kontrolní		0
Surový	1000	100
Surový	400	15
AS 75	400	60
Velikostní frakce 17	8	14
Velikostní frakce 18	8	45
Velikostní frakce 19	8	29

Poznámka: AS 75 = populace v 75% síranu amonném

Po přečištění pentinu-1 a určení je insekticidní aktivity se přistoupilo ke klonování. Prvním stupněm bylo zjištění časové a prostorové distribuce pentinu-1 westernovým přenosem a pro identifikaci tkáně nebo tkání v rostlině nebo semenu nej pravděpodobněji exprimující tento protein. Protože pentin-1 nebyl izolován v množství potřebném pro tvorbu protilátek, byl protein sekvencován pro vytvoření peptidů pro syntézu. Údaje o sekvencích aminokyselin pro pentin-1 jsou uvedeny dále v obrázku 1. CCT-konec a vnitřní sekvence odpovídají přibližně 40% peptidů pentinu-1 se shromáždily z 15 peptidů přečištěných po štěpení přečištěného pentinu-1 pomocí CNBr a LysC. Sekvence s NH₂-koncem nebyla při této proceduře identifikována.

Proti pěti z těchto peptidů se vypěstovaly protilátky. Dále jsou uvedeny syntetické peptidy použité pro vytvoření protilátek.

Syntetický peptid č. (SEQ id.č. 5)

Met Ser Thr Ser Ala Ala Pro Ile Val Phe Pro Pro Tyr Tyr Phe Lys

Poznámka: odpovídá aminokyselinám č. 213-228 v obrázku 1.

Syntetický peptid č. 2 (SEQ id. č. 6)

Ala Leu Gin Pro Gin Asn Asn Tyr Leu Arg Gin Glu Try Asp Leu Asp

Poznámka: odpovídá aminokyselinám č. 344-360 v obrázku 1.

Syntetický peptid č. 3 (SEQ id. č. 7)

Pro Asp Trp Val Val Ile Arg Ser Glu Ser Val Gly Lys

Poznámka: žádný vztah k aminokyselinám v obrázku 1.

Syntetický peptid č. 4 (SEQ id. č.8)

Lys Ala Phe Val Asn Gly Val Tyr Phe Ile Asn Thr Tyr Asp Ser Ala

Poznámka: žádný vztah k aminokyselinám v obrázku 1.

- 17CZ 297319 B6

Syntetický peptid KS (SEQ id. č. 9)

Asn Asn Tyr Leu Arg lle Gin Glu Tyr Asp Leu Pro Pro Ala Leu

Poznámka: odpovídá aminokyselinám č. 349-363 v obrázku 1.

Skvrny na membráně vzniklé westernovým přenosem pentinu-1 se syntetických peptidů a experimentálního proteinu označovaného 5C9 se inkubovaly s každou z protilátek. Výsledky inkubace ukázaly, že protilátka vypěstovaná proti syntetickému peptidu KS (protilátka anti-KS) a protilátka vypěstovaná proti syntetickému peptidu 2 (protilátka anti-2) rozeznávaly pentin-1. Skvrny po westernovém přenosu tkáňových extraktů Pentaclethra meteroloba ve styku s protilátkami prokázaly, že k největšímu rozpoznávání došlo v případě zralých semen průměru 30 až 40mm a větších. Z těchto semen byla izolována veškerá RNA.

Po izolaci genomové DNA se použilo kodonem degenerovaných oligonukleotidů na bázi peptidů pro amplifíkaci genomových fragmentů řetězovou reakcí katalyzovanou polymerázou PCR. Pro provedení RT-PCR se specifickými oligonukleotidy se použilo exonové sekvence výsledných klonů a potom se provedly zkoušky s RT-PCR s cílem získat alespoň částečnou cDNA pentinu-1 pro provedení sondy expresní knihovny. Informace získaná ze sekvencování náhodných klonů cDNA z knihovny nezralého semene P. Macroloba se použila pro vytvoření tabulky použití kodonů ve stavu zrodu. Získané údaje ukázaly, že dřevina P. macroloba nemá silnou tendenci k užití kodonu a že obsah GC je mírný. Pro použití se zvolila matrice degenerovaných primerů zepředu a zezadu genů odpovídajících peptidům pentinu-1. Sekvence primeru zepředu byla VVKRLAGYFDV (pentin-1, aminokyseliny č. 76-86. Val Val Lys Arg Leu Ala Gly Tyr Phe Asp Val) (SEQ id. č. 10) a sekvence primeru zezadu byla ENMENLEK, (aminokyseliny pentinu1 č. 372-379: Glu Asn Met Glu Asn Leu Glu Lys) (SEQ id č. 11). Kvůli malému množství získané tkáně se testování iniciačního primeru provádělo pomocí genomové DNA odvozené od listů P. macroloba. Jedna ze šedesáti čtyři možných kombinací primer poskytla fragment 3,0 kb, který kódoval peptidové sekvence pentinu-1. Dvojice primerů zepředu a zezadu se potom použila pro amplifíkaci cDNA fragmentu s 0,8 kb z celé RNA izolované ze zralých semeno průměru 30 až 40 mm. Následné třídění expresní knihovny zralého semene pomocí této sondy cDNA s 0,8 kb poskytlo několik příbuzných klonů, jedním žních je klon s 1,4 kb kódující dvanáct z patnácti peptidových sekvencí pentinu-1 (SEQ id č. 1).

Westernové přenosy se prováděly s pentinem-1, syntetickými peptidy pentinu-1, s 5C9 a proteiny BSA po expozici vybraným protilátkám. Přenosy se kontaktovaly s protilátkami vypěstovanými proti všem peptidům a 5C9, vše ve zředění 1:10.000. Každá protilátka rozpoznávala svůj antigen bez detekovatelného projevu zkřížené reaktivity s BSA jako negativní kontrolou. Všechny protilátky rozpoznávaly 1,0 mikrogramů 5C9, s výjimkou těch, které se introdukovaly proti syntetickému peptidu č. 1. Ačkoliv byly syntetické peptidy KS s č. 2 z 74 % identické, anti-2 protilátka nerozpoznávala KS, ale detekovala Pentin-1 a 5C9.

Sekvence nukleové kyseliny v klonu pentinu-1 se určila standardním způsobem známým v oboru. Sekvence cDNA a předvídaná proteinová sekvence pentinu-1 se ukázala v obrázku 1 a SEQ id. č. 1.

Biotesty klonovaného materiálu

Proti larvě bázlivce západního (CRW) se uskutečnily biologické testy za použití ultrazvukem ošetřené E. coli jež se transformovala s jedním nebo několika plazmidy uvedenými v seznamu (tabulka 1). Transformované buňky se pěstovaly v 25 až 35 ml bujónu TB. Po 24 hodinách se buňky izolovaly odstředěním. Pelety se opětovně suspendovaly v přibližně 1 ml pufru PBS a ošetřily ultrazvukem. Výsledná směs se potom nanesla na povrch živné půdy a osadila nově narozenými larvami bázlivce západního. Po čtyřech dnech se zaznamenávala mortalita. Pozitivní

- 18CZ 297319 B6 výsledek udával 100% úmrtnost. Negativní výsledek udával méně než 10% úmrtnost. Podobný test se provedl s použitím transformovaných buněk vypěstovaných a agarové plotně. Po uspokojivém růstu se buňky seškrábly, suspendovaly v malém množství pufru PBS a potom se roztok inkorporoval do výživy hmyzu. I zde se úmrtnost zaznamenávala po 4 dnech.

Tabulka 1 ukazuje výsledky dvakrát opakovaných biologických zkoušek. Žádné buňky transformované s údajně negativními plazmidy (geny nelethální vůči larvám bázlivce západního) nezpůsobily larvální úmrtnost v žádném testu. Tyto plazmidy jsou P7725, P88126 a Pl 1426. Dva plazmidy obsahují kódující sekvenci pro pentin-1, ale žádné promotory pro tvorbu skutečného 10 proteinu, PGEM a Pl 1394, nevykazovaly žádnou aktivitu vůči larvám bázlivce západního. Avšak všechny plazmidy obsahující kódující oblast pro pentin-1 (SEQ id č. 1) a funkční expresní kazetu vykazovaly vynikající aktivitu proti larvám bázlivce západního. Všechny tyto zkoušky vykázaly 100% úmrtnost. Předběžný rozbor pomocí analýzy typu westernového přenosu ukázal, že protein velikostí podobný peptinu-1 byl přítomen ve všech buněčných extraktech, ale ne v negativních 15 kontrolních vzorcích. Aktivita se projevovala při obou způsobech přípravy buněk a biotestů.

