SI20214A - Proteini z insekticidnimi aktivnostmi in postopek uporabe - Google Patents

Proteini z insekticidnimi aktivnostmi in postopek uporabe Download PDF

Info

Publication number
SI20214A
SI20214A SI9820048A SI9820048A SI20214A SI 20214 A SI20214 A SI 20214A SI 9820048 A SI9820048 A SI 9820048A SI 9820048 A SI9820048 A SI 9820048A SI 20214 A SI20214 A SI 20214A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
seq
sequence
amino acid
sequences
protein
Prior art date
Application number
SI9820048A
Other languages
English (en)
Other versions
SI20214B (en
Inventor
Amy L. Cigan
Thomas H. Czapla
Lynn Fallis
Terry E. Meyer
Scott A. Mundell
Brian Sabus
Karel Schubert
Original Assignee
Pioneer Hi-Bred International, Inc.
The Board Of Regents For The University Of Oklahoma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pioneer Hi-Bred International, Inc., The Board Of Regents For The University Of Oklahoma filed Critical Pioneer Hi-Bred International, Inc.
Publication of SI20214A publication Critical patent/SI20214A/sl
Publication of SI20214B publication Critical patent/SI20214B/sl

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01NPRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/20Fabaceae or Leguminosae [Pea or Legume family], e.g. pea, lentil, soybean, clover, acacia, honey locust, derris or millettia
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/16Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Gre za sestavke in postopke za zatiranje škodljivcev, zlasti škodljivih žuželk. Sestavki obsegajo proteine, izolirane iz rastlin rodu Pentaclethra. Gre tudi za nukleotidne sekvence, ki kodirajo proteine. Take sekvence uporabljamo pri transformiranju organizmov za zatiranje škodljivcev.ŕ

