SI20214A - Proteini z insekticidnimi aktivnostmi in postopek uporabe - Google Patents
Proteini z insekticidnimi aktivnostmi in postopek uporabe Download PDFInfo
- Publication number
- SI20214A SI20214A SI9820048A SI9820048A SI20214A SI 20214 A SI20214 A SI 20214A SI 9820048 A SI9820048 A SI 9820048A SI 9820048 A SI9820048 A SI 9820048A SI 20214 A SI20214 A SI 20214A
- Authority
- SI
- Slovenia
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- amino acid
- sequences
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 191
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 126
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 title claims description 28
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 94
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 241001343007 Pentaclethra Species 0.000 claims abstract description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 72
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 46
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 46
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 38
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 34
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 29
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 24
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 24
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 21
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 18
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 claims 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 abstract description 45
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 29
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 abstract description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 109
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 36
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 36
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 34
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 19
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 18
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 14
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 14
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 14
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 14
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 13
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 13
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 13
- 241000335023 Pentaclethra macroloba Species 0.000 description 12
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 12
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 12
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 11
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 11
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 11
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 11
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 11
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 11
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 11
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 8
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 8
- 239000004323 potassium nitrate Substances 0.000 description 8
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- LMMJFBMMJUMSJS-UHFFFAOYSA-N CH5126766 Chemical compound CNS(=O)(=O)NC1=NC=CC(CC=2C(OC3=CC(OC=4N=CC=CN=4)=CC=C3C=2C)=O)=C1F LMMJFBMMJUMSJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 7
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 7
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N Asn-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 6
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- HHSKZJZWQFPSKN-AVGNSLFASA-N Glu-Tyr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HHSKZJZWQFPSKN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 5
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 5
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 5
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 5
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 5
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- XEXJJJRVTFGWIC-FXQIFTODSA-N Ala-Asn-Arg Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N XEXJJJRVTFGWIC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- QUIGLPSHIFPEOV-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O QUIGLPSHIFPEOV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241001629132 Blissus leucopterus Species 0.000 description 4
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 4
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- AQNYKMCFCCZEEL-JYJNAYRXSA-N Glu-Lys-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AQNYKMCFCCZEEL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 4
- YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 4
- VIPDPMHGICREIS-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VIPDPMHGICREIS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N L-Leucyl-L-Arginyl-L-Proline Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YKNBJXOJTURHCU-DCAQKATOSA-N Leu-Asp-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YKNBJXOJTURHCU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- 241001478965 Melanoplus femurrubrum Species 0.000 description 4
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- APZNYJFGVAGFCF-JYJNAYRXSA-N Phe-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccccc1)C(C)C)C(O)=O APZNYJFGVAGFCF-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 4
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N Thr-Gly-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 4
- LMKKMCGTDANZTR-BZSNNMDCSA-N Tyr-Phe-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LMKKMCGTDANZTR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 4
- TYGHOWWWMTWVKM-HJOGWXRNSA-N Tyr-Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TYGHOWWWMTWVKM-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 4
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 4
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 4
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000003050 macronutrient Effects 0.000 description 4
- 235000021073 macronutrients Nutrition 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 229940111688 monobasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 4
- 108010077037 tyrosyl-tyrosyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 4
- 241001014341 Acrosternum hilare Species 0.000 description 3
- 241000566547 Agrotis ipsilon Species 0.000 description 3
- NGYHSXDNNOFHNE-AVGNSLFASA-N Arg-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NGYHSXDNNOFHNE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- WQAOZCVOOYUWKG-LSJOCFKGSA-N Asn-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N WQAOZCVOOYUWKG-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 3
- BUVNWKQBMZLCDW-UGYAYLCHSA-N Asp-Asn-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BUVNWKQBMZLCDW-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 3
- GGRSYTUJHAZTFN-IHRRRGAJSA-N Asp-Pro-Tyr Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O GGRSYTUJHAZTFN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- ALMIMUZAWTUNIO-BZSNNMDCSA-N Asp-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ALMIMUZAWTUNIO-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 3
- OQMGSMNZVHYDTQ-ZKWXMUAHSA-N Asp-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N OQMGSMNZVHYDTQ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 3
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 3
- 241000489972 Diabrotica barberi Species 0.000 description 3
- NNQDRRUXFJYCCJ-NHCYSSNCSA-N Glu-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NNQDRRUXFJYCCJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HVWXAQVMRBKKFE-UGYAYLCHSA-N Ile-Asp-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N HVWXAQVMRBKKFE-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 3
- BCVIOZZGJNOEQS-XKNYDFJKSA-N Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)[C@@H](C)CC BCVIOZZGJNOEQS-XKNYDFJKSA-N 0.000 description 3
- IIWQTXMUALXGOV-PCBIJLKTSA-N Ile-Phe-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N IIWQTXMUALXGOV-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 3
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 3
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UILIPCLTHRPCRB-XUXIUFHCSA-N Leu-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N UILIPCLTHRPCRB-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 3
- FIJMQLGQLBLBOL-HJGDQZAQSA-N Leu-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O FIJMQLGQLBLBOL-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 3
- MMEDVBWCMGRKKC-GARJFASQSA-N Leu-Asp-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N MMEDVBWCMGRKKC-GARJFASQSA-N 0.000 description 3
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- HVJVUYQWFYMGJS-GVXVVHGQSA-N Leu-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HVJVUYQWFYMGJS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 3
- IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- YESNGRDJQWDYLH-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N YESNGRDJQWDYLH-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- NJNRBRKHOWSGMN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJNRBRKHOWSGMN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- URGPVYGVWLIRGT-DCAQKATOSA-N Lys-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O URGPVYGVWLIRGT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- AETNZPKUUYYYEK-CIUDSAMLSA-N Met-Glu-Asn Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AETNZPKUUYYYEK-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- SXWQMBGNFXAGAT-FJXKBIBVSA-N Met-Gly-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SXWQMBGNFXAGAT-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 3
- AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N N-L-tyrosyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 description 3
- HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- ZJPGOXWRFNKIQL-JYJNAYRXSA-N Phe-Pro-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 ZJPGOXWRFNKIQL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- VYWNORHENYEQDW-YUMQZZPRSA-N Pro-Gly-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 VYWNORHENYEQDW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 241000722027 Schizaphis graminum Species 0.000 description 3
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 241001454293 Tetranychus urticae Species 0.000 description 3
- LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N Thr-Ala-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N 0.000 description 3
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 3
- CQNFRKAKGDSJFR-NUMRIWBASA-N Thr-Glu-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)O CQNFRKAKGDSJFR-NUMRIWBASA-N 0.000 description 3
- VGYVVSQFSSKZRJ-OEAJRASXSA-N Thr-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)CC1=CC=CC=C1 VGYVVSQFSSKZRJ-OEAJRASXSA-N 0.000 description 3
- ZEJBJDHSQPOVJV-UAXMHLISSA-N Thr-Trp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZEJBJDHSQPOVJV-UAXMHLISSA-N 0.000 description 3
- QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N Val-Asp-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 3
- AOILQMZPNLUXCM-AVGNSLFASA-N Val-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN AOILQMZPNLUXCM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 108010045397 lysyl-tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 108010078580 tyrosylleucine Proteins 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- GWFSQQNGMPGBEF-GHCJXIJMSA-N Ala-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N GWFSQQNGMPGBEF-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 2
- WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N Ala-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- TZDNWXDLYFIFPT-BJDJZHNGSA-N Ala-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O TZDNWXDLYFIFPT-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- YHBDGLZYNIARKJ-GUBZILKMSA-N Ala-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N YHBDGLZYNIARKJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N Arg-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- PYZPXCZNQSEHDT-GUBZILKMSA-N Arg-Met-Asn Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PYZPXCZNQSEHDT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- 241000343781 Chaetocnema pulicaria Species 0.000 description 2
- 241000661337 Chilo partellus Species 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001609607 Delia platura Species 0.000 description 2
- 241000489973 Diabrotica undecimpunctata Species 0.000 description 2
- 241000489976 Diabrotica undecimpunctata howardi Species 0.000 description 2
- 241000122106 Diatraea saccharalis Species 0.000 description 2
- 241000400698 Elasmopalpus lignosellus Species 0.000 description 2
- 241000995027 Empoasca fabae Species 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- DYFJZDDQPNIPAB-NHCYSSNCSA-N Glu-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DYFJZDDQPNIPAB-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- LJLPOZGRPLORTF-CIUDSAMLSA-N Glu-Asn-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O LJLPOZGRPLORTF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N Glu-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 description 2
- LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N Glu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 2
- VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- SUIAHERNFYRBDZ-GVXVVHGQSA-N Glu-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SUIAHERNFYRBDZ-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- UERORLSAFUHDGU-AVGNSLFASA-N Glu-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N UERORLSAFUHDGU-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- JVWPPCWUDRJGAE-YUMQZZPRSA-N Gly-Asn-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JVWPPCWUDRJGAE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N Gly-Glu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- ZVXMEWXHFBYJPI-LSJOCFKGSA-N Gly-Val-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O ZVXMEWXHFBYJPI-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- KSOBNUBCYHGUKH-UWVGGRQHSA-N Gly-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CN KSOBNUBCYHGUKH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000256244 Heliothis virescens Species 0.000 description 2
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 description 2
- ZFDKSLBEWYCOCS-BZSNNMDCSA-N His-Phe-Lys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)C1=CC=CC=C1 ZFDKSLBEWYCOCS-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 241001508564 Hypera punctata Species 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N Ile-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N 0.000 description 2
- NYEYYMLUABXDMC-NHCYSSNCSA-N Ile-Gly-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N NYEYYMLUABXDMC-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- DFFTXLCCDFYRKD-MBLNEYKQSA-N Ile-Gly-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N DFFTXLCCDFYRKD-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 2
- UWLHDGMRWXHFFY-HPCHECBXSA-N Ile-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N UWLHDGMRWXHFFY-HPCHECBXSA-N 0.000 description 2
- AXNGDPAKKCEKGY-QPHKQPEJSA-N Ile-Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N AXNGDPAKKCEKGY-QPHKQPEJSA-N 0.000 description 2
- PWUMCBLVWPCKNO-MGHWNKPDSA-N Ile-Leu-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PWUMCBLVWPCKNO-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 2
- KTTMFLSBTNBAHL-MXAVVETBSA-N Ile-Phe-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N KTTMFLSBTNBAHL-MXAVVETBSA-N 0.000 description 2
- PZWBBXHHUSIGKH-OSUNSFLBSA-N Ile-Thr-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PZWBBXHHUSIGKH-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N Leu-Ala-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- IBMVEYRWAWIOTN-RWMBFGLXSA-N Leu-Arg-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 2
- TWQIYNGNYNJUFM-NHCYSSNCSA-N Leu-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TWQIYNGNYNJUFM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N Leu-Pro-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- VJGQRELPQWNURN-JYJNAYRXSA-N Leu-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VJGQRELPQWNURN-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- 241000501345 Lygus lineolaris Species 0.000 description 2
- ZQCVMVCVPFYXHZ-SRVKXCTJSA-N Lys-Asn-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN ZQCVMVCVPFYXHZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- AAORVPFVUIHEAB-YUMQZZPRSA-N Lys-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O AAORVPFVUIHEAB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- VLMNBMFYRMGEMB-QWRGUYRKSA-N Lys-His-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CNC=N1 VLMNBMFYRMGEMB-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- RMKJOQSYLQQRFN-KKUMJFAQSA-N Lys-Tyr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RMKJOQSYLQQRFN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 241001422926 Mayetiola hordei Species 0.000 description 2
- 241000922538 Melanoplus sanguinipes Species 0.000 description 2
- XKJUFUPCHARJKX-UWVGGRQHSA-N Met-Gly-His Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XKJUFUPCHARJKX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- SODXFJOPSCXOHE-IHRRRGAJSA-N Met-Leu-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SODXFJOPSCXOHE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- IMTUWVJPCQPJEE-IUCAKERBSA-N Met-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IMTUWVJPCQPJEE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 241001160353 Oulema melanopus Species 0.000 description 2
- 108010029182 Pectin lyase Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- KAHUBGWSIQNZQQ-KKUMJFAQSA-N Phe-Asn-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KAHUBGWSIQNZQQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- IUVYJBMTHARMIP-PCBIJLKTSA-N Phe-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IUVYJBMTHARMIP-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 2
- VJEZWOSKRCLHRP-MELADBBJSA-N Phe-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)O VJEZWOSKRCLHRP-MELADBBJSA-N 0.000 description 2
- DNAXXTQSTKOHFO-QEJZJMRPSA-N Phe-Lys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 DNAXXTQSTKOHFO-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 2
- 241000167882 Rhopalosiphum maidis Species 0.000 description 2
- 241000532885 Sphenophorus Species 0.000 description 2
- 241000256247 Spodoptera exigua Species 0.000 description 2
- 241000344246 Tetranychus cinnabarinus Species 0.000 description 2
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- YRNBANYVJJBGDI-VZFHVOOUSA-N Thr-Ala-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O YRNBANYVJJBGDI-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 2
- SWIKDOUVROTZCW-GCJQMDKQSA-N Thr-Asn-Ala Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N)O SWIKDOUVROTZCW-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- 241000339374 Thrips tabaci Species 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- PEEAINPHPNDNGE-JQWIXIFHSA-N Trp-Asp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 PEEAINPHPNDNGE-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 2
- JWHOIHCOHMZSAR-QWRGUYRKSA-N Tyr-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JWHOIHCOHMZSAR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- ILTXFANLDMJWPR-SIUGBPQLSA-N Tyr-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N ILTXFANLDMJWPR-SIUGBPQLSA-N 0.000 description 2
- ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N Val-Ala-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- RYQUMYBMOJYYDK-NHCYSSNCSA-N Val-Pro-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N RYQUMYBMOJYYDK-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- -1 acylsterylglucoside Chemical compound 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 2
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 2
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 244000062645 predators Species 0.000 description 2
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 2
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 2
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 2
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000012487 rinsing solution Substances 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N valinyl-arginine Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 1-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- IBXNCJKFFQIKKY-UHFFFAOYSA-N 1-pentyne Chemical compound CCCC#C IBXNCJKFFQIKKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CUJMXIQZWPZMNQ-XYYGWQPLSA-N 13,14-dihydro-15-oxo-prostaglandin E2 Chemical compound CCCCCC(=O)CC[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O CUJMXIQZWPZMNQ-XYYGWQPLSA-N 0.000 description 1
- 241001558877 Aceria tulipae Species 0.000 description 1
- 241000253994 Acyrthosiphon pisum Species 0.000 description 1
- 241000673185 Aeolus Species 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000993143 Agromyza Species 0.000 description 1
- 241000001996 Agrotis orthogonia Species 0.000 description 1
- 241001652650 Agrotis subterranea Species 0.000 description 1
- JQDFGZKKXBEANU-IMJSIDKUSA-N Ala-Cys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O JQDFGZKKXBEANU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N Ala-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- CFPQUJZTLUQUTJ-HTFCKZLJSA-N Ala-Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](C)N CFPQUJZTLUQUTJ-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 1
- XSTZMVAYYCJTNR-DCAQKATOSA-N Ala-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XSTZMVAYYCJTNR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WQLDNOCHHRISMS-NAKRPEOUSA-N Ala-Pro-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WQLDNOCHHRISMS-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- 241000724328 Alfalfa mosaic virus Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 241000254175 Anthonomus grandis Species 0.000 description 1
- 241000625753 Anticarsia Species 0.000 description 1
- 241000625764 Anticarsia gemmatalis Species 0.000 description 1
- 241001600408 Aphis gossypii Species 0.000 description 1
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N Arg-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- AWMAZIIEFPFHCP-RCWTZXSCSA-N Arg-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AWMAZIIEFPFHCP-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- ZUVDFJXRAICIAJ-BPUTZDHNSA-N Arg-Trp-Asp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 ZUVDFJXRAICIAJ-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- ISVACHFCVRKIDG-SRVKXCTJSA-N Arg-Val-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O ISVACHFCVRKIDG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LEFKSBYHUGUWLP-ACZMJKKPSA-N Asn-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LEFKSBYHUGUWLP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- GFFRWIJAFFMQGM-NUMRIWBASA-N Asn-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GFFRWIJAFFMQGM-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N Asn-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NCFJQJRLQJEECD-NHCYSSNCSA-N Asn-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NCFJQJRLQJEECD-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- QJMCHPGWFZZRID-BQBZGAKWSA-N Asn-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O QJMCHPGWFZZRID-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FBODFHMLALOPHP-GUBZILKMSA-N Asn-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FBODFHMLALOPHP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HMUKKNAMNSXDBB-CIUDSAMLSA-N Asn-Met-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HMUKKNAMNSXDBB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NAPNAGZWHQHZLG-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N NAPNAGZWHQHZLG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- DTNUIAJCPRMNBT-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DTNUIAJCPRMNBT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N Asp-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SPKCGKRUYKMDHP-GUDRVLHUSA-N Asp-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N SPKCGKRUYKMDHP-GUDRVLHUSA-N 0.000 description 1
- NONWUQAWAANERO-BZSNNMDCSA-N Asp-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 NONWUQAWAANERO-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- GWWSUMLEWKQHLR-NUMRIWBASA-N Asp-Thr-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O GWWSUMLEWKQHLR-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N Asp-Tyr Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ZUNMTUPRQMWMHX-LSJOCFKGSA-N Asp-Val-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ZUNMTUPRQMWMHX-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 241000982105 Brevicoryne brassicae Species 0.000 description 1
- 241000661305 Busseola fusca Species 0.000 description 1
- 101100289888 Caenorhabditis elegans lys-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001536086 Cephus cinctus Species 0.000 description 1
- 241001101640 Chlorochroa sayi Species 0.000 description 1
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 241001367803 Chrysodeixis includens Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- DBPRUZCKPFOVDV-UHFFFAOYSA-N Clorprenaline hydrochloride Chemical compound O.Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=CC=C1Cl DBPRUZCKPFOVDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000540393 Cochylis hospes Species 0.000 description 1
- 241001529599 Colaspis brunnea Species 0.000 description 1
- 241000143939 Colias eurytheme Species 0.000 description 1
- 241000683561 Conoderus Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001663470 Contarinia <gall midge> Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241001156075 Cyclocephala Species 0.000 description 1
- 241001587738 Cyclocephala borealis Species 0.000 description 1
- 241001183634 Cylindrocopturus Species 0.000 description 1
- KVGPYKUIHZJWGA-BQBZGAKWSA-N Cys-Met-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(O)=O KVGPYKUIHZJWGA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KZZYVYWSXMFYEC-DCAQKATOSA-N Cys-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KZZYVYWSXMFYEC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241001585354 Delia coarctata Species 0.000 description 1
- 241001124144 Dermaptera Species 0.000 description 1
- 241000489977 Diabrotica virgifera Species 0.000 description 1
- 241000489947 Diabrotica virgifera virgifera Species 0.000 description 1
- 241000879145 Diatraea grandiosella Species 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241001279823 Diuraphis noxia Species 0.000 description 1
- 241000661279 Eldana Species 0.000 description 1
- 241001105160 Eleodes Species 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000462639 Epilachna varivestis Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001619920 Euschistus servus Species 0.000 description 1
- 241000220485 Fabaceae Species 0.000 description 1
- 241000654868 Frankliniella fusca Species 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FYBSCGZLICNOBA-XQXXSGGOSA-N Glu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O FYBSCGZLICNOBA-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N Glu-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HPJLZFTUUJKWAJ-JHEQGTHGSA-N Glu-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HPJLZFTUUJKWAJ-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- XMPAXPSENRSOSV-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XMPAXPSENRSOSV-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- XIKYNVKEUINBGL-IUCAKERBSA-N Glu-His-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(O)=O XIKYNVKEUINBGL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ZCOJVESMNGBGLF-GRLWGSQLSA-N Glu-Ile-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O ZCOJVESMNGBGLF-GRLWGSQLSA-N 0.000 description 1
- QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N Glu-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- PMSDOVISAARGAV-FHWLQOOXSA-N Glu-Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 PMSDOVISAARGAV-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- PMNHJLASAAWELO-FOHZUACHSA-N Gly-Asp-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PMNHJLASAAWELO-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N Gly-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)CNC(=O)C[NH3+] XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- ADZGCWWDPFDHCY-ZETCQYMHSA-N Gly-His-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CN=CN1 ADZGCWWDPFDHCY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- SXJHOPPTOJACOA-QXEWZRGKSA-N Gly-Ile-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SXJHOPPTOJACOA-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- YSDLIYZLOTZZNP-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN YSDLIYZLOTZZNP-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- PTIIBFKSLCYQBO-NHCYSSNCSA-N Gly-Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CN PTIIBFKSLCYQBO-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- CVFOYJJOZYYEPE-KBPBESRZSA-N Gly-Lys-Tyr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CVFOYJJOZYYEPE-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- FKESCSGWBPUTPN-FOHZUACHSA-N Gly-Thr-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FKESCSGWBPUTPN-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N Gly-Thr-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCC(O)=O JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 1
- DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- ZUPVLBAXUUGKKN-VHSXEESVSA-N His-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)O ZUPVLBAXUUGKKN-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- BDFCIKANUNMFGB-PMVVWTBXSA-N His-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 BDFCIKANUNMFGB-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 1
- 101000899240 Homo sapiens Endoplasmic reticulum chaperone BiP Proteins 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- 241000370519 Hypena Species 0.000 description 1
- 241000370523 Hypena scabra Species 0.000 description 1
- 241001508558 Hypera Species 0.000 description 1
- 241001508566 Hypera postica Species 0.000 description 1
- QLRMMMQNCWBNPQ-QXEWZRGKSA-N Ile-Arg-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)O)N QLRMMMQNCWBNPQ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- NCSIQAFSIPHVAN-IUKAMOBKSA-N Ile-Asn-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N NCSIQAFSIPHVAN-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- HGNUKGZQASSBKQ-PCBIJLKTSA-N Ile-Asp-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N HGNUKGZQASSBKQ-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- NPROWIBAWYMPAZ-GUDRVLHUSA-N Ile-Asp-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NPROWIBAWYMPAZ-GUDRVLHUSA-N 0.000 description 1
- WIZPFZKOFZXDQG-HTFCKZLJSA-N Ile-Ile-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WIZPFZKOFZXDQG-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 1
- PWDSHAAAFXISLE-SXTJYALSSA-N Ile-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PWDSHAAAFXISLE-SXTJYALSSA-N 0.000 description 1
- JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YSGBJIQXTIVBHZ-AJNGGQMLSA-N Ile-Lys-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YSGBJIQXTIVBHZ-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- OTSVBELRDMSPKY-PCBIJLKTSA-N Ile-Phe-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N OTSVBELRDMSPKY-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- KCTIFOCXAIUQQK-QXEWZRGKSA-N Ile-Pro-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O KCTIFOCXAIUQQK-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- CNMOKANDJMLAIF-CIQUZCHMSA-N Ile-Thr-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNMOKANDJMLAIF-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- 241000256602 Isoptera Species 0.000 description 1
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- QPRQGENIBFLVEB-BJDJZHNGSA-N Leu-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O QPRQGENIBFLVEB-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- APFJUBGRZGMQFF-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN APFJUBGRZGMQFF-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- QJXHMYMRGDOHRU-NHCYSSNCSA-N Leu-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O QJXHMYMRGDOHRU-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- FLNPJLDPGMLWAU-UWVGGRQHSA-N Leu-Met-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C FLNPJLDPGMLWAU-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- MVHXGBZUJLWZOH-BJDJZHNGSA-N Leu-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O MVHXGBZUJLWZOH-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N Leu-Thr-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- 241000234280 Liliaceae Species 0.000 description 1
- 241000966204 Lissorhoptrus oryzophilus Species 0.000 description 1
- YIBOAHAOAWACDK-QEJZJMRPSA-N Lys-Ala-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YIBOAHAOAWACDK-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- CKSXSQUVEYCDIW-AVGNSLFASA-N Lys-Arg-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N CKSXSQUVEYCDIW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LPAJOCKCPRZEAG-MNXVOIDGSA-N Lys-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN LPAJOCKCPRZEAG-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- PRSBSVAVOQOAMI-BJDJZHNGSA-N Lys-Ile-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN PRSBSVAVOQOAMI-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N Lys-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- XBZOQGHZGQLEQO-IUCAKERBSA-N Lys-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XBZOQGHZGQLEQO-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N Lys-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- MIMXMVDLMDMOJD-BZSNNMDCSA-N Lys-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MIMXMVDLMDMOJD-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 240000005036 Madhuca macrophylla Species 0.000 description 1
- 241000710118 Maize chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- 241000723994 Maize dwarf mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000732113 Mamestra configurata Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001415013 Melanoplus Species 0.000 description 1
- 241001415015 Melanoplus differentialis Species 0.000 description 1
- 241001062280 Melanotus <basidiomycete fungus> Species 0.000 description 1
- 241000088587 Meromyza Species 0.000 description 1
- YNOVBMBQSQTLFM-DCAQKATOSA-N Met-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YNOVBMBQSQTLFM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- CGUYGMFQZCYJSG-DCAQKATOSA-N Met-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CGUYGMFQZCYJSG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DBMLDOWSVHMQQN-XGEHTFHBSA-N Met-Ser-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DBMLDOWSVHMQQN-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 239000005041 Mylar™ Substances 0.000 description 1
- 241001477928 Mythimna Species 0.000 description 1
- 241000721621 Myzus persicae Species 0.000 description 1
- WYBVBIHNJWOLCJ-UHFFFAOYSA-N N-L-arginyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCCN=C(N)N WYBVBIHNJWOLCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 241000084931 Neohydatothrips variabilis Species 0.000 description 1
- 241000912288 Neolasioptera Species 0.000 description 1
- 241000615716 Nephotettix nigropictus Species 0.000 description 1
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000346285 Ostrinia furnacalis Species 0.000 description 1
- 241000131737 Otiorhynchus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241000721451 Pectinophora gossypiella Species 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000488591 Petrobia Species 0.000 description 1
- MECSIDWUTYRHRJ-KKUMJFAQSA-N Phe-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MECSIDWUTYRHRJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ZIQQNOXKEFDPBE-BZSNNMDCSA-N Phe-Lys-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N ZIQQNOXKEFDPBE-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- MMPBPRXOFJNCCN-ZEWNOJEFSA-N Phe-Tyr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O MMPBPRXOFJNCCN-ZEWNOJEFSA-N 0.000 description 1
- 241000286134 Phyllophaga crinita Species 0.000 description 1
- 241000275067 Phyllotreta Species 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 241000500439 Plutella Species 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000254101 Popillia japonica Species 0.000 description 1
- CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N Pro-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- ZYBUKTMPPFQSHL-JYJNAYRXSA-N Pro-Asp-Trp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O ZYBUKTMPPFQSHL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- HAEGAELAYWSUNC-WPRPVWTQSA-N Pro-Gly-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HAEGAELAYWSUNC-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- AUQGUYPHJSMAKI-CYDGBPFRSA-N Pro-Ile-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 AUQGUYPHJSMAKI-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- CPRLKHJUFAXVTD-ULQDDVLXSA-N Pro-Leu-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CPRLKHJUFAXVTD-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XDKKMRPRRCOELJ-GUBZILKMSA-N Pro-Val-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 XDKKMRPRRCOELJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- IIRBTQHFVNGPMQ-AVGNSLFASA-N Pro-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 IIRBTQHFVNGPMQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000590524 Protaphis middletonii Species 0.000 description 1
- 241000721694 Pseudatomoscelis seriatus Species 0.000 description 1
- 241001456339 Rachiplusia nu Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010040007 Sense of oppression Diseases 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- FIXILCYTSAUERA-FXQIFTODSA-N Ser-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FIXILCYTSAUERA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JZRYFUGREMECBH-XPUUQOCRSA-N Ser-Val-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O JZRYFUGREMECBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000931985 Sesamia calamistis Species 0.000 description 1
- 241000661452 Sesamia nonagrioides Species 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001279786 Sipha flava Species 0.000 description 1
- 241000258242 Siphonaptera Species 0.000 description 1
- 241000180219 Sitobion avenae Species 0.000 description 1
- 241000068632 Sitodiplosis Species 0.000 description 1
- 241000532790 Sitona hispidulus Species 0.000 description 1
- 241000254152 Sitophilus oryzae Species 0.000 description 1
- 241001153342 Smicronyx fulvus Species 0.000 description 1
- 241001492664 Solenopsis <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 240000003829 Sorghum propinquum Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 241001414853 Spissistilus festinus Species 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187191 Streptomyces viridochromogenes Species 0.000 description 1
- 241001575047 Suleima Species 0.000 description 1
- 241001454294 Tetranychus Species 0.000 description 1
- 241000916142 Tetranychus turkestani Species 0.000 description 1
- TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N Thr-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- OQCXTUQTKQFDCX-HTUGSXCWSA-N Thr-Glu-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N)O OQCXTUQTKQFDCX-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 1
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N Thr-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- JKGGPMOUIAAJAA-YEPSODPASA-N Thr-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JKGGPMOUIAAJAA-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- UYTYTDMCDBPDSC-URLPEUOOSA-N Thr-Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N UYTYTDMCDBPDSC-URLPEUOOSA-N 0.000 description 1
- MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N Thr-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 241001414989 Thysanoptera Species 0.000 description 1
- 241000750338 Trialeurodes abutilonea Species 0.000 description 1
- 241001414983 Trichoptera Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- LTLBNCDNXQCOLB-UBHSHLNASA-N Trp-Asp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 LTLBNCDNXQCOLB-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- YBRHKUNWEYBZGT-WLTAIBSBSA-N Trp-Thr Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 YBRHKUNWEYBZGT-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- VCXWRWYFJLXITF-AUTRQRHGSA-N Tyr-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 VCXWRWYFJLXITF-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- RCLOWEZASFJFEX-KKUMJFAQSA-N Tyr-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 RCLOWEZASFJFEX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- VFJIWSJKZJTQII-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VFJIWSJKZJTQII-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AUEJLPRZGVVDNU-STQMWFEESA-N Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- LVFZXRQQQDTBQH-IRIUXVKKSA-N Tyr-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LVFZXRQQQDTBQH-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 1
- NWEGIYMHTZXVBP-JSGCOSHPSA-N Tyr-Val-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O NWEGIYMHTZXVBP-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- UDNYEPLJTRDMEJ-RCOVLWMOSA-N Val-Asn-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)NCC(=O)O)N UDNYEPLJTRDMEJ-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- CGGVNFJRZJUVAE-BYULHYEWSA-N Val-Asp-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N CGGVNFJRZJUVAE-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- KDKLLPMFFGYQJD-CYDGBPFRSA-N Val-Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N KDKLLPMFFGYQJD-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- FTKXYXACXYOHND-XUXIUFHCSA-N Val-Ile-Leu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FTKXYXACXYOHND-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- JZWZACGUZVCQPS-RNJOBUHISA-N Val-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N JZWZACGUZVCQPS-RNJOBUHISA-N 0.000 description 1
- VCIYTVOBLZHFSC-XHSDSOJGSA-N Val-Phe-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N VCIYTVOBLZHFSC-XHSDSOJGSA-N 0.000 description 1
- PGBMPFKFKXYROZ-UFYCRDLUSA-N Val-Tyr-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O)N PGBMPFKFKXYROZ-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N Valylglycine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- CWRILEGKIAOYKP-SSDOTTSWSA-M [(2r)-3-acetyloxy-2-hydroxypropyl] 2-aminoethyl phosphate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCCN CWRILEGKIAOYKP-SSDOTTSWSA-M 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 229920003180 amino resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010719 annulation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 235000021405 artificial diet Nutrition 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004883 computer application Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 230000005058 diapause Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003008 fumonisin Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010033719 glycyl-histidyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000006278 hypochromic anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 108010078274 isoleucylvaline Proteins 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010091798 leucylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- FIJGNIAJTZSERN-DQQGJSMTSA-N monogalactosyl-diacylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@H](COC(=O)CCCCCCCCCCCC)CO[C@@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O FIJGNIAJTZSERN-DQQGJSMTSA-N 0.000 description 1
- 231100001160 nonlethal Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000013337 sub-cultivation Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011885 synergistic combination Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N trans-Zeatin Natural products OCC(/C)=C\CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N trans-zeatin Chemical compound OCC(/C)=C/CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 235000015041 whisky Nutrition 0.000 description 1
- 229940023877 zeatin Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
- A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
- A01N65/20—Fabaceae or Leguminosae [Pea or Legume family], e.g. pea, lentil, soybean, clover, acacia, honey locust, derris or millettia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Mycology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Gre za sestavke in postopke za zatiranje škodljivcev, zlasti škodljivih žuželk. Sestavki obsegajo proteine, izolirane iz rastlin rodu Pentaclethra. Gre tudi za nukleotidne sekvence, ki kodirajo proteine. Take sekvence uporabljamo pri transformiranju organizmov za zatiranje škodljivcev.ŕ
Description
PIONEER HI-BREAD INTERNATIONAL INC.
THE BOARD OF REGENTS FOR THE UNIVERSITY OF OKLAHOMA
Proteini z insekticidnimi aktivnostmi in postopek uporabe
Področje izuma
Izum se nanaša na sestavke in postopke za zatiranje vrst žuželk. Poleg tega se izum nanaša na rastline in druge organizme, ki smo jih genetsko transformirali s sestavki v smislu izuma.
Ozadje izuma
Številne vrste žuželk so resni škodljivci za običajne poljedelske pridelke, kot so koruza, soja, grah, bombaž ter podobni živilski in vlakneni pridelki. Primaren postopek za zatiranje takih škodljivcev je bil uporaba sintetičnih kemičnih spojin. Vendar široka uporaba kemičnih spojin povzroča mnoge probleme glede na okolje zaradi neselektivnosti spojin in zaradi razvoja odpornosti žuželk proti kemikalijam.
Poskušali so z drugimi pristopi za zatiranje žuželk, vključno z uporabo bioloških organizmov, ki so tipično naravni roparji vrst, ki so jih skušali zatirati. Taki roparji so lahko druge žuželke, glivice in bakterije, kot Bacillus thuringiensis. Po drugi strani so vzgajali velike kolonije škodljivih žuželk v ujetništvu, sterilizirali in spustili v okolje v upanju, da bo parjenje med steriliziranimi žuželkami im plodnimi divjimi žuželkami zmanjšalo populacijo žuželk. Čeprav so ti pristopi imeli nekaj uspeha, so imeli za posledico znatne stroške in povzročajo številne hude težave.
Npr. težko je tako aplicirati biološke organizme na velike površine in doseči, da ostanejo taki živi organizmi v obdelani površini ali na obdelani vrsti rastline daljši čas. Roparske žuželke lahko migrirajo, glivice ali bakterije pa lahko dež spere z rastline ali odstrani z obdelane površine. Čeprav ima torej uporaba takih bioloških kontrol zaželene karakteristike in je imela nekaj uspeha, se zdi, da so v praksi ti postopki resno omejeni.
Napredek v biotehnologiji v zadnjih dveh desetletjih nudi nove priložnosti za zatiranje škodljivcev z genetskim inženiringom. Zlasti napredek v rastlinski genetiki, povezan z identifikacijo rastnih faktorjev žuželk in naravno nastopajočih rastlinskih obrambnih spojin ali sredstev nudi priložnost za ustvarjanje transgenskih kulturnih rastlin, ki so sposobne producirati taka obrambna sredstva in pri tem zaščititi rastline proti napadu žuželk.
Transgenske rastline, ki so odporne za specifične škodljive žuželke, so proizvedli ob uporabi genov, ki kodirajo Bacillus thuringiensis (Bt) endotoksine ali rastlinske proteazne inhibitorje (PIs). Pokazalo se je, da so transgenske rastline, ki vsebujejo Bt endotoksinske gene, učinkovite za zatiranje nekaterih žuželk. Učinkovita rastlinska zaščita ob uporabi transgensko inseriranega Pl genetskega materiala še ni bila v
demonstrirana na polju. Čeprav lahko kultivarji, ki eksprimirajo Bt gene, trenutno kažejo odpornost na nekatere škodljive žuželke, utegne biti odpornost na osnovi ekspresije enega samega gena na koncu izgubljena zaradi evolucije Bt odpornosti pri žuželkah. Tako je potrebno poiskati dodatne gene, ki jih lahko inseriramo v rastline, da zagotovimo zaščito pred škodljivimi žuželkami.
Znanstveniki so identificirali nekatere specifične rastlinske komponente ali spojine, ki učinkujejo kot obrambna sredstva za zaščito rastline pred napadom škodljivih žuželk in patogenov. Čeprav so take komponente običajno prisotne pri le nizkih nivojih v različnih rastlinskih tkivih, so nekatere od njih tudi sposobne, da se inducirajo na višje nivoje po napadu škodljive žuželke ali patogena. Primeri takih obrambnih spojin so alkaloidi, terpeni in različni proteini, kot encimi, encimski inhibitorji in lektini.
Posebno zanimive so rastlinsko izvedene spojine, ki lahko blokirajo ali spremenijo normalno biomolekulamo aktivnost in tako inhibirajo rast žuželke ali uničijo žuželko.
Kompleks koruznega koreninskega črva (com rootworm CRW) v ZDA obstoji iz treh vrst, Diabrotica barberi Smith and Lawrence (Severni), D. undecimpunctata ho\vardi Barber (Južni) in D. virgifera virgifera LeConte (Zahodni). Zahodne in severne vrste prispevajo največ k gospodarski škodi na koruzi. Gospodarska škoda in stroški zatiranja so ocenjeni nad eno milijardo dolarjev letno. Kot je omenjeno zgoraj, so glavni problemi uporabe pesticida pri zatiranju CRW škode njegov negativni učinek na okolje in razvoj odpornosti žuželke. Rotacija kultur postaja manj učinkovita kot postopek CRW zatiranja zaradi podaljšanje diapavze pri severnem CRW in razvoja modificiranega obnašanja leganja jajčec pri zahodnem CRW. Generiranje transgenskih rastlin z odpornostjo na CRW bi lahko imelo velik gospodarski vpliv. Žal je razpoložljivih relativno malo genov, če sploh, ki lahko zatirajo CRW pri transgenskih rastlinah. Tako obstaja potreba po dodatnih insekticidnih učinkovinah, zlasti tistih, ki so aktivne proti CRW.
Povzetek izuma
Gre za sestavke in postopke za zatiranje žuželk in drugih škodljivcev. Sestavki obsegajo proteine s pesticidnimi aktivnostmi, ki jih lahko izoliramo iz rastlin rodu Pentaclethra. Očiščen protein kot tudi aminokislinska in DNA sekvenčna informacija je zagotovljena za proteine z aktivnostjo proti koreninskemu črvu. DNA sekvence, ki kodirajo pesticidne proteine, lahko uporabimo za transformiranje rastlin, bakterij, glivic, kvasovk in drugih organizmov za zatiranje škodljivcev.
Sestavke in postopke v smislu izuma lahko uporabimo v številnih sistemih za zatiranje rastlinskih in ne-rastlinskih škodljivcev.
Kratek opis risb
Sl. 1 zagotavlja aminokislinsko in nukleotidno sekvenco cDNA sekvence CRW učinkovine, pentina-1, iz Pentaclethra SEQ ID št.: 1 in 2.
Sl. 2 zagotavlja aminokislinsko in nukleotidno sekvenco cDNA sekvence pentina-1, optimirano za povečano ekspresijo SEQ ID št. :3 in 4.
Sl. 3 zagotavlja aminokislinsko sekvenco pentin-1 proteina, pri čemer podčrtan del predstavlja dozdevno signalno sekvenco. AFS ostanki, ki takoj sledijo signalni sekvenci, so prvi trije ostanki zrelega proteina. ASK ostanke, ki se začnejo pet ostankov od AFS starta zrelega proteina, označuje regija navideznega zrelega amino terminusa pentina-1, eksprimiranega kot proteina s polno dolžino in proteoliziranega v koreninah koruze.
Sl. 4 zagotavlja ekspresijsko kaseto za ekspresijo pentin-1 sekvenc.
Podroben opis izuma
Zagotavljamo sestavke in postopke za zatiranje škodljivcev, zlasti rastlinskih škodljivcev. Zlasti zagotavljamo nove pesticidne proteine. Proteine čistimo iz članov družine Leguminosae, zlasti leguminoznega rodu Pentaclethra, natančneje vrst P. macrophylla in P. macroloba.
V skladu z izumom lahko pesticidne proteine, ki jih proizvedejo člani rodu Pentaclethra, izoliramo po znanih postopkih. Postopki za proteinsko izolacijo so običajna kromatografija, vključno gelna filtracija, ionska izmenjava in imunoafmitetna kromatografija, z visoko zmogljivostno tekočinsko kromatografijo, kot je visoko zmogljivostna tekočinska kromatografija z reverzno fazo, ionsko izmenjevalna visoko zmogljivostna tekočinska kromatografija, visoko zmogljivostna tekočinska kromatografija z izključitvijo velikosti, visoko zmogljivostno kromatofokusiranje in hidrofobna interakcijska kromatografija itd., z elektroforetskim ločenjem, kot je enodimenzionalna gelna elektroforeza, dvodimenzionalna gelna elektroforeza, itd. Glej npr. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 in 2, Ausubel et al. (eds.), John Wiley & Sons, NY (1988), kar je tukaj vključeno kot referenca.
Ko očiščen protein izoliramo, lahko protein ali polipeptide, iz katerih je sestavljen, karakteriziramo in sekvenciramo s standardnimi znanimi postopki. Npr. očiščen protein ali polipeptide, ki ga sestavljajo, lahko fragmentiramo, kot z bromocianom, ali s proteazami, kot so papain, himotripsin, tripsin, lizil-C endopeptidaza itd. (Oike et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:9751-9758; Liu et al., (1983) Int. J. Pept. Protein Res. 21:209-215). Dobljene peptide ločimo, prednostno s HPLC, ali z ločenjem gelov in elektroprepivnanjem na PVDF membrane, in podvržemo amino kislinskemu sekvenciranju. Za izvedbo te naloge peptide prednostno analiziramo z avtomatiziranimi sekvenatorji. Znano je, da lahko določimo N-terminalne, C-terminalne ali interne amino kislinske sekvence. Iz amino kislinske sekvence očiščenega proteina lahko sintetiziramo nukleotidno sekvenco, ki jo lahko uporabimo kot sondo, da pripomore pri izolaciji gena, ki kodira pesticidni protein.
Na enak način lahko uporabimo protitelesa, vzgajana proti delno očiščenim ali očiščenim peptidom za določitev prostorske in časovne porazdelitve zadevnega proteina. Tako lahko določimo tkivo, v katerem je proteina največ v izobilju in je po možnosti bolj visoko eksprimiran, in konstruiramo ekspresijske knjižnice. Postopki za proizvodnjo protiteles so znani. Glej npr. Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988), in tam citirane reference. Glej tudi Radka et al. (1983) J. Immunol. 128:2804; in Radka et al. (1984) Immunogenetics 19:63. Taka protitelesa lahko uporabimo za izoliranje proteinov s podobnimi vezavnimi domenami in proteinov, testiranih glede aktivnosti proti zadevnim škodljivim žuželkam.
Znano je, da lahko za čiščenje proteinov s pesticidnimi lastnostmi uporabimo katerokoli kombinacijo postopkov. Ko je izolacijski protokol določen, lahko pesticidno aktivnost testiramo za vsako frakcijo materiala, dobljeno po vsaki stopnji čiščenja.
Rezultat takih protokolov čiščenja bo v bistvu očiščena proteinska frakcija. Z v bistvu očiščen ali v bistvu čist je mišljen protein, ki je v bistvu brez katerekoli spojine, ki je običajno povezana s proteinom v njegovem naravnem stanju. V bistvu čiste pripravke proteina lahko ocenimo z odsotnostjo drugih ugotovljivih proteinskih trakov po SDS-PAGE, kot je določeno vizualno ali z denzitrometrijskim skeniranjem.
Po drugi strani lahko odsotnost drugih amino-terminalnih sekvenc ali N-terminalnih ostankov v očiščenem pripravku označuje nivo čistote. Čistoto lahko preverimo z rekromatografijo čistih pripravkov, ki kažejo odsotnost drugih pikov z ionsko izmenjavo, reverzno fazo ali kapilarno elektroforezo. Izraza v bistvu čist ali v bistvu očiščen nista mišljena, da bi izključevala umetne ali sintetične zmesi proteinov z drugimi spojinami. Izrazi tudi niso mišljeni, da bi izključili prisotnost manjših nečistot, ki ne motijo biološke aktivnosti proteina in ki so lahko prisotne npr. zaradi nepopolnega čiščenja.
Iz fragmentov proteina lahko s PCR eksperimenti določimo celotno nukleotidno sekvenco, ki kodira protein. Podobno lahko fragmente, dobljene iz PCR eksperimentov, uporabimo za izoliranje cDNA sekvenc iz ekspresijskih knjižnic. Glej npr. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Vols. 1-3, Sambrook et al. (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), in tam citirane reference.
Na ta način lahko izoliramo proteine in nukleotidne sekvence, ki kodirajo take proteine, ki inhibirajo ali so toksični za posamezne vrste žuželk. Take proteine in nukleotidne sekvence v smislu izuma lahko uporabimo za zaščito rastlin pred škodljivci, vključno žuželkami, glivicami, bakterijami, nematodi, virusi ali viroidi ipd., zlasti pred škodljivimi žuželkami. Zlasti lahko dobimo proteine in nukleotidne sekvence, ki inhibirajo ali so toksične za žuželke reda Coleoptera.