-19CZ 297319 B6

TABULKA

	Φ Φ z z	tm tr> φ Φ Z Z	m cn Φ Φ Z Z	< < Z Z	z z	N/A
Výsledek kontroly biotestu	P P rO íO tm tm Φ φ z z	P P Φ Φ tm m φ Φ Z Z	P P <0 Φ <m cn φ φ z z	Posit. Posit.	Posit. Posit.	Posit.
Typ biotestu	mikroinkorp. svrchním nanášením	mikroinkorp. svrchním nanášením	mikroinkorp. svrchním nanášením	mikroinkorp. svrchním nanášením	mikroinkorp. svrchním nanášením	mikroincorp.
Provedeni	Plotna s živným bujónem	Plotna s živným bujónem	Plotna s živným bujónem	Plotna s živným bujónem	Plotna s živným bujónem	Plotna s
Obsah konstruktu	UBI-Bt	Bt i		UBI-full cDNA pentinu-1 z knihovny klonovaného pin II	UBI mod. pentin (ATG-TGA) -Pin II (modif. z pův. klonu, ale patrně nezralý)	cDNA pentinu-1 v pBK-CMV
Plasmid	P7725 _________1	CN ι—1 00 00 0-4	S ω 0 CL c -H P c Φ Cu O E	P11184	P11335	P11361

-20CZ 297319 B6

z	cn cn Φ <v z z	Cn cn Φ Φ Z Z	N/A N/A
	4-4 4-1 Φ ÍTJ tn cn Φ Φ z z	4-4 4-4 Φ Φ cn Cn φ Φ z z	Posít. Posít.
svrchním nanášením	^rmikroinkorp. svrchním nanášením	mikroinkorp. svrchním nanášením	mikroinkorp. svrchním nanášením
živným bujónem	Plotna s živným bujónem	Plotna s živným bujónem	Plotna s živným bujónem
(promotor lacZ) i.	Pentin-1 (zralý protein), bez promotoru nebo startovacího kodonu	in un cn > S O 1 E4 CLl O £ 1 M CQ Z	l-l M LD £ m •H > cu S i < T—1 Q 1 1 £ 4-4 -Η Φ 4-> Qm £ 1 Φ ω Cu iT> 0 cn £ £ i s •r4 < b O o \
	P11394	kD CN *<T ?—1 rd Ch	P11443

-21 CZ 297319 B6

Transformace protoplastů izolovaných z buněk kukuřičné suspenze se třemi genovými konstrukty peptinu-1 pro genovou expresi a biotesty na larvu bázlivce západního (CRW)

I. Protokol transformace protoplastů

Pro přípravu protoplastů se použily buňky stabilizované suspenze Hill (GS3). Buňky se shromáždily 3 až 4 dny po kultivaci.

Štěpení buněk: buňky se štěpily 3 až 5 hodin v roztoku enzymu při 27 °C při rychlosti třepání 50 až 60 otáček za minutu. Buněčná stěna se štěpila celulázou a pektolyázou.

Získávání protoplastů: biologický materiál po štěpení procházel filtrem délky 30 mm a protoplasty se získaly desetiminutovým odstřeďováním filtrátu při 1000 otáčkách za minutu.

Pelety protoplastů se resuspendovaly v 20 ml nebo 40 ml roztoku KMC. Hustota protoplastů a jejich celkový výtěžek se stanovily počítáním protoplastů hemacytometrem. Suspenze se odstředila za účelem peletizace protoplastů. Peletky protoplastů se suspendovaly v transformačním roztoku MaMg v koncentraci 2 miliony protoplastů na ml.

ml roztoku (asi 4 miliony protoplastů) se přemístily do zkumavek délky 15 ml s kulatým dnem. Každá zkumavka představovala replikaci (všechny byly identické). Pro každý genový konstrukt pentinu-1 se použily nejméně tři replikace. Každý konstrukt obsahoval jak přírodní pentin-1, tak i optimalizovanou sekvenci pentinu-1. Viz SEQ id. č. 1 a 3. K suspenzi protoplastů ve zkumavkách se přidal plazmid DNA (15 mg plazmidu DNA/milion protoplastů) a smíchal.

Po pěti minutách inkubace se ke směsi protoplast/DNA přidaly 2 ml 40% polyethylenglykolu (PEG-8000, Sigma, konečná koncentrace PEG je asi 20 %) a smíchaly několikerým obrácením zkumavky a inkubovaly 20 až 30 minut při teplotě místnosti.

Do každé zkumavky se přidaly asi 3 ml roztoku soli W5. Zkumavky se překryly a jemně obrátily. Toto se opakovalo dvakrát až finální objem dosáhl 13 až 14 ml. Suspenze se odstřeďovala při 1.000 otáčkách za minutu 8 minut. Pro resuspendování protoplastů se použily 3 ml média FW (viz dole). Za pomoci plastové stiskací Pasteurovy pipety se do dvou jamek šestijamkové kultivační plotny rozmísila jedna dávka třímililitrové suspenze zjednoho experimentu, uzavřela parafínem a 24 až 48 hodin inkubovala v temnu při 28 °C.

Po kultivaci se protoplasty přinesly pomocí plastové stiskací Pasteurovy pipety do zkumavky objemu 15 ml a 8 minut odstřeďují při 500 otáčkách za minutu s cílem peletizovat protoplasty.

Roztok proteinu a biotesty: jedna pětina až jedna čtvrtina pelet protoplastů v každé replikaci pro každý transformační experiment se vzorkovala pro analýzu exprese peptinu-1 westernovým přenosem. Zbytek pelet protoplastů se použil pro biotesty. Všechny replikační vzorky z téhož transformačního experimentu transformované tímtéž konstruktem pentinu-1 se spojily a přimíchaly do nutriční dávky pro biotesty s larvou bázlivce západního. Tabulka 2 ukazuje výsledky těchto biologických zkoušek.

-22CZ 297319 B6

Tabulka II

Účinek pentinu-1 proti larvám bázlivce západního při přechodné expresi do protoplastů kukuřice. Údaje byly získány v 6 pokusech průběžně opakovaných. Protoplasty byly ošetřeny ultrazvukem a celá směs byla potom přimíchána do diety.

Plazmid *	Obsah konstruktu	Westernový přenos	Biotest na pentin	Kontrola úmrtnosti
P11148 ¹	UBI-celá cDNA pentinu-1 z knihovny klonovaného pin II	pozitivní	32 *	N/A
P11335	UBI modif. pentin (ATGTGA)-pin II N/A (modif. z plného klonu, ale patrné nezralý)	slabě pozitivní	0 8	N/A
P11443	UBI-moPentin-l~Pin II	silně požit.	5 %	N/A
P8126	UBI-Bt	negat.	0 «	negat. kontrola
P3953	UBI-Gus	negat.	0 8	negat. kontrola

¹P11184 se použil pouze v posledních 4 pokusech

II. Genové konstrukty pentinu-1 pro transformaci

PÍ 1184 - Ubi promotor:: pentin-1 (původní klon v plné délce)

PÍ 1335 - Ubi promotor:: pentin-1 (částečně modifikovaný gen)

PÍ 1443 - Ubi promotor:: pentin-1 (optimalizovaný gen)

Roztoky a média použitá pro transformaci

Roztok KMC - 1000 ml

KC1 MgCl₂-6 H₂O CaCl₂ - 2 H₂O MES 0,5 % pH s KOH 5,8 Sterilizovat ultrafiltrací

8,65 g 16,47 g 12,50 g 5,0 g

Transformační roztoky MaMg

M manit	108,1 g
15 mM MgCl₂-6H₂O 10 mM MES pH 5,7 Sterilizovat ultrafiltrací	3,05 g 1,95 g

CZ 297319 B6

40% PEG - 100 ml

Přidá se 40 g PEG k 60 ml transformačního roztoku MaMg. K rozpuštění PEG se krátce použije mikrovln. Přidá se další roztok MaMg až do finálního objemu 100 m. Upraví se pH na 7,0. Sterilizovat ultrafiltrací.

Roztok enzymu pro štěpení buněk v suspenzi (roztok enzymů)

Roztok enzymů obsahuje 3 % celulázy RS a 0,3 % pektolyázy Y23 v roztoku protoplastu.