Description

PIONEER HI-BREAD INTERNATIONAL INC.
THE BOARD OF REGENTS FOR THE UNIVERSITY OF OKLAHOMA
Proteini z insekticidnimi aktivnostmi in postopek uporabe
Področje izuma
Izum se nanaša na sestavke in postopke za zatiranje vrst žuželk. Poleg tega se izum nanaša na rastline in druge organizme, ki smo jih genetsko transformirali s sestavki v smislu izuma.
Ozadje izuma
Številne vrste žuželk so resni škodljivci za običajne poljedelske pridelke, kot so koruza, soja, grah, bombaž ter podobni živilski in vlakneni pridelki. Primaren postopek za zatiranje takih škodljivcev je bil uporaba sintetičnih kemičnih spojin. Vendar široka uporaba kemičnih spojin povzroča mnoge probleme glede na okolje zaradi neselektivnosti spojin in zaradi razvoja odpornosti žuželk proti kemikalijam.
Poskušali so z drugimi pristopi za zatiranje žuželk, vključno z uporabo bioloških organizmov, ki so tipično naravni roparji vrst, ki so jih skušali zatirati. Taki roparji so lahko druge žuželke, glivice in bakterije, kot Bacillus thuringiensis. Po drugi strani so vzgajali velike kolonije škodljivih žuželk v ujetništvu, sterilizirali in spustili v okolje v upanju, da bo parjenje med steriliziranimi žuželkami im plodnimi divjimi žuželkami zmanjšalo populacijo žuželk. Čeprav so ti pristopi imeli nekaj uspeha, so imeli za posledico znatne stroške in povzročajo številne hude težave.
Npr. težko je tako aplicirati biološke organizme na velike površine in doseči, da ostanejo taki živi organizmi v obdelani površini ali na obdelani vrsti rastline daljši čas. Roparske žuželke lahko migrirajo, glivice ali bakterije pa lahko dež spere z rastline ali odstrani z obdelane površine. Čeprav ima torej uporaba takih bioloških kontrol zaželene karakteristike in je imela nekaj uspeha, se zdi, da so v praksi ti postopki resno omejeni.
Napredek v biotehnologiji v zadnjih dveh desetletjih nudi nove priložnosti za zatiranje škodljivcev z genetskim inženiringom. Zlasti napredek v rastlinski genetiki, povezan z identifikacijo rastnih faktorjev žuželk in naravno nastopajočih rastlinskih obrambnih spojin ali sredstev nudi priložnost za ustvarjanje transgenskih kulturnih rastlin, ki so sposobne producirati taka obrambna sredstva in pri tem zaščititi rastline proti napadu žuželk.
Transgenske rastline, ki so odporne za specifične škodljive žuželke, so proizvedli ob uporabi genov, ki kodirajo Bacillus thuringiensis (Bt) endotoksine ali rastlinske proteazne inhibitorje (PIs). Pokazalo se je, da so transgenske rastline, ki vsebujejo Bt endotoksinske gene, učinkovite za zatiranje nekaterih žuželk. Učinkovita rastlinska zaščita ob uporabi transgensko inseriranega Pl genetskega materiala še ni bila v
demonstrirana na polju. Čeprav lahko kultivarji, ki eksprimirajo Bt gene, trenutno kažejo odpornost na nekatere škodljive žuželke, utegne biti odpornost na osnovi ekspresije enega samega gena na koncu izgubljena zaradi evolucije Bt odpornosti pri žuželkah. Tako je potrebno poiskati dodatne gene, ki jih lahko inseriramo v rastline, da zagotovimo zaščito pred škodljivimi žuželkami.
Znanstveniki so identificirali nekatere specifične rastlinske komponente ali spojine, ki učinkujejo kot obrambna sredstva za zaščito rastline pred napadom škodljivih žuželk in patogenov. Čeprav so take komponente običajno prisotne pri le nizkih nivojih v različnih rastlinskih tkivih, so nekatere od njih tudi sposobne, da se inducirajo na višje nivoje po napadu škodljive žuželke ali patogena. Primeri takih obrambnih spojin so alkaloidi, terpeni in različni proteini, kot encimi, encimski inhibitorji in lektini.
Posebno zanimive so rastlinsko izvedene spojine, ki lahko blokirajo ali spremenijo normalno biomolekulamo aktivnost in tako inhibirajo rast žuželke ali uničijo žuželko.
Kompleks koruznega koreninskega črva (com rootworm CRW) v ZDA obstoji iz treh vrst, Diabrotica barberi Smith and Lawrence (Severni), D. undecimpunctata ho\vardi Barber (Južni) in D. virgifera virgifera LeConte (Zahodni). Zahodne in severne vrste prispevajo največ k gospodarski škodi na koruzi. Gospodarska škoda in stroški zatiranja so ocenjeni nad eno milijardo dolarjev letno. Kot je omenjeno zgoraj, so glavni problemi uporabe pesticida pri zatiranju CRW škode njegov negativni učinek na okolje in razvoj odpornosti žuželke. Rotacija kultur postaja manj učinkovita kot postopek CRW zatiranja zaradi podaljšanje diapavze pri severnem CRW in razvoja modificiranega obnašanja leganja jajčec pri zahodnem CRW. Generiranje transgenskih rastlin z odpornostjo na CRW bi lahko imelo velik gospodarski vpliv. Žal je razpoložljivih relativno malo genov, če sploh, ki lahko zatirajo CRW pri transgenskih rastlinah. Tako obstaja potreba po dodatnih insekticidnih učinkovinah, zlasti tistih, ki so aktivne proti CRW.
Povzetek izuma
Gre za sestavke in postopke za zatiranje žuželk in drugih škodljivcev. Sestavki obsegajo proteine s pesticidnimi aktivnostmi, ki jih lahko izoliramo iz rastlin rodu Pentaclethra. Očiščen protein kot tudi aminokislinska in DNA sekvenčna informacija je zagotovljena za proteine z aktivnostjo proti koreninskemu črvu. DNA sekvence, ki kodirajo pesticidne proteine, lahko uporabimo za transformiranje rastlin, bakterij, glivic, kvasovk in drugih organizmov za zatiranje škodljivcev.
Sestavke in postopke v smislu izuma lahko uporabimo v številnih sistemih za zatiranje rastlinskih in ne-rastlinskih škodljivcev.
Kratek opis risb
Sl. 1 zagotavlja aminokislinsko in nukleotidno sekvenco cDNA sekvence CRW učinkovine, pentina-1, iz Pentaclethra SEQ ID št.: 1 in 2.
Sl. 2 zagotavlja aminokislinsko in nukleotidno sekvenco cDNA sekvence pentina-1, optimirano za povečano ekspresijo SEQ ID št. :3 in 4.
Sl. 3 zagotavlja aminokislinsko sekvenco pentin-1 proteina, pri čemer podčrtan del predstavlja dozdevno signalno sekvenco. AFS ostanki, ki takoj sledijo signalni sekvenci, so prvi trije ostanki zrelega proteina. ASK ostanke, ki se začnejo pet ostankov od AFS starta zrelega proteina, označuje regija navideznega zrelega amino terminusa pentina-1, eksprimiranega kot proteina s polno dolžino in proteoliziranega v koreninah koruze.
Sl. 4 zagotavlja ekspresijsko kaseto za ekspresijo pentin-1 sekvenc.
Podroben opis izuma
Zagotavljamo sestavke in postopke za zatiranje škodljivcev, zlasti rastlinskih škodljivcev. Zlasti zagotavljamo nove pesticidne proteine. Proteine čistimo iz članov družine Leguminosae, zlasti leguminoznega rodu Pentaclethra, natančneje vrst P. macrophylla in P. macroloba.
V skladu z izumom lahko pesticidne proteine, ki jih proizvedejo člani rodu Pentaclethra, izoliramo po znanih postopkih. Postopki za proteinsko izolacijo so običajna kromatografija, vključno gelna filtracija, ionska izmenjava in imunoafmitetna kromatografija, z visoko zmogljivostno tekočinsko kromatografijo, kot je visoko zmogljivostna tekočinska kromatografija z reverzno fazo, ionsko izmenjevalna visoko zmogljivostna tekočinska kromatografija, visoko zmogljivostna tekočinska kromatografija z izključitvijo velikosti, visoko zmogljivostno kromatofokusiranje in hidrofobna interakcijska kromatografija itd., z elektroforetskim ločenjem, kot je enodimenzionalna gelna elektroforeza, dvodimenzionalna gelna elektroforeza, itd. Glej npr. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 in 2, Ausubel et al. (eds.), John Wiley & Sons, NY (1988), kar je tukaj vključeno kot referenca.
Ko očiščen protein izoliramo, lahko protein ali polipeptide, iz katerih je sestavljen, karakteriziramo in sekvenciramo s standardnimi znanimi postopki. Npr. očiščen protein ali polipeptide, ki ga sestavljajo, lahko fragmentiramo, kot z bromocianom, ali s proteazami, kot so papain, himotripsin, tripsin, lizil-C endopeptidaza itd. (Oike et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:9751-9758; Liu et al., (1983) Int. J. Pept. Protein Res. 21:209-215). Dobljene peptide ločimo, prednostno s HPLC, ali z ločenjem gelov in elektroprepivnanjem na PVDF membrane, in podvržemo amino kislinskemu sekvenciranju. Za izvedbo te naloge peptide prednostno analiziramo z avtomatiziranimi sekvenatorji. Znano je, da lahko določimo N-terminalne, C-terminalne ali interne amino kislinske sekvence. Iz amino kislinske sekvence očiščenega proteina lahko sintetiziramo nukleotidno sekvenco, ki jo lahko uporabimo kot sondo, da pripomore pri izolaciji gena, ki kodira pesticidni protein.
Na enak način lahko uporabimo protitelesa, vzgajana proti delno očiščenim ali očiščenim peptidom za določitev prostorske in časovne porazdelitve zadevnega proteina. Tako lahko določimo tkivo, v katerem je proteina največ v izobilju in je po možnosti bolj visoko eksprimiran, in konstruiramo ekspresijske knjižnice. Postopki za proizvodnjo protiteles so znani. Glej npr. Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988), in tam citirane reference. Glej tudi Radka et al. (1983) J. Immunol. 128:2804; in Radka et al. (1984) Immunogenetics 19:63. Taka protitelesa lahko uporabimo za izoliranje proteinov s podobnimi vezavnimi domenami in proteinov, testiranih glede aktivnosti proti zadevnim škodljivim žuželkam.
Znano je, da lahko za čiščenje proteinov s pesticidnimi lastnostmi uporabimo katerokoli kombinacijo postopkov. Ko je izolacijski protokol določen, lahko pesticidno aktivnost testiramo za vsako frakcijo materiala, dobljeno po vsaki stopnji čiščenja.
Rezultat takih protokolov čiščenja bo v bistvu očiščena proteinska frakcija. Z v bistvu očiščen ali v bistvu čist je mišljen protein, ki je v bistvu brez katerekoli spojine, ki je običajno povezana s proteinom v njegovem naravnem stanju. V bistvu čiste pripravke proteina lahko ocenimo z odsotnostjo drugih ugotovljivih proteinskih trakov po SDS-PAGE, kot je določeno vizualno ali z denzitrometrijskim skeniranjem.
Po drugi strani lahko odsotnost drugih amino-terminalnih sekvenc ali N-terminalnih ostankov v očiščenem pripravku označuje nivo čistote. Čistoto lahko preverimo z rekromatografijo čistih pripravkov, ki kažejo odsotnost drugih pikov z ionsko izmenjavo, reverzno fazo ali kapilarno elektroforezo. Izraza v bistvu čist ali v bistvu očiščen nista mišljena, da bi izključevala umetne ali sintetične zmesi proteinov z drugimi spojinami. Izrazi tudi niso mišljeni, da bi izključili prisotnost manjših nečistot, ki ne motijo biološke aktivnosti proteina in ki so lahko prisotne npr. zaradi nepopolnega čiščenja.
Iz fragmentov proteina lahko s PCR eksperimenti določimo celotno nukleotidno sekvenco, ki kodira protein. Podobno lahko fragmente, dobljene iz PCR eksperimentov, uporabimo za izoliranje cDNA sekvenc iz ekspresijskih knjižnic. Glej npr. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Vols. 1-3, Sambrook et al. (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), in tam citirane reference.
Na ta način lahko izoliramo proteine in nukleotidne sekvence, ki kodirajo take proteine, ki inhibirajo ali so toksični za posamezne vrste žuželk. Take proteine in nukleotidne sekvence v smislu izuma lahko uporabimo za zaščito rastlin pred škodljivci, vključno žuželkami, glivicami, bakterijami, nematodi, virusi ali viroidi ipd., zlasti pred škodljivimi žuželkami. Zlasti lahko dobimo proteine in nukleotidne sekvence, ki inhibirajo ali so toksične za žuželke reda Coleoptera.
Škodljive žuželke vključujejo žuželke, izbrane iz redov Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera itd., zlasti
Coleoptera. Škodljive žuželke v smislu izuma za glavne kulture so: koruza: Ostrinia nubilalis, Agro tis ipsilon; Helicoverpa zea; Spodoptera frugiperda; Diatraea grandiosella; Elasmopalpus lignosellus; Diatraea saccharalis; Diabrotica virgifera; Diabrotica barberi; Diabrotica undecimpunctata howardi, Melanotus spp., Cyclocephala borealis; Cyclocephala immaculata; Popillia japonica; Chaetocnema pulicaria; Sphenophorus maidis; Rhopalosiphum maidis; Anuraphis maidiradicis; Blissus leucopterus; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus sanguinipes; Delta platura; Agromyza paricornis; Anaphotrips obscrurus; Solenopsis milesta; Tetranychus urticae; Busseola fusca (AMB); Sesamia calamistis (APB); Eldana sacchharina (ASB); Chilo partellus (SSB); Ostrinia furnacalis (OCB); Sesamia nonagrioides; sorgum: Chilo partellus; Spodoptera frugiperda; Helicoverpa zea; Elasmopalpus lignosellus; Agrotis subterranea; Phyllophaga crinita; Eleodes, Conoderus in Aeolus spp. ; Oulema melanopus; Chaetocnema pulicaria; Sphenophorus maidis; Rhopalosiphum maidis; Sipha flava; Blissus leucopterus; Contarinia sorghicola; Tetranychus cinnabarinus; Tetranychus urticae; Schizaphis graminum; pšenica: Pseudaletia unipunctata; Spodoptera frugiperda; Elasmopalppus lignosellus, Agrotis orthogonia; Oulema melanopus; Hypera punctata; Diabrotica undecimpunctata owardi; ruska pšenična listna uš: Schizaphis graminum, Sitobion avenae; Melanoplus femurrubrum; Melonoplus differentialis; Melanoplus sanguinipes; Mayetiola destructor; Sitodiplosis moselana; Meromyza americana; Hylemya coarctata; Frankliniella fusca; Cephus cinctus; Eriophyes tulipae; sončnice: Suleima helianthana; Homeosoma ellectellu; Zygoramma exclamationis; Bothyrus gibbosus; Neolasioptera murtfeldtiana; Cochylis hospes; Rachiplusia nu; Smicronyx fulvus; Cylindrocopturus adspersus; tobak: Heliothis virescens; Helicoverpa zea; Spodoptera exigua; Pectinophora gossypiella; Anthonomus grandis; Aphis gossypii; Pseudatomoscelis seriatus; Trialeurodes abutilonea; Lygus lineolaris; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus diferentialis; Thrips tabaci; Franklinkiella fusca; Tetranychus cinnabarinus; Tetranychus urticarie; riž: Diatraea saccharalis; Spodoptera frugiperda; Helicoverpa zea; Colaspis brunnea; Lissorhoptrus oryzophilus; Sitophilus oryzae; Nephotettix nigropictus; Blissus leucopterus; Acrosternum hilare; soja: Pseudoplusia includens; Anticarsia gemmatalis; Plathypena scabra; Ostrinia nubilalis; Agrotis ipsilon; Spodoptera exigua; Heliothis virescens; Helicoverpa zea; Epilachna varivestis; Myzus persicae; Empoasca fabae; Acrosternum hilare; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus differentialis; Delia platura; Sericothrips variabilis; Thrips tabaci; Tetranychus turkestani; Tetranychus urticae; ječmen: Ostrinia nubilalis; Agrotis ipsilon; Schizaphis graminum; Blissus leucopterus; Acrosternum hilare; Euschistus servus; Delia platura; Mayetiola destructor; Petrobia Iatens; oljna repica: Brevicoryne brassicae; Phyllotreta spp.; vojaški črv Bertha; Mamestra configurata; diamantna vešča; Plutella xylosteila; lucerna: Autographa californica; Otiorhynchus ligusticii; Colias eurytheme; Agronyza frontella; Hypera brunneipeonis; Philaerius spumarius; Theriophis meculata; Hypera punctata; Acyrthosiphon pisum; Acyrthosiphor kondoi; Plathypena scabia; Sitona hispidulus; Branchophagus roddi; Lygus lineolaris; Chlorochroa sayi; Anticarsia friegiperda; Hypera postica; Spodoptera; Empoasca fabae; Psuedolusia includens; Spissistilus festinus; glej npr. Manya B. Stoetzel (1989) Common Names of Insects & Related Organisms, Entomological Society of America, ki je tukaj vključeno kot referenca.
Nukleotidne sekvence v smislu izuma lahko uporabimo za izolacijo drugih homolognih sekvenc pri drugih vrstah rastlin, zlasti pri drugih leguminoznih vrstah. V stroki so zlahka dostopni postopki za hibridizacijo sekvenc nukleinskih kislin. Kodirne sekvence iz drugih rastlin lahko izoliramo po znanih tehnikah na osnovi njihove sekvenčne homologije za kodirne sekvence v nadaljevanju. Pri teh tehnikah vse ali del znanih kodirnih sekvenc uporabimo kot sondo, ki se selektivno hibridizira na druge pesticidne kodirne sekvence, prisotne v populaciji kloniranih genomskih DNA fragmentov ali cDNA fragmentov (t.j. genomske ali cDNA knjižnice) iz izbranega organizma.
Npr. celotno pentin-1 sekvenco ali njene dele lahko uporabimo kot sonde, ki so sposobne, da se specifično hibridizirajo na ustrezne kodirne sekvence in informacijske RNA. Za doseganje specifične hibridizacije ob številnih pogojih take sonde vključujejo sekvence, ki so enkratne in imajo dolžino prednostno vsaj okoli 10 nukleotidov, najbolj prednostno dolžino vsaj okoli 20 nukleotidov. Take sonde lahko uporabimo za pomnoževanje pentin-1 kodirnih sekvenc iz izbranega organizma po znanem postopku polimerazne verižne reakcije (PCR). To tehniko lahko uporabimo za izoliranje dodatnih kodirnih sekvenc iz želenega organizma ali kot diagnostični test za določitev prisotnosti pentin-1 kodirnih sekvenc v organizmu.
Take tehnike vključujejo hibridizacij ski skrining zasajenih DNA knjižnic (bodisi plakov ali kolonij; glej npr. Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) in pomnoževanje s PCR ob uporabi oligonukleotidnih primerjev, ki ustrezajo sekvenčnim domenam, konzerviranim med amino kislinskimi sekvencami (glej npr. Innis et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, eds., Academic Press (1990)).
Npr. hibridizacijo takih sekvenc lahko izvedemo ob pogojih zmanjšane stringence, srednje stringence ali celo pri ostrih pogojih (npr. pogoji, ki jih predstavlja izpiralna stringenca 35-40% formamida s 5x Denhardtovo raztopino, 0,5% SDS in lx SSPE pri 37 °C; pogoji, ki jih predstavlja izpiralna stringenca 40-45% formamida s 5x Denhardtovo raztopino, 0,5% SDS in lx SSPE pri 42 °C; oz. pogoji, kijih predstavlja izpiralna stringenca 50% formamida s 5x Denhardtovo raztopino, 0,5% SDS in lx SSPE pri 42 °C), na DNA, ki kodira tukaj opisane insekticidne gene v standardnem hibridizacij skem testu. Glej J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2d Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory.
Izraz stringentni pogoji ali stringentni hibridizacij ski pogoji se nanaša na pogoje, ob katerih se bo sonda hibridizirala na svojo ciljno sekvenco do ugotovljivo večje stopnje kot na druge sekvence (npr. vsaj 2-kratno glede na ozadje). Stringentni pogoji so odvisni od sekvence in so različni v različnih okoliščinah. S kontroliranjem stringence hibridizacijskih in/ali spiralnih pogojev lahko identificiramo ciljne sekvence, ki so 100% komplementarne sondi (homologno sondiranje). Po drugi strani lahko stringentne pogoje naravnamo tako, da dopustijo nekaj neujemanja pri sekvencah, tako da ugotovimo nižje stopnje podobnosti (heterologno sondiranje). Na splošno je sonda dolžine manj kot okoli 1000 nukleotidov, prednostno manj kot okoli 500 nukleotidov, tipično od okoli 50 do okoli 300 nukleotidov.
Tipično bodo stringentni pogoji tisti, pri katerih je koncentracija soli manj kot okoli 1,5 M koncentracije Na ionov, tipično okoli 0,01 do 1,0 M koncentracije Na ionov (ali drugih soli) pri pH 7,0 do 8,3 in je temperatura vsaj okoli 30 za kratke sonde (npr. 10 do 50 nukleotidov) in vsaj okoli 60 °C za dolge sonde (npr. večje kot 50 nukleotidov). Stringentne pogoje lahko tudi dosežemo z dodatkom destabilizimih sredstev, kot formamida. Npr. nizki stringentni pogoji so hibridizacija s pufrsko raztopino 30 do 35% formamida, 1 M NaCl, 1% SDS (natrijev dodecil sulfat) pri 37 °C in izpiranje v IX do 2X SSC (20Χ SSC= 3,0 M NaCl/0,3 M natrijev citrat) pri 50 °C do 55 °C. Npr. zmerni stringentni pogoji vključujejo hibridizacijo v 40 do 45% formamidu, 1 M NaCl, 1% SDS pri 37 °C in izpiranje v 0,5X do IX SSC pri 55 °C do 60 °C. Npr. visoki stringentni pogoji vključujejo hibridizacijo v 50% formamidu, 1 M NaCl, 1% SDS pri 37 °C in izpiranje v 0,lX SSC pri 60 °C do 65 °C.
Specifičnost je tipična funkcija post-hibridizacijskih izpiranj, pri Čemer so kritični faktorji ionska jakost in temperatura končne izpiralne raztopine. Za DNA-DNA hibride lahko aproksimiramo Tm iz enačbe Meinkotha in Wahla, Anal. Biochem. 138:267-284 (1984): Tm = 81,5C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; kjer je M molamost enovalentnih kationov, %GC je odstotek gvanozinskih in citozinskih nukleotidov v DNA, % form je odstotek formamida v gvanozinskih in citozinskih nukleotidih v DNA, % form je odstotek formamida v hibridizacij ski raztopini, L pa je dolžina hibrida v baznih parih. Tm je temperatura (pri definirani ionski jakosti in pH), pri kateri se 50% komplementarne ciljne sekvence hibridizira na perfektno se ujemajočo sondo. Tm se zmanjša za okoli 1 °C za vsak 1% neujemanja; tako lahko Tm, hihridizacijske in/ali izpiralne pogoje lahko naravnamo za hibridizacijo na sekvence želene identitete. Npr. Če iščemo sekvence z >90% identiteto, se lahko Tm zmanjša za 10 °C. Na splošno izberemo stringentne pogoje tako, da so okoli 5 “C nižji kot termično tališče (Tm) za specifično sekvenco in njen komplement pri definirani ionski jakosti in pH. Vendar pa lahko resno stringentni pogoji izrabijo hibridizacijo in/ali izpiranje pri 1, 2, 3 ali 4 °C nižje, kot termično tališče (Tm); zmerno stringentni pogoji lahko izrabijo hibridizacijo in/ali izpiranje pri 6, 7, 8 ali 9 ali 10 °C nižje, kot je termično tališče (Tm); nizki stringentni pogoji lahko izrabijo hibridizacijo in/ali izpiranje pri 11, 12, 13, 14, 15 ali 20 °C nižje, kot je termično tališče (Tm). Ob uporabi enačbe, hibridizacije in izpiralnih sestavkov ter želene Tm bodo strokovnjaki razumeli, da so variacije v stringenci hibridizacije in/ali izpiralnih raztopin inherentno opisani. Če je posledica želene stopnje neujemanja Tm manj kot 45 °C (vodna raztopina) ali 32 °C (fonnamidna raztopina), je prednostno, da povečamo SSC koncentracijo, tako da lahko uporabimo višjo temperaturo. Obširen vodič za hibridizacijo nukleinskih kislin najdemo v Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, pogl. 2 Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, Elsevier, New York (1993); in Current Protocols in Molecular Biology, pogl. 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).