Škodljive žuželke vključujejo žuželke, izbrane iz redov Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera itd., zlasti
Coleoptera. Škodljive žuželke v smislu izuma za glavne kulture so: koruza: Ostrinia nubilalis, Agro tis ipsilon; Helicoverpa zea; Spodoptera frugiperda; Diatraea grandiosella; Elasmopalpus lignosellus; Diatraea saccharalis; Diabrotica virgifera; Diabrotica barberi; Diabrotica undecimpunctata howardi, Melanotus spp., Cyclocephala borealis; Cyclocephala immaculata; Popillia japonica; Chaetocnema pulicaria; Sphenophorus maidis; Rhopalosiphum maidis; Anuraphis maidiradicis; Blissus leucopterus; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus sanguinipes; Delta platura; Agromyza paricornis; Anaphotrips obscrurus; Solenopsis milesta; Tetranychus urticae; Busseola fusca (AMB); Sesamia calamistis (APB); Eldana sacchharina (ASB); Chilo partellus (SSB); Ostrinia furnacalis (OCB); Sesamia nonagrioides; sorgum: Chilo partellus; Spodoptera frugiperda; Helicoverpa zea; Elasmopalpus lignosellus; Agrotis subterranea; Phyllophaga crinita; Eleodes, Conoderus in Aeolus spp. ; Oulema melanopus; Chaetocnema pulicaria; Sphenophorus maidis; Rhopalosiphum maidis; Sipha flava; Blissus leucopterus; Contarinia sorghicola; Tetranychus cinnabarinus; Tetranychus urticae; Schizaphis graminum; pšenica: Pseudaletia unipunctata; Spodoptera frugiperda; Elasmopalppus lignosellus, Agrotis orthogonia; Oulema melanopus; Hypera punctata; Diabrotica undecimpunctata owardi; ruska pšenična listna uš: Schizaphis graminum, Sitobion avenae; Melanoplus femurrubrum; Melonoplus differentialis; Melanoplus sanguinipes; Mayetiola destructor; Sitodiplosis moselana; Meromyza americana; Hylemya coarctata; Frankliniella fusca; Cephus cinctus; Eriophyes tulipae; sončnice: Suleima helianthana; Homeosoma ellectellu; Zygoramma exclamationis; Bothyrus gibbosus; Neolasioptera murtfeldtiana; Cochylis hospes; Rachiplusia nu; Smicronyx fulvus; Cylindrocopturus adspersus; tobak: Heliothis virescens; Helicoverpa zea; Spodoptera exigua; Pectinophora gossypiella; Anthonomus grandis; Aphis gossypii; Pseudatomoscelis seriatus; Trialeurodes abutilonea; Lygus lineolaris; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus diferentialis; Thrips tabaci; Franklinkiella fusca; Tetranychus cinnabarinus; Tetranychus urticarie; riž: Diatraea saccharalis; Spodoptera frugiperda; Helicoverpa zea; Colaspis brunnea; Lissorhoptrus oryzophilus; Sitophilus oryzae; Nephotettix nigropictus; Blissus leucopterus; Acrosternum hilare; soja: Pseudoplusia includens; Anticarsia gemmatalis; Plathypena scabra; Ostrinia nubilalis; Agrotis ipsilon; Spodoptera exigua; Heliothis virescens; Helicoverpa zea; Epilachna varivestis; Myzus persicae; Empoasca fabae; Acrosternum hilare; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus differentialis; Delia platura; Sericothrips variabilis; Thrips tabaci; Tetranychus turkestani; Tetranychus urticae; ječmen: Ostrinia nubilalis; Agrotis ipsilon; Schizaphis graminum; Blissus leucopterus; Acrosternum hilare; Euschistus servus; Delia platura; Mayetiola destructor; Petrobia Iatens; oljna repica: Brevicoryne brassicae; Phyllotreta spp.; vojaški črv Bertha; Mamestra configurata; diamantna vešča; Plutella xylosteila; lucerna: Autographa californica; Otiorhynchus ligusticii; Colias eurytheme; Agronyza frontella; Hypera brunneipeonis; Philaerius spumarius; Theriophis meculata; Hypera punctata; Acyrthosiphon pisum; Acyrthosiphor kondoi; Plathypena scabia; Sitona hispidulus; Branchophagus roddi; Lygus lineolaris; Chlorochroa sayi; Anticarsia friegiperda; Hypera postica; Spodoptera; Empoasca fabae; Psuedolusia includens; Spissistilus festinus; glej npr. Manya B. Stoetzel (1989) Common Names of Insects & Related Organisms, Entomological Society of America, ki je tukaj vključeno kot referenca.
Nukleotidne sekvence v smislu izuma lahko uporabimo za izolacijo drugih homolognih sekvenc pri drugih vrstah rastlin, zlasti pri drugih leguminoznih vrstah. V stroki so zlahka dostopni postopki za hibridizacijo sekvenc nukleinskih kislin. Kodirne sekvence iz drugih rastlin lahko izoliramo po znanih tehnikah na osnovi njihove sekvenčne homologije za kodirne sekvence v nadaljevanju. Pri teh tehnikah vse ali del znanih kodirnih sekvenc uporabimo kot sondo, ki se selektivno hibridizira na druge pesticidne kodirne sekvence, prisotne v populaciji kloniranih genomskih DNA fragmentov ali cDNA fragmentov (t.j. genomske ali cDNA knjižnice) iz izbranega organizma.
Npr. celotno pentin-1 sekvenco ali njene dele lahko uporabimo kot sonde, ki so sposobne, da se specifično hibridizirajo na ustrezne kodirne sekvence in informacijske RNA. Za doseganje specifične hibridizacije ob številnih pogojih take sonde vključujejo sekvence, ki so enkratne in imajo dolžino prednostno vsaj okoli 10 nukleotidov, najbolj prednostno dolžino vsaj okoli 20 nukleotidov. Take sonde lahko uporabimo za pomnoževanje pentin-1 kodirnih sekvenc iz izbranega organizma po znanem postopku polimerazne verižne reakcije (PCR). To tehniko lahko uporabimo za izoliranje dodatnih kodirnih sekvenc iz želenega organizma ali kot diagnostični test za določitev prisotnosti pentin-1 kodirnih sekvenc v organizmu.
Take tehnike vključujejo hibridizacij ski skrining zasajenih DNA knjižnic (bodisi plakov ali kolonij; glej npr. Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) in pomnoževanje s PCR ob uporabi oligonukleotidnih primerjev, ki ustrezajo sekvenčnim domenam, konzerviranim med amino kislinskimi sekvencami (glej npr. Innis et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, eds., Academic Press (1990)).
Npr. hibridizacijo takih sekvenc lahko izvedemo ob pogojih zmanjšane stringence, srednje stringence ali celo pri ostrih pogojih (npr. pogoji, ki jih predstavlja izpiralna stringenca 35-40% formamida s 5x Denhardtovo raztopino, 0,5% SDS in lx SSPE pri 37 °C; pogoji, ki jih predstavlja izpiralna stringenca 40-45% formamida s 5x Denhardtovo raztopino, 0,5% SDS in lx SSPE pri 42 °C; oz. pogoji, kijih predstavlja izpiralna stringenca 50% formamida s 5x Denhardtovo raztopino, 0,5% SDS in lx SSPE pri 42 °C), na DNA, ki kodira tukaj opisane insekticidne gene v standardnem hibridizacij skem testu. Glej J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2d Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory.
Izraz stringentni pogoji ali stringentni hibridizacij ski pogoji se nanaša na pogoje, ob katerih se bo sonda hibridizirala na svojo ciljno sekvenco do ugotovljivo večje stopnje kot na druge sekvence (npr. vsaj 2-kratno glede na ozadje). Stringentni pogoji so odvisni od sekvence in so različni v različnih okoliščinah. S kontroliranjem stringence hibridizacijskih in/ali spiralnih pogojev lahko identificiramo ciljne sekvence, ki so 100% komplementarne sondi (homologno sondiranje). Po drugi strani lahko stringentne pogoje naravnamo tako, da dopustijo nekaj neujemanja pri sekvencah, tako da ugotovimo nižje stopnje podobnosti (heterologno sondiranje). Na splošno je sonda dolžine manj kot okoli 1000 nukleotidov, prednostno manj kot okoli 500 nukleotidov, tipično od okoli 50 do okoli 300 nukleotidov.
Tipično bodo stringentni pogoji tisti, pri katerih je koncentracija soli manj kot okoli 1,5 M koncentracije Na ionov, tipično okoli 0,01 do 1,0 M koncentracije Na ionov (ali drugih soli) pri pH 7,0 do 8,3 in je temperatura vsaj okoli 30 za kratke sonde (npr. 10 do 50 nukleotidov) in vsaj okoli 60 °C za dolge sonde (npr. večje kot 50 nukleotidov). Stringentne pogoje lahko tudi dosežemo z dodatkom destabilizimih sredstev, kot formamida. Npr. nizki stringentni pogoji so hibridizacija s pufrsko raztopino 30 do 35% formamida, 1 M NaCl, 1% SDS (natrijev dodecil sulfat) pri 37 °C in izpiranje v IX do 2X SSC (20Χ SSC= 3,0 M NaCl/0,3 M natrijev citrat) pri 50 °C do 55 °C. Npr. zmerni stringentni pogoji vključujejo hibridizacijo v 40 do 45% formamidu, 1 M NaCl, 1% SDS pri 37 °C in izpiranje v 0,5X do IX SSC pri 55 °C do 60 °C. Npr. visoki stringentni pogoji vključujejo hibridizacijo v 50% formamidu, 1 M NaCl, 1% SDS pri 37 °C in izpiranje v 0,lX SSC pri 60 °C do 65 °C.
Specifičnost je tipična funkcija post-hibridizacijskih izpiranj, pri Čemer so kritični faktorji ionska jakost in temperatura končne izpiralne raztopine. Za DNA-DNA hibride lahko aproksimiramo Tm iz enačbe Meinkotha in Wahla, Anal. Biochem. 138:267-284 (1984): Tm = 81,5C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; kjer je M molamost enovalentnih kationov, %GC je odstotek gvanozinskih in citozinskih nukleotidov v DNA, % form je odstotek formamida v gvanozinskih in citozinskih nukleotidih v DNA, % form je odstotek formamida v hibridizacij ski raztopini, L pa je dolžina hibrida v baznih parih. Tm je temperatura (pri definirani ionski jakosti in pH), pri kateri se 50% komplementarne ciljne sekvence hibridizira na perfektno se ujemajočo sondo. Tm se zmanjša za okoli 1 °C za vsak 1% neujemanja; tako lahko Tm, hihridizacijske in/ali izpiralne pogoje lahko naravnamo za hibridizacijo na sekvence želene identitete. Npr. Če iščemo sekvence z >90% identiteto, se lahko Tm zmanjša za 10 °C. Na splošno izberemo stringentne pogoje tako, da so okoli 5 “C nižji kot termično tališče (Tm) za specifično sekvenco in njen komplement pri definirani ionski jakosti in pH. Vendar pa lahko resno stringentni pogoji izrabijo hibridizacijo in/ali izpiranje pri 1, 2, 3 ali 4 °C nižje, kot termično tališče (Tm); zmerno stringentni pogoji lahko izrabijo hibridizacijo in/ali izpiranje pri 6, 7, 8 ali 9 ali 10 °C nižje, kot je termično tališče (Tm); nizki stringentni pogoji lahko izrabijo hibridizacijo in/ali izpiranje pri 11, 12, 13, 14, 15 ali 20 °C nižje, kot je termično tališče (Tm). Ob uporabi enačbe, hibridizacije in izpiralnih sestavkov ter želene Tm bodo strokovnjaki razumeli, da so variacije v stringenci hibridizacije in/ali izpiralnih raztopin inherentno opisani. Če je posledica želene stopnje neujemanja Tm manj kot 45 °C (vodna raztopina) ali 32 °C (fonnamidna raztopina), je prednostno, da povečamo SSC koncentracijo, tako da lahko uporabimo višjo temperaturo. Obširen vodič za hibridizacijo nukleinskih kislin najdemo v Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, pogl. 2 Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, Elsevier, New York (1993); in Current Protocols in Molecular Biology, pogl. 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).
Na splošno bodo sekvence, ki kodirajo za pentin-1 in druge insekticidne proteine v smislu izuma in se hibridizirajo na gen, ki je tukaj opisan, vsaj okoli 50% homologne, okoli 70% homologne, do okoli 85% homologne ali celo do okoli 90% do okoli 95% homologne z opisano sekvenco. T.j. sekvenčna podobnost sekvenc lahko variira, pri čemer si deli vsaj okoli 50%, okoli 70%, in okoli 85% do okoli 90% do 95% sekvenČne podobnosti.
Naslednje izraze uporabimo za opis sekvenčnih razmerij med dvema ali več nukleinskimi kislinami ali polinukleotidi: (a) referenčna sekvenca, (b) primerjalno okno, (c) sekvenčna identiteta, (d) odstotek sekvenČne identitete in (e) bistvena identiteta.
(a) Kot se tukaj uporablja, je referenčna sekvenca definirana sekvenca, uporabljena kot osnova za sekvenčno primerjavo. Referenčna sekvenca je lahko pod-serija ali celota specificirane sekvence; npr. kot segment popolne cDNA ali genske sekvence ali kompletna cDNA ali genska sekvenca.
(b) Kot se tukaj uporablja, pomeni primerjalno okno sklicevanje na soseden in specificiran segment polinukleotidne sekvence, kjer lahko polinukleotidno sekvenco primerjamo z referenčno sekvenco in kjer lahko del polinukleotidne sekvence v primerjalnem oknu obsega adicije ali delecije (tj. vrzeli) v primerjavi z referenčno sekvenco (ki ne vsebuje adicij ali delecij) za optimalno ujemanje obeh sekvenc. Na splošno je primerjalno okno dolžine vsaj 20 sosednjih nukleotidov in je lahko po želji 30, 40, 50, 100 ali daljše. Strokovnjaki razumejo, da tipično uvedemo vrzelni penale in ga odštejemo od števila ujemanj, da se izognemo visoki podobnosti z referenčno sekvenco zaradi inkluzijskih vrzeli v polinukleotidni sekvenci.
Metode ujemanja sekvenc za primerjavo so znane v stroki. Optimalno ujemanje sekvenc za primerjavo lahko izvedemo z lokalnim homologijskim algoritmom Smitha in Watermana, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); s homologijskim ujemalnim algoritmom Needlemana in Wunscha, J. Mol. Biol. 48:443 (1970); z metodo iskanja podobnosti Pearsona in Lipmana, Proč. Natl. Acad. Sci. 85:2444 (1988); s kompjuteriziranimi izvedbami teh algoritmov, ki vključujejo, niso pa omejem nanje: CLUSTAL v PC/Gene programu, Intelligenetics, Mountain View, Califomia, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA in TFASTA v Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Groups (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, ZDA; CLUSTAL program je dobro opisan v Higgins in Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgins in Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8:155-65 (1992), in Pearson, et al., Methods in Molecular Biology 24:307-331 (1994). BLAST družina programov, ki jo lahko uporabimo za iskanje podobnosti v bazah podatkov, vključuje: BLASTN za nukleotidne iskane sekvence proti nukleotidnim sekvencam; BLASTX za nukleotidne iskane sekvence proti proteinskim sekvencam iz baz podatkov; BLASTP za proteinske iskane sekvence proti proteinskim sekvencam iz baz podatkov; TBLASTN za proteinske iskane sekvence proti nukleotidnim sekvencam iz baz podatkov; in TBLASTX za nukleotidne iskane sekvence proti nukleotidnim sekvencam iz baz podatkov. Glej Current Protocols in Molecular Biology, pogl. 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).
Kot bodo razumeli povprečni strokovnjaki na tem področju, BLAST poizvedbe predpostavljajo, da so lahko proteini modelirani kot naključne sekvence. Vendar mnogi resnični proteini obsegajo regije nenaključnih sekvenc, ki so lahko homopolimemi trakti, kratkotrajna ponavljanja ali regije, obogatene z eno ali več amino kislinami. Take regije z nizko kompleksnostjo lahko uvrstimo med nesorodne proteine, celo če so druge regije proteina popolnoma nepodobne. Lahko uporabimo številne nizko kompleksne filtrske programe, da zmanjšamo take nizko kompleksnostne uvrstitve. Npr. uporabimo lahko SEG (Wooten and Federhen, Comput. Chem. 17:149-163 (1993) in XNU (Claverie and States, Comput. Chem., 17:191-201 (1993)) nizko kompleksnostne filtre same ali v kombinaciji.
(c) Kot se tukaj uporablja, vključuje sekvenčna identiteta ali identiteta v zvezi z dvema nukleinskima kislinama ali polipeptidnima sekvencama sklicevanje na ostanke na obeh sekvencah, ki so enaki, kadar se ujemajo za maksimalno ustrezanje v primerjavi s specificiranim primerjalnim oknom. Kadar odstotek sekvenčne identitete uporabimo glede na proteine, je znano, da se položaji ostankov, ki niso identični, često razlikujejo po konservativnih amino kislinskih substitucijah, kjer amino kislinski ostanki nadomeščajo druge amino kislinske ostanke s podobnimi kemičnimi lastnostmi (npr. naboj ali hidrofobnost) in zato ne spremenijo funkcionalnih lastnosti molekule. Kjer se sekvence razlikujejo v konservativnih substitucijah, lahko odstotno sekvenčno identiteto naravnamo navzgor, da korigiramo konservativno naravo substitucije. Za sekvence, ki se razlikujejo po takih konservativnih substitucijah, je rečeno, da imajo sekvenčno podobnost ali podobnost. Sredstva za izvedbo te naravnave so znana strokovnjakom. Tipično to vključuje ocenjevanje konservativne substitucije kot delno neujemanje, ne pa popolno neujemanje, pri čemer se poveča odstotna sekvenčna identiteta. Tako npr., kadar se da identični amino kislini oceno 1 in nekonservativni substituciji oceno 0, dobi konservativna substitucija oceno med 0 in 1. Ocenjevanje konservativnih substitucij izračunamo npr. po algoritmu Meyersa in Millerja, Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17 (1988), npr. kot je izvedeno v programu PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornija, ZDA).
(d) Kot se tukaj uporablja, pomeni odstotek sekvenčne identitete vrednost, določeno s primerjavo dveh optimalno ujemajočih se sekvenc v primerjavi s primerjalnim oknom, kjer del polinukleotidne sekvence v primerjalnem oknu lahko obsega adicije ali delecije (npr. vrzeli) v primerjavi z referenčno sekvenco (ki ne obsega adicij ali delecij) za optimalno ujemanje uvrstitev obeh sekvenc. Odstotek izračunamo z določitvijo števila leg, pri katerih se pojavi identična nukleinska kislinska baza ali amino kislinski ostanek v obeh sekvencah, da dobimo število ujemalnih leg, z deljenjem števila ujemalnih leg s celotnim številom leg v primerjalnem oknu in z množenjem rezultata s 100, da dobimo odstotek sekvenčne identitete.
(e) (i) Izraz bistvena identiteta polinukleotidnih sekvenc pomeni, da polinukleotid obsega sekvenco, ki ima vsaj 70% sekvenčne identitete, prednostno vsaj 80%, bolj prednostno vsaj 90% in najbolj prednostno vsaj 95%, v primerjavi z referenčno sekvenco, pri čemer uporabimo enega od opisanih ujemalnih programov ob uporabi standardnih parametrov. Strokovnjak bo vedel, da lahko te vrednosti primemo naravnamo, da določimo ustrezno identiteto proteinov, kodiranih z dvema nukleotidnima sekvencama ob upoštevanju kodonske degeneracije, amino kislinske podobnosti, pozicioniranja bralnega okvira ipd. Bistvena identiteta amino kislinskih sekvenc za te namene običajno pomeni sekvenčno identiteto vsaj 60%, bolj prednostno vsaj 70%, 80%, 90% in najbolj prednostno vsaj 95%.
Druga indikacija, da so nukleotidne sekvence bistveno identične, je, če se dve molekuli hibridizirata druga na drugo ob stringentnih pogojih. Vendar pa sta nukleinski kislini, ki se ne hibridizirata druga na drugo ob stringentnih pogojih, še vedno bistveno identični, če so polipeptidi, kijih kodirajo, bistveno identični. To se lahko pojavi npr., kadar ustvarimo kopijo nukleinske kisline ob uporabi maksimalne kodonske degeneracije, ki jo dopušča genetski kod. Druga indikacija, da sta dve nukleinski kislinski sekvenci bistveno identični, je, daje polipeptid, ki ga kodira prva nukleinska kislina, imunološko križno reaktiven s polipeptidom, ki ga kodira druga nukleinska kislina.
(e) (ii) Izraz bistvena identiteta v zvezi s peptidom kaže na to, da peptid obsega sekvenco z vsaj 70% sekvenčne identitete glede na referenčno sekvenco, prednostno 80%, bolj prednostno 85%, najbolj prednostno vsaj 90% ali 95% sekvenčne identitete glede na referenčno sekvenco v primerjavi s specificiranim primerjalnim oknom. Prednostno izvedemo optimalno ujemanje ob uporabi homolognega ujemalnega algoritma Needleman-a in Wunscha, J. Mol. Biol. 48:443 (1970). Indikacija, da sta dve peptidni sekvenci bistveno identični, je, da je en peptid imunološko reaktiven s protitelesi, vzgajanimi proti drugemu peptidu. Tako je peptid bistveno identičen drugemu peptidu npr., kadar se oba peptida razlikujeta le po konservativni substituciji. Peptidi, ki so bistveno podobni, si delijo sekvence, kot je omenjeno zgoraj, razen da se položaji ostankov, ki niso identični, lahko razlikujejo po konservativnih amino kislinskih spremembah.
Znano je, da so lahko pesticidni proteini oligomemi in bodo variirali v molekulski masi, številu promotorjev, komponentnih peptidih, aktivnosti proti posameznim škodljivcem in v drugih značilnostih. Vendar pa po tukaj opisanih postopkih lahko izoliramo in karakteriziramo proteine, aktivne proti številnim škodljivcem. Posebno zanimivi so proteini, ki so aktivni proti CRW. Tako očiščene ali delno očiščene proteine v smislu izuma testiramo na insekticidno aktivnost proti CRW, vključno Diabrotica barberi (severni), D. undecimpunctata howardi (južni), in D- virgifera vergifera (zahodni). Na ta način smo izolirali en protein, označen pentin-1, ki ima insekticidno aktivnost za CRW. Pentin-1 je glikoziliran protein s približno 45 do okoli 50 kDal. Amino kislinska in nukleotidna sekvenca pentin-1 proteina je podana na sl. 1 in SEQ ID NOS: 1 in 2.
Zdi se, da je najvišja koncentracija pentin-1 v rastlini v zrelih semenih. Protein je toplotno stabilen in ima LC50 približno 10 pg/ml diete proti CRW.
Pentin-1 in druge proteine v smislu izuma lahko spremenimo na različne načine, ki vključujejo amino kislinske substitucije, delecije, trunkacije in insercije. Metode za take manipulacije so v stroki na splošno znane. Npr. amino kislinske sekvenčne variante pesticidnih proteinov lahko pripravimo z mutacijami v DNA. Metode za mutagenezo in nukleotidne sekvenčne spremembe so v stroki znane. Glej npr. Kunkel,
T. (1985) Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; US. patent št. 4,873,192; Walker and Gaastra (eds.) Techniques in Molecular Biology, MacMillan Publishing Company, NY (1983) in tam citirane reference. Tako geni in nukleotidne oblike v smislu izuma vključujejo tako naravno nastopajoče sekvence kot tudi mutantne oblike. Podobno zajemajo proteini v smislu izuma tako naravno nastopajoče proteine kot tudi njihove variacije in modificirane oblike.
Take variante bodo Še naprej imele želeno pesticidno aktivnost. Očitno mutacije, ki bodo narejene v DNA, ki kodira varianto, ne smejo spraviti sekvence izven bralnega okvira in prednostno ne bodo ustvarile komplementarnih regij, ki bi lahko proizvedle sekundarno mRNA strukturo. Glej objavljeno EP patentno prijavo št. 75,444.
Na ta način predloženi izum zajema pesticidne proteine kot tudi njihove komponente in fragmente. T.j. znano je, da lahko proizvedemo komponentne promotorje, polipeptide ali fragmente proteinov, ki zadržijo pesticidno aktivnost. Ti fragmenti vključujejo trunkirane sekvence kot tudi N-terminalne, C-terminalne, notranje in notranje deletirane amino kislinske sekvence proteinov.
Za večino delecij, insercij in substitucij proteinske sekvence se ne pričakuje, da bi proizvedle radikalne spremembe pri karakteristikah proteina. Vendar pa, kadar je težko napovedati eksakten učinek substitucije, delecije ali insercije že vnaprej, bo strokovnjak upošteval, da bo učinek ocenjen z rutinskimi skrinimimi testi. T.j. aktivnost lahko ocenimo s testom toksičnosti za žuželke.
Nukleotidne sekvence lahko uporabimo pri protokolih DNA prelaganja (shuffling). DNA prelaganje je postopek za rekurzivno rekombinacijo in mutacijo, izveden z naključno fragmentacijo fonda sorodnih genov, čemur sledi ponovno sestavljanje fragmentov s PCR brez primerja. Glej npr. Stemmer, W.P.C. (1994) Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA 91:10747-10751; Stemmer, W.P.C. (1994) Nature 370:389-391; Zhang et al. (1997) Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA 94:4504-4509; in PCT objavo št. 96/19256. Prednost DNA prelaganja racionalnega vzorca je, da lahko prelaganje optimira funkcijo genov, ne da bi najprej določili, kateri genski produkt omejuje hitrost. Predloženi izum zagotavlja postopke za sekvencirano prelaganje ob uporabi polipeptidov v smislu izuma in sestavke, ki so posledica le-tega.
