CZ38194A3 - Lyophilized polyalkylenoxide modified protein and polypeptide complexes with cyclodextrin - Google Patents

Lyophilized polyalkylenoxide modified protein and polypeptide complexes with cyclodextrin Download PDF

Info

Publication number
CZ38194A3
CZ38194A3 CZ94381A CZ38194A CZ38194A3 CZ 38194 A3 CZ38194 A3 CZ 38194A3 CZ 94381 A CZ94381 A CZ 94381A CZ 38194 A CZ38194 A CZ 38194A CZ 38194 A3 CZ38194 A3 CZ 38194A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
protein
composition
polyalkylene oxide
cyclodextrin
solution
Prior art date
Application number
CZ94381A
Other languages
English (en)
Inventor
Christopher P Phillips
Robert A Snow
Original Assignee
Sterling Winthrop Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sterling Winthrop Inc filed Critical Sterling Winthrop Inc
Publication of CZ38194A3 publication Critical patent/CZ38194A3/cs

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A61K47/6951—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes using cyclodextrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5406—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C07K7/083—Neurotensin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Oblast techniky ' 5 ’
- í ! 7 l·., r- .
Tento vynález se týká lyofilizovaných vodných parenterálních roztoků fyziologicky aktivních proteinů a polypeptidů, které jsou vázány k nízko diolovému polyalkylenoxidu kombinovanému s cyklodextrinem zmrazeným ochranným prostředkem (kryoprotektantovým cyklodextrinem). 1
Tento vynález se zvláště týká lyofilizovaného vodného parenterálniho roztoku hyperoxiddismutasy vázané na nízko diolový polyethylenglykol kombinovaný s kryoprotektantovým cyklodextrinem. *
k. .
Dosavadní stav techniky . ’
Biologicky aktivní proteiny, obzvláště enzymy a r. .
peptidové hormony, jsou dlouho pokládány za ideální léčivou látku pro ošetřování různých chorob v důsledku své specifičnosti a rychlého katalytického účinku. Mezi takové enzymy se * i , zahrnují:
Oxidoreduktasy, jako urát: oxygenoxidoreduktasa (1.7.3.3? urikasa), peroxid vodíku: hydrogenperoxidoxidoreduktasa (1.11.1.6; katalasa) a , cholesterol, redukovaný NADP (nikotinamid adenin dinukleotidifosfát): oxygenoxidoreduktasa (20-p-hydroxylujicí) ‘(1.14.1.9; cholesterol-20-hydroxylaša).
Transferasy, jako je UDP glukuronát (uridin difosfoglukuronát) glukuronyltransferasy (nespecifický akceptor) (2.4.1.17; UDP glukuronyltransferasa) . a
UDP glukóza (uridin difosfoglukóza): α-D-galaktoso-l-fosfaturidylyltransferasa 2.7.7.12).
Hydrolasy, jako je mukopeptid.N-acetylmuramylhydrolasy
-(-3-.-2-.-1-.-1-7-;—-1-y-soz-y-m-)-,-:ťripsin (3.4.4.4) a
L-asparagin aminohydrolasy <3.5.1.1, “asparaginasa).
• ’T ·* I ► l Bi
Lyasy, jako je -fruktoso-1,6-difosfat-D-glyceraldehyd-3fosfatlyasa (4.1.2.12; aldolasa)..,
Isomerasy, jako je D-xylosoketolisomerasa (5.3.1.5; xylóza * · - í ' isomerasy) a dále ligasy, jako je L-citrullin: L-aspartatligasa (AMP) (6.3.4.5).
1 ' . J. — i. » _ »·’' . , · ' ' ' ' Λ 'i-i
Peptidové hormony zahrnuji: . .
--------- 'insulin, ‘ACTH^f adrenokortikotropni hormon)’, glukagon somatostatin,. somatotropin, . thymosin; hormon příštítr ných tělísek, pigmentačni. hormony, soraatomedin ' -erythropoietin ,· luteinizačni hormon, chorionický * gonadotropin, faktory uvolňující hypothalamus, antidiuretický hormon, hormon stimulující štítnou žlázu, kalcitonin a prolaktin.
Terapie s fyziologicky aktivními bílkovinnými látkami, zvlástě’s enzymy nepocházejícími od člověka, je méně než úspěšná, částečně v důsledku* jejich relativně krátkého poločasu existence a jejich vlastni imunogenetičnosti. Po * r , ’ podáni pacientům obranný systém odpovídá odstraněním cizích emnzymů tim, že začne produkovat protilátky, což podstatně snižuje nebo vylučuje terapeutické účinky takových enzymů. Opakované podáváni cizích enzymů nebo jiných lidských enzymů s krátkým poločasem existence je v podstatě neúčinné a. může
I být nebezpečné, protože se jako průvodní jev dostaví alergická odezva. Prováděly se různé pokusy vyřešit tyto problémy, které spočívaly například v enkapsulaci, zachyceni v liposomech, genovém inženýrství a připojeni enzymů k polymerům.
Z pokusů se jako slibnější ukázalo chemické vázáni bílkovinných látek k polyalkylenoxidovým (PAO) polymerům a zvláště
I k polyethylenglykolům (PEG). Dále se uvádějí ilustrativní údaje pro tyto pokusy.
US patent č. 4 179 337 popisuje použiti polyeťhylenglykolu nebo polyethylenglykolu vázaného k proteinům, vedoucí k dosaženi fyziologicky aktivní neimunogenni polypeptidové kompozice rozpustné ve vodě, ve které polyethylenglykol (zde dále též.někdy označovaný jako PEG) slouží k ochraně peptidu před ztrátou aktivity, bez vyvolání podstatné imunogenní ’ 1 r ' XT . _
a. v *··· ·. ’ : i odezvy.r Způsoby popsané v tomto patentu pro vázáni polyethylenglykolu k proteinu., zahrnuji buď převedeni chráněné aminoskupiny na amid nebo pseudoamid, s nášíedujici ztrátou · kapacity aminoskupiny nesoucí náboj, nebo zavedeni substituentu tvořeného heteroatomem, jako hydroxyskupiny, do aminoskupiny nebo vicinálni skupiny proteinu, nebo zavedení kruhového systému, který se neopakuje, do hlavního řetězce polymeru.
F. M. Veronese, E. Boccu, 0. Schaivon, G. P. Velo, A. Conforti, L. Franco a R. Milanino v Journal of· Pharmacy and Pharmacology, 35, 757-758 /1983/ uvádějí, že když se hyperoxiddimutasa získaná z červených krvinek hovězího dobytka upraví aktivním esterem N-hydroxysukcinimidu kyseliny, polyethylenglykolkarboxylové, poločas existence enzymu u krys se zvýši vzhledem k nemodifikovanému proteinu.
Evropská patentová přihláška č. 0 200 467 (Anjinomoto, lne.) popisuje hyperoxiddismutasu, která je chemicky upravena polyalkylenoxidem (PAO), který je funkcionalizován na obou koncích polymeru aktivovanými karboxylovými kopulačními skupinami, z nichž každá je schopná reagovat s proteinem. Protože aktivovaná kopulační místa jsou umístěna na obrácený.ch_ko.ncí.ch_pol.ymer.niho--řetězce. není .pravděpodobné. že by_ přítomnost aktivované skupiný ná jednom' konci polymeru mohla mít významný účinek na reaktivní povahu skupiny, která'je na druhém konci polymeru. Tyto polymery jsou schopné reagovat na obou koncích ža vzniku zesítujících vazeb s proteiny, čímž se tvoři kopolymery mezi proteinem a polyalkylenoxidem. Takové polymery nejsou dobře definovány nebo nemají molekulárně stechiometrické složení.
F. M. Veroneše a kol. v Journal of Controlled Release, 10, 145-154 /1989/ uvádí derivatizaci moríomeťhoxýpoiýěthýlénglykolem.'( zde dále někdy také. označovaným jako MPEG j hyperoxiddismutasy (zde dále někdy také označované'jako SOD) a poskytu je heterogenní směs produktů. . Heterogenita sedoloží v závislosti na přítomnosti bifunkčního polyethylěnglykoíu (DPEG)' v ~monofunkčních methóxylováných molekuláchTyto pokusy mají obecně za. výsledek poněkud delší poločas- existence a snížení imunogenetičnosti bílkovinných fyziologicky aktivních látek. Zdá se však, žeje zapotřebí dalšího zlepšení k úspěšnému ošetřování řady chorob těmito slibnými biologicky účinnými látkami.
V související US patentové přihlášce č. 07/936 416 je uvedeno, že mohou být vyrobeny biologicky aktivní bílkovinné látky, které mají delší poločas existence a ztrácejí imunogenni vlastnosti chemickou úpravou, při použití nízko diolového polyalkylenoxidu, výhodně'polyethylenglykolu. Prostředky uvedené výše mají zřetelné výhody předčici prostředky známé ze stavu techniky ha bázi polyethylenglykolem modifikovaných bílkovinných látek.
Během skladováni v kapalném stavu se polyethylenglykolem upravené bílkovinné molekuly hydrolýzují na smés volného, polyethyíenglykolu, části tvořené polyethylenglykolem a proteinem a části tvořené sukcinátem a proteinem. Aby se zabránilo destabilizačnimu procesu, prostředky se mohou lyofilizovat. Avšak pokud se provádí lyofilizace, koncentrace proteinu a stabilizátorů má vysokou úroveň a závisí na použitých excipientech, co nepříznivé ovlivňuje stupeň intermolekulární agregace, ke které dochází během skladování.
Bylo nalezeno, že cyklodextriny snižují rychlost intermolekulární agregace kovalentně vázaných nízko diolových polyethylenglykolů u proteinů během skladování, a proto poskytují prodloužený čas skladování.
, ....... v· - V. \ cyklodextrinech je v oboru známé, že mají schopnost tvořit obsažené komplexy a mají průvodní ,jev spočívající v solubilizujicích vlastnostech. Deriváty cyklodextrinu jsou také známé tím, že mají takovéto vlastnosti. Jejich používání je ilustrováno patenty uvedenými dále.
t~·
US patent č. 4 596 795 se týká podáváni sexuálních hormonů ve formě jejich komplexů s hydrofilnimi deriváty cyklodextrinu, jako je poly-p-cyklodextrin a hydroxypropyl-β-cyklodextrin, sublinguálni nebo bukálni cestou. Bylo zjištěno, že komplexy jsou velmi rozpustné ve vodě a účinné, ve srovnání s jinými cyklodextrinovými deriváty.
US patent č. 4 727 064.popisuje farmaceutické prostředky, které sestávají z léčivé látky s nízkou rozpustnosti ve vodě a amorfní směsi založené na cyklodextrinech rozpustných ve vodě. Přidáním směsi založené na cyklodextrinech se zlepšuji rozpouštéci vlastnosti léčivé látky. Smés založená na cyklodextrinech se připravuje z a-cyklodextrinu, β-cykloο dextrinu nebo τ-cyklodextrinu, a neselektivní alkylaci se dosahuje, že má amorfní vlastnosti.
Mezinárodní přihláška PCT/US89/04099 (WO 90/037.84) popisuje lyofilizovany prostředek zahrnující polypeptid_ a stabilizační nebo sbl'ubiTižační'mribžš'tví 'cyklodextrinú/'' zvoleného ze souboru zahrnujícího hydroxypropylové, hydroxy.ethylové, glukosylové, maltosylové a maltotri-osylové deriváty β-cyklodextrinu a τ-cyklodextrinuf - - - .
US patent č. 4 983 586 uvádí způsob snižování výskytu sraženiny z liofilní léčivé látky a/nebo léčivé látky nestálé ve vodě, která.se vyskytuje v místě injekce, pokud se léčivá látka podává parenterálně, a zahrnuje podání léčivé látky ve vodném roztoku, který obsahuje přibližné od 20 do 50 % hydroxypropyl-p-cyklódextrinu.. Je popsáno :jeho použití pro .. velký počet léčivých látek, mezi které se zahpnují sedativa, transkvilizéry, iršíz;:'. *'·.-/ · hypnotika, látky způsobující proti-křečím, — 1-á-tký “působící kardiotonika,. vašodilatátory; · antineoplastické léčivé látky,
- i’ '.·< Ϊ * Ί « .i. ' ,, x *4 antikonvulziva, antidepresiva,$ relaxaci svalů, -látky působící proti zánětům, antikoagúlanty.,.
a antiarytmika.
Podstata vynálezu
S překvapením bylo nyní nalezeno, že lyofilizované parenterálni prostředky, které obsahuji konjugovaný nízko diolový polyalkylenoxid a fyziologicky aktivní protein nebo polypeptid v komplexu a cyklodextrinem, skýtají stálost po dobu skladování prostředků bez intermolekulární agregace..
Tak se dostávají stabilní parenterání prostředky z fyziologicky aktivních proteinů kovalentně vázaných k nízko diolovému polyalkylenoxidu (zde dále’nékdy též označovanému ’ jako LDPAO), výhodně nízko diolovému polyethylenglykolu
Ί (zde dále někdy též označovanému jako LDPEG), který je ve formě komplexu s cyklodextriny.
Tento vynález proto poskytuje vodné fyziologicky aktivní bílkovinné prostředky pro lyofilizaci, které obsahují
Ϊ 1 od přibližné 150 do zhruba 150 000 jednotek na ml (U/ml) kovalentně vázaného nízko diolového polyalkylenoxidu na protein, od přibližně 0,1 do zhruba. 20 % hmotnostně objemových cyklodextrinu a od přibližně 0,01 do zhruba 50 mmol pufru, přičemž tento prostředek má hodnotu pH do přibližně 5,7 do zhruba 6'5’ -.TV,. < .1. : \ 'Λ. '
Při výhodném provedení prostředek obsahuje od přibližně 25 000 do zhruba 150 000 jednotektna ml, výhodněji od přibližně 50; 000 do zhruba 150 000 jednotek na ml polyalkylenoxidu na proteinu a .od přibližně 1,0 do zhruba 15 l .