Na splošno bodo sekvence, ki kodirajo za pentin-1 in druge insekticidne proteine v smislu izuma in se hibridizirajo na gen, ki je tukaj opisan, vsaj okoli 50% homologne, okoli 70% homologne, do okoli 85% homologne ali celo do okoli 90% do okoli 95% homologne z opisano sekvenco. T.j. sekvenčna podobnost sekvenc lahko variira, pri čemer si deli vsaj okoli 50%, okoli 70%, in okoli 85% do okoli 90% do 95% sekvenČne podobnosti.
Naslednje izraze uporabimo za opis sekvenčnih razmerij med dvema ali več nukleinskimi kislinami ali polinukleotidi: (a) referenčna sekvenca, (b) primerjalno okno, (c) sekvenčna identiteta, (d) odstotek sekvenČne identitete in (e) bistvena identiteta.
(a) Kot se tukaj uporablja, je referenčna sekvenca definirana sekvenca, uporabljena kot osnova za sekvenčno primerjavo. Referenčna sekvenca je lahko pod-serija ali celota specificirane sekvence; npr. kot segment popolne cDNA ali genske sekvence ali kompletna cDNA ali genska sekvenca.
(b) Kot se tukaj uporablja, pomeni primerjalno okno sklicevanje na soseden in specificiran segment polinukleotidne sekvence, kjer lahko polinukleotidno sekvenco primerjamo z referenčno sekvenco in kjer lahko del polinukleotidne sekvence v primerjalnem oknu obsega adicije ali delecije (tj. vrzeli) v primerjavi z referenčno sekvenco (ki ne vsebuje adicij ali delecij) za optimalno ujemanje obeh sekvenc. Na splošno je primerjalno okno dolžine vsaj 20 sosednjih nukleotidov in je lahko po želji 30, 40, 50, 100 ali daljše. Strokovnjaki razumejo, da tipično uvedemo vrzelni penale in ga odštejemo od števila ujemanj, da se izognemo visoki podobnosti z referenčno sekvenco zaradi inkluzijskih vrzeli v polinukleotidni sekvenci.
Metode ujemanja sekvenc za primerjavo so znane v stroki. Optimalno ujemanje sekvenc za primerjavo lahko izvedemo z lokalnim homologijskim algoritmom Smitha in Watermana, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); s homologijskim ujemalnim algoritmom Needlemana in Wunscha, J. Mol. Biol. 48:443 (1970); z metodo iskanja podobnosti Pearsona in Lipmana, Proč. Natl. Acad. Sci. 85:2444 (1988); s kompjuteriziranimi izvedbami teh algoritmov, ki vključujejo, niso pa omejem nanje: CLUSTAL v PC/Gene programu, Intelligenetics, Mountain View, Califomia, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA in TFASTA v Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Groups (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, ZDA; CLUSTAL program je dobro opisan v Higgins in Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgins in Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8:155-65 (1992), in Pearson, et al., Methods in Molecular Biology 24:307-331 (1994). BLAST družina programov, ki jo lahko uporabimo za iskanje podobnosti v bazah podatkov, vključuje: BLASTN za nukleotidne iskane sekvence proti nukleotidnim sekvencam; BLASTX za nukleotidne iskane sekvence proti proteinskim sekvencam iz baz podatkov; BLASTP za proteinske iskane sekvence proti proteinskim sekvencam iz baz podatkov; TBLASTN za proteinske iskane sekvence proti nukleotidnim sekvencam iz baz podatkov; in TBLASTX za nukleotidne iskane sekvence proti nukleotidnim sekvencam iz baz podatkov. Glej Current Protocols in Molecular Biology, pogl. 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).
Kot bodo razumeli povprečni strokovnjaki na tem področju, BLAST poizvedbe predpostavljajo, da so lahko proteini modelirani kot naključne sekvence. Vendar mnogi resnični proteini obsegajo regije nenaključnih sekvenc, ki so lahko homopolimemi trakti, kratkotrajna ponavljanja ali regije, obogatene z eno ali več amino kislinami. Take regije z nizko kompleksnostjo lahko uvrstimo med nesorodne proteine, celo če so druge regije proteina popolnoma nepodobne. Lahko uporabimo številne nizko kompleksne filtrske programe, da zmanjšamo take nizko kompleksnostne uvrstitve. Npr. uporabimo lahko SEG (Wooten and Federhen, Comput. Chem. 17:149-163 (1993) in XNU (Claverie and States, Comput. Chem., 17:191-201 (1993)) nizko kompleksnostne filtre same ali v kombinaciji.
(c) Kot se tukaj uporablja, vključuje sekvenčna identiteta ali identiteta v zvezi z dvema nukleinskima kislinama ali polipeptidnima sekvencama sklicevanje na ostanke na obeh sekvencah, ki so enaki, kadar se ujemajo za maksimalno ustrezanje v primerjavi s specificiranim primerjalnim oknom. Kadar odstotek sekvenčne identitete uporabimo glede na proteine, je znano, da se položaji ostankov, ki niso identični, često razlikujejo po konservativnih amino kislinskih substitucijah, kjer amino kislinski ostanki nadomeščajo druge amino kislinske ostanke s podobnimi kemičnimi lastnostmi (npr. naboj ali hidrofobnost) in zato ne spremenijo funkcionalnih lastnosti molekule. Kjer se sekvence razlikujejo v konservativnih substitucijah, lahko odstotno sekvenčno identiteto naravnamo navzgor, da korigiramo konservativno naravo substitucije. Za sekvence, ki se razlikujejo po takih konservativnih substitucijah, je rečeno, da imajo sekvenčno podobnost ali podobnost. Sredstva za izvedbo te naravnave so znana strokovnjakom. Tipično to vključuje ocenjevanje konservativne substitucije kot delno neujemanje, ne pa popolno neujemanje, pri čemer se poveča odstotna sekvenčna identiteta. Tako npr., kadar se da identični amino kislini oceno 1 in nekonservativni substituciji oceno 0, dobi konservativna substitucija oceno med 0 in 1. Ocenjevanje konservativnih substitucij izračunamo npr. po algoritmu Meyersa in Millerja, Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17 (1988), npr. kot je izvedeno v programu PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornija, ZDA).
(d) Kot se tukaj uporablja, pomeni odstotek sekvenčne identitete vrednost, določeno s primerjavo dveh optimalno ujemajočih se sekvenc v primerjavi s primerjalnim oknom, kjer del polinukleotidne sekvence v primerjalnem oknu lahko obsega adicije ali delecije (npr. vrzeli) v primerjavi z referenčno sekvenco (ki ne obsega adicij ali delecij) za optimalno ujemanje uvrstitev obeh sekvenc. Odstotek izračunamo z določitvijo števila leg, pri katerih se pojavi identična nukleinska kislinska baza ali amino kislinski ostanek v obeh sekvencah, da dobimo število ujemalnih leg, z deljenjem števila ujemalnih leg s celotnim številom leg v primerjalnem oknu in z množenjem rezultata s 100, da dobimo odstotek sekvenčne identitete.
(e) (i) Izraz bistvena identiteta polinukleotidnih sekvenc pomeni, da polinukleotid obsega sekvenco, ki ima vsaj 70% sekvenčne identitete, prednostno vsaj 80%, bolj prednostno vsaj 90% in najbolj prednostno vsaj 95%, v primerjavi z referenčno sekvenco, pri čemer uporabimo enega od opisanih ujemalnih programov ob uporabi standardnih parametrov. Strokovnjak bo vedel, da lahko te vrednosti primemo naravnamo, da določimo ustrezno identiteto proteinov, kodiranih z dvema nukleotidnima sekvencama ob upoštevanju kodonske degeneracije, amino kislinske podobnosti, pozicioniranja bralnega okvira ipd. Bistvena identiteta amino kislinskih sekvenc za te namene običajno pomeni sekvenčno identiteto vsaj 60%, bolj prednostno vsaj 70%, 80%, 90% in najbolj prednostno vsaj 95%.
Druga indikacija, da so nukleotidne sekvence bistveno identične, je, če se dve molekuli hibridizirata druga na drugo ob stringentnih pogojih. Vendar pa sta nukleinski kislini, ki se ne hibridizirata druga na drugo ob stringentnih pogojih, še vedno bistveno identični, če so polipeptidi, kijih kodirajo, bistveno identični. To se lahko pojavi npr., kadar ustvarimo kopijo nukleinske kisline ob uporabi maksimalne kodonske degeneracije, ki jo dopušča genetski kod. Druga indikacija, da sta dve nukleinski kislinski sekvenci bistveno identični, je, daje polipeptid, ki ga kodira prva nukleinska kislina, imunološko križno reaktiven s polipeptidom, ki ga kodira druga nukleinska kislina.
(e) (ii) Izraz bistvena identiteta v zvezi s peptidom kaže na to, da peptid obsega sekvenco z vsaj 70% sekvenčne identitete glede na referenčno sekvenco, prednostno 80%, bolj prednostno 85%, najbolj prednostno vsaj 90% ali 95% sekvenčne identitete glede na referenčno sekvenco v primerjavi s specificiranim primerjalnim oknom. Prednostno izvedemo optimalno ujemanje ob uporabi homolognega ujemalnega algoritma Needleman-a in Wunscha, J. Mol. Biol. 48:443 (1970). Indikacija, da sta dve peptidni sekvenci bistveno identični, je, da je en peptid imunološko reaktiven s protitelesi, vzgajanimi proti drugemu peptidu. Tako je peptid bistveno identičen drugemu peptidu npr., kadar se oba peptida razlikujeta le po konservativni substituciji. Peptidi, ki so bistveno podobni, si delijo sekvence, kot je omenjeno zgoraj, razen da se položaji ostankov, ki niso identični, lahko razlikujejo po konservativnih amino kislinskih spremembah.
Znano je, da so lahko pesticidni proteini oligomemi in bodo variirali v molekulski masi, številu promotorjev, komponentnih peptidih, aktivnosti proti posameznim škodljivcem in v drugih značilnostih. Vendar pa po tukaj opisanih postopkih lahko izoliramo in karakteriziramo proteine, aktivne proti številnim škodljivcem. Posebno zanimivi so proteini, ki so aktivni proti CRW. Tako očiščene ali delno očiščene proteine v smislu izuma testiramo na insekticidno aktivnost proti CRW, vključno Diabrotica barberi (severni), D. undecimpunctata howardi (južni), in D- virgifera vergifera (zahodni). Na ta način smo izolirali en protein, označen pentin-1, ki ima insekticidno aktivnost za CRW. Pentin-1 je glikoziliran protein s približno 45 do okoli 50 kDal. Amino kislinska in nukleotidna sekvenca pentin-1 proteina je podana na sl. 1 in SEQ ID NOS: 1 in 2.
Zdi se, da je najvišja koncentracija pentin-1 v rastlini v zrelih semenih. Protein je toplotno stabilen in ima LC50 približno 10 pg/ml diete proti CRW.
Pentin-1 in druge proteine v smislu izuma lahko spremenimo na različne načine, ki vključujejo amino kislinske substitucije, delecije, trunkacije in insercije. Metode za take manipulacije so v stroki na splošno znane. Npr. amino kislinske sekvenčne variante pesticidnih proteinov lahko pripravimo z mutacijami v DNA. Metode za mutagenezo in nukleotidne sekvenčne spremembe so v stroki znane. Glej npr. Kunkel,
T. (1985) Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; US. patent št. 4,873,192; Walker and Gaastra (eds.) Techniques in Molecular Biology, MacMillan Publishing Company, NY (1983) in tam citirane reference. Tako geni in nukleotidne oblike v smislu izuma vključujejo tako naravno nastopajoče sekvence kot tudi mutantne oblike. Podobno zajemajo proteini v smislu izuma tako naravno nastopajoče proteine kot tudi njihove variacije in modificirane oblike.
Take variante bodo Še naprej imele želeno pesticidno aktivnost. Očitno mutacije, ki bodo narejene v DNA, ki kodira varianto, ne smejo spraviti sekvence izven bralnega okvira in prednostno ne bodo ustvarile komplementarnih regij, ki bi lahko proizvedle sekundarno mRNA strukturo. Glej objavljeno EP patentno prijavo št. 75,444.
Na ta način predloženi izum zajema pesticidne proteine kot tudi njihove komponente in fragmente. T.j. znano je, da lahko proizvedemo komponentne promotorje, polipeptide ali fragmente proteinov, ki zadržijo pesticidno aktivnost. Ti fragmenti vključujejo trunkirane sekvence kot tudi N-terminalne, C-terminalne, notranje in notranje deletirane amino kislinske sekvence proteinov.
Za večino delecij, insercij in substitucij proteinske sekvence se ne pričakuje, da bi proizvedle radikalne spremembe pri karakteristikah proteina. Vendar pa, kadar je težko napovedati eksakten učinek substitucije, delecije ali insercije že vnaprej, bo strokovnjak upošteval, da bo učinek ocenjen z rutinskimi skrinimimi testi. T.j. aktivnost lahko ocenimo s testom toksičnosti za žuželke.
Nukleotidne sekvence lahko uporabimo pri protokolih DNA prelaganja (shuffling). DNA prelaganje je postopek za rekurzivno rekombinacijo in mutacijo, izveden z naključno fragmentacijo fonda sorodnih genov, čemur sledi ponovno sestavljanje fragmentov s PCR brez primerja. Glej npr. Stemmer, W.P.C. (1994) Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA 91:10747-10751; Stemmer, W.P.C. (1994) Nature 370:389-391; Zhang et al. (1997) Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA 94:4504-4509; in PCT objavo št. 96/19256. Prednost DNA prelaganja racionalnega vzorca je, da lahko prelaganje optimira funkcijo genov, ne da bi najprej določili, kateri genski produkt omejuje hitrost. Predloženi izum zagotavlja postopke za sekvencirano prelaganje ob uporabi polipeptidov v smislu izuma in sestavke, ki so posledica le-tega.
Na splošno sekvencirano prelaganje zagotavlja sredstvo za generiranje knjižnic polinukleotidov z želeno karakteristiko, ki jo lahko izberemo ali za katero jo lahko skriniramo. Knjižnice rekombinantnih polipeptidov generiramo iz populacije sorodnih sekvenčnih polipeptidov, ki obsegajo sekvencirane regije, ki imajo bistveno sekvenčno identiteto in jih lahko homologno rekombiniramo in vitro ali in vivo.
Populacija sekvenciranih-rekombinantnih polinukleotidov obsega sub-populacijo polinukleotidov, ki imajo želene ali prednostne karakteristike in jih lahko izberemo s primemo metodo selekcije ali skrininga. Karakteristike so lahko katerakoli lastnost ali karakteristika, ki je sposobna, da se jo da izbrati ali detektirati v skrinimem sistemu, in lahko vključuje lastnosti: kodiranega proteina, transkripcij skega elementa, sekvenčne kontrolime transkripcije, RNA pretvarjanja, RNA stabilnosti, kromatinske konfirmacije, translacije ali druge ekspresijske lastnosti gena ali transgena, replikativnega elementa, elementa, ki veže protein, ipd., kot katerakoli značilnost, ki daje izberljivo ali ugotovljivo lastnost. Pri nekaterih izvedbah bo izbrana karakteristika povečan Km in/ali Kcat v primerjavi z divjetipskim proteinom, kot se tukaj zagotavlja. Pri drugih izvedbah bo imel protein ali polinukleotid, generiran iz sekvenciranega prelaganja, afiniteto za vezavo liganda večjo kot neprelagan divjetipski polinukleotid. Povečanje pri takih lastnostih je lahko vsaj 110%, 120%, 130%, 140% ali vsaj 150% divjetipske vrednosti,
Pentin-1 je član širše genske družine esteraz, natančneje lipidnih acilnih hidrolaz, kot je določeno s sekvenčno podobnostjo. Gensko prelaganje je metoda, ki lahko izboljša ali spremeni biološko aktivnost danega genskega produkta. Gensko prelaganje lahko v zvezi s selekcijsko strategijo uporabimo za izboljšanje lastnosti, kot je specifičnost substrata, topnost, temperatura in pH optimumi proteina ali encima, z usmerjeno molekularno evolucijo. V primeru pentina-1 je toksičnost za žuželke, kot je določena z letalnimi koncentracijami, najbolj relevanten parameter.
Gensko prelaganje lahko apliciramo na en sam gen, ki uvede mutacije v tem genu pri podani pogostnosti. Kombinacije sinergističnih mutacij lahko nato izberemo s sledečimi generiranji genskega prelaganja iz primarne mutantne populacije. Ta pristop lahko apliciramo na pentin-1.
Po drugi strani lahko različne člane genskih družin, ki so že kodirani z divergentnimi, vendar sorodnimi sekvencami, uporabimo za gensko prelaganje. Ti lahko vključujejo, vendar niso omejeni na pentin-1 iz Pentaclethra in eksprimiranega sekvenčnega markerja iz koruze, identificiranega kot 5C9, ki kodira cDNA, ki je okoli 57% identičen pentinu-1 pri nukleotidnem nivoju. Glej patentno prijavo 08/449,986, vloženo 25. maja 1995, kije istočasno v postopku in je tukaj vključena kot referenca. Hkrati bodo z genskim prelaganjem uvedene tudi mutacije, ki nadalje prispevajo h genetski raznolikosti. Potem lahko sinergistične kombinacije zlitij med člani genske družine in na novo uvedenimi mutacijami izberemo z usmerjenimi molekularnimi evolucijskimi strategijami.
Lipidne acilne hidrolaze obsegajo raznoliko multigensko družino, ki je konservirana v mnogih rastlinskih vrstah. Encimi imajo hidrolizimo aktivnost za mnoge gliko- in fosfolipide. Substrati so monogalaktozildiacilglicerol, acilsterilgukozid, fosfatidilholin, lizofosfatidilholin, fosfatidiletanolamin, lizofosfatidiletanolamin, fosfatidilinozitol kot tudi mnogi drugi lipidni substrati. Podobno lahko membranske sestave različnih žuželk kot tudi rastlin variirajo od vrste do vrste in nanje lahko vplivamo s prehrano ali pogoji rasti. Torej bi lahko aktivnost dane lipidne acilne hidrolaze za dani substrat vplivala tako na specifičnost kot tudi na učinkovitost. Spremenjena substratna specifičnost bi lahko bila en parameter za izbiro produktov genskega prelaganja.
Topnost in proteinsko stabilnost bi lahko tudi izbrali iz prelaganih genskih produktov. Insekticidni proteini so aktivni v ostrem okolju črevesnega lumna žuželk. Njihove proteine digerirajo proteaze in nanje vplivajo reducimi ali oksidimi pogoji, ki variirajo glede na testirano vrsto žuželk. Topnost in stabilnost lipidnih acilnih hidrolaz tako v transgenski rastlini kot tudi v črevesnem lumnu žuželk bi lahko vplivali na biološko aktivnost in bi se lahko spremenili s strategijami genskega prelaganja.
Pogoji za encimsko reakcijo, kot pH in temperaturni optimumi, lahko tudi vplivajo na insekticidno aktivnost pentina-1. Črevesni pH od CRW je 5,5-6,0. Izbira prelaganih pentin-1 genskih produktov za encimatsko aktivnost proti lipidnim substratom v tem območju pH je drugi parameter, ki bi lahko vplival na toksičnost.
Tako lahko pentinsko sekvenco v smislu predloženega izuma uporabimo pri poskusih genskega prelaganja z drugimi lipidnimi hidrolazami, kot so patatini, zlasti s 5C9.
Proteine ali druge komponentne polipeptide, ki so tukaj opisani, lahko uporabimo same ali v kombinaciji z drugimi proteini ali sredstvi za zatiranje različnih škodljivih žuželk. Drugi insekticidni proteini so tisti od Bacillus, vključno δ-endotoksini in vegetativni insekticidni proteini, kot tudi proteazni inhibitorji (tako serinskega kot tudi cisteinskega tipa), lektini, a-amilaze, peroksidaze, holesterol oksidaza ipd.
Pri eni izvedbi ekspresijo proteinov v smislu izuma v transgenski rastlini spremlja ekspresija enega ali več Bacillus thuringiensis (Bt) δ-endotoksinov. To ko-ekspresijo več kot ene insekticidne učinkovine v isti transgenski rastlini lahko dosežemo z genetskim inženiringom rastline, da vsebuje in eksprimira vse potrebne gene. Po drugi strani lahko rastlino, starš 1, genetsko konstruiramo za ekspresijo proteinov v smislu izuma. Drugo rastlino, starš 2, lahko genetsko konstruiramo za ekspresijo drugih učinkovin, kot (Bt) δ-endotoksina. S križanjem starša 1 s staršem 2 lahko dobimo rastline potomce, ki eksprimirajo vse gene, ki so prisotni pri obeh starših 1 in 2.
Predloženi izum zajema tudi nukleotidne sekvence iz organizmov, različnih od Pentaclethra, kjer proteini križno reagirajo s protitelesi, vzgojenimi proti proteinom v smislu izuma, ali kjer se dajo nukleotidne sekvence izolirati s hibridizacijo z nukleotidnimi sekvencami v smislu izuma. Izolirane proteine ali tiste, ki jih kodirajo take nukleotidne sekvence, lahko testiramo na pesticidno aktivnost. Izolirane proteine lahko testiramo na pesticidno aktivnost s tukaj opisanimi metodami ali drugimi znanimi metodami.
Pri drugi izvedbi lahko proteine v smislu izuma uporabimo v kombinaciji s prevlekami semen, dostopnimi v stanju tehnike. Na ta način preslojimo transformirana semena z aplikacijami dostopnih insekticidnih sprejev ali praškov. Taki insekticidi so znani v stanju tehnike. Glej npr. US. patente št. 5,696,144; 5,695,763; 5,420,318; 5,405,612; 4,596,206; 4,356,934; 4,886,541; itd., ki so tukaj vključeni kot referenca.
Po tem, ko smo izolirali nukleotidne sekvence, ki kodirajo pesticidne proteine v smislu izuma, jih lahko manipuliramo in uporabimo za ekspresijo proteina v številnih gostiteljih, vključno drugih organizmih, vključno mikroorganizmih in rastlinah.
Proteine v smislu izuma lahko uporabimo za zaščito poljedelskih pridelkov in produktov pred škodljivci z uvedbo preko primernega vektorja v mikrobnega gostitelja in tega gostitelja apliciramo na okolje ali rastline. Izberemo lahko mikroorganizme gostitelja, ki so znani, da zasedajo fitosfero (filo-ploskev, filo-sfera, rizo-sfera in/ali rizo-ploskev) enega ali več zadevnih pridelkov. Te mikroorganizme izberemo tako, da so sposobni uspešnega tekmovanja v posameznem okolju z divjetipskimi mikroorganizmi, da zagotovijo stabilno vzdrževanje in ekspresijo gena, ki eksprimira polipeptidni pesticid, in zaželeno zagotovijo izboljšano zaščito pesticida pred razpadom in deaktivacijo zaradi okolja.
Proteine v smislu izuma lahko uporabimo v ekspresijskih kasetah za ekspresijo v kateremkoli gostitelju, ki je zanimiv. Take ekspresijske kasete bodo obsegale transkripcij sko iniciacijsko regijo, vezano na gen, ki kodira pesticidni gen, ki je zanimiv. Taka ekspresijska kaseta je opremljena z več restrikcijskimi mesti za insercijo gena, kije zanimiv, daje pod transkripcijsko regulacijo regulatomih regij. Ekspresijska kaseta lahko dodatno vsebuje izberljive markerske gene, primerne za posamezen organizem gostitelj.