Na splošno sekvencirano prelaganje zagotavlja sredstvo za generiranje knjižnic polinukleotidov z želeno karakteristiko, ki jo lahko izberemo ali za katero jo lahko skriniramo. Knjižnice rekombinantnih polipeptidov generiramo iz populacije sorodnih sekvenčnih polipeptidov, ki obsegajo sekvencirane regije, ki imajo bistveno sekvenčno identiteto in jih lahko homologno rekombiniramo in vitro ali in vivo.
Populacija sekvenciranih-rekombinantnih polinukleotidov obsega sub-populacijo polinukleotidov, ki imajo želene ali prednostne karakteristike in jih lahko izberemo s primemo metodo selekcije ali skrininga. Karakteristike so lahko katerakoli lastnost ali karakteristika, ki je sposobna, da se jo da izbrati ali detektirati v skrinimem sistemu, in lahko vključuje lastnosti: kodiranega proteina, transkripcij skega elementa, sekvenčne kontrolime transkripcije, RNA pretvarjanja, RNA stabilnosti, kromatinske konfirmacije, translacije ali druge ekspresijske lastnosti gena ali transgena, replikativnega elementa, elementa, ki veže protein, ipd., kot katerakoli značilnost, ki daje izberljivo ali ugotovljivo lastnost. Pri nekaterih izvedbah bo izbrana karakteristika povečan Km in/ali Kcat v primerjavi z divjetipskim proteinom, kot se tukaj zagotavlja. Pri drugih izvedbah bo imel protein ali polinukleotid, generiran iz sekvenciranega prelaganja, afiniteto za vezavo liganda večjo kot neprelagan divjetipski polinukleotid. Povečanje pri takih lastnostih je lahko vsaj 110%, 120%, 130%, 140% ali vsaj 150% divjetipske vrednosti,
Pentin-1 je član širše genske družine esteraz, natančneje lipidnih acilnih hidrolaz, kot je določeno s sekvenčno podobnostjo. Gensko prelaganje je metoda, ki lahko izboljša ali spremeni biološko aktivnost danega genskega produkta. Gensko prelaganje lahko v zvezi s selekcijsko strategijo uporabimo za izboljšanje lastnosti, kot je specifičnost substrata, topnost, temperatura in pH optimumi proteina ali encima, z usmerjeno molekularno evolucijo. V primeru pentina-1 je toksičnost za žuželke, kot je določena z letalnimi koncentracijami, najbolj relevanten parameter.
Gensko prelaganje lahko apliciramo na en sam gen, ki uvede mutacije v tem genu pri podani pogostnosti. Kombinacije sinergističnih mutacij lahko nato izberemo s sledečimi generiranji genskega prelaganja iz primarne mutantne populacije. Ta pristop lahko apliciramo na pentin-1.
Po drugi strani lahko različne člane genskih družin, ki so že kodirani z divergentnimi, vendar sorodnimi sekvencami, uporabimo za gensko prelaganje. Ti lahko vključujejo, vendar niso omejeni na pentin-1 iz Pentaclethra in eksprimiranega sekvenčnega markerja iz koruze, identificiranega kot 5C9, ki kodira cDNA, ki je okoli 57% identičen pentinu-1 pri nukleotidnem nivoju. Glej patentno prijavo 08/449,986, vloženo 25. maja 1995, kije istočasno v postopku in je tukaj vključena kot referenca. Hkrati bodo z genskim prelaganjem uvedene tudi mutacije, ki nadalje prispevajo h genetski raznolikosti. Potem lahko sinergistične kombinacije zlitij med člani genske družine in na novo uvedenimi mutacijami izberemo z usmerjenimi molekularnimi evolucijskimi strategijami.
Lipidne acilne hidrolaze obsegajo raznoliko multigensko družino, ki je konservirana v mnogih rastlinskih vrstah. Encimi imajo hidrolizimo aktivnost za mnoge gliko- in fosfolipide. Substrati so monogalaktozildiacilglicerol, acilsterilgukozid, fosfatidilholin, lizofosfatidilholin, fosfatidiletanolamin, lizofosfatidiletanolamin, fosfatidilinozitol kot tudi mnogi drugi lipidni substrati. Podobno lahko membranske sestave različnih žuželk kot tudi rastlin variirajo od vrste do vrste in nanje lahko vplivamo s prehrano ali pogoji rasti. Torej bi lahko aktivnost dane lipidne acilne hidrolaze za dani substrat vplivala tako na specifičnost kot tudi na učinkovitost. Spremenjena substratna specifičnost bi lahko bila en parameter za izbiro produktov genskega prelaganja.
Topnost in proteinsko stabilnost bi lahko tudi izbrali iz prelaganih genskih produktov. Insekticidni proteini so aktivni v ostrem okolju črevesnega lumna žuželk. Njihove proteine digerirajo proteaze in nanje vplivajo reducimi ali oksidimi pogoji, ki variirajo glede na testirano vrsto žuželk. Topnost in stabilnost lipidnih acilnih hidrolaz tako v transgenski rastlini kot tudi v črevesnem lumnu žuželk bi lahko vplivali na biološko aktivnost in bi se lahko spremenili s strategijami genskega prelaganja.
Pogoji za encimsko reakcijo, kot pH in temperaturni optimumi, lahko tudi vplivajo na insekticidno aktivnost pentina-1. Črevesni pH od CRW je 5,5-6,0. Izbira prelaganih pentin-1 genskih produktov za encimatsko aktivnost proti lipidnim substratom v tem območju pH je drugi parameter, ki bi lahko vplival na toksičnost.
Tako lahko pentinsko sekvenco v smislu predloženega izuma uporabimo pri poskusih genskega prelaganja z drugimi lipidnimi hidrolazami, kot so patatini, zlasti s 5C9.
Proteine ali druge komponentne polipeptide, ki so tukaj opisani, lahko uporabimo same ali v kombinaciji z drugimi proteini ali sredstvi za zatiranje različnih škodljivih žuželk. Drugi insekticidni proteini so tisti od Bacillus, vključno δ-endotoksini in vegetativni insekticidni proteini, kot tudi proteazni inhibitorji (tako serinskega kot tudi cisteinskega tipa), lektini, a-amilaze, peroksidaze, holesterol oksidaza ipd.
Pri eni izvedbi ekspresijo proteinov v smislu izuma v transgenski rastlini spremlja ekspresija enega ali več Bacillus thuringiensis (Bt) δ-endotoksinov. To ko-ekspresijo več kot ene insekticidne učinkovine v isti transgenski rastlini lahko dosežemo z genetskim inženiringom rastline, da vsebuje in eksprimira vse potrebne gene. Po drugi strani lahko rastlino, starš 1, genetsko konstruiramo za ekspresijo proteinov v smislu izuma. Drugo rastlino, starš 2, lahko genetsko konstruiramo za ekspresijo drugih učinkovin, kot (Bt) δ-endotoksina. S križanjem starša 1 s staršem 2 lahko dobimo rastline potomce, ki eksprimirajo vse gene, ki so prisotni pri obeh starših 1 in 2.
Predloženi izum zajema tudi nukleotidne sekvence iz organizmov, različnih od Pentaclethra, kjer proteini križno reagirajo s protitelesi, vzgojenimi proti proteinom v smislu izuma, ali kjer se dajo nukleotidne sekvence izolirati s hibridizacijo z nukleotidnimi sekvencami v smislu izuma. Izolirane proteine ali tiste, ki jih kodirajo take nukleotidne sekvence, lahko testiramo na pesticidno aktivnost. Izolirane proteine lahko testiramo na pesticidno aktivnost s tukaj opisanimi metodami ali drugimi znanimi metodami.
Pri drugi izvedbi lahko proteine v smislu izuma uporabimo v kombinaciji s prevlekami semen, dostopnimi v stanju tehnike. Na ta način preslojimo transformirana semena z aplikacijami dostopnih insekticidnih sprejev ali praškov. Taki insekticidi so znani v stanju tehnike. Glej npr. US. patente št. 5,696,144; 5,695,763; 5,420,318; 5,405,612; 4,596,206; 4,356,934; 4,886,541; itd., ki so tukaj vključeni kot referenca.
Po tem, ko smo izolirali nukleotidne sekvence, ki kodirajo pesticidne proteine v smislu izuma, jih lahko manipuliramo in uporabimo za ekspresijo proteina v številnih gostiteljih, vključno drugih organizmih, vključno mikroorganizmih in rastlinah.
Proteine v smislu izuma lahko uporabimo za zaščito poljedelskih pridelkov in produktov pred škodljivci z uvedbo preko primernega vektorja v mikrobnega gostitelja in tega gostitelja apliciramo na okolje ali rastline. Izberemo lahko mikroorganizme gostitelja, ki so znani, da zasedajo fitosfero (filo-ploskev, filo-sfera, rizo-sfera in/ali rizo-ploskev) enega ali več zadevnih pridelkov. Te mikroorganizme izberemo tako, da so sposobni uspešnega tekmovanja v posameznem okolju z divjetipskimi mikroorganizmi, da zagotovijo stabilno vzdrževanje in ekspresijo gena, ki eksprimira polipeptidni pesticid, in zaželeno zagotovijo izboljšano zaščito pesticida pred razpadom in deaktivacijo zaradi okolja.
Proteine v smislu izuma lahko uporabimo v ekspresijskih kasetah za ekspresijo v kateremkoli gostitelju, ki je zanimiv. Take ekspresijske kasete bodo obsegale transkripcij sko iniciacijsko regijo, vezano na gen, ki kodira pesticidni gen, ki je zanimiv. Taka ekspresijska kaseta je opremljena z več restrikcijskimi mesti za insercijo gena, kije zanimiv, daje pod transkripcijsko regulacijo regulatomih regij. Ekspresijska kaseta lahko dodatno vsebuje izberljive markerske gene, primerne za posamezen organizem gostitelj.
Transkripcij ska iniciacijska regija, promotor, je lahko nativna ali analogna ali tuja ali heterologna gostitelju. Dodatno je lahko promotor naravna sekvenca ali alternativno sintetska sekvenca. S tujo je mišljeno, da transkripcijske iniciacijske regije ne ugotovimo v divjetipskem gostitelju, v katerega uvedemo transkripcijsko iniciacijsko regijo. Kot se tukaj uporablja, obsega himemi gen kodirno sekvenco, ki je operabilno vezana na transkripcijsko iniciacijsko regijo, ki je heterologna kodirni sekvenci.
v
Čeprav lahko uporabimo katerikoli promotor ali promotorski element, ki je sposoben voditi ekspresijo kodirne sekvence, so za ekspresijo v rastlinah posebno zanimivi koreninski promotorji (Bevan et al. (1993) v Gene Conservation and Exploitation. Proceedings of The 20th Stadler Genetics Symposium, Gustafson et al. (eds.), Plenum Press, Nev/ York, str. 109-129; Brears et al. (1991) Plant J. 1:235-244; Lorenz et al. (1993) Plant J. 4:545-554; US. patenti št. 5,459,252; 5,608,149; 5,599,670); strženski (US. patenti št. 5,466,785; 5,451,514; 5,391,725); ali drugi tkivno specifični in konstitutivni promotorji (glej npr. US. patente št. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142), ki so tukaj vključeni kot referenca.
Transkripcijska kaseta bo vključevala v 5-3' smeri transkripcije transkripcijsko in translacijsko iniciacijsko regijo, DNA sekvenco, ki je zanimiva, in transkripcijsko in translacijsko terminacijsko regijo, funkcionalno v rastlinah. Terminacijska regija je lahko nativna s transkripcijsko iniciacijsko regijo, je lahko nativna z DNA sekvenco, ki je zanimiva, ali je lahko izvedena iz drugega vira. Primerne terminacijske regije so dostopne iz Ti-plazmida od A. tumefaciens, kot oktopin sintazne in nopalin sintazne terminacijske regije. Glej tudi Guerineau et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Celi 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Celi 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
Nukleotidne sekvence, ki kodirajo proteine ali polipeptide v smislu izuma, so zlasti uporabne pri genetski manipulaciji rastlin. Na ta način zagotovimo gene v smislu izuma v ekspresij skih kasetah za ekspresijo v rastlini, ki je zanimiva. Kaseta bo vključevala 5' in 3' regulatome sekvence, operabilno vezane na gen, ki je zanimiv. Kaseta lahko dodatno vsebuje vsaj en dodaten gen, da ga ko-transformiramo ali vežemo in transformiramo v organizem. Po drugi strani lahko zagotovimo gen(e), ki je zanimiv, na drugi ekspresijski kaseti. Kadar je primemo, lahko gen(e) optimiramo za povečano ekspresijo v transformirani rastlini. T.j. gene lahko sintetiziramo ob uporabi rastlinsko prednostnih kodonov za izboljšano ekspresijo. Dostopne so metode v stroki za sintezo rastlinsko prednostnih genov. Glej npr. US patenta št. 5,380,831, 5,436,391 in Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, tukaj vključeno kot referenca.
Odvisno od tega, kje je treba eksprimirati DNA sekvenco, ki je zanimiva, je lahko zaželeno, da sintetiziramo sekvenco z rastlinsko prednostnimi kodoni ali alternativno s kloroplastno prednostnimi kodoni. Rastlinsko prednostne kodone lahko določimo iz kodonov z največjo pogostnostjo v proteinih, eksprimiranih v največji količini v posamezni rastlinski vrsti, ki je zanimiva. Glej EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA 88:3324-3328; in Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research 17:477-498. Na ta način lahko nukleotidne sekvence optimiramo za ekspresijo v vsaki rastlini. Znano je, da so lahko vsi ali katerikoli del genske sekvence optimiran ali sintetski. T.j. lahko uporabimo tudi sintetske ali delno optimirane sekvence.
Znano je, da dodatne sekvenčne modifikacije povečajo gensko ekspresijo v celičnem gostitelju. Te vključujejo eliminacijo sekvenc, ki kodirajo neprave poliadenilacijske signale, signale ekson-intron spajalnega mesta, transpozonsko podobna ponavljanja in druge tako dobro okarakterizirane sekvence, ki so lahko škodljive za gensko ekspresijo. G-C vsebnost sekvence lahko naravnamo na nivoje, ki so povprečni za danega celičnega gostitelja, kot je izračunano glede na znane gene, eksprimirane v celici gostiteljici. Kadar je mogoče, lahko sekvenco modificiramo, da se izognemo napovedanim lasničnim (hairpin) sekundarnim mRNA strukturam.
Ekspresijske kasete lahko dodatno vsebujejo 5' voditeljske sekvence v ekspresijskem kasetnem konstruktu. Take voditeljske sekvence lahko učinkujejo tako, da povečajo translacijo. Translacijski voditelji so znani v stroki in so: pikomavirusni voditelji, npr. EMCV voditelj (encefalomiokarditis 5' nekodima regija) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T.R., and Moss, B. (1989) PNAS USA, 86:6126-6130); potivirusni voditelji, npr. TE V voditelj (virus razjede tobaka) (Allison et al. (1986)); MDMV voditelj (pritilikavi virus mozaika koruze) Virology, 154:9-20); in humani imunoglobulinski težko-verižni vezavni protein (BiP), (Macejak, D.G., and Samow, P. (1991) Nature, 353:90-4; neprevajan voditelj od pokrivne proteinske mRNA od virusa mozaika lucerne (AMV RNA 4), (Jobling, S.A., and Gehrke, L., (1987) Nature, 325:622-625); voditelj virusa mozaika tobaka (TMV), (Gallie, D.R. et al. (1989) Molecular Biology of RNA, str. 237-256); in voditelj virusa kloroznih lis koruze (MCMV) (Lommel, S.A. et al. (1991) Virology, 81:382-385). Glej tudi Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology, 84:965968. Lahko uporabimo tudi druge metode, ki so znane za povečanje translacije, npr. introne, ipd.
Gene v smislu predloženega izuma lahko ciljamo na kloroplast ali amiloplast za ekspresijo. Na ta način, kadar gena, ki je zanimiv, ne vključimo direktno v kloroplast ali aminoplast, bo ekspresij ska kaseta dodatno vsebovala gen, ki kodira tranzitni peptid, za usmerjanje gena, ki je zanimiv, na kloroplaste. Taki tranzitni peptidi so znani v stroki. Glej npr. Von Heijne et al. (1991) Plant Mol, Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res Commun. 196:14141421; in Shah et al. (1986) Science 233:478-481.
Konstrukt lahko tudi vključuje katerekoli druge potrebne regulatorje, kot jedrske lokalizacijske signale (Kalderon et al. (1984) Celi 39:499-509; in Lassner et al. (1991) Plant Molecular Biology 17:229-234); rastlinske translacijske konsenzusne sekvence (Joshi, C.P. (1987) Nucleic Acids Research 15:6643-6653), introne (Luehrsen and Walbot (1991) Mol. Gen. Genet. 225:81-93) ipd., operabilno vezane na nukleotidno sekvenco, ki je zanimiva.
Znano je, da lahko protein eksprimiramo, pri čemer obsega nativno signalno sekvenco. Glej sl. 3. Po drugi strani lahko uporabimo druge signalne sekvence v stroki, npr. ječmenovo alfa amilazno signalno sekvenco.
Pri pripravi ekspresijske kasete lahko manipuliramo različne DNA fragmente, tako da zagotovimo DNA sekvence v primerni orientaciji in, če je primerno, v primernem bralnem okviru. Za to lahko uporabimo adapterje ali linkerje, da spojimo DNA fragmente, ali so lahko vpletene druge manipulacije, da zagotovimo primerna restrikcijska mesta, odstranitev odvečne DNA, odstranitev restrikcijskih mest ipd. Za ta namen lahko uporabimo in vitro mutagenezo, popravilo primerja, restrikcijo, aneliranje, resekcijo, ligacijo, PCR ipd., kjer so lahko vpletene insercije, delecije ali substitucije, npr. tranzicije in transverzije.
Sestavke v smislu predloženega izuma lahko uporabimo za transformacijo katerekoli rastline. Na ta način lahko dobimo genetsko modificirane rastline, rastlinske celice, rastlinsko tkivo, semena ipd. Transformacijski protokoli lahko variirajo glede na tip rastline ali rastlinske celice, t.j. enokaličnice ali dvokaličnice, ki so cilj transformacije. Primerne metode za transformiranje rastlinskih celic so mikroinjekcija (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), elektroporacija (Rigs et al. (1986) Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5602-5606, z Agrobacterium mediirana transformacija (Hinchee et al. (1988) Biotecnology,6:915-921), direkten genski transfer (Paszkowski et al. (1984) EMBO J., 3:2717-2722) in balistična pospešitev delcev (glej npr. Sanford et al., US. patent št. 4,945,050; in McCabe et al. (1988) Biotechnology, 6:923-926), Glej tudi Weissinger et al. (1988) Annual Rev. Genet., 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology, 5:27-37 (čebula); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology, 6:923-926 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology, 8:736-740 (riž); Klein et al. (1988) Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4305-4309 (koruza); Klein et al. (1988) Biotechnology, 6:559-563 (koruza); Klein et al. (1988) Plant Physiol., 91:440-444 (koruza); Fromm et al. (1990) Biotechnology, 8:833-839; Tomes et al. Direct DNA transfer into intact plant celiš via microprojectile bombardment, v: Gamborg and Phillips (eds) Plant Celi, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Springer-Verlag, Berlin, 1995 (koruza); Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas (1984) Nature (London), 311:763-764; Bytebier et al. (1987) Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) In The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. G.P. Chapman et al., pp. 197-209. Longman, NY (cvetni prah); Kaeppler et al. (1990) Plant Celi Reports, 9:415-418; and Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet., 84:560-566 (whiskermediirana transformacija); D=Halluin et al. (1992) Plant Celi, 4:1495-1505 (elektroporacija); Li et al. (1993) Plant Celi Reports, 12:250-255, and Christou and
Ford (1995) Arrnals of Botany, 75:407-413 (riž); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology, 14:745-750 (koruza preko Agrobacterium tumefaciens)·, od katerih so vsi tukaj vključeni kot referenca.
Kadar je zaželeno, lahko rastlinski plastid direktno transformiramo. O stabilni transformaciji plastidov so poročali pri višjih rastlinah, glej npr. ŠVAB et al. (1990) Proč. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; ŠVAB & Maliga (1993) Proč. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Staub & Maliga (1993) Embo J. 12:601-606. Metoda se opira na bombardiranje delcev DNA, ki vsebuje izberljiv marker, in ciljanje DNA na plastidni genom s homologno rekombinacijo. Dodatno lahko plastidno transformacijo izvedemo s transaktivacijo tihega, v plastidu prisotnega transgena s tkivno specifično ekspresijo jedrsko kodirane in plastidno usmerjene RNA polimeraze. O takem sistemu so poročali v Mcbride et al. (1994) Proč. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.
Celice, ki smo jih transformirali, lahko vdelamo v rastline v skladu z običajnimi načini. Glej npr. McCormick et al. (1986) Plant Celi Reports, 5:81-84. Te rastline lahko nato gojimo in bodisi oprašujemo z istim transformiranim sevom ali različnimi sevi in identificiramo dobljeno potomstvo z želeno fenotipično karakteristiko. Lahko gojimo dve ali več generacij, da zagotovimo, da se zadevna fenotipična karakteristika stabilno vzdržuje in podeduje, in nato poberemo semena, da zagotovimo, da smo dosegli želeno fenotipsko ali drugo lastnost.
Proteine bomo eksprimirali v transformiranih organizmih v količinah, ki so toksične za žuželke, ki so zanimive, ali ki inhibirajo rast žuželk.
Naslednji primeri so za ilustracijo in niso omejevalni.
Čeprav smo zgornji izum opisali podrobno za ilustracijo in kot primer zaradi jasnosti razumevanja, bo očitno, da lahko izvajamo v okviru opisanega izuma določene spremembe in modifikacije.
POSKUSI
Čiščenje pentina-1
Semena P. macroloba smo zbrali iz nižinskega vlažnega pragozda Kostarike in prenesli v laboratorije avtorjev, kjer smo jih zrezali, liofilizirali in shranili pri -20 °C pred uporabo. Zmrznjena semena smo zrezali v manjše koščke in homogenizirali ob uporabi Brinkmannovega homogenizatorja. Pri tipični proceduri smo 10 g semenskega materiala homogenizirali z 1-2 g netopnega polivinilpirolidona in 50-100 ml 10 mM natrijevega fosfatnega pufra pH 7,5. Homogenat smo nato mešali 8-10 ur pri 4 °C in centrifiigirali 15 minut pri 5000 obr/min. Supematantno tekočino smo skrbno dekantirali in zlili skozi en sam sloj Miracloth-a in zbrali, tako da smo se izognili transferu lipidom podobnih materialov v ekstraktu, ki so se odločili in strdili na površini med centrifugiranjem. Pelet smo zavrgli in zbrano tekočino, ki je bila Še vedno nekoliko motna, drugič centrifiigirali pri 18000 obr/min v Sorvall SS-34 rotorju ali njegovem ekvivalentu 30 minut. Rahlo motno supematantno tekočino, ki jo v nadaljevanju imenujemo surovi ekstrakt, smo zbrali in pelet zavrgli. Vzorec surovega ekstrakta smo shranili za testiranje in preostanek dializirali ob uporabi membrane z omejitvijo molekulske mase (MWC0) 3500 proti petim menjavam 10 mM natrijevega fosfatnega pufra, pH 7,5 pri 3 °C do 4 °C. Razmerje dializne tekočine proti ekstraktu je bilo vsaj 20:1. Dializo smo nadaljevali 8-16 ur na izmenjavo pufra. Med dializo je ekstrakt postal precej moten kot rezultat proteinskega obarjanja. Zato smo dializirane ekstrakte zbistrili s centrifugiranjem pri 18000 obr/min 30 minut, da smo odstranili denaturirane proteine. Dobljeni material po centrifugiranju v nadaljevanju imenujemo surov dializiran ekstrakt. Surove in surove dializirane ekstrakte smo analizirali glede proteinske sestave ali vsebnosti in ugotovili, da vsebujejo snov, ki je bila insekticidno aktivna proti CRW v biološki testih. Ugotovili smo, da je insekticid protein ali proteinasta snov.
