CZ402890A3

CZ402890A3 - Lineární peptid

Info

Publication number: CZ402890A3
Application number: CS904028A
Authority: CZ
Inventors: David H. Coy; Jacques-Pierre Moreau
Original assignee: The Administrators Of The Tulane Educational Fund
Priority date: 1989-08-16
Filing date: 1990-08-16
Publication date: 1999-04-14
Also published as: SK280796B6; EP0438566A4; PT95016A; IE902958A1; SK402890A3; CA2039175A1; DD298411A5; JPH04502922A; DE69028692T2; IE77033B1; WO1991002745A1; DE69028692D1; CZ285319B6; EP0438566A1; EP0438566B1; ATE143372T1; CZ285562B6; HU906872D0; GR900100613A; ES2094160T3

Description

OBLAST TECHNIKY

Vynález se týká peptidů pro terapeutické účely a zvláště se týká analogů přírodně se vyskytujícího peptidu P.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Peptidová látka P (SP) má četná farmakologická působení, včetně vasodilatačního a tlak snižujícího působení, kontrahuje nevaskulámí hladké svaly, stimuluje sekreci slinivky a pankreasu, depolarizuje různé neurony a uvolňování histaminu z buněk. Je domněnka, Že se SP podílí na různých fyziologických funkcích (z nichž četné jsou spojeny s navozováním bolesti). Tyto funkce zahrnují regulaci peristaltiky a aktivity hladkých svalů v gastrointestinálním traktu, regulaci sekrece slinivky a pankreasu, regulaci zánětlivé odezvy špatné funkce periferní tkáně, neurotransmisi a regulaci neuroimunomodulace. Mantyh a kol., /1989/ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 5193 popisuje přítomnost látky P receptorů na straně zranění v centrálním nervovém systému a domnívá se, že SP může být zahrnuta v regulaci odezvy poškození centrálního nervového systému, jakož také v periferální tkáni. Látka P je také proliferativním Činidlem, stimulujícím proliferaci fibroblastů, i riymfocytůjendotheliálních buněk, buněk hladkých svaiů a astrocytů.

Látka SP patří do rodiny bioaktivních peptidů známých jakožto tachykininy. Struktura, účinnost a funkce látky SP a jiných tachykininů jsou diskutovány v práci Payana,/1989/ Ann. Rev. Med. £0: 341· Jak uvádí Payan, látka SP se podílí na obecných farmakologických vlastnostech a konservuje koncovou karboxylovou sekvenci /Phe-X-Gly- Leu-íIet-NH^, kde X znamená rozvětvený alifatický nebo aromatický aminokyselinový zbytek/ s jinými tachykininy. Základní biologické účinnosti a schopnost vázpt se na receptor spočívá v karboxylové koncové sekvenci těchto peptidů. Selektivita ke specifickému receptorů tachykininů je stanovena aminokyselinovou koncovou sekvenci peptidů, jak uvádí Iverson a kol., /1989/ The Tachykinin System /Tachykininový systém/; Abstrakt zveřejněn na 11. americkém symposiu o peptidech. Konservace karboxylové koncové sekvence sahá přes látku SP a jiné savčí tachykininy k ostatním bioaktivním peptidům, jak je uvedeno v tabulce I.

Četné deriváty SP, vytvářené modifikaci pce tranního řetězce a/nebo D-aminokyselinovou substitucí, působí jako SP receptorové Antagonisty. Polkers v americkém patentovém spise číslo 4 481139 popisuje P antagonisty, připravené L nebo L aminokyselinovou substitucí* Tyto antagonisty zahrnují undekapeptidový analog spantid /L-Arg-fro-Lys-Pro-Gln-G-ln-O—Trp-Phe-L-Trp-leu-Leu-NHg/, jakož také analogy látky P.

Jensen a kol., /1988/ Am. J. of Physiol. 254i G883, charakterizuje schopnost různých SP antagonistů inhibovat působení bombesinu. Jensen a kol. studovali čtyři SP analogy:

Arg-B-Pro-lys-Pro-Gln-Gln-D-Phe-Phe-D-Trp-Leu-met-NHg» Arg-D-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-B-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Met-líHg* D-Arg-B-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-B-Trp-Beu-Leu-NH2 a D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-L-Trp-Phe-B-Trp-Leu-Leu-NHg· sena kol* také studoval dva analogy SP a první tři aminokyselinové zbytky vypuštěné, D-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-TrpM

Leu-^et-NHg a L-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-D-Trp-L-Iet-NHg. Žádný z těchto receptor vázajících peptidů však není spécifický k SP receptoru. Všechny inhibují b^ombesinem stimulované uvolňování amylasy. Jensen a kol. usoudili, že schopnost inhibovat působení b ombe3inu je obecnou vlastností SP anaΊ logů, že mají také funkci jakožto SP receptorové antagonisty a že SP receptorové antagonisty jsou každý inhibován působením bombesinu funkcí jakožto bombesinové receptorové antagonisty .

Woll a kol., /1988/ Proc_T Nat. Acad. Sci. USA 85: 1857 zjistili, že P antagonist U-Arg^Pro-Bys-Pro-B-Phe-Gln-B-TrpPhe-B-Trp-Beu-Beu-Nh^ je mocný bomoesinový antagonist v buňkách murine Swiss 5T5Í

Agonisty a antagonisty širokého spektra biologicky účinných peptidových hormonů, včetně látky P, byly syntetizovány zavedením modifikace peptidových vazeb do peptidového hormonu, vis Spatola /1985/ v publikaci Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins /Chemie a biochemie aminokyselin, peptidů a bílkovin/ /B. Weinstein vyd./ M. Dekker, New York and Basel₄ str. 267 až 557·

D^le používané /neovykle'/zkratky mají tento význam: cyklohexyl-Ala - cyklohexylalanin

II

ch₉ h₂c identifikační skupina ‘CH

CH₉

I

KH₂ - OH - 00„H

Lys-£-NHR - lysin, kde £ -IT atom nese skupinu R, kde R zna' nemá atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 as 12 atomy uhlíku, fenylalkylcvcu skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku, skupinu OOE, kde E znamená alkylovou skupinu s 1 až 20 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu s 3 aš 20 atomy uhlíku, alkinylovou skupinu s 3 až 20 atomy unlíku, fenylovou skupinu, naftylovou skupinu nebo fenylaikylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku, nebo R znamená acylovou skupinu s 1 až 12 atomy uhlíku.

Hle - HgK - OH - COOH /norlouoin/ identifikační skupina 5

Hal 2 naftylalanin pClu - H₉G - CH-COOH /pyroglutamová kyselina/

H₉C^ NH

Cv

II o

Sar sarkosin

Sta /statin/ - /3S,4S/-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptá|nová kysel na, která má chemickou strukturu

CH, CH, > /3

CH identifikační skupina

CH, kk₂-ch — CH — ch₂ —cc₂h θκ

AHPPA 3 /3S,43/-4-amino-3-hydroxy-5-fenylpentano_ř0vé kyselina, která má chemickou strukturu

H t

τ é

HC

HC.

OH

II

CH identifikační skupina ch₉

I cI

UH₂— CH O

H

H — CHp — C — OH

Ή

ACEPA - /3S,43/-4-amino-5-oylcloliexyl-3-hydroxypentano/vá kyselina, která má chemickou strukturu íL·

H₂C ' CH₂ identifikační skupina

H„C

CH

CH₀/ 2

CH,

ÍIH₂ -CH - CH

O

II

CH₂ - c

- OH

OH

SP = Ar^-rro-nys-iro-u-ln-^ln-Pkie-fhe-Gly-xjeu-kst-kh.^ A-átks 17.

c7ao~há bbecn.- je predn-. tem vynálezu lineárně /necyklický/ o*eotΐΐ^~k1e-~ ry je analogem přírodní se vyskytující, biologicky účinné látky ? mající aktivní polohu a vazebnou polohu zcdpcvgdncu za vázání peptidu k receptoru no cílové buňce, anclcy r.á jednu z následujících noiifimucí: /a/ nepeptidovou vt-zbu ní sto peptidové vazby mezi aminoKyselinovým zbytkem aktivní polohy a sousedním aminokyselinovým zbytkem, /b/ náhr: u dvou aminokyselinových zbytků uvnitř· aktivní pilohy syntetickým aminokyselinovým zbytkem, ηεpříklad statinem:, anrPA, Á^h?h, β -aminokyselinovým nebo ^-aminokyselinovým zbytkem, /o/ vypustání aminokyselinového zb/_; tku v aktivní poloze a modifikace aminokyselinového zbytku mimo aktivní polohu nebo /d/ přítomnost h-konceváho aminokyselinového zb tku, který není přírodní. ce vyskytujícím aminokyselinovým zbytkem uvedeného pi-írcdn-l se vyskytujícího peptidu /kde fi- nebo y*-není stanovenou aminck celinou, nýbrž to je -aminokyselina/.