Transkripcij ska iniciacijska regija, promotor, je lahko nativna ali analogna ali tuja ali heterologna gostitelju. Dodatno je lahko promotor naravna sekvenca ali alternativno sintetska sekvenca. S tujo je mišljeno, da transkripcijske iniciacijske regije ne ugotovimo v divjetipskem gostitelju, v katerega uvedemo transkripcijsko iniciacijsko regijo. Kot se tukaj uporablja, obsega himemi gen kodirno sekvenco, ki je operabilno vezana na transkripcijsko iniciacijsko regijo, ki je heterologna kodirni sekvenci.
v
Čeprav lahko uporabimo katerikoli promotor ali promotorski element, ki je sposoben voditi ekspresijo kodirne sekvence, so za ekspresijo v rastlinah posebno zanimivi koreninski promotorji (Bevan et al. (1993) v Gene Conservation and Exploitation. Proceedings of The 20th Stadler Genetics Symposium, Gustafson et al. (eds.), Plenum Press, Nev/ York, str. 109-129; Brears et al. (1991) Plant J. 1:235-244; Lorenz et al. (1993) Plant J. 4:545-554; US. patenti št. 5,459,252; 5,608,149; 5,599,670); strženski (US. patenti št. 5,466,785; 5,451,514; 5,391,725); ali drugi tkivno specifični in konstitutivni promotorji (glej npr. US. patente št. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142), ki so tukaj vključeni kot referenca.
Transkripcijska kaseta bo vključevala v 5-3' smeri transkripcije transkripcijsko in translacijsko iniciacijsko regijo, DNA sekvenco, ki je zanimiva, in transkripcijsko in translacijsko terminacijsko regijo, funkcionalno v rastlinah. Terminacijska regija je lahko nativna s transkripcijsko iniciacijsko regijo, je lahko nativna z DNA sekvenco, ki je zanimiva, ali je lahko izvedena iz drugega vira. Primerne terminacijske regije so dostopne iz Ti-plazmida od A. tumefaciens, kot oktopin sintazne in nopalin sintazne terminacijske regije. Glej tudi Guerineau et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Celi 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Celi 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
Nukleotidne sekvence, ki kodirajo proteine ali polipeptide v smislu izuma, so zlasti uporabne pri genetski manipulaciji rastlin. Na ta način zagotovimo gene v smislu izuma v ekspresij skih kasetah za ekspresijo v rastlini, ki je zanimiva. Kaseta bo vključevala 5' in 3' regulatome sekvence, operabilno vezane na gen, ki je zanimiv. Kaseta lahko dodatno vsebuje vsaj en dodaten gen, da ga ko-transformiramo ali vežemo in transformiramo v organizem. Po drugi strani lahko zagotovimo gen(e), ki je zanimiv, na drugi ekspresijski kaseti. Kadar je primemo, lahko gen(e) optimiramo za povečano ekspresijo v transformirani rastlini. T.j. gene lahko sintetiziramo ob uporabi rastlinsko prednostnih kodonov za izboljšano ekspresijo. Dostopne so metode v stroki za sintezo rastlinsko prednostnih genov. Glej npr. US patenta št. 5,380,831, 5,436,391 in Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, tukaj vključeno kot referenca.
Odvisno od tega, kje je treba eksprimirati DNA sekvenco, ki je zanimiva, je lahko zaželeno, da sintetiziramo sekvenco z rastlinsko prednostnimi kodoni ali alternativno s kloroplastno prednostnimi kodoni. Rastlinsko prednostne kodone lahko določimo iz kodonov z največjo pogostnostjo v proteinih, eksprimiranih v največji količini v posamezni rastlinski vrsti, ki je zanimiva. Glej EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA 88:3324-3328; in Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research 17:477-498. Na ta način lahko nukleotidne sekvence optimiramo za ekspresijo v vsaki rastlini. Znano je, da so lahko vsi ali katerikoli del genske sekvence optimiran ali sintetski. T.j. lahko uporabimo tudi sintetske ali delno optimirane sekvence.
Znano je, da dodatne sekvenčne modifikacije povečajo gensko ekspresijo v celičnem gostitelju. Te vključujejo eliminacijo sekvenc, ki kodirajo neprave poliadenilacijske signale, signale ekson-intron spajalnega mesta, transpozonsko podobna ponavljanja in druge tako dobro okarakterizirane sekvence, ki so lahko škodljive za gensko ekspresijo. G-C vsebnost sekvence lahko naravnamo na nivoje, ki so povprečni za danega celičnega gostitelja, kot je izračunano glede na znane gene, eksprimirane v celici gostiteljici. Kadar je mogoče, lahko sekvenco modificiramo, da se izognemo napovedanim lasničnim (hairpin) sekundarnim mRNA strukturam.
Ekspresijske kasete lahko dodatno vsebujejo 5' voditeljske sekvence v ekspresijskem kasetnem konstruktu. Take voditeljske sekvence lahko učinkujejo tako, da povečajo translacijo. Translacijski voditelji so znani v stroki in so: pikomavirusni voditelji, npr. EMCV voditelj (encefalomiokarditis 5' nekodima regija) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T.R., and Moss, B. (1989) PNAS USA, 86:6126-6130); potivirusni voditelji, npr. TE V voditelj (virus razjede tobaka) (Allison et al. (1986)); MDMV voditelj (pritilikavi virus mozaika koruze) Virology, 154:9-20); in humani imunoglobulinski težko-verižni vezavni protein (BiP), (Macejak, D.G., and Samow, P. (1991) Nature, 353:90-4; neprevajan voditelj od pokrivne proteinske mRNA od virusa mozaika lucerne (AMV RNA 4), (Jobling, S.A., and Gehrke, L., (1987) Nature, 325:622-625); voditelj virusa mozaika tobaka (TMV), (Gallie, D.R. et al. (1989) Molecular Biology of RNA, str. 237-256); in voditelj virusa kloroznih lis koruze (MCMV) (Lommel, S.A. et al. (1991) Virology, 81:382-385). Glej tudi Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology, 84:965968. Lahko uporabimo tudi druge metode, ki so znane za povečanje translacije, npr. introne, ipd.
Gene v smislu predloženega izuma lahko ciljamo na kloroplast ali amiloplast za ekspresijo. Na ta način, kadar gena, ki je zanimiv, ne vključimo direktno v kloroplast ali aminoplast, bo ekspresij ska kaseta dodatno vsebovala gen, ki kodira tranzitni peptid, za usmerjanje gena, ki je zanimiv, na kloroplaste. Taki tranzitni peptidi so znani v stroki. Glej npr. Von Heijne et al. (1991) Plant Mol, Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res Commun. 196:14141421; in Shah et al. (1986) Science 233:478-481.
Konstrukt lahko tudi vključuje katerekoli druge potrebne regulatorje, kot jedrske lokalizacijske signale (Kalderon et al. (1984) Celi 39:499-509; in Lassner et al. (1991) Plant Molecular Biology 17:229-234); rastlinske translacijske konsenzusne sekvence (Joshi, C.P. (1987) Nucleic Acids Research 15:6643-6653), introne (Luehrsen and Walbot (1991) Mol. Gen. Genet. 225:81-93) ipd., operabilno vezane na nukleotidno sekvenco, ki je zanimiva.
Znano je, da lahko protein eksprimiramo, pri čemer obsega nativno signalno sekvenco. Glej sl. 3. Po drugi strani lahko uporabimo druge signalne sekvence v stroki, npr. ječmenovo alfa amilazno signalno sekvenco.
Pri pripravi ekspresijske kasete lahko manipuliramo različne DNA fragmente, tako da zagotovimo DNA sekvence v primerni orientaciji in, če je primerno, v primernem bralnem okviru. Za to lahko uporabimo adapterje ali linkerje, da spojimo DNA fragmente, ali so lahko vpletene druge manipulacije, da zagotovimo primerna restrikcijska mesta, odstranitev odvečne DNA, odstranitev restrikcijskih mest ipd. Za ta namen lahko uporabimo in vitro mutagenezo, popravilo primerja, restrikcijo, aneliranje, resekcijo, ligacijo, PCR ipd., kjer so lahko vpletene insercije, delecije ali substitucije, npr. tranzicije in transverzije.
Sestavke v smislu predloženega izuma lahko uporabimo za transformacijo katerekoli rastline. Na ta način lahko dobimo genetsko modificirane rastline, rastlinske celice, rastlinsko tkivo, semena ipd. Transformacijski protokoli lahko variirajo glede na tip rastline ali rastlinske celice, t.j. enokaličnice ali dvokaličnice, ki so cilj transformacije. Primerne metode za transformiranje rastlinskih celic so mikroinjekcija (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), elektroporacija (Rigs et al. (1986) Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5602-5606, z Agrobacterium mediirana transformacija (Hinchee et al. (1988) Biotecnology,6:915-921), direkten genski transfer (Paszkowski et al. (1984) EMBO J., 3:2717-2722) in balistična pospešitev delcev (glej npr. Sanford et al., US. patent št. 4,945,050; in McCabe et al. (1988) Biotechnology, 6:923-926), Glej tudi Weissinger et al. (1988) Annual Rev. Genet., 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology, 5:27-37 (čebula); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology, 6:923-926 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology, 8:736-740 (riž); Klein et al. (1988) Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4305-4309 (koruza); Klein et al. (1988) Biotechnology, 6:559-563 (koruza); Klein et al. (1988) Plant Physiol., 91:440-444 (koruza); Fromm et al. (1990) Biotechnology, 8:833-839; Tomes et al. Direct DNA transfer into intact plant celiš via microprojectile bombardment, v: Gamborg and Phillips (eds) Plant Celi, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Springer-Verlag, Berlin, 1995 (koruza); Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas (1984) Nature (London), 311:763-764; Bytebier et al. (1987) Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) In The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. G.P. Chapman et al., pp. 197-209. Longman, NY (cvetni prah); Kaeppler et al. (1990) Plant Celi Reports, 9:415-418; and Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet., 84:560-566 (whiskermediirana transformacija); D=Halluin et al. (1992) Plant Celi, 4:1495-1505 (elektroporacija); Li et al. (1993) Plant Celi Reports, 12:250-255, and Christou and
Ford (1995) Arrnals of Botany, 75:407-413 (riž); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology, 14:745-750 (koruza preko Agrobacterium tumefaciens)·, od katerih so vsi tukaj vključeni kot referenca.
Kadar je zaželeno, lahko rastlinski plastid direktno transformiramo. O stabilni transformaciji plastidov so poročali pri višjih rastlinah, glej npr. ŠVAB et al. (1990) Proč. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; ŠVAB & Maliga (1993) Proč. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Staub & Maliga (1993) Embo J. 12:601-606. Metoda se opira na bombardiranje delcev DNA, ki vsebuje izberljiv marker, in ciljanje DNA na plastidni genom s homologno rekombinacijo. Dodatno lahko plastidno transformacijo izvedemo s transaktivacijo tihega, v plastidu prisotnega transgena s tkivno specifično ekspresijo jedrsko kodirane in plastidno usmerjene RNA polimeraze. O takem sistemu so poročali v Mcbride et al. (1994) Proč. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.
Celice, ki smo jih transformirali, lahko vdelamo v rastline v skladu z običajnimi načini. Glej npr. McCormick et al. (1986) Plant Celi Reports, 5:81-84. Te rastline lahko nato gojimo in bodisi oprašujemo z istim transformiranim sevom ali različnimi sevi in identificiramo dobljeno potomstvo z želeno fenotipično karakteristiko. Lahko gojimo dve ali več generacij, da zagotovimo, da se zadevna fenotipična karakteristika stabilno vzdržuje in podeduje, in nato poberemo semena, da zagotovimo, da smo dosegli želeno fenotipsko ali drugo lastnost.
Proteine bomo eksprimirali v transformiranih organizmih v količinah, ki so toksične za žuželke, ki so zanimive, ali ki inhibirajo rast žuželk.
Naslednji primeri so za ilustracijo in niso omejevalni.
Čeprav smo zgornji izum opisali podrobno za ilustracijo in kot primer zaradi jasnosti razumevanja, bo očitno, da lahko izvajamo v okviru opisanega izuma določene spremembe in modifikacije.
POSKUSI
Čiščenje pentina-1
Semena P. macroloba smo zbrali iz nižinskega vlažnega pragozda Kostarike in prenesli v laboratorije avtorjev, kjer smo jih zrezali, liofilizirali in shranili pri -20 °C pred uporabo. Zmrznjena semena smo zrezali v manjše koščke in homogenizirali ob uporabi Brinkmannovega homogenizatorja. Pri tipični proceduri smo 10 g semenskega materiala homogenizirali z 1-2 g netopnega polivinilpirolidona in 50-100 ml 10 mM natrijevega fosfatnega pufra pH 7,5. Homogenat smo nato mešali 8-10 ur pri 4 °C in centrifiigirali 15 minut pri 5000 obr/min. Supematantno tekočino smo skrbno dekantirali in zlili skozi en sam sloj Miracloth-a in zbrali, tako da smo se izognili transferu lipidom podobnih materialov v ekstraktu, ki so se odločili in strdili na površini med centrifugiranjem. Pelet smo zavrgli in zbrano tekočino, ki je bila Še vedno nekoliko motna, drugič centrifiigirali pri 18000 obr/min v Sorvall SS-34 rotorju ali njegovem ekvivalentu 30 minut. Rahlo motno supematantno tekočino, ki jo v nadaljevanju imenujemo surovi ekstrakt, smo zbrali in pelet zavrgli. Vzorec surovega ekstrakta smo shranili za testiranje in preostanek dializirali ob uporabi membrane z omejitvijo molekulske mase (MWC0) 3500 proti petim menjavam 10 mM natrijevega fosfatnega pufra, pH 7,5 pri 3 °C do 4 °C. Razmerje dializne tekočine proti ekstraktu je bilo vsaj 20:1. Dializo smo nadaljevali 8-16 ur na izmenjavo pufra. Med dializo je ekstrakt postal precej moten kot rezultat proteinskega obarjanja. Zato smo dializirane ekstrakte zbistrili s centrifugiranjem pri 18000 obr/min 30 minut, da smo odstranili denaturirane proteine. Dobljeni material po centrifugiranju v nadaljevanju imenujemo surov dializiran ekstrakt. Surove in surove dializirane ekstrakte smo analizirali glede proteinske sestave ali vsebnosti in ugotovili, da vsebujejo snov, ki je bila insekticidno aktivna proti CRW v biološki testih. Ugotovili smo, da je insekticid protein ali proteinasta snov.
100 ml-ski vzorec dializiranega surovega ekstrakta smo segrevali na okoli 80 °C ob uporabi vodne kopeli in vzdrževali pri tej temperaturi okoli 5 minut. Segreti ekstrakt smo nato ohladili pod 25 °C ob uporabi kopeli ledu in po ohlajenju centrifiigirali 15 do minut pri 18000 obr/min ob uporabi Sorval SS-34 rotorja. Bistro supematantno tekočino smo odstranili, shranili in v nadaljevanju označili kot toplotno obdelan ekstrakt. Peletiran material smo zavrgli. Opazili smo, da je toplotno obdelan ekstrakt včasih kazal tendenco do želiranja. Toplotno obdelan ekstrakt je bil testiran protein za uporabo Bradfordove metode z BS A kot standarda in ugotovili smo, da ima insekticidno aktivnost proti CRW v bioloških testih.
Vzorec segretega ekstrakta smo frakcionirali in koncentrirali ob uporabi amonijevega sulfata. Vzorec smo ohladili ob uporabi kopeli ledu in ob mešanju počasi dodali uprašen amonijev sulfat, 0,6 g/ml vzorca. Po končanem dodajanju amonijevega sulfata smo vzorec vzdrževali pri temperaturah kopeli ledu okoli 30 minut. Vzorec smo nato centrifugirali 20 minut pri 4 °C pri 18000 obr/min ob uporabi Sorval SS-34 rotorja. Supematantno tekočino in peletiran material smo ločili ter peletiran material resolubilizirali v minimalni količini 10 mM natrijevega fosfatnega pufra, pH 7,5, in obsežno dializirali proti 10 mM natrijevemu fosfatnemu pufru, pH 7,5. Supematantno tekočino in resolubiliziran peletiran material smo testirali glede na proteinsko vsebnost po Bradfordovi metodi ob uporabi BSA kot standarda in testirali na biološko aktivnost proti CRW. V peletiranem materialu smo ugotovili velik del pentina-1 in je bil insekticiden proti CRW. Po drugi strani smo volumen segretega ekstrakta zmanjšali s centrifugalno koncentracijo ob uporabi Centricona™ ali podobnih naprav za koncentriranje v skladu z navodili proizvajalca.
Proteine smo tudi frakcionirali s kromatografijo z izključitvijo velikosti na bodisi Pharmacia Sephacryl S-200 koloni ali Pharmacia Superose 12 koloni. Uporabili smo različne velikosti kolon glede na količino proteina v vzorcu, ki ga je bilo treba kromatografirati. Na splošno volumen vzorca ni bil večji kot 0,5-1% volumna kolone. Kolono smo ekvilibrirali z vsaj dvema do tremi volumni kolone 10 mM natrijevega fosfatnega pufra, pH 7,5, preden smo vzorec nanesli na kolono. Proteine smo eluirali s kolone z 10 mM natrijevim fosfatnim pufrom, pH 7,5. Frakcije smo testirali na proteinsko vsebnost po Bradfordovi metodi ob uporabi BSA kot standarda in smo jih biotestirali ob uporabi ličink CRW. Po tej metodi lahko kromatografiramo surove ali dializirane ekstrakte, segrete ekstrakte, frakcije, resolubilizirane po amonijevem sulfatnem obarjanju, in ekstrakte ali frakcije, koncentrirane po drugih metodah. Biološko aktiven material smo eluirali tik po praznem volumnu, kar napeljuje na to, da ima aktivni material zmerno visoko molekulsko maso. Ta rezultat se sklada z ocenami velikosti, dobljenimi ob uporabi Centricon™ filtriracijskih naprav z različnimi območji molekulskih mas. Slednje kaže, da ima aktivni material nativno molekulsko maso večjo kot 100 kDa, kar je verjeten rezultat združevanja številnih podenot z molekulsko maso 40-55± 5 kDa. Čistoto frakcij smo ocenili po določitvi molekulske mase ob uporabi SDS-PAGE, kot je opisano spodaj. Te frakcije so bile v bistvu čiste z enim primarnim trakom, ugotovljenim z ocenjeno molekulsko maso podenote v območju 40-55± 5 kDa.
Toplotno obdelane vzorce ali vzorce, ki smo jih podvrgli kromatografiji z izključitvijo velikosti, smo frakcionirali z anionsko izmenjalno kromatografijo ob uporabi bodisi Pharmacia Q Sepharose kolone ali Pharmacia Resource Q kolone. Pred namestitvijo vzorca na kolono smo kolono najprej izprali s 25 mM Tris-HCl ali primernim pufrom, ki vsebuje 1 M NaCl, in nato ekvilibrirali z istim pufrom brez NaCl. pH pufrov, uporabljenih v kromatografiji, je bil v območju med pH 4 in pH 10. Za namen ilustracije metod je tukaj opisana kromatografija ob uporabi 25 mM Tris-HCl pufra, pH 9,0. Pred injiciranjem vzorca na kolono smo vzorec dializirali ob uporabi 3500 MWC0 membrane z 2-3 izmenjavami 25 mM Tris-HCl pufra brez 1 M NaCl. Po namestitvi na kolono smo pretok zbrali in kolono izprali s 25 mM Tris-HCl, pH 9,0. Izpiralno tekočino smo tudi zbrali. Kolono smo nato eluirali z gradientom v območju od 25 mM Tris-HCl, pH 9,0, nič NaCl do 25 mM Tris-HCl, pH 9,0, 1 M NaCl. Vse zbrane frakcije smo dializirali z najmanj dvema pufrskima izmenjavama proti 10 mM natrijevemu fosfatu, pH 7,5. Pretok, izpiralno tekočino in s soljo eluirane frakcije smo testirali na protein po Bradfordovi metodi ob uporabi BS A kot standarda in biotestirali ob uporabi CRW. Aktivni material smo našli v pretoku in v frakcijah, ki so bile eluirane med 0,2 in 0,5 M NaCl. Za določitev, če je bila kapaciteta kolone presežena, posledica pa so dodatni materiali, ki so prehajali skozi kolono brez vezanja, smo aktivni material v pretoku ponovno aplicirali na kolono po re-ekvilibriranju. Večina od UV 280 nm absorbirajočega materiala je prešla skozi kolono. Ta opažanja so napeljevala na to, da ima ta aktivni material drugačne lastnosti kot material, ki je bil vezan na kolono in smo ga eluirali z naraščajočimi prirastki NaCl. Drugi uporabljeni pufri so bili tudi primerni za anionsko izmenjalno kromatografijo, kot je znano strokovnjakom. Aktivni material smo lahko čistili tudi s kationsko izmenjalno kromatografijo.
Pentin-1 material smo očistili skoraj do homogenosti s kromatografijo z izključitvijo velikosti ali anionsko izmenjalno kromatografijo. Manjše proteinske trakove smo odstranili z visoko tlačno tekočinsko kromatografijo (HPLC) ob uporabi kolone z reverzno fazo pred amino kislinsko analizo in določitvijo amino kislinske sekvence.
Čistoto vzorcev in molekulsko maso podenot smo določili z SDS-PAGE ob uporabi 12% poliakrilamidnih gelov in na splošno po metodi Laemmli-ja, Nature 227:680-685 (1970). Gele smo obarvali bodisi s Coomassie Blue R250 ob uporabi standardnih protokolov ali s srebrom (Hammer et al., Phytochemistry 28:3019-3026 (1989)). Z SDS-PAGE smo ugotovili, da je molekulska masa podenot aktivne snovi v območju 40-55000 ± 5000 Daltonov.
Poleg zgoraj opisanih postopkov lahko za ločenje aktivne snovi iz ekstrakta surovega semena uporabimo druge postopke. Npr. ekstrakt lahko podvržemo izoelektričnemu fokusiranju (IEF) ob uporabi Rotofor sistema (Bio-Rad). Rotofor loči molekule na osnovi njihove pl ali izoelektrične točke. Vsaka molekula bi imela specifičen naboj, bodisi pozitiven ali negativen, pri specifičnem pH. Rotofor ob uporabi električnega toka premika molekule skozi pH gradient, dokler ne dosežejo svojega pl; t.j. pH, pri katerem imajo čisti naboj 0. Molekula preneha migrirati pri svoji pl, ker nanjo nič več ne vpliva električni tok. Fokusima komora Rotoforja je ločena v 20 manjših komor s permeabilnimi membranami. Teh 20 vzorcev istočasno odvzamemo, da zagotovimo kar najmanj mešanja.
Tipično vzorec namestimo v fokusimi medij, zapufrano raztopino (glej navodila proizvajalca), ki vključuje 12,5% (m/v) glicerola in 2,5% pH 3-10 amfolitov (BioRad). Po fokusiranju frakcije zberemo, določimo pH vsake in vsako frakcijo dializiramo proti 1 M NaCl ob uporabi 3500 MWC0 membrane, da odstranimo amfolite. Vzorce nato dializiramo proti deionizirani vodi, da odstranimo NaCI. Vsako frakcijo liofiliziramo in resuspendiramo v 0,4 ml 10 mM NaCI. Rotoforske frakcije, ki vsebujejo aktivni material, lahko določimo s proteinskim testom in biotestom z ličinkami žuželk. Rotoforske frakcije lahko nato podvržemo nadaljnji obdelavi ali ločenju, kot je opisano zgoraj.
Biološki testi