% hmotnostně objemových, výhodně od přibližné 5 do zhruba 10 % hmotnostně objemových cyklodextrinu.
Pokud se.zde.používá výrazu nízko diolový s ohledem,na.polyaíkylenoxid, jako je polyethylenglykol, vztahuje se k přímému polyalkylenoxidu, který neobsahuje více než přibližně .10·% nemonoalkoxylovaného polyalkylenoxidu, výhodně nemonomethoxylovaného polyethylenglykolů.
Výhodné nízko diolové polyalkylenoxidy používané podle tohoto vynálezu jsou s výhodou polyethylenglykolové polymery, které obsahuji ne více než 10 % hmotnostních nemonomethoxylovaného polyethylenglykolů a mají průměrnou molekulovou hmotnost od přibližně 1000 do zhruba 15 000 daltonú, které jsou zvláště vhodné ke kovalentnimu připojení k biologicky aktivním proteinům, zvláště k hyperoxiddismutase. Výhodněji polyethylenglykoly o průměrné molekulové hmotnosti od přibližně 2000 do zhruba 10 000 daltonů, Obzviáště-výhodně—od-při-bi‘ižné-+000-d,o-2hruba—e-OGO-da-it-o-nů-se· používají podle tohoto vynálezu, když polyethylenglykol výhodně obsahuje méně než přibližně 7 % hmotnostních a obzvláště výhodně měně než asi 5 % hmotnostních nemónometnyiovaného polyethyienglykolu.
_· „ Bio logickýma /nebo, fyziologicky. aktivní,, proteiny, polypeptidy a hormony, používané podle tohoto vynálezu, zahrnuji -rekombinantní lidský interleukin-4 (rhuIL-4), protéasu Subtilisiň Cařlsberg, hyperoxiddismutasy, jako jsou hovězí, lidské a různé „ rekombinantní hyperoxiddismutasy, jako rekombinantní lidskou hyperoxiďdismútášu (řhuSOD) a ' oxidoredukťasýtr“traňseferasy/hydrolasy, lýašýy isomeřásý ' a ligašý, jako jsou uvedeny, výše'a kromě peptidovýčh: hormonů uvedených? výše, také tyto látky:
interferony (α-, β- a τ-), protilátky (IgG, IgE, IgM, IgD), interleukiny 1, 2, 3, 4 a 7, faktor stimulující 'granulocytové kolonie (GCSF), faktor stimulující granulocyt-makrofagové kol-onie (GM-CSF), faktor nekrosy tumoru (TNF), růstový faktor odvozený od krevních destiček (PDGF), epidermální růstový faktor (EGF), nervový růstový faktor (NGF), kostní růstový faktor (BGF),faktor uvolňující růstový hormon (GHRF), papain, chymotrypsin, thermolysin, streptokinasa a aktivasa.
Cyklodextriny používané podle tohoto vynálezu jsou a-cyklodextriný, β-cyklodextriny a τ-cyklodextriny, které sestávají ze 6, 7 nebo 8 glukózových jednotek. Tyto sloučeniny jsou známé v oboru a bylo zjištěno, že mají schopnost tvořit obsažné komplexy s určitými léčivými látkami, proteiny a polypeptidy a máji průvodní jev projevujíci se solubilizačni vlastnosti.
Vnitřní dutina cyklodextrinu je liofilni, zatímco vnější část cyklodextrinu je hydrofilní. Pro tyto vlastnosti se cyklodextriny používají při přípravě obsažných komplexů s farmaceutickými prostředky. Za účelem stabilizace konjugátu nízko diolových polyalkylenoxidů s proteiny jsou zvláště vhodné fiydroxyethylóvé, hydřbxypropylové, glukosýlóvé, maltosylové a maltotriosylové deriváty β-cyklodextrinu.
Farmaceuticky přijatelné vodné nosné látky.používané podle tohoto vynálezu, tvoří netoxické inertní prostředí, ve.. . kterém se rozpouští komplex konjugátu cyklodextrinovaného nízko diolového polyalkylenoxidů s peptidem a farmaceuticky přijatelného pufru, jako je fosforečnan sodný, octan sodný, uhličitan sodný a pufr odvozený od minerálních nebo organických kyselin. Farmaceuticky přijatelnými pufry se míní, že pufry jsou relativně neškodné pro organismus savce, v dávkách, v jakých se pufr používá v lékařství, takže příznivé vlastnosti aktivního komplexu nejsou poškozeny vedlejšími účinky připisovanými pufrům.
. Při způsobu přípravy prostředků podle tohoto vynálezu se nejprve nízko diolový polyalkylenglykol, zde představo- , váný polyethylenglykolem, kovalentně váže k biologicky aktivnímu proteinu, jak je znázorněno schematicky: > .
i . s -t
a) LDPEG + karboxylační činidlo -> LDPEG-COOH *
b) LDPEG-COOH + činidlo aktivující karboxyskupinu ->
aktivní ester LDPEG-COOH
c) n (aktivní ester LDPEG-COOH) + protein ->
(LDPEG-CO)n-protein ve kterém
LDPEG-COOH znáči nízko diolový polyethylenglykol, který je karboxylován v místě hydroxyskupiny a n představuje počet míst připojení nízko' diolového polye-thylenglyk-olu k proteinu.
Nízko diolový polyethylenglykol se karboxyluje v místech hydroxyskupin, poté se karboxyskupiny esterifikuji činidlem aktivujícím karboxyskupinu za vzniku aktivních esterů, které se potom váží k molekule proteinu.Počet molekul -nízko diolového.polyethylenglykolú. připo jených......' k proteinu se bude měnit podle počtu' reaktivních· skupin-; jako jsou aminoskupiny, přítomných v molekule proteinu. .: ‘ .
’ ~ “Nizko*diolový''pblýěthýleng-lýkbl ’šě* v potom' rozpustí” vé” farmaceuticky přijatelné vodné'nosné látce, poté se přidá a rozpustí' požadovaný cyklodextrin.. .Roztok se .potom .suší vymrazováním v lyof-ilizéru. Lyofilizovaný roztok serekonsti tuuje sterilní vodou před svým podáním pacientovi.
Jiný znak tohoto vynálezu skýtá způsob přípravy lyofilizovaného biologicky aktivního bílkovinného prostředku, který zahrnuje stupně spočívající v tím, že se
á) karboxyluje polýalkýlenoxid obsahující méně než 10 % hmotnostních nemonoalkylovaného polyalkylenoxidu, *
t
b) .tento karboxylovaný polýalkýlenoxid aktivuje k dosažení aktivního esteru polyalkylenoxidu,
c) tento aktivní ester polyalkylenoxidu kovalentně připojí k biologicky aktivnímu proteinu,
d) tento kovalentně připojený ester polyalkylenoxidu a tento biologicky aktivní protein solubilizuji ve vodném * prostředí,
e) cyklodextrin solubilizuje v tomto vodném prostředí k dosaženi homogenního roztoku, ”f) tento roztok pufrujé'na hodnotu pH oď přibližně 5,7 do zhruba 6,5 a
g) roztok lyofilizuje. .
Vynález je dále popsán ve zvláštní’ souvislosti s hyperoxiddismutasou (zde dále také někdy označovanou jako SOD). , • - . . . ... s .1 »
Hyperoxiddismutasa je intracelulární enzym, který je, přítomný ve všech buňkách metabolizujících kyslík a je : odpovědný za katalytickou konverzi hyperoxidového radikálu na kyslík a peroxid vodíku. U hyperoxidového radikálu a druhů odvozených od něho se předpokládá, že je činidlem působícím v příčinné souvislosti s široce různorodými zánětlivými onemocněními. Hyperoxiddismutasa se používá k ošetřování určitých zánětlivých stavů pod ochrannou známkou Orgotein. Kromě toho bylo zkoumáno použití hyperoxiddismutasy pro břonchopulmonárni dysplasii a hyperbarickou toxicitu kyslíku, akutní zánět vyvolaný hořením a infekci, reperfusní poraněni po transplantaci orgánů, retrolentálni fibrinoplasii, vedlejší účinky terapeuticky ionizačního ozařováni a určité dermatologické stavy. Pokud se však hyperoxiddismutasa podává intravenózní injekcí savci, poločas existence enzymu je pouze několik minut a poté vymizí z cirkulace. Výsledkem je, že enzymatická aktivita není dostačující k odstraněni toxických látek z krevního řečiště. Opakované podáváni je naproti tomnu příčinou nepříznivých reakci. * *·
NrzkonďiOTový-pOTya^kyrenPxíd^VsáhujÝcí^řetě^zce polyalkylenoxidu o proměnné molekulové hmotnosti a obsahující přinejmenším jednu hydroxyskupinu na řetězec, jako nízko diolový polyethylenglykol, se váže k hyperoxiddismutase za *· ΓΓ. · ’ vzniku bi-ologicky aktivního prostředku, který má delší poločas existence a má menši imunogeničnost než bud přírodní .hyperoxiddismutasa nebo prostředek obsahujíci^pQlyalkylenoxid a hyperoxiddismutasu. Po lyof ilizaci nízko diolový polyethylenglykol vytváří nežádoucí agregáty, které mají ___nepříznivý vliv_na jeho biologickou aktivitu. Jejich komplexaci s cy.klodextrinem se eliminuje vznik agregace a zjistí se, že rekonstituovaný prostředek, je stabilní po prodloužený čas skladoyatelnosti.
Způsob vázáni nízko diolového polyethylenglykolu k hyperoxiddismutase (zdě'dále. též .někdy, označovaný jako LDPEGace) zahrnuje stupně,* které spočívají v tom / že se nízko diolový methoxypolyethylenglykol, který má průměrnou' molekulovou hmotnost od přibližně 1000 do zhruba 15 000, 'výhodněji od přibližné 2000 do zhruba 10 000 a zvláště výhodně od přibližně 4000 do zhruba 6000 daltonů, obsahující nevíce než přibližně 10 % nemonomethoxylovaného polyethylenglykolu, aktivuje sukcinylaci za vzniku sukcinátu nízko diolového polyethylenglykolu (LDPEG-S), výhodně působením anhydridu kyseliny’jantarové (SA), poté připraví reaktivní ester, výhodně reakci s N-hydroxysukcinimidem (NHS) za vzniku LDPEG-SS á potom reakcí LDPEG-SS s přístupným reaktivním místem na hyperoxiddismutase,. výhodné zbytkem primárního aminu na hyperoxiddismutase, hlavně lysin-e-aminem.
- 13 Ve vztahu zvláště k LDPEG-SOD se způsob dá vyjádřit takto:
.LDPEG-OH
SA
LDPEG-S
NHS/DCC (LDPEG)n.ibSOD-(S) + LDPEG-OH
HjO
LDPEG-SS· + bSOD(LDPEG)nbSOD + nNHS
LDPEG-SS +' FfeO obs
LDPEG-S + NHS ’<
H2O
LDPEG-OH + SAc ve kterém
LDPEG-OH znamená nízko diolový CH3O-PEG-OH, který- obsahuje • ne více než asi 10 % hmotnostně objemových HO-PEG-Ofr,
LDPEG-S znamená nízko diolový CH3O-PEG-OCOCH2CH2COOH, který . obsahuje ne více než 10 % (HOOC-CH2CH2-COO)2PEG,
LDPEG-SS znamená nízko diolový . . CH3O-PEG-OCOCH2CH2C0O(C4H4NO2), který obsahuje, ne více než 10% [(c4h4ó2N)ooc-ch2ch2coo]2peg,
DCC. znamená dicyklohexyikarbodiimid, bSOD znamená hovězí hyperoxiddismutasu,
NHS znamená N-hydroxysukcinimid (C4H4NO2)OH, ..
(LDPEG)nbSOD znamená nízko diolový (CH30-PEG-OCOCH2CH2CO)n-bSOD, (LDPEG)n_1bSOD-S znamená nízko diolový (CH3O-PEG-OCOCří2CH2CO) n-1- bSOD-COCH2CH2COOH ,
SAc znamená kyselinu jantarovou, n znamená počet ňizko diolových polyethylenglykolú na hyperoxiddismutasu a
Kl, -Kobs, k2 <a k3í představuj i rychlostní konstanty reakcí-..:Nyní bodou popsány základní složky používané v pro.sjtředcjčh..p_odle _tohgtp_ .vynálezu. ___ _ ____
Výchozí látky, meziprodukty a reakční činidla
Hyperoxiddismutasa .
Hyperoxiddismutasa je označeni/dané skupině^enzymů, které katalýzuji rozpad hyperoxidového'anionového radikálu * (02) na kyslík a peroxid vodíku.
s- ‘ · l
Hyperoxiddismutasa je známa podle systematické nomenklatury zpracované International Uriion of Biochěmistry jako hyperoxid oxidoreduktázy a má klasifikační číslo 1.15.1.1. Takové látky se označují jako orgoteiny a hemokupreiny, stejné jako hyperoxiddismutasy a mají rozmezí molekulové hmotnosti od přibližně 4000 do zhruba 48 000. Disamutasy mědi a zinku jsou nápadně Zachovalou skupinou s ohledem ně; souhrnné strukturní vlastnosti. V výjimkou čištěných enzymů se ukázalo, že jde o dimery (molekulová hmotnost obvykle od 31 000 do 33 000), které obsahuji dva. moly ionů jak mědi, tak zinku na mol. Enzymy ze souboru manganu a železa nemají tak c
rovnoměrné základní vlastnosti, jako je molekulová hmotnost, podjednotková struktura a obsahu kovu. Některé z nich jsou dimery a jiné jsou tetramery. Rozmezí obsahu kovu je od přibližně 0,5 do 1 mol na mol pod jednotkového polypeptidového řetězce. V přírodě se vyskytující enzymy obsahující zinek' . a měď od savců a jejich funkčně kompetenční analogy a muteiny se pokládají za Zn/Cu hyperoxiddismutasu savců (mSOD), . J
V prostředích podle tohoto vynálezu mSOD může být libovolného původu. V průmyslovém měřítku se tato látka, dostává z hovězích erythrocytů a lidských erýthřócyťů, stejně jako rekombinantní syntézou v mikroorganizmech, jako je Escherichia coli a kvasinky. Mezi jinými zdroji je dostupná Zn/Cu hyperoxiddismutasa z jater, hovězího dobytka (SOD, EC 1.15.1.1), například dostupná u firmy DDI Pharmaceuticals,,. Inc..(Mountain View, Kalifornie, USA).