100 ml-ski vzorec dializiranega surovega ekstrakta smo segrevali na okoli 80 °C ob uporabi vodne kopeli in vzdrževali pri tej temperaturi okoli 5 minut. Segreti ekstrakt smo nato ohladili pod 25 °C ob uporabi kopeli ledu in po ohlajenju centrifiigirali 15 do minut pri 18000 obr/min ob uporabi Sorval SS-34 rotorja. Bistro supematantno tekočino smo odstranili, shranili in v nadaljevanju označili kot toplotno obdelan ekstrakt. Peletiran material smo zavrgli. Opazili smo, da je toplotno obdelan ekstrakt včasih kazal tendenco do želiranja. Toplotno obdelan ekstrakt je bil testiran protein za uporabo Bradfordove metode z BS A kot standarda in ugotovili smo, da ima insekticidno aktivnost proti CRW v bioloških testih.
Vzorec segretega ekstrakta smo frakcionirali in koncentrirali ob uporabi amonijevega sulfata. Vzorec smo ohladili ob uporabi kopeli ledu in ob mešanju počasi dodali uprašen amonijev sulfat, 0,6 g/ml vzorca. Po končanem dodajanju amonijevega sulfata smo vzorec vzdrževali pri temperaturah kopeli ledu okoli 30 minut. Vzorec smo nato centrifugirali 20 minut pri 4 °C pri 18000 obr/min ob uporabi Sorval SS-34 rotorja. Supematantno tekočino in peletiran material smo ločili ter peletiran material resolubilizirali v minimalni količini 10 mM natrijevega fosfatnega pufra, pH 7,5, in obsežno dializirali proti 10 mM natrijevemu fosfatnemu pufru, pH 7,5. Supematantno tekočino in resolubiliziran peletiran material smo testirali glede na proteinsko vsebnost po Bradfordovi metodi ob uporabi BSA kot standarda in testirali na biološko aktivnost proti CRW. V peletiranem materialu smo ugotovili velik del pentina-1 in je bil insekticiden proti CRW. Po drugi strani smo volumen segretega ekstrakta zmanjšali s centrifugalno koncentracijo ob uporabi Centricona™ ali podobnih naprav za koncentriranje v skladu z navodili proizvajalca.
Proteine smo tudi frakcionirali s kromatografijo z izključitvijo velikosti na bodisi Pharmacia Sephacryl S-200 koloni ali Pharmacia Superose 12 koloni. Uporabili smo različne velikosti kolon glede na količino proteina v vzorcu, ki ga je bilo treba kromatografirati. Na splošno volumen vzorca ni bil večji kot 0,5-1% volumna kolone. Kolono smo ekvilibrirali z vsaj dvema do tremi volumni kolone 10 mM natrijevega fosfatnega pufra, pH 7,5, preden smo vzorec nanesli na kolono. Proteine smo eluirali s kolone z 10 mM natrijevim fosfatnim pufrom, pH 7,5. Frakcije smo testirali na proteinsko vsebnost po Bradfordovi metodi ob uporabi BSA kot standarda in smo jih biotestirali ob uporabi ličink CRW. Po tej metodi lahko kromatografiramo surove ali dializirane ekstrakte, segrete ekstrakte, frakcije, resolubilizirane po amonijevem sulfatnem obarjanju, in ekstrakte ali frakcije, koncentrirane po drugih metodah. Biološko aktiven material smo eluirali tik po praznem volumnu, kar napeljuje na to, da ima aktivni material zmerno visoko molekulsko maso. Ta rezultat se sklada z ocenami velikosti, dobljenimi ob uporabi Centricon™ filtriracijskih naprav z različnimi območji molekulskih mas. Slednje kaže, da ima aktivni material nativno molekulsko maso večjo kot 100 kDa, kar je verjeten rezultat združevanja številnih podenot z molekulsko maso 40-55± 5 kDa. Čistoto frakcij smo ocenili po določitvi molekulske mase ob uporabi SDS-PAGE, kot je opisano spodaj. Te frakcije so bile v bistvu čiste z enim primarnim trakom, ugotovljenim z ocenjeno molekulsko maso podenote v območju 40-55± 5 kDa.
Toplotno obdelane vzorce ali vzorce, ki smo jih podvrgli kromatografiji z izključitvijo velikosti, smo frakcionirali z anionsko izmenjalno kromatografijo ob uporabi bodisi Pharmacia Q Sepharose kolone ali Pharmacia Resource Q kolone. Pred namestitvijo vzorca na kolono smo kolono najprej izprali s 25 mM Tris-HCl ali primernim pufrom, ki vsebuje 1 M NaCl, in nato ekvilibrirali z istim pufrom brez NaCl. pH pufrov, uporabljenih v kromatografiji, je bil v območju med pH 4 in pH 10. Za namen ilustracije metod je tukaj opisana kromatografija ob uporabi 25 mM Tris-HCl pufra, pH 9,0. Pred injiciranjem vzorca na kolono smo vzorec dializirali ob uporabi 3500 MWC0 membrane z 2-3 izmenjavami 25 mM Tris-HCl pufra brez 1 M NaCl. Po namestitvi na kolono smo pretok zbrali in kolono izprali s 25 mM Tris-HCl, pH 9,0. Izpiralno tekočino smo tudi zbrali. Kolono smo nato eluirali z gradientom v območju od 25 mM Tris-HCl, pH 9,0, nič NaCl do 25 mM Tris-HCl, pH 9,0, 1 M NaCl. Vse zbrane frakcije smo dializirali z najmanj dvema pufrskima izmenjavama proti 10 mM natrijevemu fosfatu, pH 7,5. Pretok, izpiralno tekočino in s soljo eluirane frakcije smo testirali na protein po Bradfordovi metodi ob uporabi BS A kot standarda in biotestirali ob uporabi CRW. Aktivni material smo našli v pretoku in v frakcijah, ki so bile eluirane med 0,2 in 0,5 M NaCl. Za določitev, če je bila kapaciteta kolone presežena, posledica pa so dodatni materiali, ki so prehajali skozi kolono brez vezanja, smo aktivni material v pretoku ponovno aplicirali na kolono po re-ekvilibriranju. Večina od UV 280 nm absorbirajočega materiala je prešla skozi kolono. Ta opažanja so napeljevala na to, da ima ta aktivni material drugačne lastnosti kot material, ki je bil vezan na kolono in smo ga eluirali z naraščajočimi prirastki NaCl. Drugi uporabljeni pufri so bili tudi primerni za anionsko izmenjalno kromatografijo, kot je znano strokovnjakom. Aktivni material smo lahko čistili tudi s kationsko izmenjalno kromatografijo.
Pentin-1 material smo očistili skoraj do homogenosti s kromatografijo z izključitvijo velikosti ali anionsko izmenjalno kromatografijo. Manjše proteinske trakove smo odstranili z visoko tlačno tekočinsko kromatografijo (HPLC) ob uporabi kolone z reverzno fazo pred amino kislinsko analizo in določitvijo amino kislinske sekvence.
Čistoto vzorcev in molekulsko maso podenot smo določili z SDS-PAGE ob uporabi 12% poliakrilamidnih gelov in na splošno po metodi Laemmli-ja, Nature 227:680-685 (1970). Gele smo obarvali bodisi s Coomassie Blue R250 ob uporabi standardnih protokolov ali s srebrom (Hammer et al., Phytochemistry 28:3019-3026 (1989)). Z SDS-PAGE smo ugotovili, da je molekulska masa podenot aktivne snovi v območju 40-55000 ± 5000 Daltonov.
Poleg zgoraj opisanih postopkov lahko za ločenje aktivne snovi iz ekstrakta surovega semena uporabimo druge postopke. Npr. ekstrakt lahko podvržemo izoelektričnemu fokusiranju (IEF) ob uporabi Rotofor sistema (Bio-Rad). Rotofor loči molekule na osnovi njihove pl ali izoelektrične točke. Vsaka molekula bi imela specifičen naboj, bodisi pozitiven ali negativen, pri specifičnem pH. Rotofor ob uporabi električnega toka premika molekule skozi pH gradient, dokler ne dosežejo svojega pl; t.j. pH, pri katerem imajo čisti naboj 0. Molekula preneha migrirati pri svoji pl, ker nanjo nič več ne vpliva električni tok. Fokusima komora Rotoforja je ločena v 20 manjših komor s permeabilnimi membranami. Teh 20 vzorcev istočasno odvzamemo, da zagotovimo kar najmanj mešanja.
Tipično vzorec namestimo v fokusimi medij, zapufrano raztopino (glej navodila proizvajalca), ki vključuje 12,5% (m/v) glicerola in 2,5% pH 3-10 amfolitov (BioRad). Po fokusiranju frakcije zberemo, določimo pH vsake in vsako frakcijo dializiramo proti 1 M NaCl ob uporabi 3500 MWC0 membrane, da odstranimo amfolite. Vzorce nato dializiramo proti deionizirani vodi, da odstranimo NaCI. Vsako frakcijo liofiliziramo in resuspendiramo v 0,4 ml 10 mM NaCI. Rotoforske frakcije, ki vsebujejo aktivni material, lahko določimo s proteinskim testom in biotestom z ličinkami žuželk. Rotoforske frakcije lahko nato podvržemo nadaljnji obdelavi ali ločenju, kot je opisano zgoraj.
Biološki testi
Bioteste smo izvajali ob uporabi CRW novorojenih ličink, gojenih na umetnih dietah, ki so vsebovale pentin-1, dobljen iz P. macroloba, kot je tukaj opisano. Pentin-1 je lahko iz surovega ekstrakta ali očiščen, kot se tukaj opisuje. Pentin-1 smo bodisi aplicirali lokalno na površino diete ali vdelali v dieto, kot navaja Czapla and Lang, J. Econo. Ento. 83(6):2480-2485 (1990). Gojilni pladenj kulture, uporabljen v biotestih, smo razdelili v obdelovalne skupine. V vsakem pladnju smo skrinirali enega ali več pentin-1 pripravkov ali frakcij iz različnih ločb; pri čemer smo vsak pripravek ali frakcijo aplicirali na več celic. Vsako celico smo infestirali z eno ali dvema novorojenima ličinkama. Mylar film s prezračevalnimi odprtinami smo pritrdili na vrh vsakega pladnja, da smo preprečevali pobeg in dopustili izmenjavo zraka.
Za lokalne (prekrivne) teste smo pripravili raztopino, ki je vsebovala 2% pentin-1, v 0,1 M fosfatni zapufrani fiziološki raztopini kuhinjske soli (PBS), pH = 7,8. 75 μΐ pentin-1 pufrske raztopine smo pipetirali na Stoneville dietni medij v vsaki celici. Gojilni pladenj smo vrteli, da smo zagotovili enako porazdelitev pentin-1 raztopine na dietnem mediju. Celice smo inficirali in zatesnili, kot je opisano zgoraj. Kontrola je bila 75 μΐ 0,1 M PBS (samo) na celico.
Za teste vdelave diete smo Stoneville medij pripravili na standarden način, vendar le z 90% predpisane vode. Dodali smo pentin-1 tako, daje bila količina v dieti v območju 1-5 pg/g. Kontrolna obdelava je obstajala iz 0,9 ml PBS pufra, dodanega k 8,1 g medija. Medij smo zlili na celice in nato celice infestirali in pokrili, kot je opisano zgoraj. Težo žuželk (teža ali povpr. teža) smo določili pri dnevu 7 in je podana v tabelah.
Tabela A. Učinek pentina-1 na južni CRW
Vzorec | Koncentracija (pg/ml diete) | % smrtnosti |
kontrola | - | 0 |
surov | 1000 | 100 |
surov | 400 | 15 |
AS75 | 400 | 60 |
velikostna frakcija 17 | 8 | 14 |
velikostna frakcija 18 | 8 | 45 |
velikostna frakcija 19 | 8 | 29 |
Opombe: AS75 = amonijev sulfat 75% populacija
Ko je bil pentin-1 očiščen in določena njegova insekticidna aktivnost, smo se lotili kloniranja. Prva stopnja postopka je bila, da smo določili z westem blot analizo časovno in prostorsko porazdelitev pentin-1, da bi identificirali rastlinsko ali semensko tkivo ali tkiva, ki bi najverjetneje eksprimirala ta protein. Ker pentin-1 ni bil izoliran v količinah, ki bi dopuščale proizvodnjo protiteles, smo protein sekvencirali, da bi omogočili oblikovanje peptidov za sintezo. Amino kislinski sekvenčni podatki za pentin-1 so prikazani spodaj na sl. 1. Karboksi-terminus in notranjo sekvenco približno 40% pentin-1 peptidov smo kompilirali iz 15 peptidov, očiščenih iz LysC in CNBr digeriranja očiščenega pentin-1 proteina. Med tem postopkom nismo identificirali NH2-terminalne sekvence.
Protitelesa smo vzgajali proti petim od peptidov. Sintetski peptidi, uporabljeni za proizvodnjo protiteles, so našteti spodaj.
Sintetski peptid št. 1 (SEQ ID NO:5)
Opomba: ustreza amino kislinskim številom 213-228 s sl. 1.
Sintetski peptid št. 2 (SEQ ID N0:6)
Opomba: ustreza amino kislinskim številom 344-360 s sl. 1.
Sintetski peptid št. 3 (SEQ ID NO:7)
Opomba: ni ustrezanja z amino kislinami s sl. 1.
Sintetski peptid št. 4 (SEQ ID NO:8)
Opomba: ni ustrezanja z amino kislinami s sl. 1.
Sintetski peptid KS (SEQ ID NO:9)
Opomba: ustreza amino kislinskim številom 349-363 s sl. 1.
Westem pikčaste blots pentina-1, vsakega od sintetskih peptidov in eksperimentalni protein, označen s 5C9, smo inkubirali z vsakim od protiteles. Inkubacijski rezultati so pokazali, da je protitelo, vzgojeno proti sintetskemu peptidu KS (protitelo anti-KS), in protitelo, vzgojeno proti sintetskemu peptidu 2 (protitelo anti-2), prepoznalo pentin-1. Westem blots Pentaclethra macroloba tkivnih ekstraktov, obdelanih z anti-KS protitelesi, so pokazali, da je bila največja prepoznava z zrelimi semeni s premerom 30-40 mm ali večjimi. Iz teh semen smo izolirali celotno RNA.
Genomsko DNA smo izolirali, kodonsko degenerirane oligonukleide na osnovi peptidov smo uporabili za PCR pomnoževanje genomskih fragmentov. Eksonsko sekvenco dobljenih klonov smo uporabili, da smo naredili RT-PCR s specifičnimi oligi, nato smo izvedli RT-PCR poskuse, da smo dobili vsaj delno pentin-1 cDNA za sondiranje ekspresijske knjižnice. Informacijo, dobljeno iz sekvenciranja naključnih cDNA klonov iz knjižnice P. macroloba nezrelega semena, smo uporabili za generiranje nascentne kodonske uporabnostne tabele. Dobljeni podatki so pokazali, da
P. macroloba drevo nima močne kodonske uporabnostne nagnjenosti in da je GC vsebnost zmerna. Matrico degeneriranih naprej usmerjenih in reverznih primerjev, ki ustrezajo pentin-1 peptidom, smo izbrali za uporabo. Naprej usmerjena primerska sekvenca je bila VVKRLAGYFDV (pentin-1 amino kislina št. 76-86: Val Val Lys Arg Leu Ala Gly Tyr Phe Asp Val) (SEQ ID NO: 10) in reverzna primerska sekvenca je bila ENMENLEK, (pentin-1 amino kislina št. 372-379): Glu Asn Met Glu Asn Leu Glu Lys) (SEQ ID NO: 11). Zaradi majhne količine dostopnega tkiva smo izvedli začetno primersko testiranje ob uporabi genomske DNA, izvedene iz listov P. macroloba. Ena od 64 možnih primerskih kombinacij je dala 3,0 kb fragment, ki je kodiral pentin-1 peptidne sekvence. Nato smo naprej usmerjeni in reverzni primerski par uporabili za pomnoževanje 0,8 kb cDNA fragmenta iz celotne RNA, izolirane iz zrelih (30-40 mm) semen. Sledeče skriniranje ekspresijske knjižnice zrelega semena s to 0,8 kb cDNA sondo je proizvedlo več sorodnih klonov, od katerih je eden 1,4 kb klon, ki kodira 12 od 15 peptidnih sekvenc iz pentina 1 (SEQ ID NO: 1).
Westem blots smo izvedli s pentinom-1, pentin-1 sintetskimi peptidi, 5C9 in BSA proteini proti izpostavljanju izbranim protitelesom. Blots smo obdelali z 1/10000 razredčenjem protiteles, vzgojenih proti vsakemu od peptidov in 5C9. Vsako protitelo je prepoznalo svoj antigen z nikakršno ugotovljivo križno reaktivnostjo do BSA, negativno kontrolo. Vsa protitelesa, razen tistih, vzgojenih proti sintetskemu peptidu št. 1, so prepoznala 1,0 pg 5C9. Čeprav so bili sintetski peptidi KS in št. 2 74% identični, anti-2 protitelo ni prepoznalo KS, je pa ugotovilo pentin-1 in 5C9.
Nukleinsko kislinsko sekvenco pentin-1 klona smo določili po standardnih postopkih, ki so znani strokovnjakom. cDNA sekvenca in napovedana pentin-1 proteinska sekvenca sta na sl. 1 in SEQ ID NO: 1.
Biotesti kloniranega materiala
Bioteste smo izvedli proti zahodnemu koruznemu koreninskemu črvu WCR ob uporabi sonificirane E. coli, ki smo jo transformirali z enim od številnih naštetih plazmidov (tabela 1). Transformirane celice smo gojili v približno 25-35 ml TB juhe. Celice smo poželi po 24 urah s centrifugiranjem. Pelet smo resuspendirali v približno 1 ml PBS pufra in sonificirali. Dobljeno zmes smo nato dali na vrh površine diete in nato infestirali z novorojenimi WCR ličinkami. Smrtnost smo zabeležili po 4 dneh. Pozitivni rezultat je nakazoval 100% smrtnost. Negativni rezultat je nakazoval smrtnost pod 10%. Podoben poskus je zajemal uporabo transformiranih celic, gojenih na agarski plošči. Celice smo postrgali po zadostni rasti, suspendirali v majhni količini PBS pufra in nato raztopino vdelali v dieto žuželke. Izvedli smo tudi 4-dnevni biotest z zabeleženo smrtnostjo.
Tabela 1 prikazuje rezultate dveh paralelk biotestov. Vse celice, transformirane z dozdevno negativnimi (ne-letalni WCR geni) plazmidi niso povzročile nikakršne smrtnosti ličink v nobenem testu. Ti plazmidi so P7725, P88126 in Pl 1426. Oba plazmida, ki vsebujeta kodirno sekvenco za pentin-1, vendar nobenih promotorjev za proizvodnjo dejanskega proteina, PGEM in Pl 1394 nista pokazala nobene WCR aktivnosti. Vendar pa so vsi plazmidi, ki vsebujejo kodirno regijo za pentin-1 (SEQ ID NO:1) in funkcijsko ekspresijsko kaseto, pokazali odlično aktivnost proti ličinkam WCR. Vse take obdelave so imele 100% smrtnost. Predhodna analiza westem blot je pokazala, da je bil v teh celičnih ekstraktih prisoten protein, po velikosti podoben pentinu-1, vendar ne v negativnih kontrolnih vzorcih. Aktivnost se je videla v obeh tipih celične priprave in biotestih.
Tabela 1
Transformacija protoplastov, izoliranih iz koruznih suspenzijskih celic s tremi pentin1 genskimi konstrukti za gensko ekspresijo in za CRW biotest
I. Protoplastni transformacijski protokol
Za izdelavo protoplastov smo uporabili dokazane Hill (GS3) suspenzijske celice. Celice smo zbrali 3-4 dni po sub-kultiviranju.
Celično digeriranje: celice smo digerirali v encimski raztopini pri 27 °C 3-5 ur s stresalno hitrostjo 50-60 obr/min. Celično steno smo digerirali s celulazo in pektoliazo, da smo sprostili protoplaste.
Žetev protoplastov: digeriran material je prehajal skozi filter 30 mm in protoplaste smo rekuperirali s centrifugiranjem filtrata 10 minut pri 1000 obr/min.
Protoplastni pelet smo resuspendirali v 20 ml ali 40 ml KMC raztopine. Gostoto in celoten dobitek protoplastov smo določili s štetjem števila protoplastov s hemacitometrom. Suspenzijo smo centrifugirali, da smo peletirali protoplaste. Protoplastni pelet smo suspendirali v MaMg transformacijski raztopini v koncentraciji milijona protoplastov na ml.
Raztopino v količinah po 2 ml (okoli 4 milijonov protoplastov) smo porazdelili v 15 ml-ske epruvete z okroglim dnom. Vsaka epruveta je bila podvajana. Vsaj 3 podvajanja smo uporabili za vsak pentin-1 genski konstrukt. Konstrukti so vključevali tako nativno pentin-1 in optimirano pentin-1 sekvenco. Glej SEQ ID NO: 1 oz. 3. Plazmidno DNA smo dodali v protoplastno suspenzijo v epruvetah (15 mg plazmidne DNA/milijon protoplastov) in zmešali.
Po inkubaciji 5 minut smo dodali 2 ml 40% polietilen glikola (PEG-8000, Sigma) k protoplast/DNA zmesi (končna PEG koncentracija je okoli 20%) in mešali z večkratnim obračanjem epruvet in inkubirali 20-30 minut pri sobni temperaturi.
V vsako epruveto smo dodali okoli 3 ml W5 solne raztopine. Epruvete smo pokrili in rahlo obračali. To smo ponovili 2-krat, dokler končni volumen ni bil 13-14 ml. Suspenzijo smo centrifugirali 8 minut pri 1000 obr/min. Za resuspendiranje protoplastov smo uporabili 3 ml FW medija (glej spodaj). Ob uporabi Pasteurjeve pipete s plastičnim stiščkom smo eno obdelavo (3 ml) porazdelili v dve vdolbini gojilne plošče s 6 vdolbinami, zatesnili s parafilmom in inkubirali 24-48 ur v temi pri 28 °C.
Po gojenju smo protoplaste prenesli v 15 ml-epruveto ob uporabi Pasteurjeve pipete s plastičnim stiščkom in centrifugirali 8 minut pri 500 obr/min za peletiranje protoplastov.
Proteinska analiza in biotest: 1/5 do 1/4 protoplastnega peleta v vsakem podvajanju za vsako transformacijsko obdelavo smo vzorčili za analizo pentin-1 ekspresije z Westem blot. Preostanek protoplastnega peleta smo uporabili za biotest. Vse podvajalne vzorce iz iste transformacijske obdelave, t.j. transformirane z istim pentin-1 konstruktom, smo zbrali in vdelali v dieto za CRW biotest. Rezultati biotesta so v tabeli 2.
Tabela 2. Učinek pentina-1, če je bil eksprimiran prehodno v koruznih protoplastih, proti WCR ličinkam. Podatki so skupek 6 Časovno podvaianih poskusov. Protoplaste smo sonificirali in celotno zmes vdelali v dieto.