Bioteste smo izvajali ob uporabi CRW novorojenih ličink, gojenih na umetnih dietah, ki so vsebovale pentin-1, dobljen iz P. macroloba, kot je tukaj opisano. Pentin-1 je lahko iz surovega ekstrakta ali očiščen, kot se tukaj opisuje. Pentin-1 smo bodisi aplicirali lokalno na površino diete ali vdelali v dieto, kot navaja Czapla and Lang, J. Econo. Ento. 83(6):2480-2485 (1990). Gojilni pladenj kulture, uporabljen v biotestih, smo razdelili v obdelovalne skupine. V vsakem pladnju smo skrinirali enega ali več pentin-1 pripravkov ali frakcij iz različnih ločb; pri čemer smo vsak pripravek ali frakcijo aplicirali na več celic. Vsako celico smo infestirali z eno ali dvema novorojenima ličinkama. Mylar film s prezračevalnimi odprtinami smo pritrdili na vrh vsakega pladnja, da smo preprečevali pobeg in dopustili izmenjavo zraka.
Za lokalne (prekrivne) teste smo pripravili raztopino, ki je vsebovala 2% pentin-1, v 0,1 M fosfatni zapufrani fiziološki raztopini kuhinjske soli (PBS), pH = 7,8. 75 μΐ pentin-1 pufrske raztopine smo pipetirali na Stoneville dietni medij v vsaki celici. Gojilni pladenj smo vrteli, da smo zagotovili enako porazdelitev pentin-1 raztopine na dietnem mediju. Celice smo inficirali in zatesnili, kot je opisano zgoraj. Kontrola je bila 75 μΐ 0,1 M PBS (samo) na celico.
Za teste vdelave diete smo Stoneville medij pripravili na standarden način, vendar le z 90% predpisane vode. Dodali smo pentin-1 tako, daje bila količina v dieti v območju 1-5 pg/g. Kontrolna obdelava je obstajala iz 0,9 ml PBS pufra, dodanega k 8,1 g medija. Medij smo zlili na celice in nato celice infestirali in pokrili, kot je opisano zgoraj. Težo žuželk (teža ali povpr. teža) smo določili pri dnevu 7 in je podana v tabelah.
Tabela A. Učinek pentina-1 na južni CRW
Vzorec Koncentracija (pg/ml diete) % smrtnosti
kontrola - 0
surov 1000 100
surov 400 15
AS75 400 60
velikostna frakcija 17 8 14
velikostna frakcija 18 8 45
velikostna frakcija 19 8 29
Opombe: AS75 = amonijev sulfat 75% populacija
Ko je bil pentin-1 očiščen in določena njegova insekticidna aktivnost, smo se lotili kloniranja. Prva stopnja postopka je bila, da smo določili z westem blot analizo časovno in prostorsko porazdelitev pentin-1, da bi identificirali rastlinsko ali semensko tkivo ali tkiva, ki bi najverjetneje eksprimirala ta protein. Ker pentin-1 ni bil izoliran v količinah, ki bi dopuščale proizvodnjo protiteles, smo protein sekvencirali, da bi omogočili oblikovanje peptidov za sintezo. Amino kislinski sekvenčni podatki za pentin-1 so prikazani spodaj na sl. 1. Karboksi-terminus in notranjo sekvenco približno 40% pentin-1 peptidov smo kompilirali iz 15 peptidov, očiščenih iz LysC in CNBr digeriranja očiščenega pentin-1 proteina. Med tem postopkom nismo identificirali NH2-terminalne sekvence.
Protitelesa smo vzgajali proti petim od peptidov. Sintetski peptidi, uporabljeni za proizvodnjo protiteles, so našteti spodaj.
Sintetski peptid št. 1 (SEQ ID NO:5)
Opomba: ustreza amino kislinskim številom 213-228 s sl. 1.
Sintetski peptid št. 2 (SEQ ID N0:6)
Opomba: ustreza amino kislinskim številom 344-360 s sl. 1.
Sintetski peptid št. 3 (SEQ ID NO:7)
Opomba: ni ustrezanja z amino kislinami s sl. 1.
Sintetski peptid št. 4 (SEQ ID NO:8)
Opomba: ni ustrezanja z amino kislinami s sl. 1.
Sintetski peptid KS (SEQ ID NO:9)
Opomba: ustreza amino kislinskim številom 349-363 s sl. 1.
Westem pikčaste blots pentina-1, vsakega od sintetskih peptidov in eksperimentalni protein, označen s 5C9, smo inkubirali z vsakim od protiteles. Inkubacijski rezultati so pokazali, da je protitelo, vzgojeno proti sintetskemu peptidu KS (protitelo anti-KS), in protitelo, vzgojeno proti sintetskemu peptidu 2 (protitelo anti-2), prepoznalo pentin-1. Westem blots Pentaclethra macroloba tkivnih ekstraktov, obdelanih z anti-KS protitelesi, so pokazali, da je bila največja prepoznava z zrelimi semeni s premerom 30-40 mm ali večjimi. Iz teh semen smo izolirali celotno RNA.
Genomsko DNA smo izolirali, kodonsko degenerirane oligonukleide na osnovi peptidov smo uporabili za PCR pomnoževanje genomskih fragmentov. Eksonsko sekvenco dobljenih klonov smo uporabili, da smo naredili RT-PCR s specifičnimi oligi, nato smo izvedli RT-PCR poskuse, da smo dobili vsaj delno pentin-1 cDNA za sondiranje ekspresijske knjižnice. Informacijo, dobljeno iz sekvenciranja naključnih cDNA klonov iz knjižnice P. macroloba nezrelega semena, smo uporabili za generiranje nascentne kodonske uporabnostne tabele. Dobljeni podatki so pokazali, da
P. macroloba drevo nima močne kodonske uporabnostne nagnjenosti in da je GC vsebnost zmerna. Matrico degeneriranih naprej usmerjenih in reverznih primerjev, ki ustrezajo pentin-1 peptidom, smo izbrali za uporabo. Naprej usmerjena primerska sekvenca je bila VVKRLAGYFDV (pentin-1 amino kislina št. 76-86: Val Val Lys Arg Leu Ala Gly Tyr Phe Asp Val) (SEQ ID NO: 10) in reverzna primerska sekvenca je bila ENMENLEK, (pentin-1 amino kislina št. 372-379): Glu Asn Met Glu Asn Leu Glu Lys) (SEQ ID NO: 11). Zaradi majhne količine dostopnega tkiva smo izvedli začetno primersko testiranje ob uporabi genomske DNA, izvedene iz listov P. macroloba. Ena od 64 možnih primerskih kombinacij je dala 3,0 kb fragment, ki je kodiral pentin-1 peptidne sekvence. Nato smo naprej usmerjeni in reverzni primerski par uporabili za pomnoževanje 0,8 kb cDNA fragmenta iz celotne RNA, izolirane iz zrelih (30-40 mm) semen. Sledeče skriniranje ekspresijske knjižnice zrelega semena s to 0,8 kb cDNA sondo je proizvedlo več sorodnih klonov, od katerih je eden 1,4 kb klon, ki kodira 12 od 15 peptidnih sekvenc iz pentina 1 (SEQ ID NO: 1).
Westem blots smo izvedli s pentinom-1, pentin-1 sintetskimi peptidi, 5C9 in BSA proteini proti izpostavljanju izbranim protitelesom. Blots smo obdelali z 1/10000 razredčenjem protiteles, vzgojenih proti vsakemu od peptidov in 5C9. Vsako protitelo je prepoznalo svoj antigen z nikakršno ugotovljivo križno reaktivnostjo do BSA, negativno kontrolo. Vsa protitelesa, razen tistih, vzgojenih proti sintetskemu peptidu št. 1, so prepoznala 1,0 pg 5C9. Čeprav so bili sintetski peptidi KS in št. 2 74% identični, anti-2 protitelo ni prepoznalo KS, je pa ugotovilo pentin-1 in 5C9.
Nukleinsko kislinsko sekvenco pentin-1 klona smo določili po standardnih postopkih, ki so znani strokovnjakom. cDNA sekvenca in napovedana pentin-1 proteinska sekvenca sta na sl. 1 in SEQ ID NO: 1.
Biotesti kloniranega materiala
Bioteste smo izvedli proti zahodnemu koruznemu koreninskemu črvu WCR ob uporabi sonificirane E. coli, ki smo jo transformirali z enim od številnih naštetih plazmidov (tabela 1). Transformirane celice smo gojili v približno 25-35 ml TB juhe. Celice smo poželi po 24 urah s centrifugiranjem. Pelet smo resuspendirali v približno 1 ml PBS pufra in sonificirali. Dobljeno zmes smo nato dali na vrh površine diete in nato infestirali z novorojenimi WCR ličinkami. Smrtnost smo zabeležili po 4 dneh. Pozitivni rezultat je nakazoval 100% smrtnost. Negativni rezultat je nakazoval smrtnost pod 10%. Podoben poskus je zajemal uporabo transformiranih celic, gojenih na agarski plošči. Celice smo postrgali po zadostni rasti, suspendirali v majhni količini PBS pufra in nato raztopino vdelali v dieto žuželke. Izvedli smo tudi 4-dnevni biotest z zabeleženo smrtnostjo.
Tabela 1 prikazuje rezultate dveh paralelk biotestov. Vse celice, transformirane z dozdevno negativnimi (ne-letalni WCR geni) plazmidi niso povzročile nikakršne smrtnosti ličink v nobenem testu. Ti plazmidi so P7725, P88126 in Pl 1426. Oba plazmida, ki vsebujeta kodirno sekvenco za pentin-1, vendar nobenih promotorjev za proizvodnjo dejanskega proteina, PGEM in Pl 1394 nista pokazala nobene WCR aktivnosti. Vendar pa so vsi plazmidi, ki vsebujejo kodirno regijo za pentin-1 (SEQ ID NO:1) in funkcijsko ekspresijsko kaseto, pokazali odlično aktivnost proti ličinkam WCR. Vse take obdelave so imele 100% smrtnost. Predhodna analiza westem blot je pokazala, da je bil v teh celičnih ekstraktih prisoten protein, po velikosti podoben pentinu-1, vendar ne v negativnih kontrolnih vzorcih. Aktivnost se je videla v obeh tipih celične priprave in biotestih.
Tabela 1
Transformacija protoplastov, izoliranih iz koruznih suspenzijskih celic s tremi pentin1 genskimi konstrukti za gensko ekspresijo in za CRW biotest
I. Protoplastni transformacijski protokol
Za izdelavo protoplastov smo uporabili dokazane Hill (GS3) suspenzijske celice. Celice smo zbrali 3-4 dni po sub-kultiviranju.
Celično digeriranje: celice smo digerirali v encimski raztopini pri 27 °C 3-5 ur s stresalno hitrostjo 50-60 obr/min. Celično steno smo digerirali s celulazo in pektoliazo, da smo sprostili protoplaste.
Žetev protoplastov: digeriran material je prehajal skozi filter 30 mm in protoplaste smo rekuperirali s centrifugiranjem filtrata 10 minut pri 1000 obr/min.
Protoplastni pelet smo resuspendirali v 20 ml ali 40 ml KMC raztopine. Gostoto in celoten dobitek protoplastov smo določili s štetjem števila protoplastov s hemacitometrom. Suspenzijo smo centrifugirali, da smo peletirali protoplaste. Protoplastni pelet smo suspendirali v MaMg transformacijski raztopini v koncentraciji milijona protoplastov na ml.
Raztopino v količinah po 2 ml (okoli 4 milijonov protoplastov) smo porazdelili v 15 ml-ske epruvete z okroglim dnom. Vsaka epruveta je bila podvajana. Vsaj 3 podvajanja smo uporabili za vsak pentin-1 genski konstrukt. Konstrukti so vključevali tako nativno pentin-1 in optimirano pentin-1 sekvenco. Glej SEQ ID NO: 1 oz. 3. Plazmidno DNA smo dodali v protoplastno suspenzijo v epruvetah (15 mg plazmidne DNA/milijon protoplastov) in zmešali.
Po inkubaciji 5 minut smo dodali 2 ml 40% polietilen glikola (PEG-8000, Sigma) k protoplast/DNA zmesi (končna PEG koncentracija je okoli 20%) in mešali z večkratnim obračanjem epruvet in inkubirali 20-30 minut pri sobni temperaturi.
V vsako epruveto smo dodali okoli 3 ml W5 solne raztopine. Epruvete smo pokrili in rahlo obračali. To smo ponovili 2-krat, dokler končni volumen ni bil 13-14 ml. Suspenzijo smo centrifugirali 8 minut pri 1000 obr/min. Za resuspendiranje protoplastov smo uporabili 3 ml FW medija (glej spodaj). Ob uporabi Pasteurjeve pipete s plastičnim stiščkom smo eno obdelavo (3 ml) porazdelili v dve vdolbini gojilne plošče s 6 vdolbinami, zatesnili s parafilmom in inkubirali 24-48 ur v temi pri 28 °C.
Po gojenju smo protoplaste prenesli v 15 ml-epruveto ob uporabi Pasteurjeve pipete s plastičnim stiščkom in centrifugirali 8 minut pri 500 obr/min za peletiranje protoplastov.
Proteinska analiza in biotest: 1/5 do 1/4 protoplastnega peleta v vsakem podvajanju za vsako transformacijsko obdelavo smo vzorčili za analizo pentin-1 ekspresije z Westem blot. Preostanek protoplastnega peleta smo uporabili za biotest. Vse podvajalne vzorce iz iste transformacijske obdelave, t.j. transformirane z istim pentin-1 konstruktom, smo zbrali in vdelali v dieto za CRW biotest. Rezultati biotesta so v tabeli 2.
Tabela 2. Učinek pentina-1, če je bil eksprimiran prehodno v koruznih protoplastih, proti WCR ličinkam. Podatki so skupek 6 Časovno podvaianih poskusov. Protoplaste smo sonificirali in celotno zmes vdelali v dieto.
II. Pentin-1 genski konstrukti za transformacijo
Pl 1184 - Ubi promotor::pentin-l (originalen popolen klon) Pl 1335 - Ubi promotor::pentin-l (delno modificiran gen) Pl 1443 - Ubi promotor: :mopentin-1 (optimiran gen)
Raztopine in mediji, uporabljeni za transformacijo
KMC raztopina - 1000 ml
KC1 8,65 g
MgC12-6H2O 16,47 g
CaC12-2H2O 12,50 g
MES 0,5% 5,0 g pH 5,8 s KOH filtrsko sterilizirati
MaMg transformacijska raztopina - 1000 ml
Mmanitol 108,1 g mM MgC12-6H2O 3,05 g mM MES 1,95 g pH 5,7 filtrsko sterilizirati
40% PEG -100 ml
Dodati 40 g PEG k 60 ml MaMg transformacijske raztopine. Hitro obdelati z mikrovalovi, da se PEG raztopi. Dodati še MaMg raztopine do končnega volumna 100 ml. Naravnati na pH 7,0. Filtrsko sterilizirati.
Encimska raztopina za digeriranje suspenzijske celice (encimska raztopina)
Encimska raztopina vsebuje 3% celulaze RS in 0,3% pektoliaze Υ23 v protoplastni raztopini.
Protoplastna raztopina - 1000 ml
M manitol 108,1 g mM MES 1,95 g mM CaC12-2H2O 147 mg mM MgC12-6H2O 203 mg
1% BS A (po želji) 1 g pH 5,7 filtrsko sterilizirati
W5 solna raztopina - 1000 ml
154 mM NaCI 9,0 g
125 mM CaC12-2H2O 18,56 g
5mMKCl 0,373 g
5 mM glukoze pH 5,5 s KOH filtrsko sterilizirati 0,901 g
FW medij - 1000 ml
MS soli (Sigma M5519) 4,3 g
saharoza 30,0 g
manitol 54,0 g
prolin 1,5 g
2,4-D 3,0 mg
1000x B5 vitamini lml
pH 5,8
filtrsko sterilizirati
Transformacija in regeneracija koruznega kalusa
Nezrele koruzne embrije iz donorskih rastlin v rastlinjaku bombardiramo s plazmidom, ki vsebuje vse tri pentin-1 konstrukte plus plazmid, ki vsebuje izberljiv markerski gen, PAT, (Wohlleben, W., Arnold, W„ Broer, I., Hillemann, D., Strauch, E. and Puehler, A. Nucleotide sequence of the phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tue494 and its expression in Nicotiana tabacum Gene 70:25-37 (1988), ki podeli rezistenco za herbicid Bialophos, po naslednji metodi:
Prosimo upoštevati: vsi recepti za medije so v Dodatku.
Priprava tarčnega tkiva: klase površinsko steriliziramo v 30% Chlorox belilu plus 0,5% Micro detergentu 20 minut in 2-krat splaknemo s sterilno vodo. Nezrele embrije eksciziramo in namestimo os embrija na spodnjo stran (scutellum na zgornjo stran), 25 embrijev na ploščo. Te gojimo na 506L mediju 4 dni pred bombardiranjem v temi. Na dan bombardiranja embrije prenesemo v 560Υ medij za 4 ure, razporejene znotraj 2,5 cm-ske cone tarče.
Priprava DNA:
100 gl pripravljenih volframovih delcev v vodi pil (1 gg) DNA v TrisEDTA pufru (1 gg v celoti)
100 gl 2,5 M CaC12 gl 0,1 M spermidina
Vsak reagent dodamo zaporedno na suspenzijo volframovih delcev ob vzdrževanju na večcevnem vortekserju. Plazmide naravnamo po velikosti za končno 1:1 razmerje. Končno zmes hitro sonificiramo in pustimo inkubirati ob stalnem vorteksiranju 10 minut. Po obarjalnem času epruvete hitro centrifugiramo, tekočino odstranimo, izperemo s 500 ml 100% etanola in centrifugiramo 30 sekund. Tekočino spet odstranimo in h končnemu peletu volframovih delcev dodamo 105 μΐ 100% etanola. Za bombardiranje delcev delce volframa/DNA hitro sonificiramo, 10 μΐ namažemo na sredino vsakega makro-nosilca in pustimo sušiti okoli 2 minuti pred bombardiranjem.
Obdelava z bombardiranjem delcev: Vzorčne plošče bombardiramo pri nivoju #4 v pištoli za delce #HE34-1 ali #HE34-2. Vsi vzorci prejmejo en sam strel pri 650 PSI, s celoto 10 alikvotov, vzetih iz vsake epruvete pripravljenih delcev/DNA.
Naknadna obdelava: po bombardiranju držimo embrije na 560Υ mediju 2 dni, nato prenesemo v 560R selekcijski medij, ki vsebuje 3 mg/1 Bialophosa, in sub-kultiviramo vsake 2 tedna. Po približno 10 tednih selekcije selekcijsko odporne kalusne klone vzorčimo za PCR in fumonizin esterazno TLC aktivnostno analizo. Pozitivne linije prenesemo na 288J medij, da iniciiramo rastlinsko regeneracijo. Po somatskem zorenju embrijev (2-4 tednih) prenesemo dobro razvite somatske embrije v medij za kalitev in prenesemo v osvetljeno gojilno komoro. Približno 7-10 dni kasneje prenesemo razvijajoče se rastlinice v medij v epruvetah za 7-10 dni, dokler rastlinice niso dobro utrjene. Rastline nato prenesemo v vključke v ploske posode (ekvivalent lončku 6,4 cm), ki vsebujejo prst za lončnice, in jih gojimo 1 teden v rastni komori, nato gojimo še 1-2 tedna v rastlinjaku, nato prenesemo v klasične 600 lončke (6 1) in gojimo do zrelosti.
Dodatek
Sestavina Količina Enota
D-I H2O 900,000 ml
CHU (N6) bazalne soli (SIGMA C-1416) 1,600 g
N6 makrohranila 10Χ zaloga ## 60,000 ml
kalijev nitrat 1,680 g
B5H manj pomembne soli 1000Χ ### 0,600 ml
B5H Fe Na EDTA 100Χ #### 6,000 ml
Erikssonova vitaminska zmes (1000Χ SIGMA-1511) 0,400 ml
S & H vitaminska zmes 100Χ zaloga (S3766) 6,000 ml
tiamin.HCl 0,4 mg/ml 0,500 ml
L-prolin 1,980 g
kazein hidrolistat (kislina) 0,300 g
saharoza 20,000 g
glukoza 0,600 g
2,4-D 0,5 mg/ml 1,600 ml
Gelrite @ 2,000 g
Dicamba 1 mg/ml # 1,200 ml
srebrov nitrat 2 mg/ml # 1,700 ml
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna # = dodati po steriliziranju in ohlajenju na temperaturo
Raztopiti sestavine v polirani D-I H2O v sekvenci
Naravnati na pH 5,8
Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O po naravnavi pH
Sterilizirati in ohladiti na 60 °C.
## = raztopiti 1,660 g kalcijevega klorida dihidrata v 950,000 ml polirane D-I H2O. Nato raztopiti 4,629 amonijevega sulfata; 4,000 g monobazičnega kalijevega fosfata KH2PO4; 1,850 g magnezijevega sulfata 7-H2O, MgSO4, 7H2O; in 28,300 g kalijevega nitrata v sekvenco. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
### = raztopiti 3,000 g borove kisline; 10,000 g manganovega (II) sulfata monohidrata; 0,250 g natrijevega molibdata dihidrata; in 0,750 g kalijevega jodida v polirani D-I H2O v sekvenci. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
#### = raztopiti 3,700 g dinatrijevega EDTA dihidrata in 2,790 g železovega (II) sulfata 7-hidrata v D-I H2O. Dopolniti do volumna z D-I H2O.
Celoten volumen (L) = 1,00
604 A
Sestavina Količina Enota
D-I H2O 900,000 ml
CHU (N6) (SIGMA C-1416) 1,600 g
N6 makrohranila 10Χ zaloga ## 60,000 ml
kalijev nitrat 1,680 g
B5H manj pomembne soli 1000Χ ### 0,600 ml
B5H Fe Na EDTA 100Χ #### 6,000 ml
Erikssonova vitaminska zmes (1000Χ SIGMA-1511) 0,400 ml
S & H vitaminska zmes 100Χ zaloga (S3766) 6,000 ml
tiamin . HCI 0,4 mg/ml 0,500 ml
L-prolin 1,980 g
kazein hidrolizat (kislina) 0,300 g
saharoza 20,000 g
glukoza 0,600 g
2,4-D 0,5 mg/ml 1,600 ml
Gelrite @ 2,000 g
Dicamba 1 mg/ml # 1,200 ml
srebrov nitrat 2 mg/ml # 1,700 ml
Bialaphos 1 mg/ml # 3,000 ml
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna # = dodati po steriliziranju in ohlajenju na temperaturo
Raztopiti sestavine v polirani D-IH2O v sekvenci
Naravnati na pH 5,8
Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O po naravnavi pH
Sterilizirati in ohladiti na 60 °C.
## = raztopiti 1,660 g kalcijevega klorida dihidrata v 950,000 ml polirane D-I H2O. Nato raztopiti 4,629 amonijevega sulfata; 4,000 g monobazičnega kalijevega fosfata
ΚΗ2ΡΟ4; 1,850 g magnezijevega sulfata 7-H2O, MgSO4, 7H2O; in 28,300 g kalijevega nitrata v sekvenco. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
### = raztopiti 3,000 g borove kisline; 10,000 g manganovega (II) sulfata monohidrata; 0,250 g natrijevega molibdata dihidrata; in 0,750 g kalijevega jodida v polirani D-I H2O v sekvenci. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
#### = raztopiti 3,700 g dinatrijevega EDTA dihidrata in 2,790 g železovega (II) sulfata 7-hidrata v D-I H2O. Dopolniti do volumna z D-I H2O.
Celoten volumen (L) = 1,00
605 J
Sestavina Količina Enota
D-I H2O 900,000 ml
CHU (N6) (SIGMA C-1416) 1,600 g
N6 makrohranila 10Χ zaloga ## 60,000 ml
kalijev nitrat 1,680 g
B5H manj pomembne soli 1000Χ ### 0,600 ml
B5H Fe Na EDTA 100Χ #### 6,000 ml
Erikssonova vitaminska zmes (1000Χ SIGMA-1511) 0,400 ml
S & H vitaminska zmes 100Χ zaloga (S3766) 6,000 ml
tiamin . HCI 0,4 mg/ml 0,500 ml
saharoza 20,000 g
glukoza 0,600 g
2,4-D 0,5 mg/ml 1,600 ml
Gelrite @ 2,000 g
Dicamba 1 mg/ml # 1,200 ml
srebrov nitrat 2 mg/ml # 0,425 ml
Bialaphos 1 mg/ml # 3,000 ml
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna # = dodati po steriliziranju in ohlajenju na temperaturo
Raztopiti sestavine v polirani D-I H2O v sekvenci
Naravnati na pH 5,8
Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O po naravnavi pH
Sterilizirati in ohladiti na 60 °C.
## = raztopiti 1,660 g kalcijevega klorida dihidrata v 950000 ml polirane D-I H2O. Nato raztopiti 4,629 amonijevega sulfata; 4,000 g monobazičnega kalijevega fosfata KH2PO4; 1,850 g magnezijevega sulfata 7-H2O, MgSO4, 7H2O; in 28,300 g kalijevega nitrata v sekvenco. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
### = raztopiti 3,000 g borove kisline; 10,000 g manganovega (II) sulfata monohidrata; 0,250 g natrijevega molibdata dihidrata; in 0,750 g kalijevega jodida v polirani D-I H2O v sekvenci. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
#### - raztopiti 3,700 g dinatrijevega EDTA dihidrata in 2,790 g železovega (II) sulfata 7-hidrata v D-I H2O. Dopolniti do volumna z D-I H2O.
Celoten volumen (L) = 1,00
604S
Sestavina Količina Enota
D-I H2O 800,000 ml
CHU (N6) (SIGMA C-1416) 1,600 g
N6 makrohranila 10Χ zaloga ## 60,000 ml
kalijev nitrat 1,680 g
B5H manj pomembne soli 1000Χ ### 0,600 ml
B5H Fe Na EDTA 100Χ #### 6,000 ml
Erikssonova vitaminska zmes (1000Χ SIGMA-1511) 0,400 ml
S & H vitaminska zmes 100Χ zaloga (S3766) 6,000 ml
tiamin . HCI 0,4 mg/ml 0,500 ml
L-prolin 1,980 g
kazein hidrolizat (kislina) 0,300 g
saharoza 120,000 g
glukoza 0,600 g
2,4-D 0,5 mg/ml 1,600 ml
Gelrite @ 2,000 g
Dicamba 1 mg/ml # 1,200 ml
srebrov nitrat 2 mg/ml # 1,700 ml
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna # = dodati po steriliziranju in ohlajenju na temperaturo
Raztopiti sestavine v polirani D-I H2O v sekvenci
Naravnati na pH 5,8
Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O po naravnavi pH
Sterilizirati in ohladiti na 60 °C.
### = raztopiti 1,660 g kalcijevega klorida dihidrata v 950,000 ml polirane D-I H2O. Nato raztopiti 4,629 amonijevega sulfata; 4,000 g monobazičnega kalijevega fosfata KH2PO4; 1,850 g magnezijevega sulfata 7-H2O, MgSO4, 7H2O; in 28,300 g kalijevega nitrata v sekvenco. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
## = raztopiti 3,000 g borove kisline; 10,000 g manganovega (II) sulfata monohidrata; 0,250 g natrijevega molibdata dihidrata; in 0,750 g kalijevega jodida v 950,000 ml polirane D-I H2O v sekvenci. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O.
#### = raztopiti 3,700 g dinatrijevega EDTA dihidrata in 2,790 g železovega (II) sulfata 7-hidrata v 950,000 ml D-I H2O. Dopolniti do volumna z D-I H2O.
Celoten volumen (L) = 1,00
