HUT71586A - Process for producing lyp0philized polyalkyene oxide modified protein and polypeptide complexes with cyclodextrin - Google Patents

Process for producing lyp0philized polyalkyene oxide modified protein and polypeptide complexes with cyclodextrin Download PDF

Info

Publication number
HUT71586A
HUT71586A HU9400561A HU9400561A HUT71586A HU T71586 A HUT71586 A HU T71586A HU 9400561 A HU9400561 A HU 9400561A HU 9400561 A HU9400561 A HU 9400561A HU T71586 A HUT71586 A HU T71586A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
peg
poly
protein
composition
cyclodextrin
Prior art date
Application number
HU9400561A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9400561D0 (en
Inventor
Robert A Snow
Christopher P Phillips
Original Assignee
Sterling Winthrop Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sterling Winthrop Inc filed Critical Sterling Winthrop Inc
Publication of HU9400561D0 publication Critical patent/HU9400561D0/hu
Publication of HUT71586A publication Critical patent/HUT71586A/hu

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A61K47/6951—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes using cyclodextrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5406—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C07K7/083—Neurotensin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

POLI(ALKILÉN-OXID)-DAL MÓDOSÍTOTT FEHÉRJÉK ÉS POLIPEPTIDEK CIKLODEXTRINNEL ALKOTOTT, LIOFILIZÁLT KOMPLEXEI feS~EtTÁRÁSEZEK ELŐÁLLÍTÁSÁRA
Sterling Winthrop Inc., New York, NY
Feltalálók:
PHILLIPS, Christopher P.,
SNOW, Róbert A.,
Amerikai Egyesült Államok
Doylestown, PA
West Chester, PA
Amerikai Egyesült Államok
A bejelentés napja:
Elsőbbsége:
1994. 02. 25.
1993. 02. 25. (023 182)ZUS ?
79024-6458-SZŐ/KmO
- 2 A találmány „csekély-diol” típusú poli(alkilén-oxid)-dal kapcsolt, fiziológiailag hatásos fehérjék és polipeptidek, valamint krioprotektív (liofilizálás során védő hatású) ciklodextrin kombinációját (komplexét) tartalmazó, parenterális adagolásra alkalmas, vizes oldatok liofilizátumára vonatkozik.
Közelebbről a találmány csekély-diol jellegű polietiIéngIiko11aI kapcsolt szuperoxid-diszmutáz és krioprotektív ciklodextrin kombinációjának (komplexének) parenterális adagolásra alkalmas, vizes oldatai liofilizátumaira vonatkozik.
A biológiailag hatásos fehérjéket, különösen az enzimeket és a peptid-hormonokat régóta ideális gyógyszerhatóanyagoknak tekintik különböző betegségek kezelésére, mivel specifikusak és katalitikus hatásuk gyors. Ilyen enzimek például a következők:
Oxido-reduktázok, például: az urát, oxigén-oxidoreduktáz (1.7.3.3 katalógusszámú; „urikáz”);
Hidrogén-peroxid: hidrogén-peroxid-oxidoreduktáz (1.11.1.6.; „kataláz”);
Koleszterin, redukált-NADP: oxigén-oxidoreduktáz (20-β-hidroxilező) (1.14.1.9; „koleszterin-20-hidroxiláz”).
Transzferázok, például: UDP glükuronát-glükoronil-transzferáz (az akceptor nem specifikus) (2.4.1.17; „UDP glükoronil-transzferáz”);
UDP glükóz: a-D-galaktóz-1 -foszfát-uridil-transzferáz (2.7.7.12);
Hidrolázok, például: mukopeptid-N-acetil-muramil-hidroláz (3.2.1.17; lizozim); tripszin (3.4.4.4);
- 3 L-aszparagin-aminohidroláz (3.5.1.1„aszparagináz”);
Liázok, például: fruktóz-1,6-difoszfát;
D-glicerinaldehid-3-foszfát-liáz (4.1.2.12.; „aldoláz”);
Izomerázok, például: a D-xilóz-ketol-izomeráz (5.3.1.5.; xilóz-izomeráz); és a
Ligázok, például: L-citrullin: L-aszparaginát-ligáz (AMP) (6.3.4.5.).