Polyalkylenoxid, zde jako přiklad uveden polyethylenglykol
F · . ,'···.’ , * · 1 · J
Při provádění tohoto vynálezu se nízko diolový polyethylenglykol výhodné používá pro vázáni k biologicky aktivním proteinům. I když methoxypolyethylenglykoly o určité molekulové hmotnosti jsou dostupně na trhu (například 1 'methoxypolyethylenglykol o molekulové hmotnosti 5000 se dostane u firmy Union Carbide Corporation ve dvou formách: běžně dostupný vysoce diolový methoxypolyethylenglykol o molekulové hmotnosti 5000, který obsahuje od 14 do 17 % vysoko molekulárního polyethylenglykol-diolu a nízko diolový produkt, který obsahuje méně než 4 % polyethylenglykol-diolu), někdy se vyžaduje připravit a vyčistit za účelem produkce speciální protein (pegated protein), který má nízkou imunogenetičnost. Například taková speciální úprava hyperoxiddismutasy s methoxy-PEG-SS odvozeným od určitých komerčních zdrojů vede k produktu, který obsahuje složky o vysoké molekulové hmotnosti, jak se ověří vylučovací chromatografií.
Tento produkt o vysoké molekulové hmotnosti se pokládá za odvozený od proteinu zesítujícího aktivovaný diester, který vznikl z různých množství polyethylenglykol-diolů nacházejících se v komerčně dostupných zdrojích M-PEG. Jednotlivé “akťivnl^^steryT-tře'ba;že-umlstěné~na~stejném“poi-ymerní-m--— řetězci, jsou přesto navzájem chemicky vzdálené. Také přítomnost sekundární reaktivní funkcionality v polymeru má sklon uplatnit stoupající měrou pominutelný účinek na ' reaktivitu první reaktivní funkcionality. Jednotlivé reaktivity tak mají sklon být nezávislé na skupinách přítomných na obrácených koncích polymerního řetězce ..a zesiéování se Lneiňusi... vyhnout, pokud nejsou přítomna reakční činidla v nekonečném • - > . ,4 zředěni. Je proto důležité syntetizovat’známý M-PEG-SS tak, .aby obsahovat velmi malá množství diesteru, výhodně aby___ nebylo přítomno žádné množství diesteru. Ξ. Zalipský a kol. v Journal of Bioactive and Compatiblé Polymers ,/5, 227-231 /duben 1990/ popisuje čištěni polyethylenglykolu' Ó molekulové hmotnosti 2000 od methoxypolyethylenglykolu o molekulové hmotnosti 2000. Také se připravuji suke i ná ty ér je ‘předvedeno děleni ionoměničovou* chromatograf ií'na DEAE-Sephadexu'.*'
- ri*
Preparativní metoda je uvedena v přikladu 3.
I když v přípravě popsané v přikladu 3 se pracuje dobře s polyethylenglykolem o molekulové hmotnosti 2000, ' způsob selhává při vyšši molekulové hmotnosti polyethylenglykolů. Vyšší molekulová hmotnost polyethylenglykol-kyselin nevede k navázáni na anionové nebo kationové pryskyřice. Předpokládá se, že větší hmotnost polyethylenového hlavního řetězce maskuje jakékoliv ionové vlastnosti zavěšené kyseliny. Bylo nalezeno, že pro vázání sukcinátů polyethylenglykolu je vyžadován pufr o mimořádně nízké ionové síle a že tyto látky se eluují při velmi nízkém zvýšeni ionové sily, co ukazuje, že je pryskyřice pouze velmi slabě drží.
Bylo nalezeno, že methoxypolyethylenglykoly o vyšši molekulové hmotnosti se mohou oddělit od diolových složek, pokud se hydroxylové funkcionalita nejprve převede na dimethoxytritylethery (DMT-ethery), před aplikací reversní fáze při chromatografií na tenké vrstvě. Hydroxyskupiny se mohou uvolnit zpracováním,s kyselinou.
Schematické znázorněni přípravy a čištěni derivátů dimethoxytritylmethoxypolyethylenglykolu o molekulové hmotnosti 5000 (M-PEG-DMT) se uvádí dále. Detaily jsou uvedeny v příkladech 4 až 7. . > Dimethoxytritylmethoxypolyethylenglykol a DMT-PEG-DMT se připravuji shodným způsobem. Polyether.se rozpustí v chloroformu zbaveném ethanolu a roztok sé vysuší oddestilováním přibližně poloviny chloroformu za atmosférického tlaku pod argonovou atmosférou..Roztok se potom nechá, ochladit na teplotu místnosti pod argonovou atmosférou^a potě se postupně přidá přebytek diisopropylethylaminu (i, 5 .ekvivalentu) % molárních 4-dimethylaminopyridinu jako katalyzátoru a nakonec přebytečné množství (1,2 ekvivalentu) 4,4-dimethoxýtritylchloridu. Po reakci v trváni. 15 hodin se roztok odpaří,na rotační odparce a k roztoku se potom přidá bezvodý ether k vysrážení tritylovaného polyethylenglykolu. Regulární ~rfáze při chromatografií na-tenké vrstvě čisté oddělí výchozí látku-; od produktu a polyethylenglykolový hlavní řetězec se vystaví Dragendorfovu činidlu, aby vznikla skvrna. I když dimethoxytritylmethoxypolyethylenglykol se nedá rozlišit od DMT-PEG-DMT na regulární fázi při chromatografií na tenké vrstvě, reversní fáze C-18 na deskách pro chromatografií na tenké vrstvě čistě navzájem oddělí' dimethoxy tritylmethoxypolyethylenglykol, DMT-PEG-DMT, dimethoxytritylchlorid a dimethoxytritylalkohol (mobilní fázi tvoři soustava acetonitrilu, vody a isopropanolu v poměru 4:1:1). Polyethylenglykolový hlavni řetězec je potvrzen vznikem oranžové skvrny působením Dragendorfova činidla a zavedeni tritylu se potvrdí
- 1« tim, že se deska vystaví parám kyseliny chlorovodíkové, které poskytnou oranžovou skvrnu.
Autentický vzorce dimethoxytritylmethoxypolyethylen-g-l-yko-lu-o-mo.lekul.o.v.é_hmo.tnos.ti„5.0O.Q„s.e„p.r.OLjéx.u.j.é_.č.istým___ oddělením od autentického vzorku DMT-PEG-DMT' 8000' na patrone Waters c-8 s velkosti pórů 30 μη a Prep-Bak Bondapak s velikosti pórů 15 až 20 μη. Surový dimethoxytritylmethoxypglyéthylenglykól se rozpustí působením ultrazvuku ve 30 % vodném acetonitrilu na koncentraci přibližně 12 mg/ml a vede filtrem_ s otvory o velikosti 2,5 μπι. Vzorek se vnese na kolonu (2 g ve 25 ml) v 30% vodném acetonitrilu, který tvoří mobilní fázi. Po 8 minutách isokratického eluování se eluuje kontaminující pík (neznámého složení, který má vysokou absorbanci při vlnové délce 280 nm, ale vypočte se velmi nízká -relativní hmotnost). Poté následuje gradientově eluování s 30% . áž 70% vodným acetonitrilem během 21 minuty ·*-* ' ' 5 ·-· ·.··· · - .......
a požadovaný dimethoxytntylmethoxypolyethylenglykol se Λ ‘··*._ \ i ÍT?V 'Λ-γ ·. ' J - , eluuje při obsahu 58 až 60 % acetonitrilu. Autenticky vzorek
DMT-PEG-ĎMT~se běžně ' eluuje; 80%’;acetonitriTem. -První 3/4 objemu, při požadovaném piku se zachytí a poslední 1/4 se odloží; Tímto způsobem se vyčistí 15,4 g dimethoxytritylmethoxypólyethýienglykol z 22,6 surového dimethoxytritylmethoxýpólyeťhýlenglýkolu.
Tritylové štěpení dime thoxýtr i ty lmethoxypolye thy lenglykolu se provádí takto:
Pokusné odstranění dimethoxytritylové skupiny z dimethoxytritýlmethoxypolyethy lenglykolu působením kyseliny chlorovodíkové vede při chromatografii na tenké vrstvě (za použití surové nezředéné reakční směsi) k úplnému odstraněni tritylové skupiny. Odpaření chloroformového extraktu však vede ke zpětné reakci, jejímž výsledkem je opětovná tritylace významné části polyethylenglykolů. Selektivním vysrážením není možné provést vyčištěni této sloučeniny. Hydratovaný tritylový kation a chlorid jsou zřejmě v rovnováze, z čehož vyplývá, že dehydratace, která nastává .béhera odstraňování rozpouštědla, způsobuje vznik významných množství dimethoxy- tritylchloridu. Této znovu probíhající tritylaci se může zabránit použitím neekvilibrovaného opačně, nabitého ionu.
Ukazuje se, že kyselina sírová vede k nevratné detritylaci dimethoxytritylmethoxypolyethylenglykolu. Methoxypolyethylenglykol odštěpený působením kyseliny sirové se extrahuje Chloroformem, odpaří a sráží etherem za vzniku čistého . . / .
methoxypolyethylenglykolu s obsahem diolu blížícím se nule.
Tímto způsobem se 10 g dimethoxytritylmethoxypolyethýlenglykolu rozštěpí na 8,68 g methoxypolyethylenglykolu s obsahem diolu blížícím se nule. Vylučovací chromatograf ie 'úkazu je,^že tento materiál obsahuje méně než 0,3 % diolu.
Jiné methoxypolyethylenglykolové deriváty o vyšší n .;·« molekulové hmotnosti se mohou vyrobit analogickým způsobem..
Příklady provedeni vynálezu e fi’ ' ‘ ;$ » * ·' 1 ‘
Vynález nyní bude popsán v souvislosti s příklady uvedenými dále, které ilustruji přípravu konjugátů nízko diolových polyethylenglykolu s proteinem za vzniku komplexu s cyklodextrinem, ale žádným způsobem nemají být pokládány za. omezeni vynálezu. s
Příklad 1 .
A. Způsob přípravy sukcinátu methoxypolyethylenglykolu (M-PEG-S) v dvoulitrové baňce se rozpustí 100 g (0,02 mol) methoxypolyethylenglykolu (M-PEG) o molekulové hmotnosti 5000 za míchání ve 300 ml teplého (o teplotě 40 ’C) bezvodého toluenu. Z roztoku se azeotropicky odpaří 147 ml toluenu pod dusíkovou atmosférou, aby se snížil obsah vody v methoxypolyethylenglykolu z hodnoty 1,73 na 0,23 %. Po ochlazeni na teplotu místnosti se přidá 233 ml suchého methylenchloridu, potom 3,0 g (0,09 moly'ahhydFi'duJký’sélTny~jan'tárové~a'“r7l g (0,01 mol) 4-dimethylaminopyridinu (DMAP). Reakčni směs se míchá a vaří pod zpětným chladičem přes noc a poté se odpaří 200 ml methylenchloridu za sníženého tlaku. Odparek se vnese za míchání do 1,6 litru .etheru ve čtyřlitrové baňce. V mícháni se pokračuje po dobu 45 minut a nato se reakčni směs filtruje. Filtrační koláč se promyje-7.0 ml· etheru a vysuší, za sníženého tlaku, aby se dostalo 100,4 g surového sukcinátu methoxypolyethylenglykolu (M-PEG-S), jako bílé tuhé látky,
-která obsahuje 4-dimethylamiňopyridin..
100 g surového sukcinátu methoxýpolyethylenglykolu se rozpustí v 633 ml methylenchloridu a vede kolonou obsahující 114 g pryskyřice Dowex 50x8-100H+která býla předtím promyta 272 ml dioxanu a poté 316 ml methylenchloridu. Sloupec šé‘ ’ potom promyje dalšími 316 ml methylenchloridu a eluenty se spojí a vysuší bezvodým síranem hořečnatým’.' Za sníženého tlaku se odpaří 800 ml methylenchloridu. Zbývající roztok se přidá za míchání do 1600 ml etheru y baňce o objemu 4000 ml. Vše se míchá .po*dobu 30 minut, suspenze se poté nechá stát během 30 minut a nato se filtruje. Filtrační koláč se potom promyje 75 ml .etheru a vysuší za sníženého tlaku. Tak se dostane 96,0 g sukcinátu methoxypolyethylenglykolu (výtěžek odpovídá 94 % teorie), jako bílé tuhé látky, která má toto protonové NMR spektrum shodné s přiřazenou strukturou:
'H-NMR spektrum (CDCl^): δ 4,27 (triplet, 2H, -CH2-O-C(=O)-), 3,68 (široký singlet mimo měřítko, skupiny PEG-methylen-O-CHj-), 3,39 (singlet, 3H, OCH3) a 2,65 ppm (úzký multiplet, 4H, -C(=O)-CH2-CH2-C(=O)-).
Obsah karboxylové kyseliny 0,000 207 mol/g změřen titraci.
B. Způsob připarvy N-sukcinimidylsukcinátu methoxypolyethylenglykolu (M-PEG-SS) , / .
j
V dvoulitrové baňce se rozpustí 98,48 g (0,0192 mol) sukcinátu methoxypolyethylenglykolu (m-PEG-S) v 468 ml suchého toluenu při zahříváni na teplotu 40 °C. Roztok se filtruje a objem filtrátu se sníží o 263 ml azeotropickou destilaci pod dusíkovou atmosférou. Výsledná viskózni kapalina se přenese do jednolitrové trojhrdlé baňky pod dusíkovou atmosférou za použitř'225 ml suchého methylenchloridu.