272V
Sestavina Količina Enota
D-I H2O 950,000 ml
MS soli (GIBCO 111117-074) 4,300 g
Mio-Inozitol 0,100 g
osnovna raztopina MS vitaminov ## 5,000 ml
saharoza 40,000 g
Bacto-Agar @ 6,000 g
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna
Raztopiti sestavine v polirani D-I H2O v sekvenci
Naravnati na pH 5,6
Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O po naravnavi pH
Sterilizirati in ohladiti na 60 °C.
## = raztopiti 0,100 g nikotinske kisline; 0,020 g tiamin.HCl; 0,100 g piridoksin-HCl; in 0,400 g glicina v 875,00 ml polirane D-I H2O v sekvenci. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O. Narediti v 400 ml-skih deležih. Tiamin.HCl & piridoksin.HCl sta v temnem desikatorju. Shranjevati 1 mesec, razen če ne pride do kontaminacije ali obarjanja, nato narediti svežo zalogo.
Celoten volumen (L) = 1,00
288J
Sestavina Količina Enota
D-I H2O 950,000 ml
MS soli 4,300 g
Mio-Inozitol 0,100 g
osnovna raztopina MS vitaminov ## 5,000 ml
Zeatin - 0,5 mg/ml 1,000 ml
saharoza 60,000 g
Gelrite @ 3,000 g
indolocetna kislina 0,5 mg/ml # 2,000 ml
0,1 mM absisinska kislina 1,000 ml
Bialaphos 1 mg/ml # 3,000 ml
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna Raztopiti sestavine v polirani D-I H2O v sekvenci
Naravnati na pH 5,6
Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O po naravnavi pH
Sterilizirati in ohladiti na 60 °C.
Dodati 3,5 g/1 Gelrita za celično biologijo.
## = raztopiti 0,100 g nikotinske kisline; 0,020 g tiamin.HCl; 0,100 g piridoksin-HCl; in 0,400 g glicina v 875,00 ml polirane D-I H2O v sekvenci. Dopolniti do volumna s polirano D-I H2O. Narediti v 400 ml-skih deležih. Tiamin.HCl & piridoksin.HCl sta v temnem desikatorju. Shranjevati 1 mesec, razen Če ne pride do kontaminacije ali obarjanja, nato narediti svežo zalogo.
Celoten volumen (L) =1,00
560L
Sestavina Količina Enota
D-I voda, filtrirana 950,000 ml
CHU (N6) bazalne soli (SIGMA C-1416) 4,000 g
Erikssonova vitaminska zmes (1000Χ SIGMA-1511) 0,400 ml
tiamin . HCI 0,4 mg/ml 1,250 ml
saharoza 20,000 g
2,4-D 0,5 mg/ml 2,000 ml
L-prolin 2,880 g
Gelrite @ 2,000 g
srebrov nitrat 2 mg/ml # 4,250 ml
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna # = dodati po steriliziranju in ohlajenju na temperaturo Raztopiti sestavine v D-I H2O v sekvenci Naravnati na pH 5,8 s KOH Dopolniti do volumna z D-I H2O Sterilizirati in ohladiti na sobno temperaturo Celoten volumen (L) =1,00
560R
Sestavina Količina Enota
D-I voda, filtrirana 950,000 ml
CHU (N6) bazalne soli (SIGMA C-1416) 4,000 g
Erikssonova vitaminska zmes (1000Χ SIGMA-1511) 1,000 ml
tiamin . HCI 0,4 mg/ml 1,250 ml
saharoza 30,000 g
2,4-D 0,5 mg/ml 4,000 ml
Gelrite @ 3,000 g
srebrov nitrat 2 mg/ml # 0,425 ml
Bialaphos 1 mg/ml # 3,000 ml
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna # = dodati po steriliziranju in ohlajenju na temperaturo Raztopiti sestavine v D-I H2O v sekvenci Naravnati na pH 5,8 z KOH Dopolniti do volumna s D-I H2O Sterilizirati in ohladiti na sobno temperaturo Celoten volumen (L) = 1,00
560Υ
Sestavina Količina Enota
D-I voda, filtrirana 950,000 ml
CHU (N6) bazalne soli (SIGMA C-1416) 4,000 g
Erikssonova vitaminska zmes (1000Χ SIGMA-1511) 1,000 ml
tiamin . HCI 0,4 mg/ml 1,250 ml
saharoza 120,000 g
2,4-D 0,5 mg/ml 2,000 ml
L-prolin 2,880 g
Gelrite @ 2,000 g
srebrov nitrat 2 mg/ml #
4,250 ml
Navodila:
@ = dodati po dopolnitvi do volumna # = dodati po steriliziranju in ohlajenju na temperaturo
Raztopiti sestavine v D-I H2O v sekvenci
Naravnati na pH 5,8 s KOH
Dopolniti do volumna z D-I H2O
Sterilizirati in ohladiti na sobno temperaturo ** avtoklavirati manj časa zaradi povečane saharoze**
Celoten volumen (L) = 1,00
Plazmida PHP11361 in PHP11511 smo deponirali pri American Type Culture Collection, Bethesda, Maryland, in sta prejela pristopni številki 209026 oz. 209025. PHP11361 obsega nukleotidno sekvenco nativne pentin-1 sekvence. PHP11511 obsega optimirano pentin-1 sekvenco.
Vse objave in patentne prijave, omenjene v opisu, so namenjene nivoju strokovnjakov, na katere se ta izum nanaša.
Vse objave in patentne prijave so tukaj vključene kot referenca v enakem obsegu, kot če bi bilo za vsako posamezno prijavo ali patentno prijavo specifično in individualno navedeno, daje vključena kot referenca.
Čeprav smo gornji izum opisali podrobno s pomočjo ilustracij in primerov za namene jasnosti razumevanja, bo očitno, da lahko v obsegu priloženih zahtevkov prakticiramo določene spremembe in modifikacije.
- 54 Seznani sekvenc (D Splošne informacije:
(i-Prijavitelj-.cigan, amy l
CZΑΡΙΑ, THOMAS H FALLIS, LYNN MEYER, TERRY E MUNDELL, SCOTT A SABUS, BRIAN SCHUBERT, KAREL (ii) Naslov izuma: Proteini z insekticidnimi aktivnostmi in postopek uporabe (iii) Število sekvenc: 11 (iv) Naslov za dopisovanje:
(A) Naslovnik: w. murray spruill (alston & bird, llp, (b) Cesta: 3605 glenwood ave.
(c) Mesto: raleigh (d) Dežela: nc (e) Država: us a (f) Poštna številka: 27622 (v) Računalniško berljiva oblika:
(a) Tij) medija: Fioppy disk (B) Računalnik: IBM PC kompatibilen (c) Operacijski sistem: PC-DOS/MS-DOS (D) Softver: Patentln Release #l.0, verzija #1.30 (vi) Trenutni podatki o prijavi:
(a) Številka prijave:
(B) Datum vložitve:
(c) Klasifikacija:
(viii) Informacija o zastopniku:
(a) line: spruill, w. murray (b) Registrska štev.: ^2,943 (c) Referenca: 5718-9 (ix) Telekomunikacijske informacije:
(A) Telefon: 919 420 2202 (b) Telefax: 919 881 3175 (2) Informacije za seq id N0:i:
(i) Sekvenčne karakteristike:
(A) Dolžina: 1469 baznih parov (B) Tip: nukleinska kislina (c)Verižnost: enojna (D)Topologija: linearna di) Tip molekule ; cdna (vi) Originalen vir:
(A)Organizem: Pentaclethra macroloba
- 55 (ixj Značilnost:
(a) Ime/ključ: cds (B)Lokacija: 3i..1257 (xi) Opis sekvence: seq id no:1:
CGGCACGAGC TCGTACAGAT TCTATCCATT ATG AAG TCG AAA ATG GCC ATG CTC 54
Met Lys Ser Lys Met Ala Met Leu
5
CTT TTG Leu Leu 10 TTA Leu TTT Phe TGT GTG TTA TCT AAT CAG CTA GTG GCA GCA TTT TCC 102
Cys Val Leu Ser 15 Asn Gin Leu Val Ala 20 Ala Phe Ser
ACA CAA GCG AAA GCT TCT AAA GAT GGA AAC TTA GTC ACA GTT CTT GCC 150
Thr Gin Ala Lys Ala Ser Lys Asp Gly Asn Leu Val Thr Val Leu Ala
25 30 35 40
ATT GAT GGA GGT GGT ATC AGA GGA ATT ATC CCC GGA GTT ATT CTC AAA 198
Ile Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly Ile Ile Pro Gly Val Ile Leu Lys
45 50 55
CAA CTA GAA GCT ACT CTT CAG AGA TGG GAC TCA AGT GCA AGA CTA GCA 246
Gin Leu Glu Ala Thr Leu Gin Arg Trp Asp Ser Ser Ala Arg Leu Ala
60 65 70
GAG TAT TTT GAT GTG GTT GCC GGG ACG AGC ACT GGA GGG ATT ATA ACT 294
Glu Tyr Phe Asp Val Val Ala Gly Thr Ser Thr Gly Gly Ile Ile Thr
75 80 85
GCC ATT CTA ACT GCC CCG GAC CCA CAA AAC AAG GAC CGT CCT TTG TAT 342
Ala Ile Leu Thr Ala Pro Asp Pro Gin Asn Lys Asp Arg Pro Leu Tyr
90 95 100
GCT GCC GAA GAA ATT ATC GAC TTC TAC ATA GAG CAT GGT CCT TCC ATT 390
Ala Ala Glu Glu Ile Ile Asp Phe Tyr Ile Glu His Gly Pro Ser Ile
105 110 115 120
TTT AAT AAA TCC ACC GCC TGC TCG TTG CCT GGT ATC TTT TGT CCA AAG 438
Phe Asn Lys Ser Thr Ala Cys Ser Leu Pro Gly Ile Phe Cys Pro Lys
125 130 135
TAT GAT GGG AAG TAT TTA CAA GAA ATA ATA AGC CAG AAA TTG AAT GAA 486
Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Gin Glu Ile Ile Ser Gin Lys Leu Asn Glu
140 145 150
ACA CTA CTA GAC CAG ACA ACA ACA AAT GTT GTT ATC CCT TCC TTC GAC 534
Thr Leu Leu Asp Gin Thr Thr Thr Asn Val Val Ile Pro Ser Phe Asp
155 160 165
ATC AAG CTT CTT CGT CCA ACC ATA TTC TCA ACT TTC AAG TTA GAG GAA 582
Ile Lys Leu Leu Arg Pro Thr Ile Phe Ser Thr Phe Lys Leu Glu Glu
170 17S 180
GTT CCT GAG TTA AAT GTC AAA CTC TCC GAT GTA TGC ATG GGA ACT TCA 630
Val Pro Glu Leu Asn Val Lys Leu Ser Asp Val Cys Met Gly Thr Ser
185 190 195 200
GCA GCA CCA ATC GTA TTT CCT CCC TAT TAT TTC AAG CAT GGA GAT ACT 678
Al a Al a - 56 -
Pro Ile Val Phe Pro Pro Tyr Tyr Phe Lys His Gly Asp Thr 215
205 210
GAA TTC AAT CTC GTT GAT GGT GCA ATC ATC GCT GAT ATT CCG GCC CCG 726
Glu Phe Asn Leu Val Asp Gly Ala Ile Ile Ala Asp Ile Pro Ala Pro
220 225 230
GTT GCT CTC AGC GAG GTG CTC CAG CAA GAA AAA TAC AAG AAT AAA GAA 774
Val Al a Leu Ser Glu Val Leu Gin Gin Glu Lys Tyr Lys Asn Lys Glu
235 240 245
ATC CTT Ile Leu TTG Leu CTG TCT ATA GGA ACT GGA GTT GTA AAA CCT GGT GAG GGT 822
Leu Ser Ile Gly Thr Gly Val Val Lys Pro Gly Glu Gly
250 255 260
TAT TCT GCT AAT CGT ACT TGG ACT ATT TTC GAT TGG AGT AGT GAA ACT 870
Tyr Ser Ala Asn Arg Thr Trp Thr Ile Phe Asp Trp Ser Ser Glu Thr
265 270 275 280
TTA ATC GGG CTT ATG GGT CAT GGA ACG AGA GCC ATG TCT GAT TAT TAC 918
Leu Ile Gly Leu Met Gly His Gly Thr Arg Ala Met Ser Asp Tyr Tyr
285 290 295
GTT GGC TCA CAT TTC AAA GCC CTT CAA CCC CAG AAT AAC TAC CTC CGA 966
Val Gly Ser His Phe Lys Ala Leu Gin Pro Gin Asn Asn Tyr Leu Arg
300 305 310
ATT CAG GAA TAC GAT TTA GAT CCG GCA CTG GAA AGC ATT GAT GAT GCT 1014
Ile Gin Glu Tyr Asp Leu Asp Pro Ala Leu Glu Ser Ile Asp Asp Ala
315 320 325
TCA ACG GAA AAC ATG GAG AAT CTG GAA AAG GTA GGA CAG AGT TTG TTG 1062
Ser Thr Glu Asn Met Glu Asn Leu Glu Lys Val Gly Gin Ser Leu Leu
330 335 340
AAC GAA CCA GTT AAA AGG ATG AAT CTG AAT ACT TTT GTC GTT GAA GAA 1110
Asn Glu Pro Val Lys Arg Met Asn Leu Asn Thr Phe Val Val Glu Glu
345 350 355 360
ACA GGT GAA GGT ACC AAT GCA GAA GCT TTA GAC AGG CTG GCT CAG ATT 1158
Thr Gly Glu Gly Thr Asn Ala Glu Ala Leu Asp Arg Leu Ala Gin Ile
365 370 375
CTT TAT GAA GAA AAG ATT ACT CGT GGT CTC GGA AAG ATA TCT TTG GAA 1206
Leu Tyr Glu Glu Lys Ile Thr Arg Gly Leu Gly Lys Ile Ser Leu Glu
380 385 390
GTG GAT AAC ATT GAT CCA TAT ACT GAA CGT GTT AGG AAA CTG CTA TTC 1254
Val Asp Asn Ile Asp Pro Tyr Thr Glu Arg Val Arg Lys Leu Leu Phe
395 400 405
TGA TACGAATTGA AGTTGTTTCC TCCTTGCCAT ATAGCCTCAC TTTGTTTGGC 1307 *
AATAAATAAA TAAATAAATG TAATCGTTTG GTTTGATGTC CTTGACTTTG TCATATATGC 1367
TGGCTCTATA AGAAGCACCA GCAGATAAAT AAAGGTTAAT GTTTGAGGTA TWAARWAAAA 1427
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAACTC GA
1469
- 57 (2) Informacije za:SEQ id no.-2:
(i) Sekvenčne karakteristike:
(a) Dolžina: 409 amino kislin (b) Tip: amino kislina (d) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: protein
(xi) Opis sekvence: SEQ ID N0:2:
Met Lys Ser Lys Met Ala Met Leu Leu Leu Leu Phe Cys Val Leu Ser
1 5 10 15
Asn Gin Leu Val Ala Ala Phe Ser Thr Gin Ala Lys Ala Ser Lys Asp
20 25 30
Gly Asn Leu Val Thr Val Leu Ala Ile Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly
35 40 45
Ile Ile Pro Gly Val Ile Leu Lys Gin Leu Glu Ala Thr Leu Gin Arg
50 55 60
Trp Asp Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Tyr Phe Asp Val Val Ala Gly
65 70 75 80
Thr Ser Thr Gly Gly Ile Ile Thr Ala Ile Leu Thr Ala Pro Asp Pro
85 90 95
Gin Asn Lys Asp Arg Pro Leu Tyr Ala Ala Glu Glu Ile Ile Asp Phe
100 105 110
Tyr Ile Glu His Gly Pro Ser Ile Phe Asn Lys Ser Thr Ala Cys Ser
115 120 125
Leu Pro Gly Ile' Phe Cys Pro Lys Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Gin Glu
130 135 140
Ile Ile Ser Gin Lys Leu Asn Glu Thr Leu Leu Asp Gin Thr Thr Thr
145 150 155 160
Asn Val Val Ile Pro Ser Phe Asp Ile Lys Leu Leu Arg Pro Thr Ile
165 170 175
Phe Ser Thr Phe Lys Leu Glu Glu Val Pro Glu Leu Asn Val Lys Leu
180 185 190
Ser Asp Val Cys Met Gly Thr Ser Ala Ala Pro Ile Val Phe Pro Pro
195 200 205
Tyr Tyr Phe Lys His Gly Asp Thr Glu Phe Asn Leu Val Asp Gly Ala
210 215 220
Ile Ile Ala Asp Ile Pro Ala Pro Val Ala Leu Ser Glu Val Leu Gin
225 230 235 240
Gin Glu Lys Tyr Lys Asn Lys Glu Ile Leu Leu Leu Ser Ile Gly Thr
245 250 2S5
Gly Val Val Lys 260 Pro Gly Glu Gly Tyr Ser Ala Asn Arg Thr Trp Thr
265 270
Ile Phe Asp Trp Ser Ser Glu Thr Leu Ile Gly Leu Met Gly His Gly
275 280 285
Thr Arg Al a Met Ser Asp Tyr Tyr Val Gly Ser Hi s Phe Lys Ala Leu
290 295 300
Gin Pro Gin Asn Asn Tyr Leu Arg Ile Gin Glu Tyr Asp Leu Asp Pro
305 310 315 320
Al a Leu Glu Ser Ile Asp Asp Ala Ser Thr Glu Asn Met Glu Asn Leu
325 330 335
Glu Lys Val Gly Gin Ser Leu Leu Asn Glu Pro Val Lys Arg Met Asn
340 345 350
Leu Asn Thr Phe Val Val Glu Glu Thr Gly Glu Gly Thr Asn Ala Glu
355 360 365
Al a Leu Asp Arg Leu Ala Gin Ile Leu Tyr Glu Glu Lys Ile Thr Arg
370 375 380
Gly Leu Gly Lys Ile Ser Leu Glu Val Asp Asn Ile Asp Pro Tyr Thr
385 390 395 400
Glu Arg Val Arg Lys Leu Leu Phe *
405 (2) Informacije za: seq id no:3:
(i) Sekvenčne karakteristike:
(A) Dolžina: 1227 baznih parov (b) Tip: nu^einska kislina (O Veriznost: enojna (d) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: druga nukleinska kislina (A) Opis: /desc = cDNA Pentin-1 npti mi ram za povečano ekspresijo” (vi) Originalen vir:
(A) Organizem: Pentaclethra macroloba (ix) Značilnost:
(A) Ime/ključ: Cds (b)Lokacija: 1..1227 (xi) Opis sekvence: seq ID no:3.·
ATG AAG TCC AAG ATG GCC ATG CTC CTC CTC CTC TTC TGC GTG CTC TCC 48
Met Lys Ser Lys Met Ala Met Leu Leu Leu Leu Phe Cys Val Leu Ser
410 415 420 425
AAC CAG CTC GTG GCC GCG TTC TCC ACC CAG GCC AAG GCC TCC AAG GAC 96
Asn Gin Leu Val Ala Ala Phe Ser Thr Gin Ala Lys Ala Ser Lys Asp
430 435 440
GGC AAC CTC GTG ACC GTG CTC GCC ATC GAC GGC GGC GGC ATC CGC GGC 144
Gly Asn Leu Val Thr 445 Val Leu Ala Ile Asp 450 Gly Gly Gly Ile 455 Arg Gly
ATC ATC CCG GGC GTG ATC CTC AAG CAG CTC GAG GCG ACC CTC CAG AGG 192
Ile Ile Pro 460 Gly Val Ile Leu Lys Gin Leu 465 Glu Ala Thr 470 Leu Gin Arg
TGG GAC TCC AGC GCC AGG CTC GCG GAG TAC TTC GAC GTG GTG GCC GGC 240
Trp Asp Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Tyr Phe Asp Val Val Ala Gly
475 480 485
ACC TCC ACC GGC GGC ATC ATC ACC GCC ATC CTC ACC GCC CCG GAC CCG 288
Thr 490 Ser Thr Gly Gly Ile 495 Ile Thr Ala Ile Leu 500 Thr Ala Pro Asp Pro 505
CAG AAC AAG GAC CGC CCG CTC TAC GCC GCC GAG GAG ATC ATC GAC TTC 336
Gin Asn Lys Asp Arg 510 Pro Leu Tyr Ala Ala 515 Glu Glu Ile Ile Asp 520 Phe
TAC ATC GAG CAC GGC CCG TCC ATC TTC AAC AAG TCC ACC GCC TGC TCC 384
Tyr Ile Glu Hi S 525 Gly Pro Ser Ile Phe 530 Asn Lys Ser Thr Ala 535 Cys Ser
CTC CCG GGC ATC TTC TGC CCG AAG TAC GAC GGC AAG TAC CTC CAG GAG 432
Leu Pro Gly 540 Ile Phe Cys Pro Lys 545 Tyr Asp Gly Lys Tyr 550 Leu Gin Glu
ATC ATC TCC CAG AAG CTC AAC GAG ACC CTC CTC GAC CAG ACC ACC ACC 480
Ile Ile 555 Ser Gin Lys Leu Asn 560 Glu Thr Leu Leu Asp 565 Gin Thr Thr Thr
AAC GTG GTG ATC CCG TCC TTC GAC ATC AAG CTC CTC CGC CCG ACC ATC 528
Asn 570 Val Val Ile Pro Ser 575 Phe Asp Ile Lys Leu 580 Leu Arg Pro Thr Ile 585
TTC TCC ACC TTC AAG CTC GAG GAG GTG CCG GAG CTC AAC GTG AAG CTC 576
Phe Ser Thr Phe Lys 590 Leu Glu Glu Val Pro 595 Glu Leu Asn Val Lys 600 Leu
TCC GAC GTG TGC ATG GGC ACC TCC GCC GCC CCG ATC GTG TTC CCG CCG 624
Ser Asp Val Cys 605 Met Gly Thr Ser Ala 610 Ala Pro Ile Val Phe 615 Pro Pro
TAC TAC TTC AAG CAC GGC GAC ACC GAG TTC AAC CTC GTC GAC GGC GCG 672
Tyr Tyr Phe 620 Lys Hi s Gly Asp Thr 625 Glu Phe Asn Leu Val 630 Asp Gly Ala
ATC ATC GCG GAC ATC CCA GCC CCG GTG GCC CTC TCC GAG GTG CTC CAG 720
Ile Ile 635 Ala Asp Ile Pro Ala 640 Pro Val Ala Leu Ser 645 Glu Val Leu Gin
CAG GAG AAG TAC AAG AAC AAG GAG ATC CTC CTC CTG AGC ATC GGC ACC 768
Gin 650 Glu Lys Tyr Lys Asn 655 Lys Glu Ile Leu Leu 660 Leu Ser Ile Gly Thr 665
GGC GTG GTG AAG CCG GGC GAG GGC TAC TCC GCC AAC CGC ACC TGG ACC 816
Gly Val Val Lys Pro Gly Glu Gly Tyr Ser Ala Asn Arg Thr Trp Thr
670 675 680
ATC TTC GAC TGG TCC TCC GAG ACC CTC ATC GGC CTC ATG GGG CAC GGC 864
Ile Phe Asp Trp Ser 685 Ser Glu Thr Leu 690 Ile Gly Leu Met Gly His 695 Gly
ACC CGC GCC ATG TCC GAC TAC TAC GTG GGC TCC CAC TTC AAG GCC CTC 912
Thr Arg Al a Met Ser Asp Tyr Tyr Val Gly Ser His Phe Lys Ala Leu
700 705 710
CAG CCG CAG AAC AAC TAC CTC CGC ATC CAG GAG TAC GAC CTC GAC CCG 960
Gin Pro Gin Asn Asn Tyr Leu Arg Ile Gin Glu Tyr Asp Leu Asp Pro
715 720 725
GCC CTC GAG TCC ATC GAC GAC GCC TCC ACC GAG AAC ATG GAG AAC CTC 1008
Al a Leu Glu Ser Ile Asp Asp Ala Ser Thr Glu Asn Met Glu Asn Leu
730 735 740 745
GAG AAG GTG GGC CAG TCC CTC CTC AAC GAG CCG GTG AAG CGC ATG AAC 1056
Glu Lys Val Gly Gin Ser Leu Leu Asn Glu Pro Val Lys Arg Met Asn
750 755 760
CTC AAC ACG TTC GTC GTG GAG GAG ACC GGC GAG GGG ACC AAC GCC GAG 1104
Leu Asn Thr Phe Val Val Glu Glu Thr Gly Glu Gly Thr Asn Ala Glu
765 770 775
GCG CTC GAC CGC CTC GCC CAG ATC CTC TAC GAG GAG AAG ATC ACC CGC 1152
Al a Leu Asp Arg Leu Al a Gin Ile Leu Tyr Glu Glu Lys Ile Thr Arg
780 785 790
GGC CTC GGC AAG ATC TCC CTC GAG GTG GAC AAC ATC GAC CCG TAC ACC 1200
Gly Leu Gly Lys Ile Ser Leu Glu Val Asp Asn Ile Asp Pro Tyr Thr
795 800 805
GAG CGC GTG CGC AAG CTC CTC TTC TGA 1227
Glu Arg Val Arg Lys Leu Leu Phe *
810 815 (2) Informacije za:sEQ id no:4:
(i) Sekvenčne karakteristike:
(a) Dolžina: 409 amino kislin (b) Tip: amino kislina (d) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: protein (xi) Opis sekvence: seq id no:4:
Met 1 Lys Ser Lys Met 5 Ala Met Leu Leu Leu 10 Leu Phe Cys Val Leu 15 Ser
Asn Gin Leu Val 20 Ala Ala Phe Ser Thr 25 Gin Ala Lys Ala Ser 30 Lys Asp
Gly Asn Leu 35 Val Thr Val Leu Ala 40 Ile Asp Gly Gly Gly 45 Ile Arg Gly
Ile Ile 50 Pro Gly Val Ile Leu 55 Lys Gin Leu Glu Ala 60 Thr Leu Gin Arg
Trp Asp Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Tyr Phe Asp Val Val Ala Gly
65 70 75 80
Thr Ser Thr Gly Gly 85 lle lle Thr Ala lle 90 Leu Thr Ala Pro Asp 95 Pro
Gin Asn Lys Asp 100 Arg Pro Leu Tyr Ala 105 Ala Glu Glu lle lle 110 Asp Phe
Tyr lle Glu 115 Hls Gly Pro Ser lle 120 Phe Asn Lys Ser Thr 125 Ala Cys Ser
Leu Pro 130 Gly lle Phe Cys Pro 135 Lys Tyr Asp Gly Lys 140 Tyr Leu Gin Glu
lle 145 lle Ser Gin Lys Leu 150 Asn Glu Thr Leu Leu 155 Asp Gin Thr Thr Thr 160
Asn Val Val lle Pro 165 Ser Phe Asp lle Lys 170 Leu Leu Arg Pro Thr 175 lle
Phe Ser Thr Phe 180 Lys Leu Glu Glu Val 185 Pro Glu Leu Asn Val 190 Lys Leu
Ser Asp Val 195 Cys Met Gly Thr Ser 200 Ala Ala Pro lle Val 205 Phe Pro Pro
Tyr Tyr 210 Phe Lys His Gly Asp 215 Thr Glu Phe Asn Leu 220 Val Asp Gly Ala
lle 225 lle Ala Asp lle Pro 230 Ala Pro Val Ala Leu 235 Ser Glu Val Leu Gin 240
Gin Glu Lys Tyr Lys 245 Asn Lys Glu lle Leu 250 Leu Leu Ser lle Gly 255 Thr
Gly Val Val Lys 260 Pro Gly Glu Gly Tyr 265 Ser Ala Asn Arg Thr 270 Trp Thr
lle Phe Asp 275 Trp Ser Ser Glu Thr 280 Leu lle Gly Leu Met 285 Gly His Gly
Thr Arg 290 Ala Met Ser Asp Tyr 295 Tyr Val Gly Ser His 300 Phe Lys Ala Leu
Gin 305 Pro Gin Asn Asn Tyr 310 Leu Arg lle Gin Glu 315 Tyr Asp Leu Asp Pro 320
Ala Leu Glu Ser lle 325 Asp Asp Ala Ser Thr 330 Glu Asn Met Glu Asn 335 Leu
Glu Lys Val Gly 340 Gin Ser Leu Leu Asn 345 Glu Pro Val Lys Arg 350 Met Asn
Leu Asn Thr 355 Phe Val Val Glu Glu 360 Thr Gly Glu Gly Thr 365 Asn Ala Glu
Ala Leu Asp Arg Leu Ala Gin lle Leu Tyr Glu Glu Lys lle Thr Arg
370 375 380
Gly Leu Gly Lys Ile Ser Leu Glu Val Asp Asn Ile Asp Pro Tyr Thr 385 390 395 400
Glu Arg Val Arg Lys Leu Leu Phe *
405 (2) Informacije za: seq id no:5:
(D SekvenČne karakteristike:
(a) Dolžina: 16 amino kislin (b) Tip:~amino kislina (c) Veriznost: enojna (d) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: peptid (vi) Originalni vir:
(A) Organizem: Pentaclethra macroloba (xi) Opis sekvence: seq id no:5:
Met Ser Thr Ser Ala Ala Pro Ile Val Phe Pro Pro Tyr Tyr Phe Lys 15 10 15 (2) Informacije za:sEQ id no:6:
(i) SekvenČne karakteristike:
(A) Dolžina: 16 amino kislin (B) Tip:amino kislina (c) Verižnost: enojna (D) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: peptid (vi) Originalen vir:
(A)Organizem: Pentaclethra macroloba (xi) Opis sekvence: Seq id no:6:
Ala Leu Gin Pro Gin Asn Asn Tyr Leu Arg Gin Glu Tyr Asp Leu Asp 15 10 15 (2, Informacije za:sEQ id no:7:
(D SekvenČne karakteristike:
(A, Dolžina: 13 amino kislin (b) Tip: amino kislina (c) Verižnost: enojna ( d ) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: peptid (vi)Originalen vir (A) Organizem: Pentaclethra macroloba (xi) Opis sekvence: SEq id no:7:
Pro Asp Trp Val Val Ile Arg Ser Gin Ser Val Gly Lys 15 10 (2) Informacije za: seq id NO:8:
(ί) Sekvenčne.karakteristike:
(A) Dolžina: 16 amino kislin (B) Tip: amino kislina (c; Verižnost: enojna (D) Topologija: linearna (ii, Tip molekule: peptid (vi) Originalen vir:
(A) Organizem: Pentaclethra macroloba (xi) Opis sekvence: seq id no:8:
Lys Ala Phe Val Asn Gly Val Tyr Phe Ile Asn Thr Tyr Asp Ser Ala 15 10 15 (2) Informacije za:sEQ id νο.·9:
(i) Sekvenčne karakteristike:
(a) Dolžina: 15 amino kislin (b) Tipkami no kislina (c) Verižnost: enojna (D) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: peptid (vi) Originalen vir:
(A) Organizem: Pentaclethra macroloba (xi) Opis sekvence: seq id no:9:
Asn Asn Tyr Leu Arg Ile Gin Glu Tyr Asp Leu Pro Pro Ala Leu 15 10 15 (2) Informacije za:gEQ id no:10:
(i) Sekvenčne karakteristike:
(a) Dolžina: 11 amino kislin (B) Tip:~amino kislina (c) Verižnost: enojna (d) Topologija: linearna (ii) Tip molekule: peptid
- Μ (vi) Originalen vir:
(A) Organizem: pentaclethra raacroloba (xi> Opis sekvence: SEq id nchio:
Val Val Lys Arg Leu Ala Gly Tyr Phe Asp Val 15 10 (2) Informacije za: SEq id no:11:
(i) Sekvenčne karakteristike:
(a)Dolžina: 8 amino kislin (B)Tip: amino kislina (c)Verižnost: enojna (D)Topologija: linearna (ii) Tip molekule: peptid (vi, Originalen vir:
(A) Organizem: Pentaclethra macroloba (xi)
Glu
Opis sekvence:
SEQ ID NO:11:
Asn Met Glu Asn Leu Glu Lys 5
Za
PIONEER HI-BREAD INTERNATIONAL INC THE BOARD OF REGENTS FOR THE UNIVERSITY OF OKLAHOMA:
PATENTNA PISARNA, d.o.o. LJUBLJANA, ČOPOVA 14