V priu. Id výhodného provodění je analoy schopen Drobit jako konkurenční inhibitor prírodn . se vyskytující látky P vázáním nm receptor ε uskutečněním jedné z modifikací selhává in vivc biologická účinnost přírodní se vyskytujícího peptidu.

Ve výhodném provedení je aktivní polohou lineárního peptidu karboxylevý koncový polovinový lineární peptid. lineární peptid má jednu z následujících modifikací: nepeptidovou vazbu místo peptidové vazby mezi εminok selinovým zb;, tkem ; ktivní polohy ε přilehlým aminokyselinovým zbytkem, /0/ náhradu dvou aminokyselinových zbytků uvnitř aktivní polohy syntetickým aminokyselinovým zbytkem, například statinem, AHPPA, AGHPA, fo -aminokyselinovým zbyta.fn.i.Rc kem nebo £ Okysellnovým zbytkem, /o/ vypuštění aminokyselinového zbytku v aktivní poloze a modifikace aminokyselinového zbytku mimo aktivní polohu nebo /d/ přítomnost N-koncového aminokyselinového zbytku, který není přírodně se vyskytujícím aminokyselinovým zbytkem uvedeného přírodně se vyskytujícího, biologicky účinného peptidu.

Podle výhodného provedení je aktivní polohou lineárního peptidu karboxylovy koncový polovinový lineární peptid. Lineární peptid má jednu z následujících modifikací, /a/ nepeptidovcu vazbu místo peptidové vazby mezi karboxylovým koncovým aminokyselinovým zbytkem a přilehlým aminokyselinovým zbytkem nabo /b/ statin nebo AEPPA nebo AGHPA, ,5^_aíní^nokyselinový nebo ^-aminokyselinový zbytek místo přírodně se vyskytujícího karboxylového koncového zbytku a přilehlého amino kyselinového zbytku.

Podle výhodného provedení má analog látky P jednu z následujících modifikací, /a/ nepeptidovou vazbu místo peptidové vazby mezi karboxylovým koncovým aminokyselinovým zbytkem a přilehlým aminokyselinovým zbytkem nebo /b/ statin nebo AHPPA nebo ACHPA, /5 -aminokyselinový nebo ^-aminokyselinový zbytek místo přírodně se vykytujícího karboxylového koncového zbytku a přilehlého aminokyselinového zbytku.

Podle výhodných provedení je lineární peptid analogem látky P s aktivní polohou v karboxylové koncové polovině lineárního peptidu. Analog látky P má jednu z následujících modifikací: /a/ nepeptidovou vazbu místo peptidové vazby mezi karboxylovjřm. koncovým aminokyselinovým zbytkem a přiléhajícím aminokyselinovým zbytkem nebo /b/statin nebo AHPPA nebo ACHP/. nebo -aminokyselinový nebo -aminokyselinový zbytek místo přírodně se vyskytující karboxylové koncové skupiny a přilehlé aminokyselinové fekupiny.

Lineárními peptidy pro zavedení nepeptidové vazby mezi dv& přírodní aminokyselinové zbytky nebo pro náhradu dv .ou přírodních aminokyselinových zbytků, syntetickými amino kyšeaninokyselinového zbytku, vhodnými pro vytvoření nebe pro podporu antagonistické účinnosti jsou lineární peptidy, u kterých je účinnost spojena se dvěma C-koncovými aminokyselinovými zbytky aminokyselinového řetězce. Proto aktivní poloha přírodně se vyskytujícího peptidu, jehož je analogem peptid podle vynálezu, zahrnuje a výhodou alespoň aminokyšelino/, 9-y φ

v.'u zbytík . v karboxy1koncové polovině peptidu,a lineární pep(j ¹ tid podle vynálzu má aminokyselinový zbytek ve své karboxy koncové polovině, modifikace může být zavedena v oblasti zahrnuté ve vázání receptorů nebo v nevázající oblasti.

Výrazem nepeptidová vazba se míní» že atom uhlíku, podílející se na vazbě mezi dvěma zbytky, je redukován z karbonylového uhlíku na methylenový uhlík, to je nebo méně výhodněji CHg“³» CH^-CIÉ,, C^-CO nebo CO-GH^· /Podrobně o chemii nepeptidových vazeb pojednává Coy a kol_c, /1988/ Tetrahedron 44, 5: 835 až 841, Tourwe, /1985/ Janssen G^im. Acta J: 5-15, 17 - 18 a Spatola, /1983/, Ghemistry and Biochemistry of Amino Acids, řeptides and řroteins /E. Weinstein, vyd./ M. Dekker, New York and Basel, str. 267 až 357·/ výhodou, představují analogy podle vynálezu 25j$ homology a především 50/7 homology s přírodně se vyskytujícími peptidy.

Jednou modifikací přírodně se vyskytujícího peptidu k vytvoření antagonisty je použití jakožto aminokyselinového koncového zbytku aromatického D-isomeru aminokyseliny nebo alkylované aminokyseliny, /jfd-e—^tlD^fl není určeno jakožto konfigura^

-ttráenov/ incky sel iry,, 4t—j-ff- -.........._z

Jedna třída peptidu podle vynálezu zahrnuje analogy lát-

Rr

A¹⁰ . ,X , ;Z-A^-A -A-A-Á-A ' -N-CH-CO-A /1/ kde znamená ,1

D nebo L isomer aminokyseliny ze souboru Arg, nys a’ . Dys- -NH-R₂q /kde R^X znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 aš42 atomy uhlíku, fenylalkylovou skupinu se 7 až lO.atomy uhlíku, skup ipinu

COE.

10’ kde ho znamená alkylovou skupinu s 1 až 20 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu s 3 až 20 atomy uhlíku, alkinyrovou skupinu s 3 až 20 atomy uhlíku, fenylovou skupinu, naftylovou skupinuj

1<, Lineární peptid obecného vzorce IjL· +_rz.o7 kde 'a²¹-a²²-a²³-a²⁴-nh

A²⁶ A²⁷ A²⁸ ,56 ,58

A²⁹ A³⁰ A³¹ ,62 ,64

-ČH-R³⁴-ČH-R“^řĎ-CH - R⁵⁰-CH-R^0U-CH-R° ^Z-CH-R^ot+-CH-V ,10

A²¹	je	D	/1 ebo	L	izomér	Arg
A²²	je	D	M ebo	L	izomér	Pro
A²³	je	D	/1 ebo	L	izomér	Lys
A²⁴	je	D	zl ebo	L	Ϊ zorné r	Pro

_t25 je identifikační skupina D nebo L izoméru Gin je identifikační skupina D nebo L izoméru Gin je identifikační skupina D-Trp nebo identifikační skupin;

D Aebo L izoméru Phe

A^° je identifikační skupina D zi ebo •ze sdboru β-NaI, Phe, o-X-Phe,

	NC>2. OH nebo CH₃ , Aebo p-XN0₂, OH nebo CH₃	Phe , v ktoreím
29	je identifikační skupina	aminokyseli ny
	'identifikační⁷ skupina D zf.ebo	L izoméru Phe
30	je identifikační⁷ skupina D zt	ebo L izoméru
	ze skupiny Leu, Nle, Ala, Val	/lebo Ile
31	je identifikační skupina D nebo L izoméru
54	ze skupiny Leu, Nle, Ala, Val	nebo Ile
je CO-NH nebo CO-NC1!₃
56	p62 _{a R}64y_s<^ nezávisle CO-NH	nebo CH2-NH
58	je CO-NR^⁹, v ktoren R^(?9 je ch₂-nh	1! nebo C₃ _
60	je CO-NH a
10	je