K vzniklé reakční směsi se přidá 2,22 g (0,0192 mol) N-hydroxysukcinimidu a reakční směs se míchá dokud se rozpouští •Vri .7. . -.1}
N-hydroxysukcinimid. Reakční směs se potom ochladí na teplotu '·*
- i-’·'- - ' t ‘ ,1 ď:
5,.‘C,,v: ledové lázni a během 5 minut se přikape roztok 4,44 g ..(0,0125 .mol) .dicyklohexylkarbodiimidu se'24 ml methylenchloridu. .Během přidávání roztoku dicyklohexylkarbodiimidu v methylenchloridu.. začne z reakční směsi krystalovat ' ' * ' r ' ' .· ·'. .’ . ' . « dicyklohexylmočovina (DCU). Reakční směs se nechá ohřát na
..... . * > \ teplotu..místnosti a míchá přes noc. Obsah reakční baňky se přenese do baňky.o objemu 2 litry při použiti 25 ml methylenchloridu k vypláchnuti baňky. Za teploty 30 ’C se při sníženém tlaku odpaří 250 ml methylenchloridu, suspenze se filtruje a filtrační koláč se promyje 25 ml suchého toleunu.
Filtrát se poté vnese do 1,2 litru bezvodého etheru za míchání a výsledná suspenze se míchá po dobu 45 minut před h » filtraci. Filtrační koláč se propláchne 100 ml suchého etheru w
a suší pod přepážkou z kaučukového latexu po dobu 2 hodin.
Výsledná tuhá látka se poté vysuší za sníženého tlaku a ,přenese do nádoby umístěné v rukavicovém pytli naplněném argonovou atmosférou. Tak se dostane 96,13 g sloučeniny pojmenované v nadpise (M-PEG-SS) (výtěžek odpovídá 96,1 % teorie), jako bílé tuhé látky, která má toto protonové NMR spektrum shodné s přiřazenou strukturou:
1H-NMR spektrum <CDC13): $ 4,3 2 (triplet, 2H,
-CH2~O-C(=0)-), 3,68 (široký singlet mimo měřítko, skupiny -PEG-methy-l-en-O-GH^—)-,-3-,-3-9^(-si.ng-le-t7^3.H.,_OCH3J-,_2.,.9.9_a„2.,^0_(.pár tripletu, každý 2H, sukcinát, -Čí^j-ČH^CHj-Ct =Oj'-j ”a7 2',85 ppm (singlet, 4H, sukcinimid, -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-).
Obsah aktivního esteru v produktu se stanoví reakcí s přebytkem benzylaminu v toluenu s následující zpětnou titrací kyselinou.chloristou v dioxanu do konečného bodu methylové červeně a stanoví se, že odpovídá 0,000 182 mol/g'.
C.. Způsob přípravy nízko diolové polyethylenglykolhyperoxiddismutasy (PEG-SOD) ’-r* ·.
11,8 g vodného roztoku hyperoxiddismutasy-, který obsahuje 82,1 mg proteinu na gram, se zředí na celkový objeni 200 g 0,1-molárnim roztokem fosforčenanu sodného, 'jako'pufrem ' o^hodhótě’ píT 77-8řK ‘tomuto :roztoku se“při^magnetickém-mícháni - a zahříváni na teplotu 30 ‘C -přidá 3,4 g nizko diolového: N-sukcinimidylsukcinátu methoxypolyethylenglykolu,' připraveného v příkladu IB. Hodnota pH reakční směsi se udržuje 7,8 za použiti tútrátoru Mettler DL25, programovaného na způsob udržování hodnoty pH, přidáváním θ/5-normálního'roztoku hydroxidu sodného podle potřeby. Po 1 hodině se reakční směs filtruje přes filtr o velikosti otvorů 0,2 μια s polysulfonovou náplní pojenou proteinem o nízké molekulově hmotnosti, zahustí se na objem přibližně 60 ml za použití zařízení z' nerezavějící oceli Millipore Mini-tan, vybaneného membránou 30 000 NMWL 4 pk a poté se podobí diafiltraci proti 2 litrům 50 mmol roztoku chloridu sodného pufrovaného fosfátem (0,85 %) při hodnotě pH 6,2 až 6,3. Dialýzovaný roztok obsahující nízko diolovou polyethylenglykolhyperoxiádismutasu’ se potom filtruje přes filtr s velikostí otvorů 0,2 μιη.
Přiklad 2
A. Způsob přípravy sukcinátu momomethoxypolyethylenglykolu
Do tříhrdlé baňky o objemu 12 litrů se vnesou 4 litry toluenu a 2 212 g methoxypolyethylenglykolu, které jsou předem zahřátý na teplotu 70 ’C, pod dusíkovou atmosférou. Z objemu se azeotropicky odpaření 1,3 litru toluenu za sníženého tlaku. Po ochlazeni na teplotu 30 *C se přidají 4 litry methylenchloridu a potom 66,4 g anhydridu kyseliny jantarové a 24,4 g 4-dimethylaminopyridinu. Reakční směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 32 hodin a nato se odpaří 3,8 litru methylenchloridu za atmosférického tlaku. Reakční směs se ochladí a vylije za míchání do demižonu o objemu 32 litrů ze skla, který obsahuje 28 litrů methyl-terc.-butýlětheru. . 7 . . . .
Výsledná suspenze se míchá po dobu 1 hodiny a pevný podíl se zachytí na filtru Lapp. Filtrační koláč se promyje 1 litrem methyl-terc.-butyletheru. Vysušením zá’sníženého'tlaku přes' * ’ . i .. t.
noc při teplotě místnosti se dostane 2,252 kg sloučeniny pojmenované v nadpise, kterou tvoři surová bílá látka......
. 1 . .-i
Surová sloučenina pojmenovaná v nadpise se rozpustí v 8 litrěch methylenchloridu a vede skleněnou tlakovou kolonou, která obsahuje 3,0 kg pryskyřice Dowex 50W-X8 (kationoměničová pryskyřice, v H+ formě), která byla předtím promyta 5 litry acetonu a poté 4 litry methylenchloridu.
Kolona se potom promyje 3 litry methylenchloridu. Eluenty získané z kolony se spoji a 10 litrů methylenchloridu se odpaří za atmosférického tlaku. Zbývající roztok se vylije do 26 litrů methyl-terc.-butyletheru za míchání. Výsledná suspenze se míchá po dobu 45 minut a tuhá látka se odfiltruje. Zachycená látka se promyje 3 litry methyl-terc.-butyletheru. Vysušením ve vakuové sušárně za teploty místnosti se dostane 2,46 kg sloučeniny pojmenované v nadpise, jako bílé tuhé látky. Výtěžek odpovídá 95 % teorie. Tato látka obsahuje 1,5 % methoxypolyethylenglykolu a obsah je stanoven při 2,72 x 10~4 mol/g (teoretická hodnota je 1,96 x 10“4 mol/g).
Bt—Způsob-př-ipravy-N-stike-ih-i-mí-dyi-sukG-Mátu-me^he-xypoiyethys— lenglykolu
V baňce o objemu 12 litrů se rozpustí pod dusíkovou atmosférou 1,5 kg sukcinátu monomethoxypolyethyíenglykolu v 7,2 litrech toluenu při zahřívání. Objem roztoku se odpaří jo.2,8. litrů za sníženého .tlaku k odstraněni vody. Výsledná viskózní kapalina se ochladí na teplotu 40 až 45 ’C a poté se přidá 3,4 litru methylenchloridu a nato 33^89 g N-hydroxysukcinimidu. Reakčni směs se míchá po/dobu l;hodiny až se veškerý N-hydroxysukcinimid rozpustí, potom se reakční směs ochladí ná teplotu 10 °c a během 30 minut še přikape ro2tok'.
67,75. g dicyklohexylkarbodiimidu. v 368 ml methýlenčhloridů.ý Reakční směs se nechá pomalu ohřátna teplotu místnosti při míchání po dobu Ϊ8 hodin. Objem. reakčni’směs i'še “odpaří ΐ o 3,2 litru rozpouštědla zaTsnížéného'tlakuSuspenzeše*· ' ochladí na teplotu Ó až 5 ’C λ míchá po dobu 30 minut. Poté“ se reakční směs filtruje a filtrační koláč'sě promyje 250 ml toluenu. Filtrát a promývací kapalina se přidají k 28 litrům methyl-terc.rbutyletheru za mícháni. Výsledná suspenze se míchá po dobu 45’minut a poté filtruje na filtru Lapp. 1 Filtrační koláč se promyje 1 litrem methyl-terč.-butyletheru a suš i pod latexovou přepážkou po dobu 4 hodin. Dalším sušením za teploty místnosti ve vakuové súšárně při sníženém tlaku přes noc se dostane 1,5 kg bílé tuhé látky. Výtěžek odpovídá 100 % teorie. Táto látka se stanovuje'přř 1,79 x 104 mol/g (teoretická hodnota je 1,92 xío’4 mol/g).
C. Způsob přípravy hovězí methoxypolyethylenglykolsukcinoylhyperoxidďismutasy
Κ 32 litrům teplého (o teplotě 29 až 30 °C) fosfátového pufru o hodnotě pH 7,8 v reaktoru Ό objemu;42 litrů, obsahujícím elektrodu ke stanovené hodnoty pH, se přidá 194,0 g hyperoxiddismutasy z červených krvinek hovězího dobytka.., Objem reakčni směsi se upraví na 39,5 litrů a vše se zahřívá na teplotu 29 ’C. Trubice k dávkování hydroxidu sodného z titrátoru k úpravě hodnoty pH se umísti do středu reaktoru, přímo nad povrch roztoku. Titrátor k úpravě hodnoty pH se uvede dó chodu a hodnota pH se upraví na 7,8 přidáním 0,5-normálniho roztoku .hydroxidu sódného.,, V . té. době se během 2 minut přidá 614,7 g N-sukcinamidylsukcinátu methoxypoly-. ethylenglykolu a reakční směs se.míchá, po ,dobu 41 minuty, přičemž hodnota pH sé/upravu je na’7,8. přidáváním 0,5-normálního roztoku hydroxidu sodného při reakčni teplotě udržované na -30 ?C. .Reakčnii;směs se. potom .filtrujerfiltrem 20Millipak a -zahustisza^použiti diafiltračniho^systému z nerezavějícíoceli, označeného .jako Millipore. Pellicon. Reaktor se potom propláchne.600.ml/fosfátového pufru ohodnotě pH 6,2. Pufr —' -.·< -i·.....*----.. ~ *řt.í -.šiTé.-; t '.I..·-, ,· .
použitý'k^propláchnutí se přidá ke,koncentrátu, po filtraci, filtrem .Millipore 200 a k.diáfiltračnimu,systému. Konečný
- · * ' ' ' ’ -r .·,»· ' 1,5.' · . * '. ' <“ * ' ·ν -» objem filtrátu činí přibližně 9,litrů. Koncentrát se.potom,· diafiltruje za použiti diafiltračniho systému Millipore Pellicon proti 200.litrům fosfátového pufru o hodnotě pH 6,2 během 2,17 hQdin. Diafiltračni systém se propláchne 1,5 litru fosfátového pufru o hodnotě pH 6,2. Konečný objem koncentrátu je přibližně 8 litrů. Koncentrát se potom vnese do demižonu ·> t o objemu 32 litrů ze skla přes filtr Millipore 200 Millipak a filtr se propláchne 500 ml fosfátového pufru o hodnotě pH 6,2. Tento postup poskytne 11,98 kg (výtěžek odpovídá 91,4 % teorie) sloučeniny pojmenované v nadpise, kterou tvoří čirý modrý roztok s odstínem do zelena. (Aktivita je 32 960 jednotek na mililitr.)
Příklad 3
Zb
A. Způsob přípravy částečně karboxymethylovaného polyethylenoxidu g (25 miliekvivalentů OH) polyethylenoxidu o-mo-l-eku-love—hmos-tnos.ti_2.0.0O_(T-luka.)_s.e__t.o.zp.us;ti ve 120 ml toluenů a azěotřopicky^šuší,'7’ dókud^š^ v“Děan-Stárkově jímacím přídavném zařízeni ještě ukazuje voda (odpaří se přibližně 25 ml toluenu). Roztok se ochladí na teplotu 50 “Ca zpracuje s‘1,7 g (15~mmol)’terč.-butoxidu draselného. Roztok se uvede' do varu pod zpětným chladičem a oddestiluje se dalších přibližně 25 ml toluenu. Míchaná-reakční směs se ochladí na teplotu 25 ’C a přes noc zpracuje s 3,4 ml (16 mmol) ethyl-bromacetátú. Vysrážené soli-se odstraní gravitační filtrací a promyjí 30 ml methylenchloridu. Polymer se dostane částečně odpařením filtrátu (na objem přibližně 60 ml) a-kolTčě'nťróvwiy roztok:‘se pomalu vylije do 300 ml ethyletheru za teploty 5 ’C při”intenzivním mícháni. Zachycený bílý polymerní prášek se vysuší záJsníženého tlaku. Výtěžek odpovídá 24 g, infračeřvehé spektrum’ (čisté látky) ukazuje charakteristickou?
esterovou *ábsořpci~při- Ί753 - cm1 .Polymer se- rozpusti v i 50 -ml
1-nořmálniho’ roztoku hydroxidu sodného a k roztoku se přidá g chloridu'sodného. -Po přibližně 45 minutách se tento roztok’ okyselí 6-normálního kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH 3 ,.0 a třikrát extrahuje vždy 60 ml methylenchloridu. Spojeně organické fáze sé vysuší síranem hořečnatým, -odpaří na objem přibližně 50 ml- a vyliji na- 300 ml studeného míchaného etheru. Vysrážený produkt se zachytí filtrací . .
a vysuší' za sníženého tlaku. Výtěžek činí. 22 g, infračervené spektrum (čisté látky) vykazuje absorpci při 1730 cm-1, co odpovídá'«s-karboxyskupině. ·* B. Způsob přípravy čistého a-hydroxy-oo-karboxymethylpolyethylenoxidu oddělením částečně karboxymethylovaného polyethylen. . ř. . ......
oxidu na DEAE-Sephadexu
Směs 22 g homo- a heterobifunkcionalizovaného polyethylenoxidu se rozpustí ve 40 ml vody a vnese na kolonu obsahující 27 g (0,1 mol ionoméničových míst) DEAE-Sephadexu A-25 (Sigma) v tetraborátové formě. První frakce obsahující nezměněný polymer se eluuje deionizovanou vodou. Když se eluent začne projevovat negativně při testu kyselinou polyakrylovou (PAA) ke zjištěni zbytkového polyethylenglykolu, postupně se aplikuje ionový gradient hydrogenuhličitanu amonného (od 6 do 22 mmol s přírůstkem 1 až 2 mmol na každých 100 ml roztoku) a frakce se začnou zachycovat (přibližně μ
každých 40 ml)’. Frakce 2 až 21 jsou positivní při testu PAA a obsahuji čistý monokarboxylovaný.polyethylenoxid (R·^ = 0,49). Následující tři frakce neobsahují polyethylenoxid, zatímco., frakce 25 až 36 obsahuji čistou polyethylenoxid-dikyselinu (R·, = 0,26). Frakce obsahující a-hydroxy-«-karboxymethylpolyethylenoxid se spoji a odpaří (na objem přibližné 100 mí). V tomto roztoku se rozpustí 35 g chloridu sodného ’ a roztok se potom okyselí na hodnotu pH 3 á třikrát extrahuje vždy 100 ml methylenchloridu. Spojené methylenchloridové. roztoky se vysuší síranem hořečnatým, odpaří na objem přibližně 100 ml a pomalu vyliji na 500 ml studeného míchaného etheru. Vysrážený polymer se zachytí a důkladně ' vysuší za sníženého tlaku. Dostane se 8,8 g požadovaného produktu. , 13C-NMR spektrum (CDC13): S 172,7 (COOH), 72,4 (CH2CH2OH), 70,4 (PEO), 69,0 (CH2COOH), 61,3 (CH2OH) ppm.