Claims (32)

  1. Patentni zahtevki
    1. V bistvu očiščen protein, izoliran iz rodu Pentaclethra, ki ima insekticidne lastnosti.
  2. 2. V bistvu očiščen polipeptid, označen s tem, da obsega amino kislinsko sekvenco, izbrano iz skupine, ki obstoji iz:
    a) amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;
    b) ostankov 22-409 sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;
    c) ostankov 29-409 amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO.2; in
    d) pesticidno aktivnega fragmenta amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2.
  3. 3. Polipeptid z insekticidno aktivnostjo proti koruznemu koreninskemu črvu, označen s tem, da polipeptid obsega variacijo amino kislinske sekvence, izbrane iz skupine, ki obstoji iz:
    a) amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;
    b) ostankov 22-409 sekvence, navedene v SEQ ID NO.2; in
    c) ostankov 29-409 amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2, pri čemer variacija obsega vsaj eno amino kislinsko substitucijo, trunkacijo, notranjo delecijo ali insercijo.
  4. 4. Protein po zahtevku 1, označen s tem, da ima amino kislinsko sekvenco, kot je navedena na sl. 1 in SEQ ID NOS: 1 in 2.
  5. 5. V bistvu očiščen protein z insekticidno aktivnostjo, označen s tem, da obsega amino kislinsko sekvenco, navedeno na sl. 1 in SEQ ID NOSU in 2.
  6. 6. DNA sekvenca, ki kodira protein po zahtevku 5.
  7. 7. Vektor, označen s tem, da obsega DNA sekvenco po zahtevku 6.
    ββ
  8. 8. Izolirana nukleotidna sekvenca, ki kodira polipeptid z insekticidno aktivnostjo proti koruznemu koreninskemu črvu, označena s tem, da ta nukleotidna sekvenca kodira polipeptid, izbran iz skupine, ki obstoji iz;
    a) amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;
    b) ostankov 22-409 sekvence, navedene v SEQ ID NO;2;
    c) ostankov 29-409 amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;
    d) polipeptida, ki obsega variacijo (a), (b) ali (c), kjer ta variacija obsega vsaj eno amino kislinsko substitucijo, trunkacijo, notranjo delecijo ali insercijo.
  9. 9. Izolirana nukleotidna molekula, ki kodira polipeptid z insekticidno aktivnostjo, označena s tem, da ima sekvenco, izbrano iz skupine, ki obstoji iz;
    a) sekvence, navedene na sl. 1 in SEQ ID NO; 1;
    b) nukleotidnih sekvenc, ki kodirajo polipeptid z insekticidno aktivnostjo in ki se hibridizirajo na sekvence od (a) zgoraj ob ostrih pogojih, definiranih z izpiralno stringenco 0,3M NaCI, 0,03 M natrijevega citrata, 0,1% SDS pri 70 °C;
    (c) nukleotidnih sekvenc, ki kodirajo polipeptid z insekticidno aktivnostjo in ki se razlikujejo od sekvenc od (a) in (b) zaradi degeneracije genetskega koda.
  10. 10. Organizem, označen s tem, daje bil transformiran z vektorjem po zahtevku 7.
  11. 11. Izolirana nukleotidna sekvenca, označen s tem, da kodira protein, naveden na sl. 1
  12. 12. Nukleotidna sekvenca po zahtevku 11, označena s tem, daje nukleotidna sekvenca, navedena na sl. 1 in SEQ ID NO: 1.
  13. 13. DNA sekvenca po zahtevku 11, označena s tem, daje sintetska sekvenca.
  14. 14. DNA sekvenca po zahtevku 13, označena s tem, da smo jo optimirali za ekspresijo v koruzi.
  15. 15. Rastlina, kije bila stabilno transformirana z ekspresijsko kaseto, ki obsega promotor, ki vodi ekspresijo v rastlinski celici, operabilno vezani na nukleotidno sekvenco, ki kodira insekticidni protein, pri čemer protein izberemo iz skupine, ki obstoji iz:
    a) amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;
    b) ostankov 22-409 sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;
    c) ostankov 29-409 amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;
    d) polipeptida, ki obsega variacijo od (a), (b) ali (c), pri čemer ta variacija obsega vsaj eno amino kislinsko substitucijo, trunkacijo, notranjo delecijo ali insercijo.
  16. 16. Rastlina po zahtevku 15, označena s tem, daje rastlina koruza.
  17. 17. Seme rastline po zahtevku 15 ali 16.
  18. 18. Rastlina po zahtevku 15, označena s tem, da nukleotidna sekvenca kodira amino kislinsko sekvenco, navedeno na sl. 1 in SEQ ID NOSU in 2.
  19. 19. Rastlina po zahtevku 15, označena s tem, daje nukleotidna sekvenca sekvenca, navedena na sl. 1 in SEQ ID NO: 1.
  20. 20. Rastlina po zahtevku 15, označena s tem, daje nukleotidna sekvenca operabilno vezana na koreninsko prednosten promotor.
  21. 21. Rastlina po zahtevku 18, označena s tem, daje nukleotidna sekvenca operabilno vezana na koreninsko prednosten promotor.
  22. 22. Rastlina po zahtevku 19, označena s tem, daje nukleotidna sekvenca operabilno vezana na koreninsko prednosten promotor.
  23. 23. Postopek za zatiranje koruznega koreninskega črva, označen s tem, da obsega: transformiranje rastlinske celice z ekspresijsko kaseto, ki obsega promotor, ki vodi ekspresijo v rastlinski celici, operativno vezani na nukleotidno sekvenco, ki kodira insekticidni protein, pri čemer protein izberemo iz skupine, ki obstoji iz:
    a) amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;
    b) ostankov 22-409 sekvence, navedene v SEQ ID NO.2;
    c) ostankov 29-409 amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;
    d) polipeptida, ki obsega variacijo od (a), (b) ali (c), kjer ta variacija obsega vsaj eno amino kislinsko substitucijo, trunkacijo, notranjo delecijo ali insercijo.
  24. 24. Postopek po zahtevku 23, označen s tem, daje promotor koreninsko prednosten promotor.
  25. 25. Postopek po zahtevku 24, označen s tem, da ima nukleotidna sekvenca sekvenco, izbrano iz skupine, ki obstoji iz:
    (a) sekvence, navedene na sl. 1 in SEQ ID NO: 1;
    (b) nukleotidnih sekvenc, ki kodirajo polipeptid z insekticidno aktivnostjo in ki se hibridizirajo na sekvence od (a) zgoraj ob ostrih pogojih; in (c) nukleotidnih sekvenc, ki kodirajo polipeptid z insekticidno aktivnostjo in ki se razlikujejo od sekvenc od (a) in (b) zaradi degeneracije genetskega koda.
  26. 26. Postopek po zahtevku 25, označen s tem, daje rastlinska celica iz monokaličnice.
  27. 27. Postopek po zahtevku 26, označen s tem, daje monokaličnica koruza.
  28. 28. Rastlinska celica, ki smo jo stabilno transformirali z ekspresijsko kaseto, ki obsega promotor, ki vodi ekspresijo v rastlinski celici, operabilno vezani na nukleotidno sekvenco, ki kodira insekticidni protein, kjer ima ta protein aktivnost za koruznega koreninskega črva in ga izberemo iz skupine, ki obstoji iz:
    a) amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;
    b) ostankov 22-409 sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;
    c) ostankov 29-409 amino kislinske sekvence, navedene v SEQ ID NO:2;
    d) polipeptida, ki obsega variacijo od (a), (b) ali (c), kjer ta variacija obsega vsaj eno amino kislinsko substitucijo, trunkacijo, notranjo delecijo ali insercijo.
  29. 29. Rastlinska celica po zahtevku 28, označena s tem, daje promotor koreninsko prednosten promotor.
  30. 30. Rastlinska celica po zahtevku 29, označena s tem, da ima nukleotidna sekvenca, sekvenco, izbrano iz skupine, ki obstoji iz:
    (a) sekvence, navedene na sl. 1 in SEQ ID NO:1;
    (b) nukleotidnih sekvenc, ki kodirajo polipeptid z insekticidno aktivnostjo in ki se hibridizirajo na sekvence od (a) zgoraj ob ostrih pogojih, definiranih z izpiralno stringenco 0,3M NaCI, 0,03 M natrijevega citrata, 0,1% SDS pri 70 °C; in (c) nukleotidnih sekvenc, ki kodirajo polipeptid z insekticidno aktivnostjo in ki se razlikujejo od sekvenc od (a) in (b) zaradi degeneracije genetskega koda.
  31. 31. Rastlinska celica po zahtevku 30, označena s tem, daje rastlinska celica iz monokaličnice.
  32. 32. Rastlina po zahtevku 31, označena s tem, daje monokaličnica koruza.
SI9820048A 1997-05-29 1998-05-15 Proteins having insecticidal activities and method of use SI20214B (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4786497P 1997-05-29 1997-05-29
US09/074,912 US6057491A (en) 1997-05-29 1998-05-08 Protein having insecticidal activities and method of use
PCT/US1998/009995 WO1998054327A1 (en) 1997-05-29 1998-05-15 Proteins having insecticidal activities and method of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SI20214A true SI20214A (sl) 2000-10-31
SI20214B SI20214B (en) 2001-12-31