O

L izoméru aminokyselin kde X je F, Cl, Br

I je F , Cl, Br

D-Trp zt c b o asi i no kysel i ny ^R6 7

-C-O-R

#.ebo

-C-N ,/ v Ktorých každý R_6ÓC₇_jq fenylalkyl n ebo C|_?_20 a R^g je nezávisle H, C-j _ ^alky 1 ₍ naftylalkyl a které jsMj v azané na α-aminodusíkový atom aminokyseliny jsó nezávisle

R⁵¹ a alkeny1 '3-20 fenylalkyl za podmíc/nky, že >52 /í

J

N- koncové^

H, '24

^Cl- 12	alkyl ,	^C7~10
J^{e C}l-20	alkyl ,	C-j -, n
naf tyl	/7 ebo	^C7-10
jeden ze	symbolů R^¹
atom	vod i k w ‘,	* ¹ pričom.
R⁵⁸, R⁶²	rl ebo	R⁶⁴ je

R^Ji ie COE_; najmeně' jeden ze symbolů/ R'

CH^NH, TTlebo jeho farmaceuticky přijatelné solfi·.

a R'' je CQt24. druhý musí byť

-Ί-51 28 ’x%₉ií ε R_ó0 vypuštěn, dál ze podmínky^ o v případě, kdy

ε íí, /c ^^{cu v}iá^Uftteny> ' mu3Í znameňat-a^upinu CH^^/CH^/^q-CO-ííH, dále za podminky, že v případe, kdydl·^znamená skupinu, obecného vzorce CHS^q-ZCH^/^q-iF^V 'musí být A^, Rg^H a Y^° vypuštěny, dále za podmínky, že-v případě, kdy A^ , Rg^H a V^.jsou vypuštěny, musí R^ znamenat skupinu obecného vzorce ejich farmaceuticky vhodné soli.

Jakožto příklady výhodných peptidů se uvádějí:

Arg—Rrer LyorPro-Pln-ůln •Pho-lhe-Ůly-heu^/^fí^-HH^Tíreu-NH^ L-Arg-Pro-ly s-rro-Gl' n-dlyi-D-Trp-řhe-D-Trp^/Tíi^-ini_7Leu-Nle-NH₂, D-Arg-Pro-lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Prp-leu^/“ GH₂ ^-ůH_7iíle-NH₂.

Nepeptidové vazby, ve kterých je peptidová vazba redukovaná, jsou T| *· Tj zde symbolizovány výrazem /CH2“NH_7ⁿ nebo V_T

Vynález se také týká antagonisty látky P vzorce Arg-Pro-Iys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly^/^-GH₂-NH_7ieu.-Leu-NH2·

3P antagonisty podle vynálezu jsou užitečné při ošetřování nemocných troících nemocemi zahrnujícími neuroger/í záněΛ ty, například í)heumatoidní arthritis, ulcerativní kolitis, ekzem a Grohnova nemoc. 3P antagonisty podle vynálezu jsou užitečné jakožto antiproliferativní činidla například při ošetřování malých buněčných plicních karcinomů nebo poruch zahrnujících proliferaci fibroblastů. Antiproliferativní vlastnosti 3P antagonistů podle vynálezu také umožňují jejich použití při prevenci poruch, kdy je třeba usnadnit regeneraci nervů. Působení antagonistů podle vynálezu na nsurotransmisi umožňuje jejich používání jakožto neopiátových analgetik. Jejich použití jako neopiátových analgetik umožňuje obnovení

- 1-9 odezvy na opiáty. Antagonisty podle vynálezu jsou také užiteční jakožto antisekretační Činidla, působí například na slinivku a na pankreas.

V případě sloučenin shora uvedených vzorců, kde--R^, ^-_t·

R^, až Rg^nebo R?_o až R?₂ jsou aromatickou, lipofilní skupinou, může být jejich účinnost in vivo dlouhodobá a uvolňování sloučeniny podle vynálezu na cílovou tkáň může být usnadněno.

Identifikační skupina < -aminokyseliny /pro případ pyi roglutamátu, viz níže/ je atom nebo skupina atomů, jpaé než X, -karbonylový uhlíkový atom, ýl -aminodu3Íkový atom, nebo atom vodíku, vázaná na asymetrický Cf, -uhlíkový atom. Pro ilustraci příklady je identifikační skupinou alaninu methylová skupina, identifikační skupinou valinu skupina /CH^/gGH, identifikační skupina lysinu je Η^ίΤ*/^^/4 ^s^^uP^{irLa a} identifikační skupinou fenylalaninu je skupina /CgHg/CHg. Identifikační skupina Λ- nebo ^'-aminokyseliny je analogový atom nebo skupina atomů vázaných na β - nebo -uhlíkový atom. Pokud není identifikační skupina aminokyseliny specifikována, může to být jjt , fot nebo ρ , V případě pyroglutamátu je identifikační skupina -NH-GO-GHg-GHgT

Další charakteristiky a přednosti vynálezu jsou zřejmé z následujícího popisu jeho výhodných provedení. Vynález také objasňují následující obrázky, které však vynález nijak neomezují·

ΛNa obr. 1 je dvojice grafů objasňujících vliv pseudopeptidů spantidu, D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gin-Ii-Trp-Phe-LIrp-leu-Leu-NH^ /levý panel/ a SP, Arg-Pro-lys-ProGln-Gln-Phe-Phe-Gly-leu-Ittet-NHg /pravý panel/ na 3p-stitulované uvolňování amylasy z pankreatické acini_ř

Na obr. 2 je graf ukazující vliv Arg-Pro-lys-řro-Gln-Gln-Pheτ Uu-rVCC

Phe-Gly-Leu^/” SB-stimulované uvolňování amylasy z pankreatické aicini.

Na obr. 3 je dvojice grafů objasňujících schopnost různých SP a spantidovýhh pseudopeptidů inhibovat vázání ^^^I-BH-látky P k pankreatické ^rfcini.

Na obr. 4 je graf ukazující schopnost 3P a spantidov^h pseudopeptidů inhibovat vázání ^²^I-/^-fyr^_7bombesinu k pankreatické acini.

Vynález dále obgasňuje popis struktury, přípravy a použití výhodných forem provedení vynálezu.

Peptidy podle vynálezu mají všechny modifikace, například nepeptidovou vazbu v alespoň jedné udané poloze, ve které se atom uhlíku podílí na vazbé mezi dvěma zbytky a je redukován z karbonylového uhlíku na methylenový uhlík. Způsob redukce peptidové vazby, který vede k nepeptidové vazbě, popsal Goy ZZf o · a trní , , fiká práhl páka vyná/l Pěni rudni r> Peptidy podle vynálezu se mohou zpracovávat na formu farmaceuticky vhodných solí. Jakožto příklady výhodných solí se uvádějí soli s farmaceuticky vhodnými kyselinami, jako je například kyselina octová, mléčná, maleinová, citrónová, jablečná, asx: —

- 21 korbová, jantarová, benzoová, salicylová, methansulfonová, toluensulfonová a pamoová a jako jsou dále polymerní kyseliny, například kyselina tříslová nebo karboxymethylceluloza a soli s anorganickými kyselinami, jako jsou hťlogeno vodí kove kyseliny, například kyselina chlorovodíková, a dále jako je kyselina sírová nebo fosforečná.

Látka P, antagonist Arg-Pro-Lys-Bro-Gln-Gln-Phe-Phe-GlyLeuⁱ/“GH2NH_7D®^U--NH2, se připravuje dále uvedeným způsobem. Ostatní analogy látky P se mohou připravovat vhodnými modifikacemi následně popsaného způsobu přípravy.

První stupeň je příprava Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe,Phe-Gly-Leu^^_0H2-NH_7Leu-benzhydrylaminové pryskyřice jakožto meziproduktu.