A peptidhormonok például a következők:
Inzulin, ACTH, glukagon, somatosztatin, szomatotropin, timozin, paratiroid hormon; pigmenthormonok, szomatomedin, eritropoietin, luteinizáló hormon, korion-gonadotropin, a hipotalamusz felszabadító faktorai, antidiuretikus hormonok, tiroid-stimuláló hormon, kalcitonin és a prolaktin.
A fiziológiailag hatásos, fehérje jellegű anyagokkal, különösen a nem emberi eredetű enzimekkel végzett terápia ezeknek az anyagoknak a viszonylag rövid felezési ideje és immunogén jellege (immunogenitása) következtében kevéssé volt sikeres. Az adagolás után a gazdaállat védekező rendszere úgy válaszol, hogy az idegen enzimeket az ellenük ható antitestek termelésének megkezdésével eltávolítja, és ezzel lényegében azok terápiás hatékonyságát csökkenti vagy megszünteti. Idegen és egyébként rövid élettartamú emberi enzimek ismételt adagolása lényegében hatástalan, sőt, a kísérő allergiás válasz következtében veszélyes lehet. E problémák (nehézségek) megoldására különböző próbálkozások történtek, például mikrokapszulázás, liposzómákba foglalás útján, génsebészeti úton, valamint enzimeknek polimerekhez kapcsolásával. A legígéretesebb törekvésnek látszik a fehérje jellegű anyagok kapcsolása poli(aIkiIén- 4 -oxid) (PAO) polimerekhez, különösen polietilénglikolokhoz (PEG). Az alábbiakban ezeket a próbálkozásokat bemutatjuk.
A 4 179 337 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti fehérjékhez kötött polietilénglikolokhoz vagy polipropilénglikol alkalmazását fiziológiailag hatásos, nem-immunogén, vízoldható polipeptid készítmény előállítására, ahol a polietilénglikol (az alábbiakban esetenként rövidítve: PEG) szerepe a polipeptid védelme az aktivitásának elvesztésétől, lényeges immunogén válasz kiváltása nélkül. E szabadalomban a polietilénglikolnak fehérjéhez kapcsolására leírt módszer abban áll, hogy egy protein aminocsoportját alakítják amiddé vagy pszeudoamiddá - az aminocsoport töltéshordozó kapacitásának elvesztésével - vagy a fehérje aminocsoportján, vagy annak közvetlen szomszédságában egy heteroatomos szubsztituenst - például hidroxilcsoportot vagy gyűrürendszert vezetnek be, amely a polimer vázában nem ismétlődik.
F. M. Veronese és munkatársai [J. of Pharmacy and Pharmacology 35, 757-758 (1933)] közölték, hogy ha a szarvasmarha vörösvérsejtjéből származó szuperoxid-diszmutázt polietilénglikol-karbonsav-(N-hidroxi-szukcinimid)-aktív észterrel reagáltatva módosították, akkor az enzim felezési ideje patkányokban meghaladta a nem módosított fehérje felezési idejét.
Az Anjimoto, Inc. cég 0 200 467 publikált európai szabadalmi bejelentésében olyan szuperoxid-diszmutázt ismertet, amelyet a polimer mindkét végén aktivált karboxil kapcsolócsoportokkal funkcionalizált poli(alkil-oxid)-dal kémiailag módosítottak, és mindkét aktivált karboxilcsoport proteinekkel (fehérjékkel) reagálni képes. Mivel az aktivált kapcsolóhelyek a • * · · · · · • · · · · · · • ·· ···· *
- 5 polimer lánc ellentétes végein helyezkednek el, nem valószínű, hogy a polimer egyik végén lévő aktivált csoport jelenléte lényeges hatással van a polimer másik végén lévő csoport reakcióképességére. A polimerek mindkét végükön képesek fehérjékkel térhálósító reakcióba lépni, aminek során a fehérjékből és a poli(alkilén-oxid)-ből kopolimerek képződnek. Az ilyen kopolimereknek nincsen jól meghatározott vagy molekulárisán (molekuláris alapon) sztöchiometrikus összetétele.