Roztok protoplastu - 1000 ml

M manit 10 mM MES 1 mM CaCl₂ - 2 H₂O 1 mM MgCl₂ - 6 H₂O 1% BSA (podle volby) pH 5,7 Sterilizovat ultrafiltrací

108,1 g 1,95 g 147 mg 203 mg 1 g

Roztok soli W5 - 1000 ml

154 mM NaCl 125 mM CaCl₂-2 H₂O 5 mM KC1 5 mM glukóza pH s KOH 5,5 Sterilizovat ultrafiltrací

9,0 g 18,56 g 0,373 g 0,901 g

Médium FW - 1000 ml

soli MS (Sigma M5519) sacharóza manit Proline 2,4-D vitaminy B5 lOOOx pH 5,8 Sterilizovat ultrafiltrací

4,3 g 30,0 g 54,0 g 1,5 g 3,0 mg 1 ml

Transformace a regenerace kukuřičného tumoru (callus)

Nezralé zárodky kukuřice z rostlinných skleníkových donorů se bombardují plazmidem obsahujícím tři konstrukty pentinu-1 a plazmidem obsahujícím selektovatelné gen s funkcí signálního znaku, PAT, (Wohlleben, W., Arnold, W., Broer I., Hilleman D., Strauch E. a Puehler A.: „Nukleotidová sekvence genu fosfinothricin-N-acetyltransferázy ze Streptomyces viridochromogenes Tue 494 a její exprese vNicotiana tabacum“, Gene, sv. 70, s. 25-37 (1988), vnášející rezistenci do herbicidu Bialophos následujícím způsobem:

(Poznámka: všechny předpisy medií jsou v Příloze.)

Příprava cílové tkáně:

Klasy se 20 minut povrchově sterilizují 30% roztokem bělícího činidla Chlorox s přísadou 0,5% detergentu Micro a dvakrát opláchnou sterilizovanou vodou. Nezralá embrya se vyříznou a umístí v počtu 25 embryí na plotnu osovou stranou dolů (scutellum nahoru). Kultivují se v temnu v médiu 560L 4 dny před bombardováním. V den bombardování se embrya přenesou na 4 hodiny do média 560Y a umístí v cílovém pásmu (2,5 cm).

Příprava DNA:

100 μΐ připravených wolframových částic ve vodě μΐ (1 pg) DNA v pufru TrisEDTA (celkem 1 pg)

100 μΐ 2,5 M CaCl₂ μΐ 0,1 M spermidin

Všechna reakční činidla se postupně přidávají k suspenzi wolframových částic na vortexu pro více zkumavek. Plazmidy se upraví pro finální poměr 1:1 na základě rozměrů. Na konečnou směs se krátce působí ultrazvukem a ponechá se deset minut inkubovat za stálého otáčení. Po vysrážení se zkumavky krátce odstředí, kapalina se odstraní, promyje 500 ml 100% ethanolu a 30 vteřin se odstřeďuje. Kapalina se opět odstraní a k peletám wolframových částic se přidá 100 μΐ 100% ethanolu. Pro bombardování částicovým dělem se částice wolfram/DNA zpracují ultrazvukem a po 10 μΐ vnášejí do středu každého makronosiče a před bombardováním se nechají 2 minuty schnout.

Užití částicového děla:

Plotny se vzorky se bombardovaly intenzitou #4 v částicovém dělu &HE34-1 nebo #HE34-2. Všechny vzorky dostaly jednotlivý zásah při 650 psi, přičemž šlo celkem o 10 aliquotů vyjmutých ze všech zkumavek s připojenými systémy částice/DNA.

Následné zpracování:

Po bombardování se embrya udržují 2 dny na médiu 560Y a potom se přenesou do selekčního média 560R obsahujícího 3 mg/1 Bialophos a každé 2 týdny subkultivují. Po přibližně 10 týdnech selekce se z klonů nádoru odolných vůči selekci vybraly vzorky pro PCR (řetězovou rekci katalyzovanou polymerázou) a analýzu TLC aktivitu vůči fumonisinesteráze. Pozitivní linie se přenesly do média 288J za účelem regenerace rostlin.Po dozrání somatického embrya (2 až 4 týdny) se dobře vyvinutá somatická embrya přenesou do média pro klíčení a v něm do osvětleného kultivačního prostoru. Přibližně po 7 až 10 dnech se vyvíjející se rostlinky přenesou do média ve zkumavkách na 7 až 10 dní, dokud se rostlinky dobře nevyvinou. Potom se rostliny přenesou do plochých dělených sadbovačů (odpovídajících květináčům 2,5 palců) obsahujících zahradní zem a nechají se 1 týden růst ve fytotronu, potom dalších 1 až 2 týdny ve skleníku a potom se přenesou do klasických květináčů (600) s obsahem 1,6 galonu (ca 4 1), kde rostou do zralosti.

-25 CZ 297319 B6

Příloha

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizovaná voda	900,000	ml
Základní soli CHU (N6) (SIGMA C-1416)	1,600	g
Makroživiny N6, lOx zás. roztok # #	60,000	ml
Dusičnan draselný	1,680	g
Minoritní soli B5H, lOOOx # # #	0,600	ml
B5H FeNa EDTA, lOOx # # # #	6,000	ml
Vitaminová směs Eriksson, (lOOOx SIGMA- 1511.)	0, 400	ml
Vitaminová směs S & H, lOOx zás. roztok (S3766)	6,000	ml
Thiamin.HCI, 0,4 mg/ml	0,500	g
L-Prolin	1,980	g
Hydrolyzát kaseinu (kyselý)	0,300	g
Sacharóza	20,000	g
Glukóza	0,600	g
2, 4-D 0,5 mg/ml	1,600	ml
Gelrite @	2,000	g
Dicamba 1 mg/ml #	1,200	ml
Dusičnan stříbrný 2 mg/ml #	1,700	ml

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

# = Přidej po sterilizaci a ochlazení na teplotu.

Rozpusť přísady postupně ve vyčištěné deionizované vodě. Uprav pH na 5,8.

Po úpravě pH doplň na požadovaný objem deionizovanou vodu. Sterilizuj a ochlaď na 60 °C.

# # = Rozpusť 1,660 g dihydrátu chloridu vápenatého v 950,00 ml vyčištěné deionizované vody. Potom postupně rozpusť 4,629 g síranu amonného, 4,000 dihydrogenfosforečnanu draselného K.H2PO4, 1,850 g síranu hořečnatého MgSO₄. 7H₂O a 28,300 g dusičnanu draselného. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodu.

# # # = Rozpusť postupně 3,000 g kyseliny borité, 10,000 g monohydrátu síranu hořečnatého, 0,250 g molybdenanu sodného dihydrátu a 0,750 g jodidu draselného ve vyčištěné deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodou.

-26CZ 297319 B6 #### = Rozpusť 3,700 g dihydrátu DETA disodného a 2,790 g heptahydrátu síranu železnatého v deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou. Celkový objem (L) = 1,00.

604 A

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizované voda	900,000	ml
Základní soli CHU (N6) (SIGMA C-1416)	1,600	g
Makroživiny N6 lOx zás. roztok # #	60,000	ml
Dusičnan draselný	1,680	g
Minoritní soli B5H lOOOx # # #	0, 600	ml
B5H FeNa EDTA lOOx # # # #	6,000	ml
Vitaminová směs Eriksson (lOOOx SIGMA- 1511)	0,400	ml
Vitaminová směs S & H lOOx zás. roztok (Ξ3766)	6,000	ml
Thiamin.HCl, 0,4 mg/ml	0,500	g
L-Prolin	1,980	g
Hydrolyzát kaseinu (kyselý)	0,300	g
Sacharóza	20,000	g
Glukóza	0,600	g
2,4-D 0,5 mg/ml	1,600	ml
Gelrite @	2,000	g
Dicamba 1 mg/ml #	1,200	ml
Dusičnan stříbrný 2 mg/ml #	1, 700	ml
Bialaphos 1 mg/ml #	3,000	ml

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

# = Přidej po sterilizaci a ochlazení na teplotu.

Rozpusť přísady postupně ve vyčištěné deionizované vodě. Uprav pH na 5.8.

Po úpravě pH doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou. Sterilizuj a ochlaď na 60 °C.

## = Rozpusť 1,660 g dihydrátu chloridu vápenatého v 950,000 ml vyčištěné deionizované vody. Potom postupně rozpusť 4,629 síranu amonného, 4,000 dihydrogenfosforeěnanu draselného KH₂PO₄, 1,850 g síranu hořečnatého MgSO₄.7H₂O, a 28,300 g dusičnanu draselného. Doplň na 20 požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodu.