Benzhy^ylaminpolystyrenová pryskyřice /Vega Biochemicals, lne./ /0,97 St 0,5mmol/ ve formě chloridového iontu se vnese do reakční nádoby Beckmanova 9903 peptidového syntetizéru naprogramovaného k provedení následujícího reakčního cyklu: /a/ methylenchlorid; /b/ 55/ trifluoroctová kyselina /TPA/ v methy lenchloridu /2 krát pro 1 a 25 min/; /c/ methylenchlorid; /d/ ethanol; /e/ methylenchlorid; a /f/ 10;é triethylamin v chloroformu.

Neutralizovaná pryskřice se míchá s ^/-t-butoxykarbonyl/Boc/—leucinem a s diisopropylkarbodiimidem /l,5mmol v obou případech/ v methylenchloridu po dobu jedné hodiny a vznik/ O & JL· J-Xtv# * U* ju* 4. j M JA- j i 1=1 ύλοΊγ fiirtl n Ť o irú α +n nm‘ /α / až /f/ shora uvedeným programem promývání. Butoxykarbonylleuoinaldehyd /1,25 mmol/, připravený způsobem podle Behrentze a Castra. Svnthesis. str. 676 /1985/. se rOZDUStí

- //- 22 v 5 ml suchého dimethylformamidu /Bml·¹/ a přidá se do pryskyřičné trifluoroctové solné suspenze, načež se přidá 100 mg /2 mmol/ kyanoborohydridu sodného /Sasaki and Ooy, Beptides 8: 119 - 121 /1987/; Ooy a kol./, míchá se po dobu jedné hodiny, pak se zjistí negativní reakce pryskyřičné směsi na ninhydrin /1 min/, dokládající dokonalou derivatizaei volné aminoskupiny.

rak se postupně kopulují následující aminokyseliny /1,5 mmol/ v přítomnosti diisopropylkarbodiimidu /1,5 mmol/ a získaná aminokyselinová, pryskyřice se cykluje stupni promýv vání/deblokování /a/ až /f/ stejnou procedurou, jak shora po psáno: butoxykarbonyl-Gly /Boc-Gly se kopuluje jakožto 6dí nadbytek p-nitrofenylesteru/, Boc-Phe, Boc-Phe, Boc-Gln, Boc-C-ln, /Boc-Gln se kopuluje jakožto 6 íď nadbytek p-nitrof enylesteru/, Boc-Brc, Boc-Lys, Boc-řro a Boc-Arg. Hotová pryskyřice se pak promyje methanolem a vysuší se na vzduchu.

Shora připravená pryskyřice /1,6 g, 0,5 mmol/ se smíchá s anisolem /5 ml/ a s bezvodým fluorovodíkem /55 ml/ při tOuTctc 0 θθ a míchá se ^τ'·^η 4R τ-frnt·.. Tlarihv-Rpk flnňrnvfidíku se rychle odpaří v proudu suchého dusíku, volný peptid se vysráží a promyje se etherem. Surový peptid se rozpustí v minimálním objemu 2LI kyseliny octové a čistí se na sloupci /2,5 x 90 cm/ Sephaáexu G—25, který se eluuje 2M kyselinou octovou, následuje preparativní středně tlaková chromá tografie na sloupci /1,5 x 45 cm/ oxidu křemičitého Vydac /10 až 15 mikrometrů/, který se eluuje s lineárními gradienty acetonitrilú. v 0,1/ trifluoroctová kyselině za použití kontroloru gradientu Eldex Ghromatrol /průtoková rychlost 1 ml/min/· Popřípadě se analogy dále čistí opětnou ohrcmatografií na téže koleně s mírnými modifikacemi sa případných. mírných modifikací podmínek gradientu· homogenity peptidu se dosahuje chromatografii v tenké vrstvě a analytickou fázovou reverzní vysokotlakou kapalinovou chromatografií; dosahuje 3e 57/ i vyšší čistoty. Analytické stanovení aminokyselin udává očekávané poměry aminokyselin. Přítomnost redukované peptidové vazby demonstrována hmotovou spektroskopií za bombardování rychlým atomem. V každém případě analog vykazuje dobrý výtěžek molekulárního iontu odpovídající vypočtené molekulové hmotnosxi.

Statinový, AHPřA, ACKPA, ^-aminokyselinový nebo <ylaminokysslinový zbytek se zavádí stejným způsobem jako přírodní ^-aminokyselinový zbytek kopulací jako v případě Bocaminokyseliny /butoxykarbonylaminokyseliny/. Statin nebo Bocstatin se může připravovat způsobem, který popsal Rich a kol. 1978, J. Org. CÍÍem. 43, 3624; Rich a kol., 1988, J. Org. Ctíem 52í 869; a Rich a kol., 1980, J-r I-íed. Chem. 21: 27· AKPPA se může připravovat způsobem, který popsal Hui a kol., 1987

J. Med. Chem. 10: 1287. ACKPA se může připravovat způsobem, který popsal Schuda a kol., 1988, Journal of Organic C^emistry 21: 873· Boc-kopulovane syntetické aminokyseliny jsou dostupné u společnosti Rova Biochemicals /Švýcarsko/, Bachem /Torrance, Kalifornie/ a CalBiochem /San Biego, Kalifornie/.

--24Další sloučeniny se mohou připravovat, jak shora uvedeno, a mohou se zkoušet se zřetelem na účinnost jakožto agonisty ne· bo antagonisty následujícím programem zkoušky.

Fáze 1 - Uvolňování amylasy z pankreatického acini

8P stimuluje uvolňování amylasy v pankreatickém acini. Stimulace nebo inhibice uvolňování amylasy pankreatickým acini se využívá jakožto míra případné účinnosti peptidů jakožto agonistu nebo antagonistů. Dispergovaná acini z pakreasu živočišného se suspenduje ve 150 ml standardního inkubačního roztoku. Uvolňování amylasy se měří způsobem, který popsal Gardner a kol., 1977, J- Phýsiol. 270= 439/. Aktivita amylasy se stanoví způsobem, který popsal Česka a kol., 1969, Clin. G^im. Acta £6: 437 a Česka a kol., 1969, Clin. Ghim. Acta 26: 445/ za použití Phadebasovy re&gencie. Uvolňování amylasy se vypočte jako procento účinnosti amylasy v acini na začátku inkubace, která se uvolní do extracelulárního prostředí v průběhu inkubace.

/ hh^A. _ί

Páže 2 - Konkuronění inhibice ^^^I-Bolton-Hunter-SP vazby

Vázání ¹^^I-Bolton-Hunter-SP /¹²^I-BH-SP/ k dispergovanému pankreatickému acini se měří způsobem, který popsal Jensen a kol., 1984, Biochem,· Biophys. Acta 804= 181 a Jensen a kol., 1988 Am. J. Physiol. 254= G883. Inkubace obsahují 0,125 nl£ ^^^I-BH-SP a 0,1/ bacitracin jakožto standardní inkubační pufr a udržují se po dobu 30 minut na teplotě 37 °C₀Nenasyíř^ná vazb# ^JI-BH-SP je množství radioaktivity

- /-7 spojení s acini v případě, kdy inkubace obsahuje 0,125 nM

125

I-BH-SP plus 1 yuM neznačeného 3P. Všechny dané hodnoty ⁷ jsou pro . ..nasýMsnou vazbu, to znamená, že se vazby měří se samotným ^²^I-BH-SP /celková vazba/. Ve všech případech se nenasytná vazba podílela na celkové vazbě méně než 20 /.

Fáze 2 - Konkurenční inhibice vazby ^^^I-/^Tyr^7 Bombesin

Připraví se ^²^I-/”fyr^J Bombesin /2200 Ci/mmol/ za použití modifikovaného způsobu, který popsal Jensen a kol.,

1978» Proč. Nati. Acad. 3ci. USA 751 6129. Rozpustí se jodoC-en /mg/ v 5 ml chloroformu a 5 mikrolitrů tohoto roztoku /1 mikrogram jodo-Oenu/ se převede do nádobky v proudu dusíku. Do této nádobky se přidá 50 mikrolitrů dihydrogenfosfátu drasel ného /KH^PO^/ /hodnota pH 7,4/» 6 mikrogramů /”Tyr4_7 bombesinu v 5 mikrolitrech vody a 1 mCi Na I, promísí se a inkubuje se po dobu 6 minut při teplotě 4 °C» přidá se jodační směs do nádobky lů dithiothreitolu a inkubuje se při teplotě 80 °G po dobu 60 minut. Jodinační směs se pak vnese na SepPak a eluuje se 0,25 M tetraethylamoniumfosfátu /TEAP/ a pak 50/ /objem/objem/ systémenR acetonitril - 0,25 M. tetraethylamoniumfosfát, U-/xyr _7 bombesin se čistí reversní fázovou vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií /HPGl/ a eluuje se.