Bis-karboxymethylpolyethylenoxid izolovaný z kolony se také analyzuje.
13C7NMR spektrum (CDC1.3): δ 17 2,4 (COOH), 70,4 (PEO), 68,8 (CH2COOH) ppm.
Příklad 4
Způsob přípravy dimethoxytritylmethoxypolyethylenglykolu
36,3 g (7,26 mmol) methoxypolyethylenglykolu o průměrně móleRulove“Kifíothds'ti'“5000~dal'tOnů~se“rozpus,t-ív 500 ml chloroformu a poté se oddestilu je 250 ml chloroformu k odstranění vody. K baňce se připojí sušicí trubice a roztok se nechá ochladit na teplotu přibližně 50 DC. K roztoku se přidá 1,8 ml (10,3 mmol) N,N-diisopropylethylaminu, poté 100 mg (0,8 mmol, 10 % molárních) 4-dÍmethylaminopyridinu a 2,9 g (98%) 4, 4-dimethoxytr i ty lchloridu. .....
Směs se nechá-míchat přes noc za teploty místnosti ' ‘‘ · J— fc ai λ t ’ a po této době.se rozpouštědlo odpaří na'rotační odparce za teploty 60 ’C. Odparek se vyjme malým'množstvím chloroformu a dimethoxytritylmethoxypolyethylenglykol'' se vysráží “ přídavkem 2 litrů bezvodého etheru. Sraženina se'záchyti, ' vysuší a chromatografuje na koloně naplněné reveřešni fázi C-8 300A prep v systému Waters'LC4000 při'použiti“gradientu s 30 až 95 % acetonitrilu (proti vodě) během 20 minuti
Požadovaná sloučenina se eluuje 58 až:60% aceťonitrilem:' ’
Vzorek o hmotnosti 2 g ve 20 ml 30% vadného acetonitrilu se zavádí na kolonu při rychlosti toku 50 ml/min. Tento eluent (30% vodný acetonitril) se nechá pokračovat'isokraticky dokud se eluuje velký pik nečistot, obvykle po dobu 3 až 5 minut (mv 280 μιη) . Po eluování tohoto prvního piku se zahájí gradientově zpracováni. Následující pik při eluování tvoří požadovaný dimethoxytritylmethoxypolyethylenglykol o molekulové hmotnosti 5000. První 3/4 piku se zachytí a koncová část piku se odloží.
Tímto způsobem se 22,6 g surového dimethoxytrítylmethoxypolyethylenglykolu o molekulové hmotnosti 5000 vyčisti v podílech po 2 g a dostane se 15,44 g sloučeniny pojmenované v nadpise.
Přiklad 5
Způsob přípravy methoxypolyethylenglykolu s nulovým obsahem
V · W- · · ..·.· 5-¾. 1 , ť..
diolu z dimethoxytritylmethoxypolyethylenglykolu T · > '.
g ,dimethoxytritylmethoxypolyethylenglykolu o.molekulové hmotnosti 5000 se umístí do baňky objemu 500 ml a rozpustí ve 320 ml Milli-Q vody. K roztoku se přidá 80 ml kyseliny sírové a pomalý proud se uvede na koncentraci 20 %.
Roztok se zbarvi na červeno .'a stane homogenní. Po celonočním míchání se kyselý roztok dvakrát extrahuje,vždy, 500 ml . chloroformu a spojeně .extrakty, se. vysuší..síranem hořečnatým, odpaří a červený olej se jako tenký proud vylije do 2 litrů bezvodého. etheru . za. teploty 20..;c., Sraženina se nechá ustát během 24 hodin.-Tato sraženina se zachytí y,nálevce opatřené průtokovou fritou ze,, slinutého skla. poté ;promy je dvěmaJ podíly vždy 200 ml.,bezvodého etheru..Kolář,sraženiny,;se,výjme a vysuší za sníženého tlaku. Dostane se 8,68 g'methoxypolyethylenglykolu o molekulové hmotnosti 5000 {s nulovým obsahem diolu). . . ... , . . >
I ' i „ . · t* 1 7
Přiklad 6 .Air·· . '4 'nHUL·!. Μ. I IUU J· si» A, -1».* > nm .41' , —. i. í- s k , «*
Způsob přípravy sukcinátu methoxypolyethylenglykolu s nulovým obsahem diolu z methoxypolyethylenglykolu s nulovým obsahem diolu
4,7 g (0,94 mol) M-PEG-OH o molekulové hmotnosti 5000 s nulovým obsahem diolu se rozpustí ve 100 ml toluenu. Roztok se uvede do varu pod zpětným chladičem a přitom se k odstranění vody použije Dean-Starkův nástavec. Po varu pod zpětným chladičem v trváni 1 hodiny se celkem oddestiluje 80 ml toluenu a nádoba obsahující 20 ml toluenu se. nechá ochladit za přetlaku argonu. K reakční. směsi se přidá 110 mg (1,1 mmol) anhydridu kyseliny jantarové a poté 137 mg (1,12 mmol) 4-dimethylaminopyridinu. Ježto anhydrid kyseliny jantarové se nerozpouští, přidá se 10 ml bezvodého chloroformu, který je zbaven ethanolu, a roztok se udržuje za varu pod zpětným -chi-adi-čem—z-a—použ-i-t-i— zce-l-a—vysušeného-chiad-i-ée—Po-va-ru-pod— zpětným chladičem trvajícím 15 hodin se roztok ochladí a poté míchá s 10 g kationoměničové pryskyřice, filtruje a filtrát odpaří, aby se dostala sloučenina pojmenovaná v nadpise.
t ~ M - L , t . r.- k
Příklad 7
Způsob přípravy sukcinimidylsukcinátu methoxypolyethylenglykolu s nulovým obsahem diolu z šukcinátu methoxypolyethylenglykolu s nulovým obsahem diolu'7·
Roztok 4,15 g (0,83'mmol) sukčinátu'methoxypolyethylen' glykolu z příkladu 6 ve'1Ó0 ml’toluenu:šé suší'ázeotropicky. Část toluenu* (60;ml) še.oddestiluje (v reakční- baňce zbude 40 ml toluenů) a^přiďá^šě ÍÓOmg (o;87 mmol) N-hydroxysukčinimiclu' á^poté ‘še “opátrně^přiďá~30^ml čĚloróf óřmu/“ který ”* neobsahuje ethanol. Dalších'25 ml smíšených rozpouštědel se oddestiluje a roztok se nechá ochladit na teplotu místnosti pod argonovou atmosférou. K reakční směsi se přidá 200 mg (9,7 mmol). dicyklohexylkarbodiimidu a roztok se míchá. Po 10 minutách'začne krystalovat dicyklohexylmočovina-(DCŮj. V0e se míchá po dobu 2 dnů a poté přidá dalších 25 mg (0,22 mmol) N-hydroxysukcinimidu. Suspenze dicyklohexylmočoviny se filtruje a sraženina se promyje toluenem. Filtrát se odpaří na rotační odparce a poskytne další sraženinu dicyklohexylmočoviňý’. ZfiItrovanýkoncentrát se přikape do Γ litru bezvodého etheru. Sraženina se zachytí na filtru ze skleněných vláken Whatman 9 cm 6F/F a poté suší za vysokého vakua po dobu 15 hodin,-aby-se dostalo 3,37 g sukcinimidylsukcinátu methoxypolyethylenglykolu.
Obsah aktivního esteru: 1,71 x 10-4 mol/g, stranovení vysoko účinnou kapalinovou chromatografií: 1,3 % sukcinát methoxypolyethylenglykolu, jiné nečistoty: 1,2 %, dicyklohexylmočovina nestanovena, celkové nečistoty: 3 %.
Přiklad 8
Způsobn přípravy polyethylenglykolhyperoxiddismutasy s nulovým obsahem diolu
1,33 ml hýperoxiddismutasy (ze zásobního roztoku s obsahem 75 mg/ml) se přidá k 18,67 ml reakčního pufru (100 mmol fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,8) a roztok se uvede na teplotu 30 “C. Najednou se přidá 300 mg N-sukcinimidylsukcinátu methoxypolyethylenglykolu z přikladu 7 a hodnota pH se udržuje_7,8, za použití příslušného přístroje k jejímu udržováni. Po .28 minutách reakce hodnota pH se přestane měnit a vzorek se zahustí za použití membrány (Centrium centrifugal membrane) s řezem molekulové hmotnosti 10 000. ‘ Zahuštěný vzorek se podrobí výměně ionů tímto způsobem s PBS (Dulbecco), který byl upraven na hodnotu pH 6,2 pomocí 1-molární kyseliny chlorovodíkové. Pěti výměnami se dosáhne celkem 60 ml kapalné fáze. Vylučovací vysoko účinná kapalinová chromatograf ie projevuje nepatrný· pik při vysoké molekulové' hmotnosti, co ukazuje, že sloučenina pojmenovaná v nadpise obsahuje zanedbatelné množství látky odvozené od diolu (to znamená, že jde o nulový obsah diolu).
Způsob přípravy dalších biologicky aktivních proteinů kovalentně připojených k polyethylenglykolu
Příklad 9
Způsob výroby methoxypolyethylenglykolsukcinoylkatalasy o nulovém obsahu diolu
4,17 g vodné suspenze katalasy, obsahující 24,0 mg proteinu na mililitr, se zředí 15,84 ml 0,1-molárního roztoku fosforečnanu sodného, jako pufru o hodnotě pH 7,8. K tomuto ‘ro'zfo'ku7“m'a'gn'e't'i'Cky”m'ít:h''a‘němU“a'~zahřiva^hemu^-ha^éploťů^O °C, se přidá 550 mg nízko diolového N-sukcinimidylsukcinátu methoxypolyethylenglykolu. Hodnota pH reakční směsi se udržuje na 7,8 za použití titrátoru Mettler DL25, programováněho k udrženi hodnoty pH přidáváním 0,5-normálniho roztoku hydroxidu sodného podle potřeby. Po 30 minutách se reakční směs filtruje přes f iltr; o velikosti otvorů 0,45 μιη, z polysulfonu vázaného proteinem o nízké molekulové hmostnosti, umístí šé vé dvou koncentrátorech Amicon Centriprep 30 (membrána 30K NMWL) _a_puf r_ se několikrát .vymění z.a_PBS (Dulbecco). Dialyzovaný roztok obsahující nízko diolóvou’ polýethylenglykolkatalasu se potom filtruje filtremš véli- ’ kosti otvorů 0,2 #m. Tvorba konjugátu se dóloži vylučovací'' vysoko účinnou kapalinovou chromatografií(SEHPLC) a gelovoú eléktroforézou. ....·> Přiklad 10
- ·. + . . ' *
Způsob přípravy nízko diolového polyethylenglykolovalbuminu ' ~ 503 mg ovalbuminu'{Sigma) se rozpustí v 50 g 0,25-molárního fosfátového pufru o hodnotě pH 7,8 za teploty místnosti v polyethylenové kádince obsahující magnetické míchadlo potažené teflonem. Vše se míchá po dobu 15 minut . · a poté se najednou přidá 1900 g nízko diolového N-sukcinimidylsukcinátu methoxypolyethylenglykolu o molekulové hmotnosti ,
5000. Hodnota pH reakční směsi se udržuje na 7,8 pomocí titrátoru Mettler DL25, kterým se přidává podle potřeby
0,5-normálni roztok hydroxidu sodného. Reakce se nechá pokračovat po dobu 1 hodiny za teploty místnosti a poté se reakční směs diafiltruje membránou Amicon YM30 za použiti
B' míchacího zařízení pro nádobu, provozovaného pod tlakem argonu 17 2 kPa přes noc za teploty 4 ’C v chladničce. Poté se došlo k diafitraci 800 ml pufru, produkt se zahusti ultrafiltraci, poté filtruje přes polysulfonový^filtr o velikosti t otvorů 0,2 μη a plni do sterilních skleněných láhvičék. Dostane se 44,3 g roztoku s obsahem proteinu 10,5 mg/ml. Stupen modifikace proteinu je stanoven 71,4 %, pomoci titračni analýzy lysinaminů.