-27CZ 297319 B6 # # # = Rozpusť postupně 3,000 kyseliny borité, 10,000 g monohydrátu síranu hořečnatého, 0,250 g dihydrátu molybdenanu sodného, a 0,750 g jodidu draselného ve vyčištěné deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodu.

#### = Rozpusť 3,700 g dihydrátu EDTA disodného a 2,790 g heptahydrátu síranu železnatého v deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem deionizovanou vodu. Celkový objem (L) = 1,00.

605 J

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizovaná voda	900,000	ml
Základní soli CHU (N6) (SIGMA C-1416)	1, 600	g
Makroživiny N6 lOx zás. roztok # #	60,000	ml
Dusičnan draselný	1, 680	g
Minoritní soli B5H lOOOx # # #	0, 600	ml
B5H FeNa EDTA lOOx # # # #	6, 000	ml
Vitaminová směs Eriksson (lOOOx SIGMA- 1511)	0,400	ml
Vitaminová směs S & H lOOx zás. roztok (S3766)	6,000	ml
Thiamin.HCl, 0,4 mg/ml	0,500	g
Sacharóza	20,000	g
Glukóza	0,600	g
2,4-D 0,5 mg/ml	1,600	ml
Gelrite @	2, 000	g
Dicamba 1 mg/ml #	1,200	ml
Dusičnan stříbrný 2 mg/ml #	0, 425	ml
Bialaphos 1 mg/ml #	3,000	ml

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

# = Přidej po sterilizaci a ochlazení na teplotu.

# # = Rozpusť 1,660 g dihydrátu chloridu vápenatého v 950,00 ml vyčištěné deionizované vody. Potom postupně rozpusť 4,629 síranu amonného, 4,000 dihydrogenfosforečnanu draselného KH₂PO₄, 1,850 g, síranu hořečnatého MgSO₄.7H₂O, a 28,300 g dusičnanu draselného. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodu.

-28CZ 297319 B6 # # # = Rozpusť postupně 3,000 kyseliny borité, 10,000 g monohydrátu síranu hořečnatého, 0,250 g molybdenanu sodného dihydrátu, a 0,750 g jodidu draselného ve vyčištěné deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodou.

#### = Rozpusť 3,700 g dihydrátu EDTA disodného a 2,790 g heptahydrátu síranu železnatého v deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou. Celkový objem (L) = 1,00.

ío 406 S

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizovaná voda	800,000	ml
Základní soli CHU (N6> (SIGMA C-1416)	1,600	9
Makroživiny N6 lOx zás. roztok # #	60,000	ml
Dusičnan draselný	1,680	9
Minoritní soli B5H lOOOx zás. rozt. # # #	0,600	ml
B5H Fe Na EDTA lOOx # # # #	6,000	ml
Vitaminová směs Eriksson (lOOOx SIGMA- 1511)	0,400	ml
Vitaminová směs S & H lOOx zás. roztok (S3766)	6, 000	ml
Thiarain.HC1, 0,4 mg/ml	0, 500	ml
L-Prolin	1.980	9
Hydrolyzát. kaseinu (kyselý)	0, 300	9
Sacharóza	120.000	9
Glukóza	0, 600	9
2,4-D 0,5 mg/ml	1, 600	ml
Gel rite @	2,000	9
Dicamba 1 mg/ml #	1,200	ml
Dusičnan stříbrný 2 mg/ml #	1,700	ml

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

# = Přidej po sterilizaci a ochlazení na teplotu.

-29CZ 297319 B6 # # = Rozpusť 1,660 g dihydrátu chloridu vápenatého v 950,00 ml vyčištěné deionizované vody. Potom postupně rozpusť 4,629 síranu amonného, 4,000 dihydrogenfosforečnanu draselného KH2PO4, 1,850 g, síranu hořečnatého MgSO₄.7H₂O, a 28,300 g dusičnanu draselného. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodu.

# # # = Rozpusť postupně 3,000 kyseliny borité, 10,000 g monohydrátu síranu hořečnatého, 0,250 g molybdenanu sodného dihydrátu, a 0,750 g jodidu draselného ve vyčištěné deionizované vodě. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodou.

272 V

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizovaná voda	950,000	ml
Solí MS (Gibco 11117-074)	4,300	9
Myo—inosit	0,100	g
Zásobní roztok vitaminů MS # #	5,000	ml
Sacharóza	40,000	g
Bacto-agar 0	6,000	g

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

Rozpusť přísady postupně ve vyčištěné deionizované vodě. Uprav pH na 5,6.

# # = Rozpusť postupně 0,100 g kyseliny nikotinové, 0,02 g thiaminhydrochloridu, 0,100 g pyridoxinhydrochloridu a 0,400 g glycinu v 875,00 ml vyčištěné deionizované vody. Rozděl do dávek po 400 ml. Thiaminhydrochlorid a pyridoxinhydrochlorid se uchovávají v zatemněném exsikátoru. Skladovat 1 měsíc, pokud nedojde ke kontaminaci nebo vysrážení, potom se zásoba obnoví.

Celkový objem (L) = 1,00

-30CZ 297319 B6

288 J

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizované voda	950,000	ml
Soli MS	4, 300	g
Myo-inosit	0,100	g
Zásobní roztok vitaminů MS # #	5,000	ml
Zeatin, 5 mg/ml	1,000	ml
Sacharóza	60,000	g
Gelrite @	3,000	g
Indoloctová kyselina 0,5 mg/ml #	2,000	ml
Abscisová kyselina, 0,1 mM roztok	1,000	ml
Bialaphos 1 mg/ml #	3,000	tni

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

Přidej 3,5 g/1 Gelrite v biologickém zájmu buněk.

# # = Rozpusť postupně 0,100 g kyseliny nikotinové, 0,020 g thiaminhydrochloridu, 0,100 g pyridoxinhydrochloridu a 0,400 g glycinu v 875,00 ml vyčištěné deionizované vody. Doplň na požadovaný objem vyčištěnou deionizovanou vodou. Rozděl do dávek po 400 ml. Thiaminhydrochlorid a pyridoxinhydrochlorid se uchovávají v zatemněném exsikátoru. Skladovat 1 měsíc, pokud nedojde ke kontaminaci nebo vysrážení, potom se zásoba obnoví.

Celkový objem (L) = 1,00

560 L

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizovaná voda filtrovaná	950,000	ml
Základní soli CHU (N6) (SIGMA C-1416)	4,000	g
Vitaminová směs Eriksson (lOOOx SIGMA- 1511)	0, 400	ml
Thiamin.HCl, 0,4 mg/ml	1,250	g
Sacharóza	20,000	g
2,4-D 0,5 mg/ml	2, 000	ml
L-Prolin	2,880	g
Gelrite @	2,000	g
Dusičnan stříbrný 2 mg/ml #	4,250	ml

-31 CZ 297319 B6

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

# = Přidej po sterilizaci a ochlazení na potřebnou teplotu.

Rozpusť přísady postupně v deionizované vodě. Uprav pH na 5,8 pomocí KOH.

Doplň na požadovaný objem deionizovanou vodou. Sterilizuj a ochlaď na teplotu místnosti.

Celkový objem (L) = 1,00

560 R

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizovaná voda filtrovaná	950,000	ml
Základní soli CHU (N6) (SIGMA C-1416)	4,000	g
Vitaminová směs Eriksson (lOOOx SIGMA- 1511)	1, 000	ml
Thiamin.HCl, 0,4 mg/ml	1,250	g
Sacharóza	30,000	g
2,4-D 0,5 mg/ml	4,000	ml
Gelrite @	3, 000	g
Dusičnan stříbrný 2 mg/ml #	0, 425	ml
Bialaphos 1 mg/ml #	3, 000	ml

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

# = Přidej po sterilizaci a ochlazení na potřebnou teplotu.

Celkový objem (L) = 1,00

-32CZ 297319 B6

560Y

Přísada	Množství	Jednotka
Deionizovaná voda filtrovaná	950,000	ml
Základní soli CHU (N6) (SIGMA C-1416)	4,000	g
Vitaminová směs Eriksson (lOOOx SIGMA- 1511)	1,000	ml
Thiamin.HCl, 0,4 mg/ml	1,250	g
Sacharóza	120,000	g
2,4-D 0,5 mg/ml	2,000	ml
L-Proline	2,880	g
Gelrite @	2,000	g
Dusičnan stříbrný 2 mg/ml #	4,250	ml

Instrukce:

@ = Přidej po doplnění na požadovaný objem.