Jakožto výsledky zkoušek shora popsaných zkoušených peptidů se uvádí: četné analogy látky P nebo spantidu jakožto antagonistů látky P, přičemž každý obsahuje nepeptidovou vazbu, se mohou připravovat a zkoušet jedním nebo několika

- 29 způsoby, jako je popsáno v odstavcích fáze 1 až fáze 3. lát(q&n/ ka P má strukturu. Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gl^-Phe-Phe-Gly-LeuKet-NH^. Spantid je analog SP, Struktura spantidu je D-ArgPro-Lys-Pro-Gln-Gln-L-Trp-Phe-P-Trp-Leu-Leu-líH^. Stimulace ν' ^d inhibice uvolnovánnamylasy z dispergovaného pankreatického acini se používá jakožto zkouška pro Sp agonistovou účinnost nebo AP antagonistovou účinnost. Při koncentraci 10 v

yultl, 9 az 10 SP a spantidem odvozené pseudopeptidy selhávají při stimulaci uvolňování amylasy, pokud jsou přítomny samotné /tabulka ll/, Jeden peptid, Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Cln-FhePhe-Gly /“CH^-í^/íeu-I-eu-KH^» /10 /Uli/ má agonistovou účinnost, způsobující trojnásobný vzrůst uvolňování amjlasy /tabulka ll/, Každý z 9 pseudopeptidů bez agonistové účinnosti se zkouší se zřetelem na účinnost jako SP antagonist. Při koncentraci 10 /uM každý ze spantidu odvozeného pseudopeptidových analogů inhibuje 1 níí-SP-stimulované uvolňování amylasy. /Tabulka ll/, Tři SP pseudopeptidy, Arg-Pro-Lys-ProGln-Gln-Phe-Phe-rGly-leu^/“GH^-NH^/Leu-KH^, Arg-Pro-Lys-ProGln-Gl^n-Phe-Phe^/nH^-HH^Gly-Leu-Leu-MH^ a Arg-Pro-Lys-ProGln-Gln^/^GH^-KH^yPhe-Phe-Gly-Leu-Leu-IÍHg způsobují inhibici /tabulka 11/« helativní schopnost každého peptidu inhibovat SP-stimulované uvolňování amylasy se stanoví podle vlivu velikosti dávky peptidu na inhibici. Zjišťování inhibiční dávky se provádí pro každý z devíti pseudopeptidů za použití koncentrace SP /1 nií/, která způsobuje polovinu maximální stimulace /©br.l/<

j^pro put cd sjSantidu odvozených psc-udopeptidů jsou uveden?/ nt obr. 1, levý díl, D-Arg-Pro-<vs-?ro-&ln-Gln-B-Trp-Phe-L-i'rp- 4.eu 7 Cil.-hn 7K19-NH- ?e stedn účinnv -it-kn .q~>?.nŤ.id ? sr.ňsobuje zjistitelnou inhibici pil C,D /Uli a polovinu maximální inhibice při 1,3 ^uh /tabulka lil/. D-nrp-lro-^ys-ProGln-C-ln-L-irp-lhe-D-irp ^/bií^-hi^/i-eu-Nle-Nh^ je dvakrát méně účinný /±z^ 5,5 /Uk, tabulka 111/ než spantid. P-Ary-Pre- nys-Pro-Gln-Gln / 0Ρΐ-Ι·:Η_7ΰ-ΤΓρ-Ρίιθ-Ώ-ΤΓρ-ι,θυ-Ν1θ-ΝΙ·ί₂ je 2,6 krát /í-pp 4,7 ^ul..7 méně účinný nes spantid. D-Arg-řro-L.ysPro-Gln-Gin-D-lrp ⁿ/ CH^-zn /Phe-D-lrp-Leu-hle-hh^ je 3,5 krát /IC^q, 6,4 uLí/ mén.. účinný a D-Ary-Pro—^Uys-Pro-Gln- Gin-fi-lrp-Phe '/-ϋ^-Ι^^/ζ’-ίΓρ-^ΰη-ΙΙθ-ί.'η^ je 17 krát /10 30 yUŽ;/ méně účinný než spantid /tobulka 111/i

Výsledky pro SP p „eudopeptidové analogy j^ou uvedeny na obr. 1 , pravá část. jr.rpi-Pro-hys-Pro-Gln-Gln-Phe-lhe-Gly-*x.eu VCiu-ilh 7neu-Aiiz- jo nejúcinnějaím SP derivátem, způ“ C,j yUÍ.^i- olov inu _moxi ná lni i n hibice oři sobu jícím zjistitelnou inhioici^/r^yTT^^Ař-^-/tabulka 111, yrnvo/. 2,ri-Pro—^L-7s-Pro-Gln-‘jln-Phe---'he ^/ΟΗ,,-Μτ. 7Glv-neu — á —

1j · ™ - 7

- ^eu-uřh, a xirn-Pro-j-vs-iro-Gln-Gln / Ch^.-hH /Phc-ihe-Glv1 ° z

- neu-^eu-Nrhj jsou mó^ě účinné, způsobující zjistitelnou inhibici oři 10 /tú... Jsou 7 krát o. 46 krát méně účinné neš Ar£ -Pro-j-s,·s-Pro-iln-Gln-Phe-Phe-Gly-neu Ch^-nh-^Leu-Kl·^ /tabulka III, vpravo/. Arg-Pro-nys-Pro-Gln-Gln-Phe ^L/ CH^- líh /Ihe-uly-^eu-neu-hn^ nemá žádnou inhibiční účinnost při koncentraci i 30' ^uld /obr. 1, vprevo/. Hejúcinnější pseudopeptidový antagonist odvozený od SP je Arg-J?ro-nys-ProGln-Gln-Phe-Phe-Gly-i-eu ^l/”0íí_o-íúí_7i_jgu-NH₂ /obr. 1, tabulka 11/.

/Inhibiční působení nejúcinnajšího pseudopeptidového sntayonist^,, odvozeného od SP, Kr£_i-Rro--_<s-Pro-Gln-Gln-rhGΛι-3-Gly-Leu ^K/ Ch^-KK-ZLeu-Krh,, je ukázáno nu obr. 2. Acini se inkubují se vzrůste jící koncentrací SP. uvolňování amylazy je zjistitelné 0,1 nm SP, je poloviční maxima s 1 nK SP2 a je maximální s 10 nl·.. /obr. 2/. Přidání Arg-Pro-nysPro-Oln-uln-Phe-Phe-Gly-reu ^/’ΟΗ^-ΡΗ /^eu-hn^ způsobuje paralelní posun vzhůfcu v křivce odezvy ne dávku uvolnění amyla zy stimulované SP. Posun je úměrný Koncentraci A.rg-Prorys-Pro-uln-Gln-Phe-Phe-dly-reu ^L/ CH -KH_7^eu-Kn^ přidaného, nejsou však žádné zrniny maximální odezvy /obr. 2/. K-Arg-Prox-vs-Pro-rln-Gln-P-Tro-Phe-D-PrD-r.eu ^υ/θΗ. -KH 7hle-Kn,. po^J ' - z r skytuje podobné výsledky, ncdnot nejsou znázorněny.