II. Pentin-1 genski konstrukti za transformacijo
Pl 1184 - Ubi promotor::pentin-l (originalen popolen klon) Pl 1335 - Ubi promotor::pentin-l (delno modificiran gen) Pl 1443 - Ubi promotor: :mopentin-1 (optimiran gen)
Raztopine in mediji, uporabljeni za transformacijo
KMC raztopina - 1000 ml
KC1 8,65 g
MgC12-6H2O 16,47 g
CaC12-2H2O 12,50 g
MES 0,5% 5,0 g pH 5,8 s KOH filtrsko sterilizirati
MaMg transformacijska raztopina - 1000 ml
Mmanitol 108,1 g mM MgC12-6H2O 3,05 g mM MES 1,95 g pH 5,7 filtrsko sterilizirati
40% PEG -100 ml
Dodati 40 g PEG k 60 ml MaMg transformacijske raztopine. Hitro obdelati z mikrovalovi, da se PEG raztopi. Dodati še MaMg raztopine do končnega volumna 100 ml. Naravnati na pH 7,0. Filtrsko sterilizirati.
Encimska raztopina za digeriranje suspenzijske celice (encimska raztopina)
Encimska raztopina vsebuje 3% celulaze RS in 0,3% pektoliaze Υ23 v protoplastni raztopini.
Protoplastna raztopina - 1000 ml
M manitol 108,1 g mM MES 1,95 g mM CaC12-2H2O 147 mg mM MgC12-6H2O 203 mg
1% BS A (po želji) 1 g pH 5,7 filtrsko sterilizirati
W5 solna raztopina - 1000 ml | |
154 mM NaCI | 9,0 g |
125 mM CaC12-2H2O | 18,56 g |
5mMKCl | 0,373 g |
5 mM glukoze pH 5,5 s KOH filtrsko sterilizirati | 0,901 g |
FW medij - 1000 ml | |
MS soli (Sigma M5519) | 4,3 g |
saharoza | 30,0 g |
manitol | 54,0 g |
prolin | 1,5 g |
2,4-D | 3,0 mg |
1000x B5 vitamini | lml |
pH 5,8 |
filtrsko sterilizirati
Transformacija in regeneracija koruznega kalusa
Nezrele koruzne embrije iz donorskih rastlin v rastlinjaku bombardiramo s plazmidom, ki vsebuje vse tri pentin-1 konstrukte plus plazmid, ki vsebuje izberljiv markerski gen, PAT, (Wohlleben, W., Arnold, W„ Broer, I., Hillemann, D., Strauch, E. and Puehler, A. Nucleotide sequence of the phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tue494 and its expression in Nicotiana tabacum Gene 70:25-37 (1988), ki podeli rezistenco za herbicid Bialophos, po naslednji metodi:
Prosimo upoštevati: vsi recepti za medije so v Dodatku.
Priprava tarčnega tkiva: klase površinsko steriliziramo v 30% Chlorox belilu plus 0,5% Micro detergentu 20 minut in 2-krat splaknemo s sterilno vodo. Nezrele embrije eksciziramo in namestimo os embrija na spodnjo stran (scutellum na zgornjo stran), 25 embrijev na ploščo. Te gojimo na 506L mediju 4 dni pred bombardiranjem v temi. Na dan bombardiranja embrije prenesemo v 560Υ medij za 4 ure, razporejene znotraj 2,5 cm-ske cone tarče.
Priprava DNA:
100 gl pripravljenih volframovih delcev v vodi pil (1 gg) DNA v TrisEDTA pufru (1 gg v celoti)
100 gl 2,5 M CaC12 gl 0,1 M spermidina
Vsak reagent dodamo zaporedno na suspenzijo volframovih delcev ob vzdrževanju na večcevnem vortekserju. Plazmide naravnamo po velikosti za končno 1:1 razmerje. Končno zmes hitro sonificiramo in pustimo inkubirati ob stalnem vorteksiranju 10 minut. Po obarjalnem času epruvete hitro centrifugiramo, tekočino odstranimo, izperemo s 500 ml 100% etanola in centrifugiramo 30 sekund. Tekočino spet odstranimo in h končnemu peletu volframovih delcev dodamo 105 μΐ 100% etanola. Za bombardiranje delcev delce volframa/DNA hitro sonificiramo, 10 μΐ namažemo na sredino vsakega makro-nosilca in pustimo sušiti okoli 2 minuti pred bombardiranjem.
Obdelava z bombardiranjem delcev: Vzorčne plošče bombardiramo pri nivoju #4 v pištoli za delce #HE34-1 ali #HE34-2. Vsi vzorci prejmejo en sam strel pri 650 PSI, s celoto 10 alikvotov, vzetih iz vsake epruvete pripravljenih delcev/DNA.
Naknadna obdelava: po bombardiranju držimo embrije na 560Υ mediju 2 dni, nato prenesemo v 560R selekcijski medij, ki vsebuje 3 mg/1 Bialophosa, in sub-kultiviramo vsake 2 tedna. Po približno 10 tednih selekcije selekcijsko odporne kalusne klone vzorčimo za PCR in fumonizin esterazno TLC aktivnostno analizo. Pozitivne linije prenesemo na 288J medij, da iniciiramo rastlinsko regeneracijo. Po somatskem zorenju embrijev (2-4 tednih) prenesemo dobro razvite somatske embrije v medij za kalitev in prenesemo v osvetljeno gojilno komoro. Približno 7-10 dni kasneje prenesemo razvijajoče se rastlinice v medij v epruvetah za 7-10 dni, dokler rastlinice niso dobro utrjene. Rastline nato prenesemo v vključke v ploske posode (ekvivalent lončku 6,4 cm), ki vsebujejo prst za lončnice, in jih gojimo 1 teden v rastni komori, nato gojimo še 1-2 tedna v rastlinjaku, nato prenesemo v klasične 600 lončke (6 1) in gojimo do zrelosti.
Dodatek
Sestavina | Količina | Enota |
D-I H2O | 900,000 | ml |
CHU (N6) bazalne soli (SIGMA C-1416) | 1,600 | g |
N6 makrohranila 10Χ zaloga ## | 60,000 | ml |
kalijev nitrat | 1,680 | g |
B5H manj pomembne soli 1000Χ ### | 0,600 | ml |
B5H Fe Na EDTA 100Χ #### | 6,000 | ml |
Erikssonova vitaminska zmes (1000Χ SIGMA-1511) | 0,400 | ml |
S & H vitaminska zmes 100Χ zaloga (S3766) | 6,000 | ml |
tiamin.HCl 0,4 mg/ml | 0,500 | ml |
L-prolin | 1,980 | g |
kazein hidrolistat (kislina) | 0,300 | g |
saharoza | 20,000 | g |
glukoza | 0,600 | g |
2,4-D 0,5 mg/ml | 1,600 | ml |
Gelrite @ | 2,000 | g |
Dicamba 1 mg/ml # | 1,200 | ml |
srebrov nitrat 2 mg/ml # | 1,700 | ml |
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna # = dodati po steriliziranju in ohlajenju na temperaturo
Raztopiti sestavine v polirani D-I H2O v sekvenci
Naravnati na pH 5,8
Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O po naravnavi pH
Sterilizirati in ohladiti na 60 °C.
## = raztopiti 1,660 g kalcijevega klorida dihidrata v 950,000 ml polirane D-I H2O. Nato raztopiti 4,629 amonijevega sulfata; 4,000 g monobazičnega kalijevega fosfata KH2PO4; 1,850 g magnezijevega sulfata 7-H2O, MgSO4, 7H2O; in 28,300 g kalijevega nitrata v sekvenco. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
### = raztopiti 3,000 g borove kisline; 10,000 g manganovega (II) sulfata monohidrata; 0,250 g natrijevega molibdata dihidrata; in 0,750 g kalijevega jodida v polirani D-I H2O v sekvenci. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
#### = raztopiti 3,700 g dinatrijevega EDTA dihidrata in 2,790 g železovega (II) sulfata 7-hidrata v D-I H2O. Dopolniti do volumna z D-I H2O.
Celoten volumen (L) = 1,00
604 A
Sestavina | Količina | Enota |
D-I H2O | 900,000 | ml |
CHU (N6) (SIGMA C-1416) | 1,600 | g |
N6 makrohranila 10Χ zaloga ## | 60,000 | ml |
kalijev nitrat | 1,680 | g |
B5H manj pomembne soli 1000Χ ### | 0,600 | ml |
B5H Fe Na EDTA 100Χ #### | 6,000 | ml |
Erikssonova vitaminska zmes (1000Χ SIGMA-1511) | 0,400 | ml |
S & H vitaminska zmes 100Χ zaloga (S3766) | 6,000 | ml |
tiamin . HCI 0,4 mg/ml | 0,500 | ml |
L-prolin | 1,980 | g |
kazein hidrolizat (kislina) | 0,300 | g |
saharoza | 20,000 | g |
glukoza | 0,600 | g |
2,4-D 0,5 mg/ml | 1,600 | ml |
Gelrite @ | 2,000 | g |
Dicamba 1 mg/ml # | 1,200 | ml |
srebrov nitrat 2 mg/ml # | 1,700 | ml |
Bialaphos 1 mg/ml # | 3,000 | ml |
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna # = dodati po steriliziranju in ohlajenju na temperaturo
Raztopiti sestavine v polirani D-IH2O v sekvenci
Naravnati na pH 5,8
Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O po naravnavi pH
Sterilizirati in ohladiti na 60 °C.
## = raztopiti 1,660 g kalcijevega klorida dihidrata v 950,000 ml polirane D-I H2O. Nato raztopiti 4,629 amonijevega sulfata; 4,000 g monobazičnega kalijevega fosfata
ΚΗ2ΡΟ4; 1,850 g magnezijevega sulfata 7-H2O, MgSO4, 7H2O; in 28,300 g kalijevega nitrata v sekvenco. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
### = raztopiti 3,000 g borove kisline; 10,000 g manganovega (II) sulfata monohidrata; 0,250 g natrijevega molibdata dihidrata; in 0,750 g kalijevega jodida v polirani D-I H2O v sekvenci. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
#### = raztopiti 3,700 g dinatrijevega EDTA dihidrata in 2,790 g železovega (II) sulfata 7-hidrata v D-I H2O. Dopolniti do volumna z D-I H2O.
Celoten volumen (L) = 1,00
605 J
Sestavina | Količina | Enota |
D-I H2O | 900,000 | ml |
CHU (N6) (SIGMA C-1416) | 1,600 | g |
N6 makrohranila 10Χ zaloga ## | 60,000 | ml |
kalijev nitrat | 1,680 | g |
B5H manj pomembne soli 1000Χ ### | 0,600 | ml |
B5H Fe Na EDTA 100Χ #### | 6,000 | ml |
Erikssonova vitaminska zmes (1000Χ SIGMA-1511) | 0,400 | ml |
S & H vitaminska zmes 100Χ zaloga (S3766) | 6,000 | ml |
tiamin . HCI 0,4 mg/ml | 0,500 | ml |
saharoza | 20,000 | g |
glukoza | 0,600 | g |
2,4-D 0,5 mg/ml | 1,600 | ml |
Gelrite @ | 2,000 | g |
Dicamba 1 mg/ml # | 1,200 | ml |
srebrov nitrat 2 mg/ml # | 0,425 | ml |
Bialaphos 1 mg/ml # | 3,000 | ml |
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna # = dodati po steriliziranju in ohlajenju na temperaturo
Raztopiti sestavine v polirani D-I H2O v sekvenci
Naravnati na pH 5,8
Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O po naravnavi pH
Sterilizirati in ohladiti na 60 °C.
## = raztopiti 1,660 g kalcijevega klorida dihidrata v 950000 ml polirane D-I H2O. Nato raztopiti 4,629 amonijevega sulfata; 4,000 g monobazičnega kalijevega fosfata KH2PO4; 1,850 g magnezijevega sulfata 7-H2O, MgSO4, 7H2O; in 28,300 g kalijevega nitrata v sekvenco. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
### = raztopiti 3,000 g borove kisline; 10,000 g manganovega (II) sulfata monohidrata; 0,250 g natrijevega molibdata dihidrata; in 0,750 g kalijevega jodida v polirani D-I H2O v sekvenci. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
#### - raztopiti 3,700 g dinatrijevega EDTA dihidrata in 2,790 g železovega (II) sulfata 7-hidrata v D-I H2O. Dopolniti do volumna z D-I H2O.
Celoten volumen (L) = 1,00
604S
Sestavina | Količina | Enota |
D-I H2O | 800,000 | ml |
CHU (N6) (SIGMA C-1416) | 1,600 | g |
N6 makrohranila 10Χ zaloga ## | 60,000 | ml |
kalijev nitrat | 1,680 | g |
B5H manj pomembne soli 1000Χ ### | 0,600 | ml |
B5H Fe Na EDTA 100Χ #### | 6,000 | ml |
Erikssonova vitaminska zmes (1000Χ SIGMA-1511) | 0,400 | ml |
S & H vitaminska zmes 100Χ zaloga (S3766) | 6,000 | ml |
tiamin . HCI 0,4 mg/ml | 0,500 | ml |
L-prolin | 1,980 | g |
kazein hidrolizat (kislina) | 0,300 | g |
saharoza | 120,000 | g |
glukoza | 0,600 | g |
2,4-D 0,5 mg/ml | 1,600 | ml |
Gelrite @ | 2,000 | g |
Dicamba 1 mg/ml # | 1,200 | ml |
srebrov nitrat 2 mg/ml # | 1,700 | ml |
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna # = dodati po steriliziranju in ohlajenju na temperaturo
Raztopiti sestavine v polirani D-I H2O v sekvenci
Naravnati na pH 5,8
Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O po naravnavi pH
Sterilizirati in ohladiti na 60 °C.
### = raztopiti 1,660 g kalcijevega klorida dihidrata v 950,000 ml polirane D-I H2O. Nato raztopiti 4,629 amonijevega sulfata; 4,000 g monobazičnega kalijevega fosfata KH2PO4; 1,850 g magnezijevega sulfata 7-H2O, MgSO4, 7H2O; in 28,300 g kalijevega nitrata v sekvenco. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
## = raztopiti 3,000 g borove kisline; 10,000 g manganovega (II) sulfata monohidrata; 0,250 g natrijevega molibdata dihidrata; in 0,750 g kalijevega jodida v 950,000 ml polirane D-I H2O v sekvenci. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
#### = raztopiti 3,700 g dinatrijevega EDTA dihidrata in 2,790 g železovega (II) sulfata 7-hidrata v 950,000 ml D-I H2O. Dopolniti do volumna z D-I H2O.
Celoten volumen (L) = 1,00
272V
Sestavina | Količina | Enota |
D-I H2O | 950,000 | ml |
MS soli (GIBCO 111117-074) | 4,300 | g |
Mio-Inozitol | 0,100 | g |
osnovna raztopina MS vitaminov ## | 5,000 | ml |
saharoza | 40,000 | g |
Bacto-Agar @ | 6,000 | g |
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna
Raztopiti sestavine v polirani D-I H2O v sekvenci
Naravnati na pH 5,6
Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O po naravnavi pH
Sterilizirati in ohladiti na 60 °C.
## = raztopiti 0,100 g nikotinske kisline; 0,020 g tiamin.HCl; 0,100 g piridoksin-HCl; in 0,400 g glicina v 875,00 ml polirane D-I H2O v sekvenci. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O. Narediti v 400 ml-skih deležih. Tiamin.HCl & piridoksin.HCl sta v temnem desikatorju. Shranjevati 1 mesec, razen če ne pride do kontaminacije ali obarjanja, nato narediti svežo zalogo.
Celoten volumen (L) = 1,00
288J
Sestavina | Količina | Enota |
D-I H2O | 950,000 | ml |
MS soli | 4,300 | g |
Mio-Inozitol | 0,100 | g |
osnovna raztopina MS vitaminov ## | 5,000 | ml |
Zeatin - 0,5 mg/ml | 1,000 | ml |
saharoza | 60,000 | g |
Gelrite @ | 3,000 | g |
indolocetna kislina 0,5 mg/ml # | 2,000 | ml |
0,1 mM absisinska kislina | 1,000 | ml |
Bialaphos 1 mg/ml # | 3,000 | ml |
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna Raztopiti sestavine v polirani D-I H2O v sekvenci
Naravnati na pH 5,6
Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O po naravnavi pH
Sterilizirati in ohladiti na 60 °C.
Dodati 3,5 g/1 Gelrita za celično biologijo.
## = raztopiti 0,100 g nikotinske kisline; 0,020 g tiamin.HCl; 0,100 g piridoksin-HCl; in 0,400 g glicina v 875,00 ml polirane D-I H2O v sekvenci. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O. Narediti v 400 ml-skih deležih. Tiamin.HCl & piridoksin.HCl sta v temnem desikatorju. Shranjevati 1 mesec, razen Če ne pride do kontaminacije ali obarjanja, nato narediti svežo zalogo.
Celoten volumen (L) =1,00
560L
Sestavina | Količina | Enota |
D-I voda, filtrirana | 950,000 | ml |
CHU (N6) bazalne soli (SIGMA C-1416) | 4,000 | g |
Erikssonova vitaminska zmes (1000Χ SIGMA-1511) | 0,400 | ml |
tiamin . HCI 0,4 mg/ml | 1,250 | ml |
saharoza | 20,000 | g |
2,4-D 0,5 mg/ml | 2,000 | ml |
L-prolin | 2,880 | g |
Gelrite @ | 2,000 | g |
srebrov nitrat 2 mg/ml # | 4,250 | ml |
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna # = dodati po steriliziranju in ohlajenju na temperaturo Raztopiti sestavine v D-I H2O v sekvenci Naravnati na pH 5,8 s KOH Dopolniti do volumna z D-I H2O Sterilizirati in ohladiti na sobno temperaturo Celoten volumen (L) =1,00
560R
Sestavina | Količina | Enota |
D-I voda, filtrirana | 950,000 | ml |
CHU (N6) bazalne soli (SIGMA C-1416) | 4,000 | g |
Erikssonova vitaminska zmes (1000Χ SIGMA-1511) | 1,000 | ml |
tiamin . HCI 0,4 mg/ml | 1,250 | ml |
saharoza | 30,000 | g |
2,4-D 0,5 mg/ml | 4,000 | ml |
Gelrite @ | 3,000 | g |
srebrov nitrat 2 mg/ml # | 0,425 | ml |
Bialaphos 1 mg/ml # | 3,000 | ml |
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna # = dodati po steriliziranju in ohlajenju na temperaturo Raztopiti sestavine v D-I H2O v sekvenci Naravnati na pH 5,8 z KOH Dopolniti do volumna s D-I H2O Sterilizirati in ohladiti na sobno temperaturo Celoten volumen (L) = 1,00
560Υ
Sestavina | Količina | Enota |
D-I voda, filtrirana | 950,000 | ml |
CHU (N6) bazalne soli (SIGMA C-1416) | 4,000 | g |
Erikssonova vitaminska zmes (1000Χ SIGMA-1511) | 1,000 | ml |
tiamin . HCI 0,4 mg/ml | 1,250 | ml |
saharoza | 120,000 | g |
2,4-D 0,5 mg/ml | 2,000 | ml |
L-prolin | 2,880 | g |
Gelrite @ | 2,000 | g |
srebrov nitrat 2 mg/ml #
4,250 ml
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna # = dodati po steriliziranju in ohlajenju na temperaturo
Raztopiti sestavine v D-I H2O v sekvenci
Naravnati na pH 5,8 s KOH
Dopolniti do volumna z D-I H2O
Sterilizirati in ohladiti na sobno temperaturo ** avtoklavirati manj časa zaradi povečane saharoze**
Celoten volumen (L) = 1,00
Plazmida PHP11361 in PHP11511 smo deponirali pri American Type Culture Collection, Bethesda, Maryland, in sta prejela pristopni številki 209026 oz. 209025. PHP11361 obsega nukleotidno sekvenco nativne pentin-1 sekvence. PHP11511 obsega optimirano pentin-1 sekvenco.
Vse objave in patentne prijave, omenjene v opisu, so namenjene nivoju strokovnjakov, na katere se ta izum nanaša.
Vse objave in patentne prijave so tukaj vključene kot referenca v enakem obsegu, kot če bi bilo za vsako posamezno prijavo ali patentno prijavo specifično in individualno navedeno, daje vključena kot referenca.
Čeprav smo gornji izum opisali podrobno s pomočjo ilustracij in primerov za namene jasnosti razumevanja, bo očitno, da lahko v obsegu priloženih zahtevkov prakticiramo določene spremembe in modifikacije.
- 54 Seznani sekvenc (D Splošne informacije:
(i-Prijavitelj-.cigan, amy l
CZΑΡΙΑ, THOMAS H FALLIS, LYNN MEYER, TERRY E MUNDELL, SCOTT A SABUS, BRIAN SCHUBERT, KAREL (ii) Naslov izuma: Proteini z insekticidnimi aktivnostmi in postopek uporabe (iii) Število sekvenc: 11 (iv) Naslov za dopisovanje:
(A) Naslovnik: w. murray spruill (alston & bird, llp, (b) Cesta: 3605 glenwood ave.