# = Přidej po sterilizaci a ochlazení na teplotu.

** Autoklávovat kratší dobu kvůli zvýšenému obsahu sacharózy.

Celkový objem (L) = 1,00

Plazmidy PHP11361 a PHP11511 byly uloženy v Type Culture Collection, Bethesda, Maryland a mají přírůstková čísla 209026 a 209025. PHP 11361 obsahuje nukleotidovou sekvenci přírodního pentinu-1. PHP11511 obsahuje optimalizovanou sekvenci pentinu-1.

Všechny publikace a patentové přihlášky zmíněné v této specifikaci odpovídají odborné úrovní pracovního oboru, kterým je patent určen. Všechny publikace a patentové přihlášky jsou zde zahrnuty odkazy ve stejném rozsahu, jako kdyby byla každá individuální publikace nebo patentová přihláška specificky a individuálně zahrnuta odkazem.

Třebaže uvedený vynález byl detailně popsán ilustracemi a příklady pro snazší pochopení a zvýšení srozumitelnost, je zřejmé, že v rozsahu předložených nároků lze uskutečnit určité změny a modifikace.

-33CZ 297319 B6

SEZNAM SEKVENCÍ (1) Všeobecné informace:

(I) Přihlašovatel: Cigaň, Amy L

Czapla, Thomas H

Fallis, Lynn

Meyer, Terry E

Muldell, Scott A

Sabus, Brian

Schubert, Karel (II) Název vynálezu: Proteiny s insekticidními účinky a způsoby jejich užití (III) Počet sekvencí: 11 (IV) Adresa pro korespondenci:

(A) Adresát: W. Murray Spruill (Alston & Bird, LLP) (B) Ulice: 3605 Glenwood Ave.

(C) Město: Raleigh (D) Stát: NC (Severní Karolina) (E) Země: USA (F) ZIP (PSČ) 27662 (V) Počítačem čitelné provedení:

(A) Médium: Disketa 3,5 (B) Počítač: kompatibilní s IBM PC (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patent In Release #1,0, verze #1,30 (VI) Údaje o přihlášce:

(A) Číslo přihlášky:

(B) Datum registrace:

(C) Klasifikace:

(VIII) Informace o patentovém právníkovu/agentu:

(A) Jméno: Spruill, W. Murray (B) Registrační číslo: 32.943 (C) Číslo spisu: 5718-9 (IX) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 919 420 2202 (B) Telefax: 919 881 3175

-34CZ 297319 B6 (2) Informace pro SEQ ID č. 1:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1469 bp (B) Typ: nukleová kyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: cDNA (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (IX) Znak:

(A) Klíčové označení: CDS (B) Lokace: 31... 1257 (XI) Popis sekvence: SEQ id č. 1:

CGGCACGAGC TCGTACAGAT TCTATCCATT ATG AAG TCG AAA ATG GCC ATG CTC Met Lys Ser Lys Met Ala Met Leu 1 5