Vzájemná působení analogů odvozených od Sp ε> spantidu s receptory, SP pankreatických acini se můří chopností pep1 25 tiúu inhibovat vázání ^yl-HH-3P na acini /viz 'tabulka iíl a obr. 3/.

y. /<Spantides-odvozené pseudopeptidy vykazují četné účinnosti. D-Arg-Prc-^ys-Pro-GIn-Gln-K-írp--he-d-lrp-beu ^/ CH„~

- KH^··le-ih-i^ je zhruba stejné účinný jako Spantid a způsobuje zjistitelnou inhioici při C,C3 yui.I & polovinu maximáln^nhibicer ·. .' „ při 2,2/Uk /obr. 3, vlevo, tc bulka 111/. b-nrg— iTo-r/s-iro-Gln-Gln-D-trp-Phe-D-xrp ‘‘V ΑΡΗ,-ΐ·Κ_7ηeu-Kle-Klh a D-r.rg-Pro-J-g/s-?ro-Gln-Gln ^/ CE^-bh 7u-lTp-Phe-D_Grp~reu— ι’Ίρ-ΡΗΚ -i sni i dvrkrát méně účinné než soantid. D-AJEn-Pro.........................

— -y s-ι ro-Oln-Gln-D-urp Jhu-KH /Phe-b-lrp-^cu-nlc-idK, tíúmnt siené účinný /h- , ó,3 7-'-/ než s^sntid. Ό-Α

--y z, -r r o - G1 n - u i η -P -7 r o - Ph e ^ /

7ΰ-_Γ?ro-r,eu-..ie-i.u., je krát méně účinný /id , 14,7 yU.-/ nsž sgontid /dbjr. 3, tcbulio ii±/.

SP odvozené nseudoj ectidy U ké v,um.zují Pí. du účinností. Λίγ-Pro-uys-χro-cin-uln-Phe-Phe-Giv-x.eu Gx;.-..n zd-eu-.r.,, způsobuje zjistitelnou inhibici při C, 1 /Ud e nedovinu r.orimální účinnosti inhibiční pri 3 /UM. Arp;-Pro-hys-Pro-GlnGln-Phe-Piie-Giy ^/ Gh^-dii Zneu-^eu-hři,. ' *ciá 1,b krát nižší

- č “ <L ’ účinnost, λϊ’ρ-Ιγο—yo-Pro-Gln-£ln-Phe-Phe 7 u^-d. Zi-lyruye-^eu-.ru má ii krát nižní účinnost ε· ^rp-Pro-^ys--rc;in-Gln-Phe '/ Cíi,- -GH /rhe-Gly-ieu-neu-dd^ t _fir--.-lro-i.ys· *“ á * 4L heu-^cu-id CgíOU více ne.

Prc-Gin-Gln ^/ Ch,.-Ea 7Phe-rhe—GIv-j.

- č. ói hrát mén-i. účinné než Ary-1ro-i-ys-Pro-Gln-Gln-rhe-dheJj

Glv-reu / ih,,-3d 7rou-..d. .

č. - 2

-o rozdíl od dříve studovaných SP onsiogů jsou r.eptidy podle vynálezu specifické pro SP receptory,

Arr-Prc-j-vs-lro-Gln-Gln-Hie-rhe-GlY-Leu Un„-í.h 7d leu-iím se zkoušel se zřetelem ηε schopnost inhibovet uv/tváíené /cZvcinování omylnsy^/různými pt.nkh.u<t-ovymi· činžemi /tubulkm 17/, ar/ -x ro-ivs-rro-oln-uln-Fhs-Pbe-Giy-ieu ^/ GE,,-zn /neu-dm e ·, - G - z /20 yUi·,./ inhibuje uvolňování činyles,/ stimulované Sp, nečiti né však bombesin, CCK-8, ce.rbechol, ViP, sekretin, GGRP AÍ31G7 nebo LA stimulovaná uvolňování unplfcsy.

Eejúčinnt. jsi i^jeceptorové íintagonity se zkouší se zře125 ^z' telem na schopnost inhibovst vázání ^^i-ZPyrVbombesinu no bomtesinové receptory pankreatických ocini,· Spnntid in- A -,30 1 2^k' 4· hibuje vázaní lyr^Z!'_7bombesinu, jak shoř.·, uvedeno /Jensen o kol., 1986, Am.J.Physiol. 254:0683/, způsobuje polo• Ί“ vinu maxima mhibice oři 3 - 1 ^ulb a úplnou innibici při ICO yui. /obr. 4/. D-Árg-č³ro-x-,/s-?ro-Cln-Gln-D-irp-lhe-Di^:rp-x-eu CH2“NH /hle-AA^ inhibuje r.yr^ 7bombesi nové vázání avšak je 3 krát méně účinný než spantid způsobující polovinu maximální účinnosti při 10 ^ulí /p menší než

0,05 ve srovnaní se spantidem/ /bbr. 4/. Ar_f--Aro-lys-í^;ro, _ Leu-A/wA

Oln-Gln.-?he-lhe-Gl_ty-^eu / Ch^-Uh /{''nezpůsobuje zjistitelnou innibici tž do koncentrace nad 30 yUL a má vypočtené

30C í 20 yUl·,:. Spantid a D-Arg-Pro-nys-Fro-Gln-Gln-Dírp-lhe-D-ÍTp-^eu ^/“Ch^-NE 7Nle-íIh₂ má 3 sž 10 krát nižší afinitu k innibici ^1“/ lyr^4- 7bombesinové vazby než k ^{1 4Í5}I-cH-3P.

Schopnost Arg-Prc-jjys-Fro-Gln-Glp-Phe-Phe-Gly-leu /^_CH,.-IiH 7íeu-NH_n inhibovat vázání ¹ ^1-/ Tyr^ /bombesinu

- z - 2 _ _

125 je 70 krát nižší než jeho schopnost inhibovat vázáni I-im-Sp

Peptidy podle vynálezu se mohou podávat savcům, zvláště lidem jedním z běžných způsobů /například orálně, psrenterálnč, transdermálně nebo transmuskulárne/ ve formy přív pravků s řízeným uvolňováním za použití biologicky odbourátelného bikompatibilního polymeru nebo micel, gelů a $iposomů. Peptidy se podávají lidem v dávce 0,5 /Ug/kg/den až 5 mg/kg/den.

- ζΠ

lebulkn 1
řet koncových karboxylových	sb.tků různých biologicky ektiv-
nich peptidů
Peptid	Xerboxylové koncové se'?
uombesin	-Vsl-Gly-nis-Leu-Eet-En^
Neuromedin-β	-Thr-Gly -Li s -Phe -ke t -Eh,_;
neuronedin-C	-Ve 1 -Glv-ni s-Leu-Ee t -EL· ^v z
Litorin	-Vel -Gly -ni s - Ph e -Ee t -k u ... ^c Z
Neurokinin-A	-PheVel-Gly-Leu-keu-EB.
heurokinin-B	-Ph e-Ve1-G1y-Leu -Ee t -E L..
Lét ke P	-Phe -Phe -Gly -n eu-Ee t -En... íL
Prototypické techykininové	sekvence -Phe-X-Gly-Leu-Eet-Xin Ll

kde X zněměná rozv.tvsný ulifetický nebo &romstický sminokyselinový zbytek

V príptdi podie následující t,b při teplotě 37 °G po dobu 30 minut s centrtcích různých SP c spnntidových logů buč. se,notných nebo v konbint.ci.

i ce c.cini inkubuje 1 nX 3P a 10 ..uE konpseučopep Lidových ono uvolňovaní emylncy se

Iru;

Ε .ko urccento cétku inkubace v průběhu zkou v

z si.ΰo on ; . 11 icU zun. no mete ní-, .řp. onist \3 , utere se uvomuje do extr;-celulárníno prostředí cky. Hodnot;, jcou střednípi hodnotuni - 1 311.

jednotlivých žnoucek. Pii kcldé zkoušce se z jutuje dvakrát. skrutky ni ji tento význesu = nezkoušeno jeko ntt _í:onist jelikož jde oni;

Tabulka II

-2b- as Vliv různých pseudopeptidů odvozených od SP a spantidu na bazální ε SP-stimulovené uvolňování ' amylasy

Přidaný peptid Uvolňování amylasy /celkové ./

žádný	samotné 3,4 í 0,5	SP /1	nK/ 0,7
6,6	+
Árg-Pro-nys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-
Gly-Leu ^/^^-iWjTLeu-Kh^ /10 ^um/	3,1 í 0,7	4,3	+
Ary-. ro-nys-Fro-Gln-Gln-Phe-Fhe-
Oly ^/ ΟΗ,.-ΝΗ 7Leu-Leu-Ph„ /10 ¹⁷ - z - 2 J^J	10,4 í 1,0⁺⁺	1\±-		,&goni
a r y. -P r o -n y s -Pr o -G1 n - 01 n - Ph e -Phe
Gii^-^^/Oly-jxeu-x-eu-nri.^ /IQtyJ	3,1 - 1,0'	3,4	+	+ ^c,7