(c) Mesto: raleigh (d) Dežela: nc (e) Država: us a (f) Poštna številka: 27622 (v) Računalniško berljiva oblika:
(a) Tij) medija: Fioppy disk (B) Računalnik: IBM PC kompatibilen (c) Operacijski sistem: PC-DOS/MS-DOS (D) Softver: Patentln Release #l.0, verzija #1.30 (vi) Trenutni podatki o prijavi:
(a) Številka prijave:
(B) Datum vložitve:
(c) Klasifikacija:
(viii) Informacija o zastopniku:
(a) line: spruill, w. murray (b) Registrska štev.: ^2,943 (c) Referenca: 5718-9 (ix) Telekomunikacijske informacije:
(A) Telefon: 919 420 2202 (b) Telefax: 919 881 3175 (2) Informacije za seq id N0:i:
(i) Sekvenčne karakteristike:
(A) Dolžina: 1469 baznih parov (B) Tip: nukleinska kislina (c)Verižnost: enojna (D)Topologija: linearna di) Tip molekule ; cdna (vi) Originalen vir:
(A)Organizem: Pentaclethra macroloba
- 55 (ixj Značilnost:
(a) Ime/ključ: cds (B)Lokacija: 3i..1257 (xi) Opis sekvence: seq id no:1:
CGGCACGAGC TCGTACAGAT TCTATCCATT ATG AAG TCG AAA ATG GCC ATG CTC 54
Met Lys Ser Lys Met Ala Met Leu
5
CTT TTG Leu Leu 10 | TTA Leu | TTT Phe | TGT GTG TTA TCT AAT CAG CTA GTG GCA GCA TTT TCC | 102 | ||||||||||||
Cys Val | Leu Ser 15 | Asn | Gin | Leu | Val Ala 20 | Ala | Phe | Ser | ||||||||
ACA | CAA | GCG | AAA | GCT | TCT | AAA | GAT | GGA | AAC | TTA | GTC | ACA | GTT | CTT | GCC | 150 |
Thr | Gin | Ala | Lys | Ala | Ser | Lys | Asp | Gly | Asn | Leu | Val | Thr | Val | Leu | Ala | |
25 | 30 | 35 | 40 | |||||||||||||
ATT | GAT | GGA | GGT | GGT | ATC | AGA | GGA | ATT | ATC | CCC | GGA | GTT | ATT | CTC | AAA | 198 |
Ile | Asp | Gly Gly Gly | Ile | Arg | Gly | Ile | Ile | Pro | Gly | Val | Ile | Leu | Lys | |||
45 | 50 | 55 | ||||||||||||||
CAA | CTA | GAA | GCT | ACT | CTT | CAG | AGA | TGG | GAC | TCA | AGT | GCA | AGA | CTA | GCA | 246 |
Gin | Leu | Glu | Ala | Thr | Leu | Gin | Arg | Trp | Asp | Ser | Ser | Ala | Arg | Leu | Ala | |
60 | 65 | 70 | ||||||||||||||
GAG | TAT | TTT | GAT | GTG | GTT | GCC | GGG | ACG | AGC | ACT | GGA | GGG | ATT | ATA | ACT | 294 |
Glu | Tyr | Phe | Asp | Val | Val | Ala | Gly | Thr | Ser | Thr | Gly Gly | Ile | Ile | Thr | ||
75 | 80 | 85 | ||||||||||||||
GCC | ATT | CTA | ACT | GCC | CCG | GAC | CCA | CAA | AAC | AAG | GAC | CGT | CCT | TTG | TAT | 342 |
Ala | Ile | Leu | Thr | Ala | Pro | Asp | Pro | Gin | Asn | Lys | Asp | Arg | Pro | Leu | Tyr | |
90 | 95 | 100 | ||||||||||||||
GCT | GCC | GAA | GAA | ATT | ATC | GAC | TTC | TAC | ATA | GAG | CAT | GGT | CCT | TCC | ATT | 390 |
Ala | Ala | Glu | Glu | Ile | Ile | Asp | Phe | Tyr | Ile | Glu | His | Gly | Pro | Ser | Ile | |
105 | 110 | 115 | 120 | |||||||||||||
TTT | AAT | AAA | TCC | ACC | GCC | TGC | TCG | TTG | CCT | GGT | ATC | TTT | TGT | CCA | AAG | 438 |
Phe | Asn | Lys | Ser | Thr | Ala | Cys | Ser | Leu | Pro | Gly | Ile | Phe | Cys | Pro | Lys | |
125 | 130 | 135 | ||||||||||||||
TAT | GAT | GGG | AAG | TAT | TTA | CAA | GAA | ATA | ATA | AGC | CAG | AAA | TTG | AAT | GAA | 486 |
Tyr | Asp | Gly | Lys | Tyr | Leu | Gin | Glu | Ile | Ile | Ser | Gin | Lys | Leu | Asn | Glu | |
140 | 145 | 150 | ||||||||||||||
ACA | CTA | CTA | GAC | CAG | ACA | ACA | ACA | AAT | GTT | GTT | ATC | CCT | TCC | TTC | GAC | 534 |
Thr | Leu | Leu | Asp | Gin | Thr | Thr | Thr | Asn | Val | Val | Ile | Pro | Ser | Phe | Asp | |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||||
ATC | AAG | CTT | CTT | CGT | CCA | ACC | ATA | TTC | TCA | ACT | TTC | AAG | TTA | GAG | GAA | 582 |
Ile | Lys | Leu | Leu | Arg | Pro | Thr | Ile | Phe | Ser | Thr | Phe | Lys | Leu | Glu | Glu | |
170 | 17S | 180 | ||||||||||||||
GTT | CCT | GAG | TTA | AAT | GTC | AAA | CTC | TCC | GAT | GTA | TGC | ATG | GGA | ACT | TCA | 630 |
Val | Pro | Glu | Leu | Asn | Val | Lys | Leu | Ser | Asp | Val | Cys | Met | Gly | Thr | Ser | |
185 | 190 | 195 | 200 | |||||||||||||
GCA | GCA | CCA | ATC | GTA | TTT | CCT | CCC | TAT | TAT | TTC | AAG | CAT | GGA | GAT | ACT | 678 |
Al a | Al a | - 56 - | ||||
Pro | Ile | Val Phe Pro Pro Tyr Tyr | Phe Lys His Gly Asp Thr 215 | |||
205 | 210 | |||||
GAA | TTC | AAT | CTC | GTT GAT GGT GCA ATC | ATC | GCT GAT ATT CCG GCC CCG 726 |
Glu | Phe | Asn | Leu | Val Asp Gly Ala Ile | Ile | Ala Asp Ile Pro Ala Pro |
220 | 225 | 230 | ||||
GTT | GCT | CTC | AGC | GAG GTG CTC CAG CAA | GAA | AAA TAC AAG AAT AAA GAA 774 |
Val | Al a | Leu | Ser | Glu Val Leu Gin Gin | Glu | Lys Tyr Lys Asn Lys Glu |
235 240 245
ATC CTT Ile Leu | TTG Leu | CTG TCT ATA GGA ACT GGA GTT GTA AAA CCT GGT GAG GGT | 822 | |||||||||||||
Leu Ser | Ile Gly Thr Gly Val Val Lys Pro Gly Glu Gly | |||||||||||||||
250 | 255 | 260 | ||||||||||||||
TAT | TCT | GCT | AAT | CGT | ACT | TGG | ACT | ATT | TTC | GAT | TGG | AGT | AGT | GAA | ACT | 870 |
Tyr | Ser | Ala | Asn | Arg | Thr | Trp | Thr | Ile | Phe | Asp | Trp | Ser | Ser | Glu | Thr | |
265 | 270 | 275 | 280 | |||||||||||||
TTA | ATC | GGG | CTT | ATG | GGT | CAT | GGA | ACG | AGA | GCC | ATG | TCT | GAT | TAT | TAC | 918 |
Leu | Ile | Gly | Leu | Met | Gly | His | Gly | Thr | Arg | Ala | Met | Ser | Asp | Tyr | Tyr | |
285 | 290 | 295 | ||||||||||||||
GTT | GGC | TCA | CAT | TTC | AAA | GCC | CTT | CAA | CCC | CAG | AAT | AAC | TAC | CTC | CGA | 966 |
Val | Gly | Ser | His | Phe | Lys | Ala | Leu | Gin | Pro | Gin | Asn | Asn | Tyr | Leu | Arg | |
300 | 305 | 310 | ||||||||||||||
ATT | CAG | GAA | TAC | GAT | TTA | GAT | CCG | GCA | CTG | GAA | AGC | ATT | GAT | GAT | GCT | 1014 |
Ile | Gin | Glu | Tyr | Asp | Leu | Asp | Pro | Ala | Leu | Glu | Ser | Ile | Asp | Asp | Ala | |
315 | 320 | 325 | ||||||||||||||
TCA | ACG | GAA | AAC | ATG | GAG | AAT | CTG | GAA | AAG | GTA | GGA | CAG | AGT | TTG | TTG | 1062 |
Ser | Thr | Glu | Asn | Met | Glu | Asn | Leu | Glu | Lys | Val | Gly | Gin | Ser | Leu | Leu | |
330 | 335 | 340 | ||||||||||||||
AAC | GAA | CCA | GTT | AAA | AGG | ATG | AAT | CTG | AAT | ACT | TTT | GTC | GTT | GAA | GAA | 1110 |
Asn | Glu | Pro | Val | Lys | Arg | Met | Asn | Leu | Asn | Thr | Phe | Val | Val | Glu | Glu | |
345 | 350 | 355 | 360 | |||||||||||||
ACA | GGT | GAA | GGT | ACC | AAT | GCA | GAA | GCT | TTA | GAC | AGG | CTG | GCT | CAG | ATT | 1158 |
Thr | Gly | Glu | Gly | Thr | Asn | Ala | Glu | Ala | Leu | Asp | Arg | Leu | Ala | Gin | Ile | |
365 | 370 | 375 | ||||||||||||||
CTT | TAT | GAA | GAA | AAG | ATT | ACT | CGT | GGT | CTC | GGA | AAG | ATA | TCT | TTG | GAA | 1206 |
Leu | Tyr | Glu | Glu | Lys | Ile | Thr | Arg | Gly | Leu | Gly | Lys | Ile | Ser | Leu | Glu | |
380 | 385 | 390 | ||||||||||||||
GTG | GAT | AAC | ATT | GAT | CCA | TAT | ACT | GAA | CGT | GTT | AGG | AAA | CTG | CTA | TTC | 1254 |
Val | Asp | Asn | Ile | Asp | Pro | Tyr | Thr | Glu | Arg | Val | Arg | Lys | Leu | Leu | Phe |
395 400 405
TGA TACGAATTGA AGTTGTTTCC TCCTTGCCAT ATAGCCTCAC TTTGTTTGGC 1307 *
AATAAATAAA TAAATAAATG TAATCGTTTG GTTTGATGTC CTTGACTTTG TCATATATGC 1367
TGGCTCTATA AGAAGCACCA GCAGATAAAT AAAGGTTAAT GTTTGAGGTA TWAARWAAAA 1427
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAACTC GA
1469
- 57 (2) Informacije za:SEQ id no.-2:
(i) Sekvenčne karakteristike:
(a) Dolžina: 409 amino kislin (b) Tip: amino kislina (d) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: protein
(xi) Opis sekvence: | SEQ ID N0:2: | ||||||||||||||
Met | Lys | Ser | Lys | Met | Ala | Met | Leu | Leu | Leu | Leu | Phe | Cys | Val | Leu | Ser |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Asn | Gin | Leu | Val | Ala | Ala | Phe | Ser | Thr | Gin | Ala | Lys | Ala | Ser | Lys | Asp |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gly | Asn | Leu | Val | Thr | Val | Leu | Ala | Ile | Asp | Gly | Gly Gly | Ile | Arg | Gly | |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Ile | Ile | Pro | Gly | Val | Ile | Leu | Lys | Gin | Leu | Glu | Ala | Thr | Leu | Gin | Arg |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Trp | Asp | Ser | Ser | Ala | Arg | Leu | Ala | Glu | Tyr | Phe | Asp | Val | Val | Ala | Gly |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Thr | Ser | Thr | Gly | Gly | Ile | Ile | Thr | Ala | Ile | Leu | Thr | Ala | Pro | Asp | Pro |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Gin | Asn | Lys | Asp | Arg | Pro | Leu | Tyr | Ala | Ala | Glu | Glu | Ile | Ile | Asp | Phe |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Tyr | Ile | Glu | His | Gly | Pro | Ser | Ile | Phe | Asn | Lys | Ser | Thr | Ala | Cys | Ser |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Leu | Pro | Gly | Ile' | Phe | Cys | Pro | Lys | Tyr | Asp | Gly | Lys | Tyr | Leu | Gin | Glu |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Ile | Ile | Ser | Gin | Lys | Leu | Asn | Glu | Thr | Leu | Leu | Asp | Gin | Thr | Thr | Thr |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Asn | Val | Val | Ile | Pro | Ser | Phe | Asp | Ile | Lys | Leu | Leu | Arg | Pro | Thr | Ile |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Phe | Ser | Thr | Phe | Lys | Leu | Glu | Glu | Val | Pro | Glu | Leu | Asn | Val | Lys | Leu |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Ser | Asp | Val | Cys | Met | Gly | Thr | Ser | Ala | Ala | Pro | Ile | Val | Phe | Pro | Pro |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Tyr | Tyr | Phe | Lys | His | Gly | Asp | Thr | Glu | Phe | Asn | Leu | Val | Asp | Gly | Ala |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Ile | Ile | Ala | Asp | Ile | Pro | Ala | Pro | Val | Ala | Leu | Ser | Glu | Val | Leu | Gin |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gin | Glu | Lys | Tyr | Lys | Asn | Lys | Glu | Ile | Leu | Leu | Leu | Ser | Ile | Gly | Thr |
245 | 250 | 2S5 |
Gly | Val | Val | Lys 260 | Pro | Gly Glu Gly Tyr Ser Ala Asn Arg Thr Trp | Thr | |||||||||
265 | 270 | ||||||||||||||
Ile | Phe | Asp | Trp | Ser | Ser | Glu | Thr | Leu | Ile | Gly | Leu | Met | Gly | His | Gly |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Thr | Arg | Al a | Met | Ser | Asp | Tyr | Tyr | Val | Gly | Ser | Hi s | Phe | Lys | Ala | Leu |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Gin | Pro | Gin | Asn | Asn | Tyr | Leu | Arg | Ile | Gin | Glu | Tyr | Asp | Leu | Asp | Pro |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Al a | Leu | Glu | Ser | Ile | Asp | Asp | Ala | Ser | Thr | Glu | Asn | Met | Glu | Asn | Leu |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Glu | Lys | Val | Gly | Gin | Ser | Leu | Leu | Asn | Glu | Pro | Val | Lys | Arg | Met | Asn |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Leu | Asn | Thr | Phe | Val | Val | Glu | Glu | Thr | Gly | Glu | Gly | Thr | Asn | Ala | Glu |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Al a | Leu | Asp | Arg | Leu | Ala | Gin | Ile | Leu | Tyr | Glu | Glu | Lys | Ile | Thr | Arg |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Gly | Leu | Gly | Lys | Ile | Ser | Leu | Glu | Val | Asp | Asn | Ile | Asp | Pro | Tyr | Thr |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Glu | Arg | Val | Arg | Lys | Leu | Leu | Phe | * |
405 (2) Informacije za: seq id no:3:
(i) Sekvenčne karakteristike:
(A) Dolžina: 1227 baznih parov (b) Tip: nu^einska kislina (O Veriznost: enojna (d) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: druga nukleinska kislina (A) Opis: /desc = cDNA Pentin-1 npti mi ram za povečano ekspresijo” (vi) Originalen vir:
(A) Organizem: Pentaclethra macroloba (ix) Značilnost:
(A) Ime/ključ: Cds (b)Lokacija: 1..1227 (xi) Opis sekvence: seq ID no:3.·
ATG | AAG | TCC | AAG | ATG | GCC | ATG | CTC | CTC | CTC | CTC | TTC | TGC | GTG | CTC | TCC | 48 |
Met | Lys | Ser | Lys | Met | Ala | Met | Leu | Leu | Leu | Leu | Phe | Cys | Val | Leu | Ser | |
410 | 415 | 420 | 425 | |||||||||||||
AAC | CAG | CTC | GTG | GCC | GCG | TTC | TCC | ACC | CAG | GCC | AAG | GCC | TCC | AAG | GAC | 96 |
Asn | Gin | Leu | Val | Ala | Ala | Phe | Ser | Thr | Gin | Ala | Lys | Ala | Ser | Lys | Asp |
430 435 440
GGC AAC CTC | GTG ACC GTG CTC | GCC ATC GAC GGC GGC GGC ATC CGC GGC | 144 | ||||||||
Gly | Asn | Leu | Val Thr 445 | Val | Leu | Ala Ile Asp 450 | Gly Gly Gly | Ile 455 | Arg | Gly | |
ATC | ATC | CCG | GGC GTG | ATC | CTC | AAG CAG CTC | GAG GCG ACC | CTC | CAG | AGG | 192 |
Ile | Ile | Pro 460 | Gly Val | Ile | Leu | Lys Gin Leu 465 | Glu Ala Thr 470 | Leu | Gin | Arg | |
TGG | GAC | TCC | AGC GCC | AGG | CTC | GCG GAG TAC | TTC GAC GTG | GTG | GCC | GGC | 240 |
Trp | Asp | Ser | Ser Ala | Arg | Leu | Ala Glu Tyr | Phe Asp Val | Val | Ala | Gly |
475 480 485
ACC | TCC | ACC | GGC | GGC | ATC | ATC | ACC | GCC | ATC | CTC | ACC | GCC | CCG | GAC | CCG | 288 |
Thr 490 | Ser | Thr | Gly Gly | Ile 495 | Ile | Thr | Ala | Ile | Leu 500 | Thr | Ala | Pro | Asp | Pro 505 | ||
CAG | AAC | AAG | GAC | CGC | CCG | CTC | TAC | GCC | GCC | GAG | GAG | ATC | ATC | GAC | TTC | 336 |
Gin | Asn | Lys | Asp | Arg 510 | Pro | Leu | Tyr | Ala | Ala 515 | Glu | Glu | Ile | Ile | Asp 520 | Phe | |
TAC | ATC | GAG | CAC | GGC | CCG | TCC | ATC | TTC | AAC | AAG | TCC | ACC | GCC | TGC | TCC | 384 |
Tyr | Ile | Glu | Hi S 525 | Gly | Pro | Ser | Ile | Phe 530 | Asn | Lys | Ser | Thr | Ala 535 | Cys | Ser | |
CTC | CCG | GGC | ATC | TTC | TGC | CCG | AAG | TAC | GAC | GGC | AAG | TAC | CTC | CAG | GAG | 432 |
Leu | Pro | Gly 540 | Ile | Phe | Cys | Pro | Lys 545 | Tyr | Asp | Gly | Lys | Tyr 550 | Leu | Gin | Glu | |
ATC | ATC | TCC | CAG | AAG | CTC | AAC | GAG | ACC | CTC | CTC | GAC | CAG | ACC | ACC | ACC | 480 |
Ile | Ile 555 | Ser | Gin | Lys | Leu | Asn 560 | Glu | Thr | Leu | Leu | Asp 565 | Gin | Thr | Thr | Thr | |
AAC | GTG | GTG | ATC | CCG | TCC | TTC | GAC | ATC | AAG | CTC | CTC | CGC | CCG | ACC | ATC | 528 |
Asn 570 | Val | Val | Ile | Pro | Ser 575 | Phe | Asp | Ile | Lys | Leu 580 | Leu | Arg | Pro | Thr | Ile 585 | |
TTC | TCC | ACC | TTC | AAG | CTC | GAG | GAG | GTG | CCG | GAG | CTC | AAC | GTG | AAG | CTC | 576 |
Phe | Ser | Thr | Phe | Lys 590 | Leu | Glu | Glu | Val | Pro 595 | Glu | Leu | Asn | Val | Lys 600 | Leu | |
TCC | GAC | GTG | TGC | ATG | GGC | ACC | TCC | GCC | GCC | CCG | ATC | GTG | TTC | CCG | CCG | 624 |
Ser | Asp | Val | Cys 605 | Met | Gly | Thr | Ser | Ala 610 | Ala | Pro | Ile | Val | Phe 615 | Pro | Pro | |
TAC | TAC | TTC | AAG | CAC | GGC | GAC | ACC | GAG | TTC | AAC | CTC | GTC | GAC | GGC | GCG | 672 |
Tyr | Tyr | Phe 620 | Lys | Hi s | Gly Asp | Thr 625 | Glu | Phe | Asn | Leu | Val 630 | Asp | Gly | Ala | ||
ATC | ATC | GCG | GAC | ATC | CCA | GCC | CCG | GTG | GCC | CTC | TCC | GAG | GTG | CTC | CAG | 720 |
Ile | Ile 635 | Ala | Asp | Ile | Pro | Ala 640 | Pro | Val | Ala | Leu | Ser 645 | Glu | Val | Leu | Gin | |
CAG | GAG | AAG | TAC | AAG | AAC | AAG | GAG | ATC | CTC | CTC | CTG | AGC | ATC | GGC | ACC | 768 |
Gin 650 | Glu | Lys | Tyr | Lys | Asn 655 | Lys | Glu | Ile | Leu | Leu 660 | Leu | Ser | Ile | Gly | Thr 665 | |
GGC | GTG | GTG | AAG | CCG | GGC | GAG | GGC | TAC | TCC | GCC | AAC | CGC | ACC | TGG | ACC | 816 |
Gly | Val | Val | Lys | Pro | Gly | Glu | Gly | Tyr | Ser | Ala | Asn | Arg | Thr | Trp | Thr |
670 675 680
ATC TTC GAC TGG TCC TCC GAG ACC CTC ATC GGC CTC ATG GGG CAC GGC | 864 | |||||||||||||||
Ile | Phe Asp | Trp Ser 685 | Ser | Glu | Thr | Leu 690 | Ile | Gly Leu Met | Gly His 695 | Gly | ||||||
ACC | CGC | GCC | ATG | TCC | GAC | TAC | TAC | GTG | GGC | TCC | CAC | TTC | AAG | GCC | CTC | 912 |
Thr | Arg | Al a | Met | Ser | Asp | Tyr | Tyr | Val | Gly | Ser | His | Phe | Lys | Ala | Leu | |
700 | 705 | 710 | ||||||||||||||
CAG | CCG | CAG | AAC | AAC | TAC | CTC | CGC | ATC | CAG | GAG | TAC | GAC | CTC | GAC | CCG | 960 |
Gin | Pro | Gin | Asn | Asn | Tyr | Leu | Arg | Ile | Gin | Glu | Tyr | Asp | Leu | Asp | Pro | |
715 | 720 | 725 | ||||||||||||||
GCC | CTC | GAG | TCC | ATC | GAC | GAC | GCC | TCC | ACC | GAG | AAC | ATG | GAG | AAC | CTC | 1008 |
Al a | Leu | Glu | Ser | Ile | Asp | Asp | Ala | Ser | Thr | Glu | Asn | Met | Glu | Asn | Leu | |
730 | 735 | 740 | 745 | |||||||||||||
GAG | AAG | GTG | GGC | CAG | TCC | CTC | CTC | AAC | GAG | CCG | GTG | AAG | CGC | ATG | AAC | 1056 |
Glu | Lys | Val | Gly | Gin | Ser | Leu | Leu | Asn | Glu | Pro | Val | Lys | Arg | Met | Asn | |
750 | 755 | 760 | ||||||||||||||
CTC | AAC | ACG | TTC | GTC | GTG | GAG | GAG | ACC | GGC | GAG | GGG | ACC | AAC | GCC | GAG | 1104 |
Leu | Asn | Thr | Phe | Val | Val | Glu | Glu | Thr | Gly | Glu | Gly | Thr | Asn | Ala | Glu | |
765 | 770 | 775 | ||||||||||||||
GCG | CTC | GAC | CGC | CTC | GCC | CAG | ATC | CTC | TAC | GAG | GAG | AAG | ATC | ACC | CGC | 1152 |
Al a | Leu | Asp | Arg | Leu | Al a | Gin | Ile | Leu | Tyr | Glu | Glu | Lys | Ile | Thr | Arg | |
780 | 785 | 790 | ||||||||||||||
GGC | CTC | GGC | AAG | ATC | TCC | CTC | GAG | GTG | GAC | AAC | ATC | GAC | CCG | TAC | ACC | 1200 |
Gly | Leu | Gly | Lys | Ile | Ser | Leu | Glu | Val | Asp | Asn | Ile | Asp | Pro | Tyr | Thr | |
795 | 800 | 805 | ||||||||||||||
GAG | CGC | GTG | CGC | AAG | CTC | CTC | TTC | TGA | 1227 | |||||||
Glu | Arg | Val | Arg | Lys | Leu | Leu | Phe | * |
810 815 (2) Informacije za:sEQ id no:4:
(i) Sekvenčne karakteristike:
(a) Dolžina: 409 amino kislin (b) Tip: amino kislina (d) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: protein (xi) Opis sekvence: seq id no:4:
Met 1 | Lys | Ser | Lys | Met 5 | Ala | Met | Leu | Leu | Leu 10 | Leu | Phe | Cys | Val | Leu 15 | Ser |
Asn | Gin | Leu | Val 20 | Ala | Ala | Phe | Ser | Thr 25 | Gin | Ala | Lys | Ala | Ser 30 | Lys | Asp |
Gly | Asn | Leu 35 | Val | Thr | Val | Leu | Ala 40 | Ile | Asp | Gly | Gly | Gly 45 | Ile | Arg | Gly |
Ile | Ile 50 | Pro | Gly | Val | Ile | Leu 55 | Lys | Gin | Leu | Glu | Ala 60 | Thr | Leu | Gin | Arg |
Trp Asp Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Tyr Phe Asp Val Val Ala Gly | |||||||||||||||
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Thr | Ser | Thr | Gly Gly 85 | lle | lle | Thr | Ala | lle 90 | Leu | Thr | Ala | Pro | Asp 95 | Pro | |
Gin | Asn | Lys | Asp 100 | Arg | Pro | Leu | Tyr | Ala 105 | Ala | Glu | Glu | lle | lle 110 | Asp | Phe |
Tyr | lle | Glu 115 | Hls | Gly | Pro | Ser | lle 120 | Phe | Asn | Lys | Ser | Thr 125 | Ala | Cys | Ser |
Leu | Pro 130 | Gly | lle | Phe | Cys | Pro 135 | Lys | Tyr | Asp | Gly | Lys 140 | Tyr | Leu | Gin | Glu |
lle 145 | lle | Ser | Gin | Lys | Leu 150 | Asn | Glu | Thr | Leu | Leu 155 | Asp | Gin | Thr | Thr | Thr 160 |
Asn | Val | Val | lle | Pro 165 | Ser | Phe | Asp | lle | Lys 170 | Leu | Leu | Arg | Pro | Thr 175 | lle |
Phe | Ser | Thr | Phe 180 | Lys | Leu | Glu | Glu | Val 185 | Pro | Glu | Leu | Asn | Val 190 | Lys | Leu |
Ser | Asp | Val 195 | Cys | Met | Gly | Thr | Ser 200 | Ala | Ala | Pro | lle | Val 205 | Phe | Pro | Pro |
Tyr | Tyr 210 | Phe | Lys | His | Gly | Asp 215 | Thr | Glu | Phe | Asn | Leu 220 | Val | Asp | Gly | Ala |
lle 225 | lle | Ala | Asp | lle | Pro 230 | Ala | Pro | Val | Ala | Leu 235 | Ser | Glu | Val | Leu | Gin 240 |
Gin | Glu | Lys | Tyr | Lys 245 | Asn | Lys | Glu | lle | Leu 250 | Leu | Leu | Ser | lle | Gly 255 | Thr |
Gly | Val | Val | Lys 260 | Pro | Gly | Glu | Gly | Tyr 265 | Ser | Ala | Asn | Arg | Thr 270 | Trp | Thr |
lle | Phe | Asp 275 | Trp | Ser | Ser | Glu | Thr 280 | Leu | lle | Gly | Leu | Met 285 | Gly | His | Gly |
Thr | Arg 290 | Ala | Met | Ser | Asp | Tyr 295 | Tyr | Val | Gly | Ser | His 300 | Phe | Lys | Ala | Leu |
Gin 305 | Pro | Gin | Asn | Asn | Tyr 310 | Leu | Arg | lle | Gin | Glu 315 | Tyr | Asp | Leu | Asp | Pro 320 |
Ala | Leu | Glu | Ser | lle 325 | Asp | Asp | Ala | Ser | Thr 330 | Glu | Asn | Met | Glu | Asn 335 | Leu |
Glu | Lys | Val | Gly 340 | Gin | Ser | Leu | Leu | Asn 345 | Glu | Pro | Val | Lys | Arg 350 | Met | Asn |
Leu | Asn | Thr 355 | Phe | Val | Val | Glu | Glu 360 | Thr | Gly | Glu | Gly | Thr 365 | Asn | Ala | Glu |
Ala | Leu | Asp | Arg | Leu | Ala | Gin | lle | Leu | Tyr | Glu | Glu | Lys | lle | Thr | Arg |
370 375 380
Gly Leu Gly Lys Ile Ser Leu Glu Val Asp Asn Ile Asp Pro Tyr Thr 385 390 395 400
Glu Arg Val Arg Lys Leu Leu Phe *
405 (2) Informacije za: seq id no:5:
(D SekvenČne karakteristike:
(a) Dolžina: 16 amino kislin (b) Tip:~amino kislina (c) Veriznost: enojna (d) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: peptid (vi) Originalni vir:
(A) Organizem: Pentaclethra macroloba (xi) Opis sekvence: seq id no:5:
Met Ser Thr Ser Ala Ala Pro Ile Val Phe Pro Pro Tyr Tyr Phe Lys 15 10 15 (2) Informacije za:sEQ id no:6:
(i) SekvenČne karakteristike:
(A) Dolžina: 16 amino kislin (B) Tip:amino kislina (c) Verižnost: enojna (D) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: peptid (vi) Originalen vir:
(A)Organizem: Pentaclethra macroloba (xi) Opis sekvence: Seq id no:6:
Ala Leu Gin Pro Gin Asn Asn Tyr Leu Arg Gin Glu Tyr Asp Leu Asp 15 10 15 (2, Informacije za:sEQ id no:7:
(D SekvenČne karakteristike:
(A, Dolžina: 13 amino kislin (b) Tip: amino kislina (c) Verižnost: enojna ( d ) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: peptid (vi)Originalen vir (A) Organizem: Pentaclethra macroloba (xi) Opis sekvence: SEq id no:7:
Pro Asp Trp Val Val Ile Arg Ser Gin Ser Val Gly Lys 15 10 (2) Informacije za: seq id NO:8:
(ί) Sekvenčne.karakteristike:
(A) Dolžina: 16 amino kislin (B) Tip: amino kislina (c; Verižnost: enojna (D) Topologija: linearna (ii, Tip molekule: peptid (vi) Originalen vir:
(A) Organizem: Pentaclethra macroloba (xi) Opis sekvence: seq id no:8:
Lys Ala Phe Val Asn Gly Val Tyr Phe Ile Asn Thr Tyr Asp Ser Ala 15 10 15 (2) Informacije za:sEQ id νο.·9:
(i) Sekvenčne karakteristike:
(a) Dolžina: 15 amino kislin (b) Tipkami no kislina (c) Verižnost: enojna (D) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: peptid (vi) Originalen vir:
(A) Organizem: Pentaclethra macroloba (xi) Opis sekvence: seq id no:9:
Asn Asn Tyr Leu Arg Ile Gin Glu Tyr Asp Leu Pro Pro Ala Leu 15 10 15 (2) Informacije za:gEQ id no:10:
(i) Sekvenčne karakteristike:
(a) Dolžina: 11 amino kislin (B) Tip:~amino kislina (c) Verižnost: enojna (d) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: peptid
- Μ (vi) Originalen vir:
(A) Organizem: pentaclethra raacroloba (xi> Opis sekvence: SEq id nchio:
Val Val Lys Arg Leu Ala Gly Tyr Phe Asp Val 15 10 (2) Informacije za: SEq id no:11:
(i) Sekvenčne karakteristike:
(a)Dolžina: 8 amino kislin (B)Tip: amino kislina (c)Verižnost: enojna (D)Topologija: linearna (ii) Tip molekule: peptid (vi, Originalen vir:
(A) Organizem: Pentaclethra macroloba (xi)
Glu
Opis sekvence:
SEQ ID NO:11:
Asn Met Glu Asn Leu Glu Lys 5
Za
PIONEER HI-BREAD INTERNATIONAL INC THE BOARD OF REGENTS FOR THE UNIVERSITY OF OKLAHOMA:
PATENTNA PISARNA, d.o.o. LJUBLJANA, ČOPOVA 14
Claims (32)
- Patentni zahtevki1. V bistvu očiščen protein, izoliran iz rodu Pentaclethra, ki ima insekticidne lastnosti.