CTT Leu

TTG TTA TTT TGT Leu Leu Phe Cys 10

GTG TTA TCT AAT CAG CTA

GTG GCA GCA TTT TCC

Val

Leu 15

Ser

Asn Gin Leu

Val 20

Ala Ala

Phe

Ser

ACA

CAA

GCG

AAA

GCT

TCT

AAA

GAT

GGA

AAC

TTA

GTC

ACA

GTT

CTT

GCC

Thr

Gin

Ala

Lys

Ala

Ser

Lys

Asp

Gly

Asn

Leu

Val

Thr

Val

Leu

Ala

25

30

35

40

102

150

-35 CZ 297319 B6

ATT GAT

GGA GGT

GGT ATC AGA GGA

ATT ATC CCC

GGA GTT Gly Val

ATT Ile

CTC Leu 55

AAA Lys

198

Ile

Asp

Gly

Gly 45

Ile Arg

Gly

Ile

Ile 50

Pro

CAA

CTA

GAA

GCT

ACT

CTT

CAG

AGA

TGG

GAC

TCA

AGT

GCA

AGA

CTA

GCA

246

Gin

Leu

Glu

Ala

Thr

Leu

Gin

Arg

Trp

Asp

Ser

Ala

Arg

Leu

Ala

60

65

70

GAG

TAT

TTT

GAT

GTG

GTT

GCC

GGG

ACG

AGC

ACT

GGA

GGG

ATT

ATA

ACT

294

Glu

Tyr

Phe

Asp

Val

Ala

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Ile

Thr

75

80

85

GCC

ATT

CTA

ACT

GCC

CCG

GAC

CCA

CAA

AAC

AAG

GAC

CGT

CCT

TTG

TAT

342

Ala

Ile

Leu

Thr

Ala

Pro

Asp

Pro

Gin

Asn

Lys

Asp

Arg

Pro

Leu

Tyr

90

95

100

GCT

GCC

GAA

ATT

ATC

GAC

TTC

TAC

ATA

GAG

CAT

GGT

CCT

TCC

ATT

390

Ala

Glu

Ile

Asp

Phe

Tyr

Ile

Glu

His

Gly

Pro

Ser

Ile

105

110

115

120

TTT

AAT

AAA

TCC

ACC

GCC

TGC

TCG

TTG

CCT

GGT

ATC

TTT

TGT

CCA

AAG

43B

Phe

Asn

Lys

Ser

Thr

Ala

Cys

Ser

Leu

Pro

Gly

Ile

Phe

Cys

Pro

Lys

125

130

135

TAT

GAT

GGG

AAG

TAT

TTA

CAA

GAA

ATA

AGC

CAG

AAA

TTG

AAT

GAA

486

Ty r

Asp

Gly

Lys

Tyr

Leu

Gin

Glu

Ile

Ser

Gin

Lys

Leu

Asn

Glu

140

145

150

ACA

CTA

GAC

CAG

ACA

AAT

GTT

ATC

CCT

TCC

TTC

GAC

534

Thr

Leu

Asp

Gin

Thr

Asn

Val

Ile

Pro

Ser

Phe

Asp

155

160

165

ATC

AAG

CTT

CGT

CCA

ACC

ATA

TTC

TCA

ACT

TTC

AAG

TTA

GAG

GAA

582

Ile

Lys

Leu

Arg

Pro

Thr

Ile

Phe

Ser

Thr

Phe

Lys

Leu

Glu

170

175

180

GTT

CCT

GAG

TTA

AAT

GTC

AAA

CTC

TCC

GAT

GTA

TGC

ATG

GGA

ACT

TCA

630

Val

Pro

Glu

Leu

Asn

Val

Lys

Leu

Ser

Asp

Val

Cys

Met

Gly

Thr

Ser

185

190

195

200

GCA

CCA

ATC

GTA

TTT

CCT

ccc

TAT

TTC

AAG

CAT

GGA

GAT

ACT

678

Ala Ala

Pro

Ile

Val 205

Phe

Pro Pro Tyr Tyr 210

Phe Lys His Gly Asp Thr 215

GAA

TTC

AAT

CTC

GTT

GAT

GGT

GCA

ATC

GCT

GAT

ATT

CCG

GCC

CCG

726

Glu

Phe

Asn

Leu

Val

Asp

Gly

Ala

Ile

Ala

Asp

Ile

Pro

Ala

Pro

220

225

230

GTT

GCT

CTC

AGC

GAG

GTG

CTC

CAG

CAA

GAA

AAA

TAC

AAG

AAT

AAA

GAA

774

Val

Ala

Leu

Ser

Glu

Val

Leu

Gin

Glu

Lys

Tyr

Lys

Asn

Lys

Glu

235

240

245

ATC

CTT

TTG

CTG

TCT

ATA

GGA

ACT

GGA

GTT

GTA

AAA

CCT

GGT

GAG

GGT

822

Ile

Leu

Ser

Ile

Gly

Thr

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Glu

Gly

250

255

260

-36CZ 297319 B6

TAT TCT GCT AAT

CGT ACT TGG ACT ATT

TTC Phe

GAT TGG

AGT AGT

GAA Glu

ACT Thr 280

870

Tyr 265

Ser

Ala

Asn

Arg Thr 270

Trp

Thr

lle

Asp 275

Trp

Ser

TTA

ATC

GGG

CTT

ATG

GGT

CAT

GGA

ACG

AGA

GCC

ATG

TCT

GAT

TAT

TAC

918

Leu

lle

Gly

Leu

Met

Gly

His

Gly

Thr

Arg

Ala

Met

Ser

Asp

Tyr

285

290

295

GTT

GGC

TCA

CAT

TTC

AAA

GCC

CTT

CAA

CCC

CAG

AAT

AAC

TAC

CTC

CGA

966

Val

Gly

Ser

His

Phe

Lys

Ala

Leu

Gin

Pro

Gin

Asn

Tyr

Leu

Arg

300

305

310

ATT

CAG

GAA

TAC

GAT

TTA

GAT

CCG

GCA

CTG

GAA

AGC

ATT

GAT

GCT

1014

lle

Gin

Glu

Tyr

Asp

Leu

Asp

Pro

Ala

Leu

Glu

Ser

lle

Asp

Ala

315

320

325

TCA

ACG

GAA

AAC

ATG

GAG

AAT

CTG

GAA

AAG

GTA

GGA

CAG

AGT

TTG

1062

Ser

Thr

Glu

Asn

Met

Glu

Asn

Leu

Glu

Lys

Val

Gly

Gin

Ser

Leu

330

335

340

AAC

GAA

CCA

GTT

AAA

AGG

ATG

AAT

CTG

AAT

ACT

T-T

GTC

GTT

GAA

1110

Asn

Glu

Pro

Val

Lys

Arg

Met

Asn

Leu

Asn

Thr

Phe

Val

Glu

.345

350

355

360

ACA

GGT

GAA

GGT

ACC

AAT

GCA

GAA

GCT

TTA

GAC

AGG

CTG

GCT

CAG

ATT

1158

Thr

Gly

Glu

Gly

Thr

Asn

Ala

Glu

Ala

Leu

Asp

Arg

Leu

Ala

Gin

Tle

365

370

375

CTT

TAT

GAA

AAG

ATT

ACT

CGT

GGT

CTC

GGA

AAG

ATA

TCT

TTG

GAA

1206

Leu

Tyr

Glu

Lys .

lle

Thr

Arg

Gly

Leu

Gly

Lys

lle

Ser

Leu

Glu

380

385

390

GTG

GAT

AAC

ATT

GAT

CCA

TAT

ACT

GAA

CGT

GTT

AGG

AAA

CTG

CTA

TTC

1254

Val

Asp

Asn

lle

Asp

Pro

Tyr

Thr

Glu

Arg

Val

Arg

Lys

Leu

Phe

395

400

405

TGA TACGAATTGA AGTTGTTTCC TCCTTGCCAT ATAGCCTCAC TTTGTTTGGC

1307

AATAAATAAA	TAAATAAATG	TAATCGTTTG	GTTTGATGTC	CTTGACTTTG	TCATATATGC	1367
TGGCTCTATA	AGAAGCACCA	GCAGATAAAT	AAAGGTTAAT	GTTTGAGGTA	TWAARWAAAA	1427
ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ	ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ	ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ	AAAAAAACTC	GA		1469

(2) Informace pro SEQ ID č. 2:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 409 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: protein

-37CZ 297319 B6 (XI) Popis sekvence: SEQ id č. 2:

Met 1

Lys

Ser

Lys Met 5

Ala Met

Leu

Leu Leu Leu 10

Phe

Cys

Val

Leu Ser 15

Asn

Gin

Leu

Val

Ala

Phe

Ser

Thr

Gin

Ala

Lys

Ala

Ser

Lys

Asp

20

25

30

Gly

Asn

Leu

Val

Thr

Val

Leu

Ala

Ile

Asp

Gly

Ile

Arg

Gly

35

40

45

Ile

Pro

Gly

Val

Ile

Leu

Lys

Gin

Leu

Glu

Ala

Thr

Leu

Gin

Arg

50

55

60

Trp

Asp

Ser

Ala

Arg

Leu

Ala

Glu

Tyr

Phe

Asp

val

Ala

Gly

65

70

75

80

Thr

Ser

Thr

Gly

Ile

Thr

Ala

Ile

Leu

Thr

Ala

Pro

Asp

Pro

'85

90

95

Gin

Asn

Lys

Asp

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ala

Glu

Ile

Asp

Phe

100

105

110

Tyr

Ile

Glu

His

Gly

Pro

Ser

Ile

Phe

Asn

Lys

Ser

Thr

Ala

Cys

Ser

115

120

125

Leu

Pro

Gly

Ile

Phe

Cys

Pro

Lys

Tyr

Asp

Gly

Lys

Tyr

Leu

Gin

Glu

130

135

140

Ile

Ser

Gin

Lys

Leu

Asn

Glu

Thr

Leu

Asp

Gin

Thr

145

150

155

160

Asn

Val

Ile

Pro

Ser

Phe

Asp

Ile

Lys

Leu

Arg

Pro

Thr

Ile

165

170

175

Phe

Ser

Thr

Phe

Lys

Leu

Glu

val

Pro

Glu

Leu

Asn

Val

Lys

Leu

180

185

190

Ser

Asp

Val

Cys

Met

Gly

Thr

Ser

Ala

Pro

Ile

Val

Phe

Pro

195

200

205

Tyr

Phe

Lys

His

Gly

Asp

Thr

Glu

Phe

Asn

Leu

Val

Asp

Gly

Ala

210

215

220

Ile

Ala

Asp

Ile

Pro

Ala

Pro

Va 1

Ala

Leu

Ser

Glu

val

Leu

Gin

225

230

235

240

Gin

Glu

Lys

Tyr

Lys

Asn

Lys

Glu

ile

Leu

Ser

Ile

Gly

Thr

24S

250

255

Gly

Val

Lys 260

Pro Gly Glu

Gly Tyr Ser 265

Ala Asn

Arg

Thr 270

Trp

Thr

Ile

Phe

Asp

Trp

Ser

G1U

Thr

Leu

Ile

Gly

Leu

Met

Gly

His

Gly

275

280

285

Thr

Arg

Ala

Met

Ser

Asp

Tyr

Val

Gly

Ser

His

Phe

Lys

Ala

Leu

290

295

300

Gin

Pro

Gin

Asn

Tyr

Leu

Arg

Ile

Gin

Glu

Tyr

Asp

Leu

Asp

Pro

305

310

315

320

Ala

Leu

Glu

Ser

Ile

Asp

Ala

Ser

Thr

Glu

Asn

Met

Glu

Asn

Leu

325

330

335

Glu

Lys

Val

Gly

Gin

Ser

Leu

Asn

Glu

Pro

Val

Lys

Arg

Met

Asn

340

345

350

Leu

Asn

Thr

Phe

Val

Glu

Thr

Gly

Glu

Gly

Thr

Asn

Ala

Glu

355

360

365

Ala

Leu

Asp

Arg

Leu

Ala

Gin

Ile

Leu

Tyr

Glu

Lys

Ile

Thr

Arg

370

375

380

Gly

Leu

Gly

Lys

Ile

Ser

Leu

Glu

Val

Asp

Asn

Ile

Asp

Pro

Tyr

Thr

385

390

395

400

Glu

Arg

Val

Arg

Lys

Leu

Phe

★

405 (2) Informace pro SEQ ID č. 3:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1227 bp (B) Typ: nukleová kyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: jiná molekulová kyselina (A) Popis:/popis = „cDNA pentinu-1 optimalizovaná pro zesílenou expresi“ (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macrologa (IX) Znak:

(A) Klíčové jméno: CDS (B) Poloha: 1...1227

-39CZ 297319 B6 (XI) Popis sekvence: SEQ id. č. 3:

ATG Met 410

AAG Lys

TCC Ser

AAG Lys

ATG Met

GCC Ala 415

ATG Met

CTC Leu

CTC Leu 420

TTC Phe

TGC Cys

GTG Val

CTC Leu

TCC Ser 425

48

AAC

CAG

CTC

GTG

GCC

GCG

TTC

TCC

ACC

CAG

GCC

AAG

GCC

TCC

AAG

GAC

96

Asn

Gin

I.eu

Val

Ala

Phe

Ser

Thr

Gin

Ala

Lys

Ala

Ser

Lys

Asp

430

435

440

GGC AAC CTC

GTG

ACC

GTG

CTC

GCC

ATC

GAC

GGC

ATC

CGC

GGC

144

Gly Asn Leu

Val

Thr

Val

Leu

Ala

Ile

Asp

Gly

Gly Gly

Ile

Arg

Gly

44S

450

455

ATC ATC CCG

GGC

GTG

ATC

CTC

AAG

CAG

CTC

GAG

GCG

ACC

CTC

CAG

AGG

192

Ile Ile Pro

Gly

Val

Ile

Leu

Lys

Gin

Leu

Glu

Ala

Thr

Leu

Gin

Arg

460

465

470

TGG GAC TCC

AGC

GCC

AGG

CTC

GCG

GAG

TAC

TTC

GAC

GTG

GCC

GGC

240

Trp Asp Ser

Ser

Ala

Arg

Leu

Ala

Glu

Tyr

Phe

Asp

val

Val

Ala

Gly

475

480

485

ACC TCC ACC

GGC

ATC

ACC

GCC

ATC

CTC

ACC

GCC

CCG

GAC

CCG

288

Thr Ser Thr

Gly

Ile

Thr

Ala

Ile

Leu

Thr

Ala

Pro

Asp

Pro

490

495

500

505

CAG AAC AAG

GAC

CGC

CCG

CTC

TAC

GCC

GAG

ATC

GAC

TTC

336

Gin Asn Lys

Asp

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ala

Glu

ile

Ile

Asp

Phe

510

515

520

TAC AT^ G-.G

CAC

GGC

CCG

TCC

ATC

TTC

AAC

AAG

TCC

ACC

GCC

TGC

TCC

3Θ4

Tyr Ile Clu

His

Gly

Pro

Ser

Ile

Phe

Asn

Lys

Ser

Thr

Ala

Cys

Ser

525

530

535

CTC CCG GGC

ATC

TTC

TGC

CCG

AAG

TAC

GAC

GGC

AAG

TAC

CTC

CAG

GAG

432

Leu Pro cly

Ile

Phe

Cys

Pro

Lys

T/r

Asp

Gly

Lys

Tyr

Leu

Gin

Glu

5:4 0

54 5

550

ATC ATC TCC

CAG

AAG

CTC

AAC

GAG

ACC

CTC

GAC

CAG

ACC

480

Ile Ile Ser

Gin

Lys

Leu

Asn

Glu

Thr

Leu

Asp

Gin

Thr

555

56C

565

-40CZ 297319 B6

AAC Asn 570

GTG Val

GTG ATC CCG

TCC Ser 575

TTC GAC

ATC AAG CTC CTC CGC

CCG ACC ATC

528

Val

Ile

Pro

Phe

Asp

Ile

Lys

Leu Leu Arg 580

Pro Thr

Ile 585

TTC

TCC

ACC

TTC

AAG

CTC

GAG

GTG

CCG

GAG

CTC

AAC

GTG

AAG

CTC

576

Phe

Ser

Thr

Phe

Lys

Leu

Glu

Val

Pro

Glu

Leu

Asn

Val

Lys

Leu

590

595

600

TCC

GAC

GTC-

TGC

ATG

GGC

ACC

TCC

GCC

CCG

ATC

GTG

TTC

CCG

624

Ser

Asp

Val

Cys

Met

Gly

Thr

Ser

Ala

Pro

Ile

Val

Phe

Pro

605

610

615

TAC

TTC

AAG

CAC

GGC

GAC

ACC

GAG

TTC

AAC

CTC

GTC

GAC

GGC

GCG

672

Tyr

Phe

Lys

His

Gly

Asp

Thr

Glu

Phe

Asn

Leu

val

Asp

Gly

Ala

620

625

630

ATC

GCG

GAC

ATC

CCA

GCC

CCG

GTG

GCC

CTC

TCC

GAG

GTG

CTC

CAG

720

Ile

Ala

Asp

Ile

Pro

Ala

Pro

Val

Ala

Leu

Ser

Glu

Val

Leu

Gin

635

640

645

CAG

GAG

AAG

TAC

AAG

AAC

AAG

GAG

ATC

CTC

CTG

AGC

ATC

GGC

ACC

768

Gin

Glu

Lys

Tyr

Lys

Asn

Lys

Glu

Ile

Leu

Ser

Ile

Gly

Thr

650

655

660

665

GGC

GTG

AAG

CCG

GGC

GAG

GGC

TAC

TCC

GCC

AAC

CGC

ACC

TGG

ACC

816

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Glu

Gly

Tyr

Ser

Ala

Asn

Arg

Thr

Trp

Thr

670

675

680

ATC

TTC

GAC

TGG

TCC

GAG

ACC

CTC

ATC

GGC

CTC

¹ ATG

GGG

CAC

GGC

864

Ile

Phe

Asp

Trp

Ser

Glu

Thr

Leu

Ile

Gly

Leu

Met

Gly

His

Gly

685

690

695

ACC

CGC

GCC

ATG

TCC

GAC

TAC

GTG

GGC

TCC

CAC

TTC

AAG

GCC

CTC

912

Thr

Arg

Ala

Met

Ser

Asp

Tyr

Val

Gly

Ser

His

Phe

Lys

Ala

Leu

700

705

710

CAG

CCG

CAG

AAC

TAC

CTC

CGC

ATC

CAG

GAG

TAC

GAC

CTC

GAC

CCG

960

Gin

Pro

Gin

Asn

Tyr

Leu

Arg

Ile

Gin

Glu

Tyr

Asp

Leu

Asp

Pro

715

720

725

GCC

CTC

GAG

TCC

ATC

GAC

GCC

TCC

ACC

GAG

AAC

ATG

GAG

AAC

CTC

1008

Ala

Leu

Glu

Ser

Ile

Asp

Ala

Ser

Thr

Glu

Asn

Met

Glu

Asn

Leu

730

735

740

745

GAG

AAG

GTG

GGC

CAG

TCC

CTC

AAC

GAG

CCG

GTG

AAG

CGC

ATG

AAC

1056

Glu

Lys

Val

Gly

Gin

Ser

Leu

Asn

Glu

Pro

Val

Lys

Arg

Met

Asn

750

755

760

CTC

AAC

ACG

TTC

GTC

GTG

GAG

ACC

GGC

GAG

GGG

ACC

AAC

GCC

GAG

1104

Leu

Asn

Thr

Phe

Val

Glu

Thr

Gly

Glu

Gly

Thr

Asn

Ala

Glu

765

770

775

GCG

CTC

GAC

CGC

CTC

GCC

CAG

ATC

CTC

TAC

GAG

AAG

ATC

ACC

CGC

1152

Ala

Leu

Asp

Arg

Leu

Ala

Gin

Ile

Leu

Tyr

Glu

Lys

Ile

Thr

Arg

780

785

790

GGC

CTC

GGC

AAG

ATC

TCC

CTC

GAG

GTG

GAC

AAC

ATC

GAC

CCG

TAC

ACC

1200

Gly

Leu

Gly

Lys

Ile

Ser

Leu

Glu

Val

Asp

Asn

Ile

Asp

Pro

Tyr

Thr

795

800

805

GAG

CGC

GTG

CGC

AAG

CTC

TTC

TGA

1227

Glu .

Arg

val

Arg

Lys

Leu

Phe

★

810 815 (2) Informace pro SEQ ID č. 4:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 409 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární ίο (II) Typ molekuly: protein (XI) Popis sekvence: SEQ id č. 4:

Met 1

Lys

Ser

Lys

Met 5

Ala

Met

Leu Leu Leu 1C

Leu

Phe

Cys

Val

Leu 15

Ser

Asn

Gin

Leu

Val

Ala

Phe

Ser Thr

Gin

Ala

Lys

Ala

Ser

Lys

Asp

20

25

30

Gly

Asn

Leu

Val

Thr

Val

Leu

Ala Ile

Asp

Gly

Ile

Arg

Gly

3 5

40

45

11 <;

Ile

Pro

Gly

Val

Ile

Leu

Lys Gin

Leu

Glu

Ala

Thr

Leu

Gin

Arg

50

55

60

Trp

Asp

Ser

Ala

Arg

Leu

Ala Glu

Tyr

Phe

Asp

Val

Ala

Gly

65

70

75

80

Thr

Ser

Thr

Gly

Ile

Thr Ala

Ile

Leu

Thr

Ala

Pro

Asp

Pro

85

90

95

Gin

Asn

Lys

Asp

Arg

Pro

Leu

Tyr Ala

Ala

Glu

Ile

Asp

Phe

100

105

110

Tyr

Ile

Glu

His

Gly

Pro

Ser

Ile Phe

Asn

Lys

Ser

Thr

Ala

Cys

Ser

115

120

125

Leu

Pro

Gly

Ile

Phe

Cys

Pro

Lys Tyr

Asp

Gly

Lys

Tyr

Leu

Gin

Glu

130

135

140

Ile

Ser

Gin

Lys

Leu

Asn

Glu Thr

Leu

Asp

Gin

Thr

145

150

155

160

As n

Val

V a 1

Ile

Pro

Ser

Phe

Asp Ile

Lys

Leu

Arg

Pro

Thr

Ile

165

170

175

Phe

Ser

Thr

Phe

Lys

Leu

Glu

Glu val

Pro

Glu

Leu

Asn

Val

Lys

Leu

180

18 5

1 90

Asp

V a 1

Cys

s t

Gly

Thr

Ser Ala

Pro

Ile

Val

Phe

Pro

: X.