6,4 - C,3

Árg-Pro-^ys-Pro-Gln-Gln-Phe / CH^-PH 7?he-Gly-i.eu-ijeu-;'.’i-Í2 ty^ 3,3 - 0,7 >-Gln-Gln 0Ή_ο-ΡΉ 7Ar £ -x-r c -ny s-rr o· Pha-Phe-Gly-Leu-neu-GPx^ 710 yuP/

3,1 - C, + ·$Ó,1 -1,0

D-Arg-Pro-nys-Pro-Gln-Gln-b-Trp-Pheb-Trp-neu ΟΗ^-λΉ^/ΝΙθ-ϊϋ^ 71 C /UL./ 3,0 I 0,05 3,6 - 0,1

D -^rg-Pr o -χ-y s-rr o-oln-oin-D-ír p-Phe 2-Trp '^L/’Ch2-/H_7neu-Gle-Ph2 /10 tyj 3,5 - 0, D-Arg-Pro-nys-IPO-Gln-Gln-D-Trp-Phe^i /OH^-Pn /D-Trp-^eu-.ile-On^ 710 tyj

D-arg-Pro-ny s-Pro-Gln-Gin-D-Trp L· / CiU-OK /TTie-B-Trp-neu-Tle-dH^ 710 tyj 4,1 - 0,5

D -n r y -P r o -ny s -i-r o -Gin-Gin /0 -Xh_7b-Trp-Piic-D-Trp-neu-ble-Ín^ /10 tyj +

G'··

Ό

4,2 C,2⁺

4,0-0,5 5,6 + Β,8

3,8 - 0,3 výrazné méné než samotný SP_; p menší než 0,05 ++ výre zm. více

- r·.^

4,3 — O¹ j o úce než při žádné přísadě^ p menší než 0,01

Tsbulke III

- 2? -^rSchopnost 3P, spantidu ε pseudo. pgptidu innibove.t vázání

125- ~ l-kn-SP nebo SP-etmulovené uvolňování tnivlesv

L, ·» reotid

125

I-bři-so Inhibice 1 hn$n-sti~u

- V ^χ loveného uvolňování amyl&s.y nebo ί<β/yuh/

1C , / ,uk/ '?C /

-i-r^-áro--ys-?ro-áln-b-ln-b-'IrpPhe-B-lro-i-su-j-ou-RK^/coř ntid/ ¹ i i}-Arg-Pro-x.ys-Pro-6jln-oln-D-i'rpáhe-D-Trp-Leu Ch^-bn 7bItí-hPx, 0r. -Pr o -η v o -Ir c -0 r n -Gin-Ώ.-Ιr o -

fha-D-lrp ^x'/	L· iir-, “3'11 Zm-S U.^—1Θ
	dl —
D-hr₍ ^:;-?rc-i.7	^-Pro-vjln-Lrin-D-'
Phe On. -h	J ZEJ-Trp-^eu-^lc

2.1 - C,6

2.2 1 0,4

3,6 i 0,7

14,7

2,0

1,6 - 6,1

1,6 4 C,25

0.6 - b.C j -/i r _c -Pr o s -P r o - - lu -01 n -3 - rr p 3 /~7 ΣΚ -uri_7?he -Ώ-xrp-j-eu-nle -bii

D-Ár^-Prc-ip/s-Pro-Oln-O-ln ^/_ ChUPii 70-xrp-?xie-O-lrD-Leu-iýÍG-r.xi.

— * * á.

r á - -1' o - i. : s — z r o - i η—o χ n - z h e o ,3 +

-T - I ,-,7 ϊ—θ£ν-χ;θυ-..·.θί-1Ρη /3F/

0,CC25 ar p -Pro-j-y s-Pr o -oln-o-ln-Phe Phe-biy-ueu / Cl;?-hú_7j-eu-hi-u. Ar g -1 r o o -Pr o - uln - vln-Ph e -Phe ,ol>

rie-iy cmst .fy ^/“ΟΗ,,-ΙΙπ 7reu-xeu-ihi,, - X - X . , 3 - 0, j

I /· 1 , · .- -.

b , o - χ, ά hr {·'. -P ro-xys-Pr o -nl η - O1 n -Piie -P h e / 7uly--~eu-*,5U-eh·,

L

Aro-rro-rys-pro~uln--±n-zne /^-CK₂ -Nh_7?he-Gly-^eu-keu-IK-2 ará-Prá--.'s-Prc~xJ.r-..lri ^J'/ On. .- κ - χ

..-i_7?ne-Phe-Gl,y —-eu-xeu-áx,_;

41,3 - 16,7

265,2 - 65,0

v.. t._í než 30

VŽtál ΓΡ v ioí než 36 ~ 2/- 47 hodnoty jsou sti^dmmi hodnotami - ISSIě Kd hodnot pro C? ε zíake / 125

2í se ze Scetchcrdovy snalyzy I-značeného SP studia vazby hcd( · , 1 -5_ noit pře aycnist nebp ro sntagemsty ze studia vazby í-nii-S?^ přičemž platí rovnice: = /1/1-R/ /Sa/S + A/, kde 1 jc nosytitslna vazba ^<'^;X-lt.-SP v přítomnosti ants.yonistu /0/, vyjádřeno jakožto zlomek, pro případ, kdy b není obsažen; λ je hone -.ntrece 'i-bn-SP /b,125 nk/. b je koncentrace tntí ponist^., S je SP str, z “ / novená Scc-xchercovou aneiygou. le-a_t,onist zn&mf.ená, ní zkoušen na inhibiční účinnost^ pro .agonistovou účinnost, pokud je přítomen samotný.

ia bulka IV

Schopnost i:rp-Phó-J-y;	—1'r o-Gin-Gin-Ph e-Phe	-Gly-^eu ^Á/ 0:-..-1.. ,

ovlivňovat uvolňování	amalasy stimulované	různými faktory
	uvolňování Lm-.yla.sy	/c e 1 ko v é p r c c en t o /
Faktor	ε·- mo tné	ll_l ^J-^{GU L}1O-11-SP 20' .ul
žádný	a, / - 0,4	2,3 í 0,3
látka P /1 ni../	4-	4- _ +
2,7 - 1,8	4,J - U',5
UCn-6 /&/ nlií	15,7 - 4,2	21,6 - 4,9
bomb o s in /0,3 nll/	14,G - o,i	14,3 Í 3,1
ktrbachol /iC/nb/	22,7 - 4,1	20,7 - 4,3
/ VIP /0,3 ni/	—·,> - j,a	18,9 í 4,2
secretin /0,1 /Ul·../	lo,9 í 3,o	18,0 Í 4,1
CGRP /0,1 yUh/	12,1 í 3,3	12,0 - 3,5
A23187 /0,1 /UÍ./	9,2 í 1,5	11,6 í 1,6
TPA /0,1 fo/	32,2 í 5,7	30,2 -5,6

výrazně menší než faktor samotný p menší neŽ 0,001

-29*cini se inkubují po dobu 30 minut při teclotě 37 °C s různýA mi látkami k vylučovaní p&nkreatového sekretu símotn^.Z nebo s λΓ^—i'ro—xjys—Pro—uln—uxti—ihd—xlie—Oly—i.-6u g νπ....—χ.'χι /x^eu—

V každé zkoušce se každá hodnota stanovuje dvakrát a výsled+ * ky jsou středem - iS.ok z alespoň čtyř oddálených zkoušek.

Zkratky mají tento význam: GCk-b, CCOh koncový ektaoectid choCfsA L/fř lecykiokininu; VIP vasoaktivní intestinóiní peptid; COP?, cclcitoni ne gen vztažený peptid; A231S7 ε ΪΡΑ 1,2-o-tetradekanoylxorbol-l,3acetéto

Vynález lze přirozené různ-d modifikovat ε obmdňovc-t.