- 2. V bistvu očiščen polipeptid, označen s tem, da obsega amino kislinsko sekvenco, izbrano iz skupine, ki obstoji iz:a) amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;b) ostankov 22-409 sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;c) ostankov 29-409 amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO.2; ind) pesticidno aktivnega fragmenta amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2.
- 3. Polipeptid z insekticidno aktivnostjo proti koruznemu koreninskemu črvu, označen s tem, da polipeptid obsega variacijo amino kislinske sekvence, izbrane iz skupine, ki obstoji iz:a) amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;b) ostankov 22-409 sekvence, navedene v SEQ ID NO.2; inc) ostankov 29-409 amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2, pri čemer variacija obsega vsaj eno amino kislinsko substitucijo, trunkacijo, notranjo delecijo ali insercijo.
- 4. Protein po zahtevku 1, označen s tem, da ima amino kislinsko sekvenco, kot je navedena na sl. 1 in SEQ ID NOS: 1 in 2.
- 5. V bistvu očiščen protein z insekticidno aktivnostjo, označen s tem, da obsega amino kislinsko sekvenco, navedeno na sl. 1 in SEQ ID NOSU in 2.
- 6. DNA sekvenca, ki kodira protein po zahtevku 5.
- 7. Vektor, označen s tem, da obsega DNA sekvenco po zahtevku 6.ββ
- 8. Izolirana nukleotidna sekvenca, ki kodira polipeptid z insekticidno aktivnostjo proti koruznemu koreninskemu črvu, označena s tem, da ta nukleotidna sekvenca kodira polipeptid, izbran iz skupine, ki obstoji iz;a) amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;b) ostankov 22-409 sekvence, navedene v SEQ ID NO;2;c) ostankov 29-409 amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;d) polipeptida, ki obsega variacijo (a), (b) ali (c), kjer ta variacija obsega vsaj eno amino kislinsko substitucijo, trunkacijo, notranjo delecijo ali insercijo.
- 9. Izolirana nukleotidna molekula, ki kodira polipeptid z insekticidno aktivnostjo, označena s tem, da ima sekvenco, izbrano iz skupine, ki obstoji iz;a) sekvence, navedene na sl. 1 in SEQ ID NO; 1;b) nukleotidnih sekvenc, ki kodirajo polipeptid z insekticidno aktivnostjo in ki se hibridizirajo na sekvence od (a) zgoraj ob ostrih pogojih, definiranih z izpiralno stringenco 0,3M NaCI, 0,03 M natrijevega citrata, 0,1% SDS pri 70 °C;(c) nukleotidnih sekvenc, ki kodirajo polipeptid z insekticidno aktivnostjo in ki se razlikujejo od sekvenc od (a) in (b) zaradi degeneracije genetskega koda.
- 10. Organizem, označen s tem, daje bil transformiran z vektorjem po zahtevku 7.
- 11. Izolirana nukleotidna sekvenca, označen s tem, da kodira protein, naveden na sl. 1
- 12. Nukleotidna sekvenca po zahtevku 11, označena s tem, daje nukleotidna sekvenca, navedena na sl. 1 in SEQ ID NO: 1.
- 13. DNA sekvenca po zahtevku 11, označena s tem, daje sintetska sekvenca.
- 14. DNA sekvenca po zahtevku 13, označena s tem, da smo jo optimirali za ekspresijo v koruzi.
- 15. Rastlina, kije bila stabilno transformirana z ekspresijsko kaseto, ki obsega promotor, ki vodi ekspresijo v rastlinski celici, operabilno vezani na nukleotidno sekvenco, ki kodira insekticidni protein, pri čemer protein izberemo iz skupine, ki obstoji iz:a) amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;b) ostankov 22-409 sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;c) ostankov 29-409 amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;d) polipeptida, ki obsega variacijo od (a), (b) ali (c), pri čemer ta variacija obsega vsaj eno amino kislinsko substitucijo, trunkacijo, notranjo delecijo ali insercijo.
- 16. Rastlina po zahtevku 15, označena s tem, daje rastlina koruza.
- 17. Seme rastline po zahtevku 15 ali 16.
- 18. Rastlina po zahtevku 15, označena s tem, da nukleotidna sekvenca kodira amino kislinsko sekvenco, navedeno na sl. 1 in SEQ ID NOSU in 2.
- 19. Rastlina po zahtevku 15, označena s tem, daje nukleotidna sekvenca sekvenca, navedena na sl. 1 in SEQ ID NO: 1.
- 20. Rastlina po zahtevku 15, označena s tem, daje nukleotidna sekvenca operabilno vezana na koreninsko prednosten promotor.
- 21. Rastlina po zahtevku 18, označena s tem, daje nukleotidna sekvenca operabilno vezana na koreninsko prednosten promotor.
- 22. Rastlina po zahtevku 19, označena s tem, daje nukleotidna sekvenca operabilno vezana na koreninsko prednosten promotor.
- 23. Postopek za zatiranje koruznega koreninskega črva, označen s tem, da obsega: transformiranje rastlinske celice z ekspresijsko kaseto, ki obsega promotor, ki vodi ekspresijo v rastlinski celici, operativno vezani na nukleotidno sekvenco, ki kodira insekticidni protein, pri čemer protein izberemo iz skupine, ki obstoji iz:a) amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;b) ostankov 22-409 sekvence, navedene v SEQ ID NO.2;c) ostankov 29-409 amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;d) polipeptida, ki obsega variacijo od (a), (b) ali (c), kjer ta variacija obsega vsaj eno amino kislinsko substitucijo, trunkacijo, notranjo delecijo ali insercijo.
- 24. Postopek po zahtevku 23, označen s tem, daje promotor koreninsko prednosten promotor.
- 25. Postopek po zahtevku 24, označen s tem, da ima nukleotidna sekvenca sekvenco, izbrano iz skupine, ki obstoji iz:(a) sekvence, navedene na sl. 1 in SEQ ID NO: 1;(b) nukleotidnih sekvenc, ki kodirajo polipeptid z insekticidno aktivnostjo in ki se hibridizirajo na sekvence od (a) zgoraj ob ostrih pogojih; in (c) nukleotidnih sekvenc, ki kodirajo polipeptid z insekticidno aktivnostjo in ki se razlikujejo od sekvenc od (a) in (b) zaradi degeneracije genetskega koda.
- 26. Postopek po zahtevku 25, označen s tem, daje rastlinska celica iz monokaličnice.
- 27. Postopek po zahtevku 26, označen s tem, daje monokaličnica koruza.
- 28. Rastlinska celica, ki smo jo stabilno transformirali z ekspresijsko kaseto, ki obsega promotor, ki vodi ekspresijo v rastlinski celici, operabilno vezani na nukleotidno sekvenco, ki kodira insekticidni protein, kjer ima ta protein aktivnost za koruznega koreninskega črva in ga izberemo iz skupine, ki obstoji iz:a) amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;b) ostankov 22-409 sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;c) ostankov 29-409 amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;d) polipeptida, ki obsega variacijo od (a), (b) ali (c), kjer ta variacija obsega vsaj eno amino kislinsko substitucijo, trunkacijo, notranjo delecijo ali insercijo.
- 29. Rastlinska celica po zahtevku 28, označena s tem, daje promotor koreninsko prednosten promotor.
- 30. Rastlinska celica po zahtevku 29, označena s tem, da ima nukleotidna sekvenca, sekvenco, izbrano iz skupine, ki obstoji iz:(a) sekvence, navedene na sl. 1 in SEQ ID NO:1;(b) nukleotidnih sekvenc, ki kodirajo polipeptid z insekticidno aktivnostjo in ki se hibridizirajo na sekvence od (a) zgoraj ob ostrih pogojih, definiranih z izpiralno stringenco 0,3M NaCI, 0,03 M natrijevega citrata, 0,1% SDS pri 70 °C; in (c) nukleotidnih sekvenc, ki kodirajo polipeptid z insekticidno aktivnostjo in ki se razlikujejo od sekvenc od (a) in (b) zaradi degeneracije genetskega koda.
- 31. Rastlinska celica po zahtevku 30, označena s tem, daje rastlinska celica iz monokaličnice.
- 32. Rastlina po zahtevku 31, označena s tem, daje monokaličnica koruza.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US4786497P | 1997-05-29 | 1997-05-29 | |
US09/074,912 US6057491A (en) | 1997-05-29 | 1998-05-08 | Protein having insecticidal activities and method of use |
PCT/US1998/009995 WO1998054327A1 (en) | 1997-05-29 | 1998-05-15 | Proteins having insecticidal activities and method of use |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SI20214A true SI20214A (sl) | 2000-10-31 |
SI20214B SI20214B (en) | 2001-12-31 |
Family
ID=26725524
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SI9820048A SI20214B (en) | 1997-05-29 | 1998-05-15 | Proteins having insecticidal activities and method of use |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6057491A (sl) |
EP (1) | EP0986645A1 (sl) |
AR (1) | AR016059A1 (sl) |
AU (1) | AU742709B2 (sl) |
BR (1) | BR9809516A (sl) |
CA (1) | CA2290776C (sl) |
CZ (1) | CZ297319B6 (sl) |
NZ (1) | NZ501218A (sl) |
SI (1) | SI20214B (sl) |
SK (1) | SK160099A3 (sl) |
WO (1) | WO1998054327A1 (sl) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SK466390A3 (en) * | 1989-09-27 | 2000-05-16 | Gist Brocades Nv | Purified and isolated dna sequence, construct, vector, transformed cell, peptide or protein having phytase activity, process for its preparation, and its use |
EP1073670A1 (en) | 1998-05-01 | 2001-02-07 | Maxygen, Inc. | Optimization of pest resistance genes using dna shuffling |
WO2001018179A1 (fr) * | 1999-09-07 | 2001-03-15 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Synthases de depsipeptides cycliques, genes correspondants et systeme de production de masse de ces depsipeptides cycliques |
WO2001036468A2 (en) * | 1999-11-15 | 2001-05-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel proteins having insecticidal activities and method of use |
US6657046B1 (en) | 2000-01-06 | 2003-12-02 | Monsanto Technology Llc | Insect inhibitory lipid acyl hydrolases |
WO2001049834A2 (en) | 2000-01-06 | 2001-07-12 | Monsanto Technology Llc | Preparation of deallergenized patatin proteins and patatin permutein proteins |
US6664097B2 (en) * | 2000-05-23 | 2003-12-16 | North Carolina State University | Polynucleotide encoding a Lactobacillus gasseri beta-glucuronidase polypeptide |
US6643672B1 (en) * | 2000-07-31 | 2003-11-04 | Hewlett-Packard Development Company, Lp. | Method and apparatus for asynchronous file writes in a distributed file system |
AU2002315052A1 (en) | 2001-05-15 | 2002-11-25 | Emory University | Polynucleotides and polypeptides relating to the modulation of sirp alpha-cd47 |
WO2003020929A1 (fr) * | 2001-08-28 | 2003-03-13 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Nouveau gene d'amide hydrolase |
US20060212964A9 (en) * | 2004-02-20 | 2006-09-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for enhancing insect resistance in plants |
BRPI0507896A (pt) | 2004-02-20 | 2007-07-24 | Pionner Hi Bred International | lipases e métodos de utilização das mesmas na criação ou no aumento de resistência a insetos em plantas |
WO2008055210A2 (en) * | 2006-10-31 | 2008-05-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Sulfonylurea receptor short forms from mitochondria and uses thereof |
WO2010096613A1 (en) | 2009-02-19 | 2010-08-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Blended refuge deployment via manipulation during hybrid seed production |
MX2013009092A (es) | 2011-02-11 | 2013-10-17 | Pioneer Hi Bred Int | Proteinas insecticidas sinteticas activas contra el gusano de la raiz del maiz. |
US9090906B2 (en) | 2011-03-30 | 2015-07-28 | Universidad Nacional Autonoma De Mexico | Mutant Bacillus thuringiensis cry genes and methods of use |
US20120283111A1 (en) | 2011-05-02 | 2012-11-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Bacterial mRNA screen strategy for novel pesticide-encoding nucleic acid molecule discovery |
BR112015008504A2 (pt) | 2012-10-15 | 2017-08-22 | Pioneer Hi Bred Int | Método para aumentar a atividade pesticida, polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, cassete de expressão, vetor, método de obtenção de uma planta, método de obtenção de uma célula de planta, composição pesticida, método para proteção de uma planta, método para proteger uma planta, método para aumentar a resistência de uma planta |
WO2016000237A1 (en) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | Pioneer Overseas Corporation | Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes |
US10743535B2 (en) | 2017-08-18 | 2020-08-18 | H&K Solutions Llc | Insecticide for flight-capable pests |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0587798A4 (en) * | 1991-06-07 | 1995-04-19 | Dowelanco | INSECTICIDE PROTEINS AND METHOD FOR PROTECTING PLANTS. |
US5743477A (en) * | 1992-08-27 | 1998-04-28 | Dowelanco | Insecticidal proteins and method for plant protection |
GB9300124D0 (en) * | 1993-01-06 | 1993-03-03 | Zeneca Ltd | Bacterial strain |
UA27966C2 (uk) * | 1993-03-12 | 2000-10-16 | Монсанто Компані | Спосіб зменшення кількості комах, що поїдають рослини та спосіб отримання генетично трансформованих, стійких до ураження комахами рослин |
US5824864A (en) * | 1995-05-25 | 1998-10-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize gene and protein for insect control |
US5672680A (en) * | 1995-11-20 | 1997-09-30 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Pentaclethera macroloba protein having insecticidal properties |
US5756661A (en) * | 1996-11-15 | 1998-05-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Pentaclethra macroloba derived substances having insecticide, agglutination and aminopeptidase inhibition activity |
-
1998
- 1998-05-08 US US09/074,912 patent/US6057491A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-15 EP EP98921234A patent/EP0986645A1/en not_active Withdrawn
- 1998-05-15 SI SI9820048A patent/SI20214B/sl not_active IP Right Cessation
- 1998-05-15 BR BR9809516-1A patent/BR9809516A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-05-15 SK SK1600-99A patent/SK160099A3/sk unknown
- 1998-05-15 CZ CZ0421199A patent/CZ297319B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-05-15 WO PCT/US1998/009995 patent/WO1998054327A1/en active IP Right Grant
- 1998-05-15 NZ NZ501218A patent/NZ501218A/en unknown
- 1998-05-15 CA CA002290776A patent/CA2290776C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-15 AU AU73891/98A patent/AU742709B2/en not_active Ceased
- 1998-05-28 AR ARP980102483A patent/AR016059A1/es unknown
-
1999
- 1999-04-13 US US09/290,136 patent/US6339144B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CZ297319B6 (cs) | 2006-11-15 |
WO1998054327A1 (en) | 1998-12-03 |
SK160099A3 (en) | 2000-06-12 |
AU742709B2 (en) | 2002-01-10 |
CZ421199A3 (cs) | 2000-04-12 |
CA2290776C (en) | 2003-10-14 |
EP0986645A1 (en) | 2000-03-22 |
CA2290776A1 (en) | 1998-12-03 |
AR016059A1 (es) | 2001-06-20 |
US6339144B1 (en) | 2002-01-15 |
NZ501218A (en) | 2002-02-01 |
US6057491A (en) | 2000-05-02 |
WO1998054327A9 (en) | 1999-04-01 |
SI20214B (en) | 2001-12-31 |
AU7389198A (en) | 1998-12-30 |
BR9809516A (pt) | 2000-06-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6384302B1 (en) | Trypsin inhibitors with insecticidal properties obtained from Pentaclethra macroloba | |
CN100413966C (zh) | δ-内毒素基因及其使用方法 | |
US7214860B2 (en) | Methods of using non-plant encoding nucleic acids | |
AU742709B2 (en) | Proteins having insecticidal activities and method of use | |
JP6957583B2 (ja) | 毒素遺伝子及びその使用方法 | |
EP1844064B1 (en) | Axmi-018, axmi-020, and axmi-021, a family of delta-endotoxin genes and methods for their use | |
JP6888044B2 (ja) | Axmi477、axmi482、axmi486およびaxmi525毒素遺伝子およびそれらの使用方法 | |
HUE032365T2 (en) | AXMI-205 pesticide gene and methods of application | |
BRPI0914780B1 (pt) | Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, composição, e métodos para o controle de uma população de pragas, matar uma praga proteção de uma planta de uma praga e produção de um polipeptídeo com atividade pesticida | |
MX2011006342A (es) | Genes que codifican toxinas contra nematodos. | |
US20030140381A1 (en) | Genes and regulatory DNA sequences associated with stress-related gene expression in plants and methods of using the same | |
CA2358161A1 (en) | Organisms containing insecticidal proteins | |
MXPA99010882A (en) | Proteins having insecticidal activities and method of use | |
HUP0003403A2 (hu) | Rovarírtó aktivitású fehérjék és alkalmazásuk | |
WO2001036468A2 (en) | Novel proteins having insecticidal activities and method of use | |
BR112012000030B1 (pt) | Molécula de ácido nucleico recombinante, célula hospedeira bacteriana, e método para proteção de uma planta contra peste de lagarta da raiz do milho ocidental |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
IF | Valid on the event date | ||
KO00 | Lapse of patent |
Effective date: 20100114 |