Family

ID=26725524

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI9820048A SI20214B (en) 1997-05-29 1998-05-15 Proteins having insecticidal activities and method of use

Country Status (11)

Country Link
US (2) US6057491A (sl)
EP (1) EP0986645A1 (sl)
AR (1) AR016059A1 (sl)
AU (1) AU742709B2 (sl)
BR (1) BR9809516A (sl)
CA (1) CA2290776C (sl)
CZ (1) CZ297319B6 (sl)
NZ (1) NZ501218A (sl)
SI (1) SI20214B (sl)
SK (1) SK160099A3 (sl)
WO (1) WO1998054327A1 (sl)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK466390A3 (en) * 1989-09-27 2000-05-16 Gist Brocades Nv Purified and isolated dna sequence, construct, vector, transformed cell, peptide or protein having phytase activity, process for its preparation, and its use
EP1073670A1 (en) 1998-05-01 2001-02-07 Maxygen, Inc. Optimization of pest resistance genes using dna shuffling
WO2001018179A1 (fr) * 1999-09-07 2001-03-15 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Synthases de depsipeptides cycliques, genes correspondants et systeme de production de masse de ces depsipeptides cycliques
WO2001036468A2 (en) * 1999-11-15 2001-05-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel proteins having insecticidal activities and method of use
US6657046B1 (en) 2000-01-06 2003-12-02 Monsanto Technology Llc Insect inhibitory lipid acyl hydrolases
WO2001049834A2 (en) 2000-01-06 2001-07-12 Monsanto Technology Llc Preparation of deallergenized patatin proteins and patatin permutein proteins
US6664097B2 (en) * 2000-05-23 2003-12-16 North Carolina State University Polynucleotide encoding a Lactobacillus gasseri beta-glucuronidase polypeptide
US6643672B1 (en) * 2000-07-31 2003-11-04 Hewlett-Packard Development Company, Lp. Method and apparatus for asynchronous file writes in a distributed file system
AU2002315052A1 (en) 2001-05-15 2002-11-25 Emory University Polynucleotides and polypeptides relating to the modulation of sirp alpha-cd47
WO2003020929A1 (fr) * 2001-08-28 2003-03-13 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Nouveau gene d'amide hydrolase
US20060212964A9 (en) * 2004-02-20 2006-09-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for enhancing insect resistance in plants
BRPI0507896A (pt) 2004-02-20 2007-07-24 Pionner Hi Bred International lipases e métodos de utilização das mesmas na criação ou no aumento de resistência a insetos em plantas
WO2008055210A2 (en) * 2006-10-31 2008-05-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Sulfonylurea receptor short forms from mitochondria and uses thereof
WO2010096613A1 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Blended refuge deployment via manipulation during hybrid seed production
MX2013009092A (es) 2011-02-11 2013-10-17 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas sinteticas activas contra el gusano de la raiz del maiz.
US9090906B2 (en) 2011-03-30 2015-07-28 Universidad Nacional Autonoma De Mexico Mutant Bacillus thuringiensis cry genes and methods of use
US20120283111A1 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacterial mRNA screen strategy for novel pesticide-encoding nucleic acid molecule discovery
BR112015008504A2 (pt) 2012-10-15 2017-08-22 Pioneer Hi Bred Int Método para aumentar a atividade pesticida, polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, cassete de expressão, vetor, método de obtenção de uma planta, método de obtenção de uma célula de planta, composição pesticida, método para proteção de uma planta, método para proteger uma planta, método para aumentar a resistência de uma planta
WO2016000237A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Pioneer Overseas Corporation Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes
US10743535B2 (en) 2017-08-18 2020-08-18 H&K Solutions Llc Insecticide for flight-capable pests

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0587798A4 (en) * 1991-06-07 1995-04-19 Dowelanco INSECTICIDE PROTEINS AND METHOD FOR PROTECTING PLANTS.
US5743477A (en) * 1992-08-27 1998-04-28 Dowelanco Insecticidal proteins and method for plant protection
GB9300124D0 (en) * 1993-01-06 1993-03-03 Zeneca Ltd Bacterial strain
UA27966C2 (uk) * 1993-03-12 2000-10-16 Монсанто Компані Спосіб зменшення кількості комах, що поїдають рослини та спосіб отримання генетично трансформованих, стійких до ураження комахами рослин
US5824864A (en) * 1995-05-25 1998-10-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize gene and protein for insect control
US5672680A (en) * 1995-11-20 1997-09-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pentaclethera macroloba protein having insecticidal properties
US5756661A (en) * 1996-11-15 1998-05-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pentaclethra macroloba derived substances having insecticide, agglutination and aminopeptidase inhibition activity

Also Published As

Publication number Publication date
CZ297319B6 (cs) 2006-11-15
WO1998054327A1 (en) 1998-12-03
SK160099A3 (en) 2000-06-12
AU742709B2 (en) 2002-01-10
CZ421199A3 (cs) 2000-04-12
CA2290776C (en) 2003-10-14
EP0986645A1 (en) 2000-03-22
CA2290776A1 (en) 1998-12-03
AR016059A1 (es) 2001-06-20
US6339144B1 (en) 2002-01-15
NZ501218A (en) 2002-02-01
US6057491A (en) 2000-05-02
WO1998054327A9 (en) 1999-04-01
SI20214B (en) 2001-12-31
AU7389198A (en) 1998-12-30
BR9809516A (pt) 2000-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6384302B1 (en) Trypsin inhibitors with insecticidal properties obtained from Pentaclethra macroloba
CN100413966C (zh) δ-内毒素基因及其使用方法
US7214860B2 (en) Methods of using non-plant encoding nucleic acids
AU742709B2 (en) Proteins having insecticidal activities and method of use
JP6957583B2 (ja) 毒素遺伝子及びその使用方法
EP1844064B1 (en) Axmi-018, axmi-020, and axmi-021, a family of delta-endotoxin genes and methods for their use
JP6888044B2 (ja) Axmi477、axmi482、axmi486およびaxmi525毒素遺伝子およびそれらの使用方法
HUE032365T2 (en) AXMI-205 pesticide gene and methods of application
BRPI0914780B1 (pt) Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, composição, e métodos para o controle de uma população de pragas, matar uma praga proteção de uma planta de uma praga e produção de um polipeptídeo com atividade pesticida
MX2011006342A (es) Genes que codifican toxinas contra nematodos.
US20030140381A1 (en) Genes and regulatory DNA sequences associated with stress-related gene expression in plants and methods of using the same
CA2358161A1 (en) Organisms containing insecticidal proteins
MXPA99010882A (en) Proteins having insecticidal activities and method of use
HUP0003403A2 (hu) Rovarírtó aktivitású fehérjék és alkalmazásuk
WO2001036468A2 (en) Novel proteins having insecticidal activities and method of use
BR112012000030B1 (pt) Molécula de ácido nucleico recombinante, célula hospedeira bacteriana, e método para proteção de uma planta contra peste de lagarta da raiz do milho ocidental

Legal Events

Date Code Title Description
IF Valid on the event date
KO00 Lapse of patent

Effective date: 20100114