>
+ , > ► . Λ . 4
Příklad 11 ...
Způsob syntézy nízko diolového mPEG5K-S-ovalbuminu ml studeného roztoku, obsahujícího 10 mg/ml * ' / „7 * ·./-..·! · ·; i ovalbuminu (Sigma, jakost VI) v 0,25-molárnim'fosfátovém pufru o hodnotě pH.7,4, se přidá k,382 mg nízko diolovému mPEG5K-SS a míchá za teploty. 5 *C po dobu 16 hodin.'Látka se čistí v koncentrátoru Centriprep 30 (Ámicon, membrána 3OK NMWL) za použiti PBS (Dulbecco), jako výměnného pufrú. čistý roztok se filtruje filtrem s velikosti otvorů 0,2 μιη a clostane se 6,539 g produktu, který, obsahuje 13,8 mg/ml ze 74 % modifikovaného proteinu (titrační způsob TNBS).
Podobným způsobem se 100 mg ovalbuminu nechá reagovat s 283.mg nízko diolového mPEG5K-SS a dostane se 6,274 g produktu,, který obsahuje 13,8 mg/ml ze 74 %.modifikovaného proteinu. ,
Podobným způsobem se 100 mg ovalbuminu nechá reagovat se 190 mg nízko diolového mPEG^-SS a dostane.se 5,704 g produktu, který obsahuje 16,8 mg/ml ze 67 % modifikovaného . proteinu.
Příklad 12
Způsob přípravy nízko diolového mPEG5K~S-rhu-IL-4
190 μΐ roztoku s obsahem 5,26 mg/ml rhu-IL4 (Immunex) se zředí 772 μΐ 0,1-molárního borátového pufru o hodnotě pH
-8y5—RO-2toi<-rhu=Tt4“se“potom“zpracúje-s-—297-2-μ-Ι—roz-tok-u^který obsahuje 34 mg/ml roztoku nízko diolového N-sukcinimidylsukcinátu methoxypolyethylenglykolu v‘dimethylformamidu.
Po 80 minutách za teploty místnosti sereakční směs odstředí a injekčně zavede přímo na kolonu pro preparativní vylučovací vysoko účinnou kapalinovou chromatografii. Vyčištěný konjugát -ukazuje v podstatě jediný pás při_gelové elektroforéze..
Příklad 13
Způsob přípravy nízko diolového mPEG5K-S-NT
Roztok obsahující 8.,.7 mg?neiurotenšinu „(NT) '(BaChem)ýl v 2,175 ml 0,2 5 -mo lárniho f osf á tóvého pufru-ó ^hodnotě ’ pH:· 7,8 se přidá k 174 mg ni z'3<of diolového* mPĚG^ř.SSt1 Reakční směs -se udržuje za teploty místnosti“' pójičbÚ^iO:5 ‘minut áípoťé^se’ . uloží v chladničce. Čistý mono-mPEG5K-S-NT se dostane po’ oddělení '. z NT-mPEGgK-NT s reversní; fází7 vysoko účinné kapalinové chromatografie na C-8 koloně' při graduentovém eluování vodným acetonitrilem.
Prostředky podle tohoto vynálezu se zhotovují za ‘ použiti obvyklých technických postupů, které jsou známy odborníkovi v oboru. Prostředky popřípadě mohou obsahovat sacharózu nebo trehalózu.
Zvláštní prostředky jsou ilustrovány v tabulce 1, kde HPCD představuje hydroxypropyleyklodextrin.
Tabulka 1
Přiklad PEG-SOD (jedn./ml) (nmol) Fosfátový pufr Hodnota pH HPCD % % hmot./obj. Sacharóza % hmot./obj
14 25 000 ' 10 6,2 - - 5
15 50 000 10 6,2 - - 5
16 75 000 10 6,2 - - 5
17 100 000 10 6,2 - - 5
18 125 000 10 6,2 - - 5
19 150 000 10 6,2 5 ,
20 .25 000 10 6,2 10
21 50 000 10 6,2 - - 10
22 75 000 10 6,2 - _ 10
23 100 000 10 6,2 10 ·
24 125 000 10 6,2 - - 10
25 150 000 10 6,2 _ - 10'
26 25 000 -10 6,2 20
27 50 000 10 ' 6,2 - - 20
28 75 000 10 6,2 - _ 20
29 100 000 10 6,2 - - 20 ί·
30 125 000 10 6,2 - - 20
' 31 ' ’ . .. 150 000.. 10 6,2 - - 20
32 25 000 10 6,2 5 - -
33 50 000 10 6,2 5 - -
34 75 000 10 6,2 5 -
35 100 00Ό 10 6,2 5 - -
36 125 000 10 6,2 5 - -
37 150 000 10 6,2 5
38 25 000 10 6,2 10 - -
39 50 000 10 6,2 1° - -
40 75 000 10 6,2 10 ' - -
41 100 000 10 6,2 10 — -
Tabulka 1 - pokračování
Přiklad PEG-SOD Fosfátový Hodnota HPCD % Sacharóza
(jedn./ml) pufr pH % %
- ----- ·-- (Tímo 1) - -·...... TlIROt · /OD-j ♦ hmot. /oog-
42 125 000 10 6,2 10 - -
43 150 000 10 6,2 10 - -
44 25 000 10 6,2 20
45 50 000 10 6,2 20 - -
46 - 75 000 10 ... . 6,2 , 20 , . - -
47 100 000 10 6,2 20 - -
48 125 000 10 6,2 20 ’ - -
49 150 000 10 6,2 20 _ «.
50 25 000 10 6,2 5 5
51 -50 000 10 6,2 5 5 . '
52 75 000 10 6,2 5 5
53 100 000 10 6,2 5 5 _
54 125 000 10 6,2 5 b. 5
$5 l50‘000' ~ ~10 . *' . 6,2 . . I 5 : . · · 5 :-·
56 25 000 10 6,2 10 10
57 50 000 10 6,2 10 10
58 75 000 10 6,2 10 10
59 100 000 10 6,2 10 10
60 125 000 - '10 6,2 10 ‘ 10
61 150 000 10 6,2 10 10
62 25 000 10 6,2 15 5
63 50 000 10 6,2 15 5
64 75 000 10 6,2 15 5
65' 100. 000 10 6,2 ' 15 . 5
66 125 000 10 6,2 15 5'
67 150 000 10 6,2 15 5
68 25 000 10 6,2 5 15 ’
69 50 000 10 6,2 5 15
Tabulka 1 - pokračování
Přiklad- PEG-SOD (jedn./ml) (nmol) Fosfátový pufr Hodnota PH HPCD % % hmot./obj. Sacharóza % hmot./obj
70 75 000 10 6,2 5 15
71 100 000 10 6,2 . .5 15
72 125 000 10 6,2 5 15
73 . 150 000 10 6,2 15
Prostředky podle tohoto vynálezu se .lyof ilizují za ” ' použití způsobu popsaného dále. ý ’ > v - ·. -I·.“· ' iUji“ ,··./?*.> ri. i ··· iíLv · .f ...
Požadované rozměry lahviček se vybírají tak, aby se láhvičky naplnily prostředkem na základě.požadavků na dávku. Ve zvolených lahvičkách se .přizpůsobí dávka,^naplněný objem by neměl překročit.průměr láhvičky. Například ..náplň J3 objemu 5 ml by se neměla zavádět do.mehši než.lOml láhvičky. Po naplněni se láhvičky vnesou do sušicí komory a\ umístí přímo. na policích mrazicího zařízeni, které se předchladilo na teplotu 4 ’C. Termočlánek se umísti mimo. řadu láhviček -. „ a slouží ke sledování teploty prostředku během lyófilizačního , procesu.-Teplota láhviček se potom nechá vyrovnat s teplotou polic (4 ’ C) předtím, než se teplota na policích sníží na
». -40 ’C. Po dosažení teploty -40 ’C se láhvičky udržují při této teplotě po dobu 6 hodin, k dosaženi úplného vymražení ' prostředku. Po tomto časovém období se chladičová spirála rychle ochladí na teplotu -80 ’C a vývěvou Se evakuuje chladicí komora, s následujícím procesem prvního a druhého sušeni. Při prvním sušicím procesu se hlavni ventil mezi chladičem a sušicí komorou otevře a sušicí.komora se evakuuje , na tlak přibližně 100 mikronů plynným dusíkem. Po.dosažení tohoto podtlaku se teplota na policích zvýši na -20 ’C, k zahájení sublimačního procesu. Tato část lyofilizačního cyklu vyžaduje trvání přibližné 10 až 18 hodin. První sušicí proces je úplný, pokud zmizí všechen led z mrazící mřížky a teplota dosáhne -20 ’C. V druhém sušicím procesu se teplota zvýší z -20 °C na +25 C k odstranění veškerého ledu, který se neodstranil během lyofilizačního procesu. Toto odstranění vyžaduje přibližně 4 až 8 hodin.
Po ukončeni druhého sušicího procesu se hlavni ventil uzavře a sušiči komora se naplní dusíkem, aby se dosáhlo slabého podtlaků v komoře. Potom se uvede .do chodu uzavírací zařízení-ado-láhviček se vtlačí zátky. Tlak sušicí komory se potom vyrovná s atmosférickým tlakem a komorové dvéře se • · ' *’ · ·’* ...· 1’ i i .« ’ ·**%> .. »5 . . x- Μ» .·< T U otevřou, k vyjmutí láhviček a k aplikaci zvlněných uzávěrů. Lahvičky se potom skladuji za předepsané teploty, dokud se obsah nerekonstituu je-vodou pro injekce.
Bylo ňalezerioývžě čas'skladovatelnosti prostředků pódíé tohoto'vynálezů' jé vyniká jící / Čas 'skladovatelnosti je ilustrován následujícími srovnávacími studiemi za použití rekonstituovaných^roztoků, u kterých je pozorován, vizuální vzhled, prostředků'a -je provedeno stanovení procenta materiálu, obsaženého' v prostředcích uvedených v příkladech 74 a 75, který má vysokoumolekulovou hmotnost (HMW), pomoci výlučovací vysoko účinné kapalinové chromatografie (SEHPLC).
Prostředek A podle tohoto vynálezu obsahuje 10 % hydróxyprópylcyklodextrinu.
Prostředek B pro srovnávací účely, obsahuje 10 % sacharózy a neobsahuje hydroxypropylcyklodextrin.
Ol «
Oba prostředky obsahují 10 mmol fosfátového pufru o hodnotě pH 6,2 a 75 000 jednotek/ml polyethylenglykolhyperoxiddismutasy. Naplněný objem lahviček činí 0,5 ml, teplotní podmínky jsou 4 ’C, 22 ’C, 30 ’C a 50 ’C. Oba prostředky byly lyofilozovány a udržovaly se za výše uvedených teplot po dobu 30 měsíců a poté se, rekonstituovaly a testovaly, jak je uvedeno.
Příklad 74
Vzhled rekonstituovaných prostředků
Prostře- Vzhled Prostře- Vzhled
dek A .. dek B 1
4 ’C čirý, modro-zelený 4 ’C čirý, modro-zelený
22 •c čirý^ modro-zelený 22 ’C čirý, modro-zelený
30 ’C čirý, modro-zelený 30 ’C čirý, modro-zelený
* 50 ‘C čirý, modro-zelený 50 ’C zakalený,
žluto-hnědý
Stanoveni látek s vysokou molekulovou hmotnosti za použití ( vylučovací vysoko účinné kapalinové chromatografie
Λ ' i ,
Vylučovací vysoko účinná kapalinová chromatografie se provádí ekvilibrováním'kolony (o rozměru 0,8 x 30 cm) naplněné Shodex WŠ-803F v 0,1-molárnim fosfátovém pufru o hodnotě pH 6,5, 0,15-molárním roztokem chloridu sodného při rychlosti toku 1 ml/min a čerpáni přes detekční soupravu při 280-nm. Tato kolona je schopna rozlišit rozdíly v molekulové hmotnosti na základě jejich frakčního rozmezí a vylučovací meze (molekulová hmotnost větší než 1 000 000). Za těchto podmínek se materiál o vysoké molekulové hmotnosti eluuje před materiálem o nízké molekulové hmotnosti (solemi, a složkami o nízké molekulové hmotnosti). Detektor je připojen k počítači, který je programován k integrování piků založených na čislených parametrech a kvantitativních údajích ό množství piku, vztažených na procentuální základ.
Procento látek s vysokou molekulovou hmotnosti (HMW) druhů nalezených a uvedených v přikladu 75 je měřítkem rozsahu agregace polypeptidu při skladováni. Příklad 75 uvádí volný PEG (co je indikátorem rozsahu hydrolýzy esterových vazeb sukcinátu) a % aktivity enzymu.
Příklad 75
Studie stability lyofilizovaných prostředků s obsahem/ polyethylenglykolhyperoxiddismutasy, které obsahují ló % sacharózy nebo 10 % β-hydroxypropylcyklodextrinu (HPpCD) při skladováni během 2 a 20 měsíců za různých teplot
Prostředek Teplo- HMW2 Volný PEG3 ' r<:% aktivity4
(75 000 jedn/mg. ta ro (%) 2 měs. (mg/ml) 10 měs. - - - --- . —- — 2 měs. 10 měs
2 měs. 10 měs.
10 % 4 . 0,3 0,2 0,35 0,1 99 ' - -
sacharózy 22 0,4 0,6 0,36 0 100 ' -
30 0,7 0,9 0,44 0 98 100
'50 *20 >50 3,45 '10 ‘ 71 - -
* 10 % 4 0,3 - - 0,12 100 - _
HPpCD 2 2 0,4 - - 0,08 - - 99 - _
30 0,4 0,7 0,14 0,9 100 100
50 * 0,6 4,8 0,87 3,23 95 92
1 Vizuální pozorováni lyofilizovaných koláčů -před rekonstitucí ukazuje, že prostředek obsahující sacharózu se za teploty 50 °C odbarvil.