Claims

1. Lineární peptid obecného vzorce I kde

Ά²¹ -a²²-a²³-a²⁴-nii~

A²⁵ A²⁶ A²⁷ A²⁸ A²⁹ A³⁰ A³¹ •ch-r⁵⁴-ch-r⁵⁶-ch-r⁵⁸-ch-r⁶⁰-ch-r⁶²-ch-r⁶⁴-ch-v¹⁰

A²¹ Je D H ebo L izotnér Arg A²² je D Π ebo L izomér P ro A²³ je D /1 ebo L i zomér Lys A²⁴ je D Π. ebo L i zorné r P ro

_t25 je identifikační skupina D nebo L izoméru Gin je identifikační skupinu D nebo L izoméru Gin je identifikační skupina D-Trp nebo identifikační skupin;.

D >2. ebo L i zorné r u Phe je identifikační skupina D n ebo L izoméru am i i π o k v s e 1 i r i y ze sdboru β-Nal. , Phe, o-X-Phe, kde X je F, Cl,~Br, no₂ , OH 4 ebo CHj, riebo p-X-Phe, v kterém X je F, Cl, Br, no₂ , OH n. ebo CH^ je identifikační skupina aminokyseliny D-Trp nebo

identifikační skupina D M.ebo L izoméru Phe je identifikační skupina D nebo L izoméru aminokyseliny z© skupiny Leu, Nle, Ala, Val nebo Ile je identifikační skupina D nebo L izoméru aminokyseliny ze skupiny Leu, Nle, Ala, Val n ebo Ile R^d4 je CO-NH nebo CO-NCH-j

R _k30 _k3l

R^² a RÓ⁴js<i nezávisle CO-NH nebo CH₀-NH _ř10 je CO-NR⁶⁹ch₂-nh je CO-NH a 3^e v kterém

R⁶⁹ je

2' /1 ebo ^1-12 ^a '⁴·’/ I Λ ebo

-C-O-R |fl,ebo

-C-N

D v kterých každý R ^67 ^{a R}68 3^e nezávisle H, 12alkyli 5¹ a D 5 2 ^7-10 fenylalkyl n ebo C₄₂_₂q ^naftylalky1 a R“'ⁱ a R které jžXf v^ázané na a-arninodusíkovy atom N-koncove” - o.

aminokyseliny jsú nezávisle H, C₁_₁₂ alkyl, C fenylalkyl M.ebo COE₂₄, kde E₂₄ je C-^jq alkyl, alkenyl, ₂θ alkinyl, fenyl. naftvl /2 ebo '24 je ^1-20 fenyl, naftyl fenylalkyl za podmínky, že já-tk jeden za a r5² je C0E24, druhý musí nejmene jeden ze symbolaR~’^u, R^JO, R CH2NH, 77 ebo jeho farmaceuticky přijatelné solfi.

7-10 '3-20 '7-10 symbolů R^f byl atom vodí k w přičemž) 62 (7 ebo r64 je

2 lineární peptid podle nároku l¹ vzorce H-D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Ghi-D-lrp-Phe-D-TrpH[CH2-NH]Leu-Nle-NH2 /iebo jeho farmaceuticky přijatelná sLÍf,

3.lineární..peplid podlft nároku 1 vzorce H-D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln'-Gkt-D-Ttp-Phrt-D-Trp-Leu^LtCH₂-NH!Nle-NH2 Aebo jeho farmaceuticky prijateíjⁿ^ sól.

« -

4.Lineární peptid podlfí nároku 1 vzorce H-D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp^L[CH2-NH ] Phe-D-T^rp-Leu-Nle-NH₂ fl ebo jeho farmaceuticky přijatelná sól.

(

5.Lineární peptid jpod lét nároku j. vzorce H-D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln^(CH₂-NH ]D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Nle-NH₂ ;řt ebo jeho farmaceuticky přijatelná sttl.

6η δ r η í peptid podle

29 /

A je identifikační nároku 2 , kde skupina D-Trp.

Lineární peptiďpodlfí. nároku í , kde A²¹ je D alebo L izomČr Arg A²² je Pro _Λ 23 Λ je Lys A²⁴ je Pro A²⁵ je *»* identifikační· skupina Gin A²⁶ je identifikační· skupina Gin A²⁷ je ’ z identifikační skupina Phe n'et.

28 je i den t i f i .. . Z i kacn^ skup 29 J^e i den t i f i A i kacnái skup 30 je i den t i f i z i kiiěný skup 3 1 je í.den c i f i i kačrí£ skup

w

Phe <

1) Tr μ

Leu

Leu alebc) Nie.

I <D CN mrze

ClZ

Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-GlnPhe-Gly-Leuy(CH2-NH)LeuI

CL

C

I CN oi

I

CZ I —, <L> θ'—

C— oz i CN ox i_O

CO

L

LO

N ,_T

O LO

10 CN

0ΘΡ.4 ¹²⁵KTyr⁴ o

w

0 1 t C3 o x· i -— í ^: Á U5

PA7

Civ! í ;ViS

PRAHA

I i 1/ í ^v ’υ

J L·'

CM cn ogj t_z= *37 Ο-

AU í.\l —ií 1 2ZZZC ο_ξζ ωζ | J W Z3 >, CD CZ mí CZ Z3 —> OJ I | r—. OJ CZ_i CD—J 1 1 0 >> CZ ZJ O Π L. QJ CL CD 1 1 —¹ GJ GD—J O__1 1 1 tzn<p 1 OT co >> ¹ <CL L_z _JCD Cl i 1 CM OZC COZL us >LJ Cl. 1 _1— 1 1 CM cnzc O >, L-O i_-—. CLO 1 1

LO i

CO l·1 co

Cl CL I I cn cu <CL

Ι— CM i nz qs:

i i

CZ GJ

I 4 F·· <

ωζ i i C zz

CM

—' GJ —- / CL 1 GJ CD_I / Z C_ Cl 1 —> ^{1 1} / I— CM s_ Ω^ 0 0. i_y 1— CM 1 (_ 1— ¹ Τ’ Ω2: 1 ΠΖ czzc O-l— í 1 | ωζ: —12: ¹¹ / > tm gj 1 1 CD 1 ωΩ /1 cm srn 0 1 CM :=-,- . / □“Lg , ♦zl nz LUZ ——¹ czzc _izjz r / JWH (/· sc 1 | CJJ2Z —i(_J ¹ / // // 1 cz ms l 1 cd·—-

CZ ZJ

OJ

GJ

1 __1 CD_1 — GJ 0 mj cz z 1 1 DD — CD -' 1 O Q. 1 -—· o__1 0 O L_ í— ozc 1 1 1 GJ C— |—. t-ZC CO Q. 0 —1 1 | □_ 1 >L_ Ι- 1 «Ω 1 CM _II— Ο- Cl >1 1 C/JZC 1 1 Ι 1— _1 OJ >a ΟΩ CO 1— 1 JZZ _J — *— 1

O0_

I

O Q.

ΟΙ

LO

CO rI

-v o

o iO ri?

i Q-> CM JZZ □= cl cm I π\ • t -LL s- > L_ <c CZ |— I —¹ I Ω O q

CLZC t Z CD I L. CM <ZIZ 3- I I O

-Q'-' I O QCL

LO

0-1—

I I οίω

Cl cd

1 1= σ>ο_ c_ I <C Q.

I !— ΩΗ ¹²⁵i-bi sp

LO

OJ

0 6 \ 6 0 ΐ·Ί$0·OBA. 3 i

o

CT.

u

V»

-Ί σ' o

·; j ‘<1 —i | ”7 i

TA ?'{?' •i \ / I’ -·Λ

HRáHA

7 M íl/

OJ

CZ Z3 —' OJ CO—J i I CZ >1

I

OJ OJ

-I clz

1 I o

ZZ Cl i CL Ti CD 1 OJ 1 zzs _l cože CO CD 1 >(J >\—1 Q _1 — _1 t L, ι i Cl 1— O CZL O i- 1 L_ L·. 1—1— o ClI— Cl i i i i Q I CjiQ cn i O í— 1 «^C φ i- OJ =-ΐ2ΖΖ LO 1 zzz 1 CL QQ. co

HJ í— <

Ll

PRAHA