200

205

-42CZ 297319 B6

Tyr Tyr

Phe

Lys

His

Gly

Asp 215

Thr Glu

Phe Asn Leu Val 220

Asp

Gly

Ala

210

Ile

Ala

Asp

Ile

Pro

Ala

Pro

val

Ala

Leu

Ser

Glu

Val

Leu

Gin

225

230

235

240

Gin

Glu

Lys

Tyr

Lys

Asn

Lys

Glu

Ile

Leu

Ser

Ile

Gly

Thr

245

250

255

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Glu

Gly

Tyr

Ser

Ala

Asn

Arg

Thr

Trp

Thr

260

265

270

Ile

Phe

Asp

Trp

Ser

Glu

Thr

Leu

Ile

Gly

Leu

Met

Gly

His

Gly

275

280

285

Thr

Arg

Ala

Met

Ser

Asp

Tyr

Val

Gly

Ser

His

Phe

Lys

Ala

Leu

290

295

300

Gin

Pro

Gin

Asn

Tyr

Leu

Arg

Ile

Gin

Glu

Tyr

Asp

Leu

Asp

Pro

305

310

315

320

Ala

Leu

Glu

Ser

Ile

Asp

Ala

Ser

Thr

Glu

Asn

Met

Glu

Asn

Leu

325

330

335

Glu

Lys

Val

Gly

Gin

Ser

Leu

Asn

Glu

Pro

Val

Lys

Arg

Met

Asn

340

34 5

3S0

Leu

Asn

Thr

Phe

Val

Glu

Thr

Gly

Glu

Gly

Thr

Asn

Ala

Glu

355

360

365

Ala

Leu

Asp

Arg

Leu

Ala

Gin

Ile

Leu

Tyr

Glu

Lys

Ile

Thr

Arg

370

375

380

Gly

Leu

Gly

Lys

Ile

Ser

Leu

Glu

Val

Asp

Asn

Ile

Asp

Pro

Tyr

Thr

365

390

395

400

Glu

Arg

Val

Arg

Lys

Leu

Phe

*

405 (2) Informace pro SEQ ID č. 5:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Seřetězení: jednotlivá ίο (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: peptid (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba

-43CZ 297319 B6 (XI) Popis sekvence: SEQ id č. 5:

Met Ser Thr Ser Ala Ala Pro Ile Val Phe Pro Pro Tyr Tyr Phe Lys 15 10 15 (2) Informace pro SEQ ID č. 6:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: peptid (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (XI) Popis sekvence: SEQ id č. 6:

Ala Leu Gin Pro Gin Asn Asn Tyr Leu Arg Gin Glu Tyr Asp Leu Asp 15 10 15 (2) Informace pro SEQ ID č. 7:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 13 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: peptid (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (XI) Popis sekvence: SEQ id č. 7:

Pro Asp Trp Val Val Ile Arg Ser Gin Ser Val Gly Lys 15 10 (2) Informace pro SEQ ID č. 8:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina

-44CZ 297319 B6 (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: peptid (VI) Původní zdroj;

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (XI) Popis sekvence: SEQ id č. 8:

Lys Ala Phe Val Asn Gly Val Tyr Phe Ile Asn Thr Tyr Asp Ser Ala 15 10 15 (2) Informace pro SEQ ID č. 9:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: peptid (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (XI) Popis sekvence: SEQ id č. 9:

Asn Asn Tyr Leu Arg ile Gin Glu Tyr Asp Leu Pro Pro Ala Leu 1 5 10 15 (2) Informace pro SEQ ID č. 10:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: peptid (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba

-45 CZ 297319 B6 (XI) Popis sekvence: SEQ id č. 10:

Val val Lys Arg Leu Ala Gly Tyr Phe Asp Val 15 10 (2) Informace pro SEQ ID č. 11:

(I) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 8 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Seřetězení: jednotlivá (D) Topologie: lineární (II) Typ molekuly: peptid (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Pentaclethra macroloba (XI) Popis sekvence: SEQ id č. 11:

Glu Asn Met Glu Asn Leu Glu Lys

5

-46CZ 297319 B6

Claims

1. V podstatě přečištěný polypeptid, zahrnující sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny sestávající z:

(a) sekvence aminokyselin uvedené v SEQ id. č. 2;

(b) zbytků 22-408 sekvence uvedené v SEQ id č. 2;

(c) zbytků 29-408 aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ id. č. 2;

(d) insekticidně účinného fragmentu sekvence aminokyselin uvedené v SEQ id č. 2; a (e) sekvence aminokyselin, která má alespoň 90% sekvenční identitu se sekvencí aminokyselin SEQ id č. 2 a má insekticidní účinnost.

2. V podstatě přečištěný polypeptid podle nároku 1, kde uvedená sekvence aminokyselin má alespoň 95% sekvenční identitu se sekvencí aminokyselin SEQ id č. 2.

3. V podstatě přečištěný polypeptid podle nároku 1 nebo 2, který má insekticidní účinnost.

4. Polypeptid podle nároku 3, který má insekticidní účinnost vůči Diabrotica.

5. Izolovaná nukleotidová sekvence, kódující polypeptid podle kteréhokoli z předcházejících nároků.

6. Izolovaná sekvence podle nároku 5, vybraná ze skupiny složené z:

(a) sekvence uvedené v SEQ id. č. 1;

(b) nukleotidové sekvence kódující polypeptid s insekticidní účinností, která hybridizuje se sekvencí výše uvedenou pod (a) za přísných podmínek definovaných přísností promývání roztoky 0,3 M NaCl, 0,03 M citrátu sodného, 0,1% SDS při 70 °C; a (c) nukleotidové sekvence kódující polypeptid mající sekvenci uvedenou v SEQ id. č. 2.

7. Sekvence DNA podle nároku 6, ve které jsou kodony optimalizovány pro expresi v kukuřici.

8. Vektor, zahrnující sekvenci podle kteréhokoli z nároků 5 až 7.

9. Organismus, transformovaný vektorem podle nároku 8, kde tímto organismem je jednoděložná rostlina, houba nebo bakterie.

10. Expresní kazeta, zahrnující promotor, který řídí expresi v rostlinné buňce, operativně připojený k nukleotidové sekvenci podle kteréhokoli z nároků 5 až 7.

11. Expresní kazeta podle nároku 10, kde promotor je heterologní k nukleotidové sekvenci.

12. Expresní kazeta podle nároku 11, kde promotorem je preferenční kořenový promotor.

13. Rostlina, zahrnující expresní kazetu podle nároku 11 nebo 12.

-47CZ 297319 B6

14. Jednoděložná rostlina, zahrnující expresní kazetu podle kteréhokoli z nároků 10 až 12, kde se v transformované rostlině exprimuje protein kódovaný sekvencí podle kteréhokoli z nároků 5 až 7.

15. Rostlina podle nároku 13 nebo 14, kterou je rostlina kukuřice.

16. Semeno rostliny podle kteréhokoli z nároků 13 až 15, kde toto semeno zahrnuje uvedenou expresní kazetu.

17. Způsob potírání Diabrotica, vyznačující se tím, že se rostlinná buňka transformuje expresní kazetou podle kteréhokoli z nároků 10 až 12.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že rostlinná buňka jez jednoděložné rostliny.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že jednoděložnou rostlinou je kukuřice.

20. Rostlinná buňka, zahrnující expresní kazetu podle nároku 11 nebo 12.

21. Rostlinná buňka, zahrnující expresní kazetu podle kteréhokoli z nároků 10 až 12, kde se v transformované rostlinné buňce exprimuje protein kódovaný sekvencí podle kteréhokoli z nároků 5 až 7.

22. Buňka jednoděložné rostliny podle nároku 20 nebo 21, kterou je buňka rostliny podle kteréhokoli z nároků 13 až 15.