2 Látky s vysokou molekulovou hmotností představují nečistoty, jako jsou polypeptidové agregáty a jsou vyjádřeny jako procentuální odchylka od kontrolních podmínek (čas).
·* Volný PEG (polyethylenglykol) představuje hydrolýzu sukcinylesterové vazby a je vyjádřen jako procentuální odchylka od kontrolních podmínek (čas).
4 Je vyjádřen Jako procento z počáteční hodnoty. Jak má být zřejmé z hodnot uvedených v příkladu 75, prostředky obsahující p-hydroxypropylcykíóděxtřin'(HPPCD) : dokládají vynikající stabilitu při skladování' za teploty 30* ’C. Nepozoruji se žádné významné změny aktivity enzymu po skladování trvajícím 10 měsíců, co ukazuje, že se dosáhlo uspokojivé stálosti enzymu. Zřetelná nadřazenost β-hydroxypropylcyklodextrinu jako stabilizátoru Je zřejmá při porovnáni procentuálních hodnot látek s vysokou molekulovou hmotnosti u prostředků obsahujících sacharózu a β-hydroxypropylcyklodextrin při skladování za teploty 50 ’C po dobu 10 měsíců. Procentuální hodnota látek s vysokou molekulovou hmotností v prostředcích obsahujících β-hydroxypropylcyklodextrín po tepelném střesu za teploty 50 ’C po dobu 10 měsíců je pouze 4,8, v porovnání k >50 pro prostředek obsahující sacharózu za stejných podmínek. Výrazná stabilizační schopnost β-hydroxypropylcyklodextrinu také při skladování za vysokých teplot je ukazatelem jedinečného stabilizačního mechanizmu dosahovaného s tímto stabilizátorem, který minimalizuje interakci proteinu a tak snižuje tvorbu látek s vysokou molekulovou hmotnosti. Z teoretického hlediska se může uvést, že vzhledem k tomu, že cyklodextrin obsahuje dutiny, je možné, že chránící mechanizmus je ve vztahu k enkapsulaci určitých reaktivních center (spojených s tvorbou
- 42' agregátů o vysoké molekulové hmotnosti), které minimalizuji interakci a snižují agregaci.
Využitelnost
Zvýšená stabilita dosahovaná podle tohoto vynálezu dovoluje skladováni produktu za teploty místnosti a vede ke zvýšení času skladovatelnosti. Tento lyofilizovaný produkt je vhodný pro balení bud do obvyklých skleněných láhviček nebo do předem naplněných injekčních stříkaček. Předem naplněné injekční stříkačky nabízejí produkt hotový k použiti, co vyžaduje minimální manipulaci a je dobře vhodný pro nepředvídané použití. Prostředky mají vysokou použitelnost, které až dosud nebylo dosahováno, v klinických, nemocničních a neočekávaných situacích. '

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY — - —
    1. Vodný fyziologicky aktivní bílkovinný prostředek pro lyofilizaci, vyznačující se tím, že obsahuje od přibližně 150 do zhruba 150 000 jednotek kovalentně vázaného nízko diolového polyalkylenoxidu na ml proteinu, · '
    «. 1 .
    od přibližné 0,1 do zhruba 20 % hmotnostně objemových cyklodextrinu a od přibližně 0,01 do zhruba 50 mmol pufru, přičemž tento prostředek má hodnotu pH do přibližně 5,7 do zhruba ‘ fc
    6,5.
  2. 2. Prostředek podle nároku 1,vyznačující se t i m, že cyklodextrin je přítomen v množství od přibližně 1,0 do zhruba 15 % hmotnostně objemových.
    t
  3. 3. Prostředek podle nároku 1,vyznačující septim, že nízko diolovým polyalkylenoxidem je lineární polyalkylenoxid, který neobsahuje více než přibližně 10 % hmotnostních nemonoalkoxylovaného polyalkylenoxidu.
    i
  4. 4. Prostředek podle nároku 3,vyznačující se t i m, že nemonoalkoxylovaným polyalkylenoxidem je nemonomethoxylovaný polyethylenglykol.
    ř
  5. 5. Prostředek podle nároku 4,vyznačující se tim, že tento polyethylenglykol má průměrnou molekulovou hmotnost od přibližně 1000 do zhruba 15 000 daltonů.
  6. 6. Prostředek podle nároku 1,vyznačující se t i n, že cyklodextrinem je derivát β-cyklodextrinu.
  7. 7. Prostředek podle nároku 1,vyznačující se t i m, že protein je zvolen ze souboru zahrnujícího rekombinantní lidský interleukín-4 (rhuIL-4), protéasu Subtilisiň Carlsberg, oxidoreduktasu, katalasu, cholesterol, redukovaný nikotinamid adenin dinukleotidfosfát, oxygenoxidoreduktasu (20-β-hydroxylujici) (1.14.1,9; cholesterol-20-hydroxylasu), transferasu, uridindifosfoglukózu, hydrólasu, tripsin (3.4.4.4), L-asparagin-aminohydrolasu (3.5.1.1, asparaginasu”), lyasu, isomerasu a ligasu.
  8. 8. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že protein je zvolen ze.souboru zahrnujícího insulin, adrenokortikotropni hormon, glukagon/-‘somatóštatin>\· somato-tropin, thymosin, hormon přištitných tělísek, pigměn-S tační hormony, somatomedin, erythropoietin a luteinizační • ’ /· *·; Z ř Λ' ' ; Λ ' hormon. L .
    « * . .4
  9. 9. -Prostředek podle nároku 1, vyznačující' s e -t i m, že protein je zvolen ze souboru zahrnujícího • | ' J chorionický gonadotropin, faktory uvolňující hypothalamus, antidiuretický hormon, hormon stimulující štítnou žlázu, kalcitonin, proláklin, interferon (α-, β- a τ-), protilátky· (IgG, IgE, IgM, IgD), interleukiny 1, 2, 3, 4 a 7, faktor stimulující granulocytové kolonie (GCSF) a faktor stimulující granulocyt-makrofagové kolonie (GM-CSF).
  10. 10. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se t í m, že protein je zvolen ze souboru zahrnujícího faktor nekrosy tumoru (TNF), růstový faktor odvozený od krevních destiček (PDGF), epidermální růstový faktor (EGF), nervový růstový faktor (NGF), kostní růstový faktor (BGF), faktor uvolňující růstový hormon (GHRF), papain, chymotrypsin, thermolysin, streptokinasu a aktivasu.
  11. 11. Prostředek podle nároku 1, v'y. značující se t i in, že proteinem je hyperoxiddismutasa.
  12. 12Prostředek podle nároku 11, vyznačující se t i m, že hyperoxiddismutasou je rekombinantní lidská ? hyperoxiddismutasa.
  13. 13. Způsob přípravy lyofilizovaňého biologicky aktivního bílkovinného prostředku, vyznačující s e t í m, že.se 1 : Ί 1
    a) 1 karboxyluje polyaíkylenoxid.obsahující méně než 10 , % hmotnostních nemonoálkylovaného polyalkylenoxidu, - ,:¾.
    -v ’τ
    1 ,S
    b) tento karboxylovaný polyaíkylenoxid aktivuje k dosažení aktivního esteru polyalkylenoxidu,
    c) tento aktivní ester polyalkylenoxidu kovalentně připojí k biologicky aktivnímu proteinu,
    d) tento kovalentně připojený ester polyalkylenoxidu ř· , a tento biologicky aktivní protein solubilizuji ve vodném prostředí, . e) cykiodextrin'solubilizuje v tomto vodném prostředí k dosažení homogenního roztoku,
    f) .tento roztok pufruje na hodnotu pH od přibližné 5,7 do zhruba 6,5 a , g)·roztok lyofilizuje.
    I i
  14. 14. Způsob podle nároku 13,vyznačující se t i b, že prostředkem je prostředek nárokovaný v některém z nároků 1 až 12.
  15. 15. Použiti prostředku podle některého z předcházejících nároků k přípravě léčiva pro ošetřováni chorobných stavů ‘způsobených hyper-oxi-dovými aniony na -tkáni savce.
CZ94381A 1993-02-25 1994-02-21 Lyophilized polyalkylenoxide modified protein and polypeptide complexes with cyclodextrin CZ38194A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/023,182 US5298410A (en) 1993-02-25 1993-02-25 Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ38194A3 true CZ38194A3 (en) 1994-10-19

Family

ID=21813561

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ94381A CZ38194A3 (en) 1993-02-25 1994-02-21 Lyophilized polyalkylenoxide modified protein and polypeptide complexes with cyclodextrin

Country Status (18)

Country Link
US (4) US5298410A (cs)
EP (1) EP0614666A1 (cs)
JP (1) JPH06256222A (cs)
KR (1) KR940019312A (cs)
AU (1) AU660843B2 (cs)
CA (1) CA2106519A1 (cs)
CZ (1) CZ38194A3 (cs)
FI (1) FI940909A (cs)
HU (1) HUT71586A (cs)
IL (1) IL108777A (cs)
MX (1) MX9305528A (cs)
MY (1) MY131553A (cs)
NO (1) NO940663L (cs)
NZ (1) NZ248590A (cs)
PH (1) PH30462A (cs)
RU (1) RU94006023A (cs)
SK (1) SK23294A3 (cs)
TW (1) TW260611B (cs)

Families Citing this family (117)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
DE4239877C1 (de) * 1992-11-27 1994-03-17 Boehringer Ingelheim Int Stabilisierte Superoxid-Dismutase (SOD)-Zusammensetzung
CA2114163C (en) * 1993-01-29 2002-04-30 Nobuo Nishiki Method for stabilizing antigenicity of myeloperoxidase
US5298410A (en) * 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5981719A (en) 1993-03-09 1999-11-09 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
US6090925A (en) 1993-03-09 2000-07-18 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
FR2703927B1 (fr) * 1993-04-13 1995-07-13 Coletica Utilisation d'une réaction de transacylation entre un polysaccharide estérifié et une polyamine pour former en milieu aqueux une membrane au moins en surface de particules gélifiées.
US7070790B1 (en) * 1993-06-29 2006-07-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 and core genes of isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines
JPH0776700A (ja) * 1993-07-14 1995-03-20 Senju Pharmaceut Co Ltd コンタクトレンズ用剤の安定化方法
US5605976A (en) * 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
DE4423131A1 (de) * 1994-07-01 1996-01-04 Bayer Ag Neue hIL-4-Mutantenproteine als Antagonisten oder partielle Agonisten des humanen Interleukin 4
MX9704137A (es) * 1994-12-07 1997-09-30 Novo Nordisk As Polipeptidos de alergenicidad reducida.
JP3708151B2 (ja) * 1994-12-15 2005-10-19 協和醗酵工業株式会社 Ｐｅｇ化したヒト顆粒球コロニー刺激因子の定量法
US5861148A (en) * 1995-01-23 1999-01-19 Smith; Stewart Gregory Ophthalmic compositions and process of using
ATE257844T1 (de) * 1995-03-10 2004-01-15 Nakamura Toshikazu Menschlicher wachstumsfaktor (hgf), verändert durch polyethylenglykol
US5756593A (en) * 1995-05-15 1998-05-26 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkyene oxide carboxylic acids
US5868868A (en) * 1995-06-19 1999-02-09 Alcon Laboratories, Inc. Peg-modified proteases and methods of use in contact lens cleaning
JPH11502255A (ja) * 1995-12-29 1999-02-23 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー 固定化酵素を含有する洗剤組成物
DE69733664T3 (de) * 1996-04-19 2011-04-14 Grifols Inc. (n.d. Ges.d.Staates Delaware), Los Angeles Verfahren zur INaktivierung von Viren und Lyophilisierung von Blutproteinen
AU4981897A (en) * 1996-10-15 1998-05-11 Navix, Inc. Stabilized conjugates of uncomplexed subunits of multimeric proteins
US6321909B1 (en) * 1997-02-13 2001-11-27 Sky High, Llc System for storing polyethylene glycol solutions
GB9711643D0 (en) * 1997-06-05 1997-07-30 Janssen Pharmaceutica Nv Glass thermoplastic systems
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US7642323B2 (en) * 1997-11-06 2010-01-05 Nektar Therapeutics Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
GB9815785D0 (en) * 1998-07-20 1998-09-16 Cerebrus Ltd Chemical compounds
ATE498409T1 (de) 1998-08-06 2011-03-15 Mountain View Pharmaceuticals Peg-uricase konjugate und verwendung davon
US6994686B2 (en) * 1998-08-26 2006-02-07 Neomend, Inc. Systems for applying cross-linked mechanical barriers
DK1121156T3 (da) 1998-10-16 2006-06-06 Biogen Idec Inc Polymerkonjugater af interferon-beta-1a samt deres anvendelse
BR9915548A (pt) * 1998-10-16 2001-08-14 Biogen Inc Proteìnas de fusão de interferon-beta e usos
US7279001B2 (en) * 1998-11-06 2007-10-09 Neomend, Inc. Systems, methods, and compositions for achieving closure of vascular puncture sites
US6716452B1 (en) 2000-08-22 2004-04-06 New River Pharmaceuticals Inc. Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents
US7169889B1 (en) * 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
EP1282411A4 (en) * 2000-04-26 2008-05-21 Charlotte Mecklenburg Hospital ANTICANCER TREATMENT METHOD
US20050124537A1 (en) * 2000-04-27 2005-06-09 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
US6756480B2 (en) 2000-04-27 2004-06-29 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
SG98393A1 (en) * 2000-05-19 2003-09-19 Inst Materials Research & Eng Injectable drug delivery systems with cyclodextrin-polymer based hydrogels
US6468989B1 (en) * 2000-07-13 2002-10-22 Dow Pharmaceutical Sciences Gel compositions containing metronidazole
US8394813B2 (en) * 2000-11-14 2013-03-12 Shire Llc Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents
CN1406131A (zh) * 2000-12-25 2003-03-26 株式会社资生堂 活化交感神经的香料组合物
US20020146409A1 (en) * 2001-01-30 2002-10-10 Herring Steven W. Methods for stabilizing lyophilized blood proteins
US7195923B2 (en) * 2001-01-31 2007-03-27 Scripps Laboratories, Inc. Ratiometric determination of glycated protein
US6867183B2 (en) * 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7060675B2 (en) * 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
WO2002094324A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-28 Institute Of Materials Research & Engineering Injectable drug delivery systems with cyclodextrin-polymer based hydrogels
US6828297B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6835802B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US6858580B2 (en) 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7713932B2 (en) * 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6713452B2 (en) 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828305B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US20060014697A1 (en) * 2001-08-22 2006-01-19 Travis Mickle Pharmaceutical compositions for prevention of overdose or abuse
ATE376020T1 (de) 2001-08-22 2007-11-15 Bioartificial Gel Technologies Inc Verfahren zu herstellung von aktivierten polyethylenglykolen
US7169752B2 (en) * 2003-09-30 2007-01-30 New River Pharmaceuticals Inc. Compounds and compositions for prevention of overdose of oxycodone
WO2003072046A2 (en) * 2002-02-22 2003-09-04 New River Pharmaceuticals Inc. Novel sustained release pharmaceutical compounds to prevent abuse of controlled substances
US7030082B2 (en) * 2001-09-07 2006-04-18 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith
US6913903B2 (en) * 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7166571B2 (en) * 2001-09-07 2007-01-23 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US6770625B2 (en) 2001-09-07 2004-08-03 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7312192B2 (en) * 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7196059B2 (en) * 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
DE10149030A1 (de) * 2001-10-05 2003-04-10 Viscum Ag Stabile galenische gefriergetrocknete Arzneimittelzubereitung von rViscumin
US7060498B1 (en) 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
US20050132430A1 (en) * 2001-12-21 2005-06-16 Mogens Baltsen Igamete recruitment and developmental competence in mammals by inhibiting the de-nova sterol biosynthesis and/or promoting sterol efflux
CN1620499A (zh) * 2001-12-21 2005-05-25 哥本哈根大学医院 哺乳动物的配子募集和发育能力－通过抑制固醇从头生物合成和/或促进固醇外流
EP3669887A1 (en) 2002-01-18 2020-06-24 Biogen MA Inc. Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
WO2003072637A1 (en) * 2002-02-22 2003-09-04 Insert Therapeutics, Inc. Carbohydrate-modified polymers, compositions and uses related thereto
CN1649614A (zh) * 2002-02-22 2005-08-03 新河药品股份有限公司 活性剂传递系统和保护及施用活性剂的方法
US7700561B2 (en) * 2002-02-22 2010-04-20 Shire Llc Abuse-resistant amphetamine prodrugs
US7659253B2 (en) * 2002-02-22 2010-02-09 Shire Llc Abuse-resistant amphetamine prodrugs
US7105486B2 (en) * 2002-02-22 2006-09-12 New River Pharmaceuticals Inc. Abuse-resistant amphetamine compounds
WO2003105768A2 (en) * 2002-06-13 2003-12-24 Nobex Corporation Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus
JP4723244B2 (ja) 2002-07-19 2011-07-13 オメロス コーポレイション 生分解性トリブロックコポリマー、その合成方法、ならびにそれから作製されるヒドロゲルおよび生体材料
CN102516417B (zh) 2002-09-06 2014-12-10 天蓝制药公司 用于传递治疗剂的以环糊精为基础的聚合物
AU2004251647B2 (en) * 2003-05-29 2010-01-14 Takeda Pharmaceutical Company Limited Abuse resistant amphetamine compounds
PL1656410T3 (pl) 2003-07-22 2010-08-31 Nektar Therapeutics Sposób wytwarzania sfunkcjonalizowanych polimerów z polimerycznych alkoholi
US20060182692A1 (en) * 2003-12-16 2006-08-17 Fishburn C S Chemically modified small molecules
ES2733764T3 (es) * 2003-12-16 2019-12-02 Nektar Therapeutics Método para la preparación de oligo etilenglicol monodisperso
US7351787B2 (en) * 2004-03-05 2008-04-01 Bioartificial Gel Technologies, Inc. Process for the preparation of activated polyethylene glycols
CN100355786C (zh) * 2004-04-28 2007-12-19 江苏豪森药业股份有限公司 聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物
AU2005269753B2 (en) 2004-07-19 2011-08-18 Biocon Limited Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof
US7772182B2 (en) 2004-08-05 2010-08-10 Alza Corporation Stable suspension formulations of erythropoietin receptor agonists
US8080423B2 (en) * 2004-08-05 2011-12-20 Asahi Kasei Pharma Corporation Reagent containing protease reaction promoter and/or colorant stabilizer
TW200640493A (en) * 2005-02-16 2006-12-01 Insert Therapeutics Inc Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
SG10201706384VA (en) * 2005-04-11 2017-09-28 Crealta Pharmaceuticals Llc A variant form of urate oxidase and use thereof
WO2006110819A2 (en) 2005-04-11 2006-10-19 Savient Pharmaceuticals, Inc. Variant forms of urate oxidase and use thereof
US20080159976A1 (en) * 2005-04-11 2008-07-03 Jacob Hartman Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
US8148123B2 (en) * 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
EP1896610A2 (en) * 2005-05-03 2008-03-12 Handylab, Inc. Lyophilized pellets
BRPI0611901A2 (pt) 2005-06-14 2012-08-28 Amgen, Inc composição, liofilizado, kit, e, processo para preparar uma composição
US8568705B2 (en) 2005-07-18 2013-10-29 Nektar Therapeutics Method for preparing branched functionalized polymers using branched polyol cores
KR100664969B1 (ko) * 2005-08-26 2007-01-04 아이디비켐(주) 고순도의 메톡시폴리에틸렌글리콜 및 그들의 유도체의제조방법
CN100360666C (zh) * 2005-11-29 2008-01-09 沈阳农业大学 一种修饰玉米sod的方法
US7989554B2 (en) * 2006-01-10 2011-08-02 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Reacting polyalkylene oxide with base, tertiary alkyl haloacetate, then acid to prepare polyalkylene oxide carboxylic acid
US20070173634A1 (en) * 2006-01-24 2007-07-26 Olsson Nils U Methods for one-step purification of organic polymers using tangential flow filtration
ES2532804T3 (es) * 2006-04-12 2015-03-31 Crealta Pharmaceuticals Llc Purificación de proteínas con tensioactivo catiónico
US20080176958A1 (en) 2007-01-24 2008-07-24 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
EP2113009B1 (en) * 2007-02-22 2018-11-21 Biovectra Inc. Process for purification of water soluble polymers
JP4697809B2 (ja) * 2007-02-22 2011-06-08 旭化成ファーマ株式会社 ロイコ色素の安定化方法
RU2007131782A (ru) * 2007-08-22 2009-02-27 Общество с ограниченной ответственностью "Концерн O3" (RU) Гипогликемическое средство и способ его получения
RU2007137048A (ru) * 2007-10-05 2009-04-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" (Ru) Лекарственное средство для лечения и предупреждения осложнений при сахарном диабете
RU2007137044A (ru) * 2007-10-05 2009-04-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" (Ru) Лекарственное средство, обладающее гемопоэзстимулирующим и гепатопротекторным действием
PT2203181T (pt) * 2007-10-16 2018-05-10 Biocon Ltd Uma composição farmacêutica sólida para administração por via oral e o seu processo de fabrico
JP5569787B2 (ja) * 2009-03-31 2014-08-13 日油株式会社 高分子量ポリエチレングリコール化合物の精製方法
JP5713274B2 (ja) 2009-03-31 2015-05-07 日油株式会社 高分子量ポリオキシアルキレン誘導体の精製方法
BRPI1010069A2 (pt) 2009-06-25 2016-03-15 Savient Pharmaceuticals Inc "método para prevenir reações à infusão durante terapia por uricase peguilada em pacientes; e método para diagnosticar se um paciente tratado com uricase peguilada desenvolverá reações à infusão ou desenvolverá liberação de uricase peguilada mediada por anticorpo sem a medição de títulos de anticorpos anti-peg e anti-uricase peguilada"
CN104208716A (zh) * 2009-11-23 2014-12-17 天蓝制药公司 用于传递治疗剂的基于环糊精的聚合物
WO2011119995A2 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 Cerulean Pharma Inc. Formulations and methods of use
GB201008902D0 (en) 2010-05-27 2010-07-14 Imp Innovations Ltd Membrane enhanced polymer sythesis
US8163869B1 (en) 2010-12-27 2012-04-24 Nof Corporation Purification method of carboxyl group-containing polyoxyethylene derivative
RU2452509C1 (ru) * 2011-01-31 2012-06-10 Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" Средство для стимуляции роста организма
US9090769B2 (en) 2011-04-05 2015-07-28 Ticona Llc Molded articles having a swirl-like or marble-like appearance and compositions for producing same
WO2012145632A1 (en) * 2011-04-21 2012-10-26 Cerulean Pharma Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutic delivery
WO2014055493A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
CN114917185B (zh) 2016-10-21 2023-11-14 美国安进公司 药物配制品及其制备方法
CN111936549B (zh) * 2018-03-29 2023-03-10 日油株式会社 包含三苯甲基的单分散聚乙二醇的纯化方法
EP3810089B1 (en) * 2018-06-07 2023-08-02 Pfizer Inc. Aqueous formulation comprising 1-(4-{[4-(dimethylamino)piperidin-1-yl]carbonyl}phenyl)-3-[4-(4,6-dimorpholin-4-yl-1,3,5-triazin-2-yl)phenyl]urea
CN109206598A (zh) * 2018-09-10 2019-01-15 武汉轻工大学 聚乙二醇-聚丙交酯嵌段共聚物的制备方法以及药物载体

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4596795A (en) * 1984-04-25 1986-06-24 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health & Human Services Administration of sex hormones in the form of hydrophilic cyclodextrin derivatives
US4727064A (en) * 1984-04-25 1988-02-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Pharmaceutical preparations containing cyclodextrin derivatives
JPH084504B2 (ja) * 1985-04-26 1996-01-24 味の素株式会社 安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ
US4970216A (en) * 1986-03-17 1990-11-13 Richardson Vicks, Inc. Skin treatment composition and method
US5080894A (en) * 1986-05-15 1992-01-14 Emory University Method and composition for reducing tissue damage
US4791192A (en) * 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5006333A (en) * 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5002935A (en) * 1987-12-30 1991-03-26 University Of Florida Improvements in redox systems for brain-targeted drug delivery
US5183809A (en) * 1990-02-15 1993-02-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania/Childrens Hospital Corporation Cyclodextrin polymers and cyclodextrins immobilized on a solid surface
US5153265A (en) * 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5997856A (en) * 1988-10-05 1999-12-07 Chiron Corporation Method and compositions for solubilization and stabilization of polypeptides, especially proteins
US5068227A (en) * 1989-01-18 1991-11-26 Cyclex, Inc. Cyclodextrins as carriers
US5182270A (en) * 1989-08-03 1993-01-26 Iolab Corporation Stabilizing preparation for thymoxamine
JP3051145B2 (ja) * 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5145644A (en) * 1990-12-20 1992-09-08 Allergan, Inc. Hydrogen peroxide destroying compositions and methods of making and using same
JPH04248984A (ja) * 1991-02-05 1992-09-04 Kuraray Co Ltd スーパーオキシドジスムターゼ誘導体およびその製造方法
CA2101361A1 (en) * 1992-08-27 1994-02-28 Robert A. Snow Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances
US5298410A (en) * 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life

Also Published As

Publication number Publication date
NZ248590A (en) 1995-07-26
EP0614666A1 (en) 1994-09-14
FI940909A (fi) 1994-08-26
PH30462A (en) 1997-05-28
HU9400561D0 (en) 1994-05-30
RU94006023A (ru) 1996-04-20
SK23294A3 (en) 1995-02-08
JPH06256222A (ja) 1994-09-13
US5298410A (en) 1994-03-29
NO940663D0 (no) 1994-02-25
FI940909A0 (fi) 1994-02-25
MX9305528A (es) 1994-08-31
CA2106519A1 (en) 1994-08-26
MY131553A (en) 2007-08-30
US5334382A (en) 1994-08-02
TW260611B (cs) 1995-10-21
IL108777A0 (en) 1994-06-24
KR940019312A (ko) 1994-09-14
HUT71586A (en) 1995-12-28
AU660843B2 (en) 1995-07-06
NO940663L (no) 1994-08-26
US5529915A (en) 1996-06-25
IL108777A (en) 1998-02-08
AU4616293A (en) 1994-09-01
US5389381A (en) 1995-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ38194A3 (en) Lyophilized polyalkylenoxide modified protein and polypeptide complexes with cyclodextrin
US5006333A (en) Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5283317A (en) Intermediates for conjugation of polypeptides with high molecular weight polyalkylene glycols
US5661020A (en) Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances
AU776715B2 (en) Combinations for introducing nucleic acids into cells
HUT75533A (en) Improved interferon polymer conjugates
EP0377613B1 (en) Conjugates of superoxide dismutase
Boccu et al. Coupling of monomethoxypolyethyleneglycols to proteins via active esters
HU228877B1 (en) Formulations for stabilization of peg-interferon alpha conjugates and method for preparation such formulations
ES2395894T3 (es) Hemoglobinas de mamífero compatibles con plasma sanguíneo, reticuladas y conjugadas con poli(óxidos de alquileno) como portadores de oxígeno médicos artificiales, su preparación y su uso
JP2632518B2 (ja) ビリルビンオキシダーゼの化学修飾体
JP2531661B2 (ja) 酸素運搬剤
KR100360946B1 (ko) 재조합인간초-산화물불균화효소(rhSOD)의고분자결합체및이를제조하는방법
JPH09124512A (ja) 肝臓ターゲティングのための水溶性の薬物−プルラン結合体製剤
KR20040086521A (ko) 생물학적 활성물질과 생체적합성 고분자의 1:1 접합체,이의 제조방법과 이를 함유하는 약학 조성물