F. M. Veronese és munkatársai [J. of Controlled Release 10, 145-154 (1989)] közük, hogy a szuperoxid-diszmutáz (a továbbiakban esetenként rövidítve: SÓD) monometoxi-polietilénglikollal (a továbbiakban esetenként: MPEG) végbemenő származékképzése (derivatizálása) termékek heterogén keverékéhez vezet. Kimutatták, hogy ez a heterogenitás attól függ, hogy milyen mértékben vannak jelen bifunkciós (dimetoxilezett) polietilénglikol-molekulák (DPEG) a monometoxilezett molekulák között.
A fenti próbálkozások némileg hosszabb felezési idejű és kevésbé immunogén fehérje jellegű, fiziológiailag hatásos anyagokat eredményeztek; úgy látszik azonban, hogy további tökéletesítések szükségesek arra a célra, hogy sokféle betegséget ezekkel az ígéretes biológiai anyagokkal kezelhessünk.
Az egyidejűleg vizsgálat alatt lévő 07/936,416 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben közük, hogy biológiailag hatásos, fehérje jellegű anyagok felezési ideje meghosszabbítható, és immunogén sajátságaik csökkenthetők úgy, hogy azokat csekély-diol típusú poli(alkilén-oxid)-dal, előnyösen polietilénglikollal kémiailag módosítják. Az ismertetett • · • · · · • · · · · · · • · · · · · · • «· ···· ·
- 6 készítményeknek határozott előnyei vannak az előzőleg közölt, polietilénglikollal módosított, fehérje jellegű anyagok készítményeivel szemben.
Folyékony állapotban végzett tárolás során a polietilénglikollal módosított fehérjemolekulák hidrolizálnak, s így szabad polietilénglikol, polietilénglikollal kapcsolt fehérje és szukcinát-fehérje molekulaegységek keveréke képződik. E destabilizáló folyamat megelőzése céljából a készítmények liofilizálhatók. Liofilizálás során azonban a fehérje és a stabilizálószerek koncentrációja magas, és ez - az alkalmazott vivőanyagoktól függően - a tárolás során végbemenő, molekulák közötti halmozódás (aggregáció) mértékét károsan befolyásolja.
Azt találtuk, hogy ciklodextrinek a csekély-diol típusú polietilénglikollal kovalensen kapcsolt fehérjék tárolás során bekövetkező intramolekuláris halmozódásának sebességét csökkentik, s így hosszabb tárolási időtartamot tesznek lehetővé.
Ismert, hogy a ciklodextrinek zárványkomplexeket képesek alkotni, és ehhez szolubilizáló sajátságok társulnak. Ismert továbbá, hogy ciklodextrinszármazékok is ilyen sajátságokkal rendelkeznek. Ezek alkalmazását a kővetkező szabadalmak mutatják.
A 4 596 795 számú, amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás nemi hormonok adagolására vonatkozik ciklodextrin hidrofil származékaival, így poli(p-ciklodextrin)-nel vagy (hidroxi-propil)-p-ciklodextrinnel alkotott komplexeik alakjában, szublinguális vagy bukkális (szájüregi) úton. Úgy találták, hogy • · · · · • · · • · · · · · ·
- 7 ezek a komplexek vízben igen jól oldódnak, és más ciklodextrinszármazékokkal összehasonlítva erős hatásúak.
A 4 727 064 számú, amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban vízben kevéssé oldható hatóanyag és amorf, vízben oldható, ciklodextrin-alapú keverékből álló gyógyászati készítményeket írnak le. A ciklodextrin-alapú keverék hozzáadása a hatóanyag oldódási sajátságait javítja. A ciklodextrin-alapú keveréket nemszelektív alkilezéssel amorffá alakított α-, β- vagy γ-ciklodextrinből állítják elő.
A WO 90/03784 számmal közzétett PCT/US89/04099 számú nemzetközi bejelentésben olyan liofilizált készítményeket ismertetnek, amelyek egy polipeptidet, valamint β- és γ-ciklodextrin (hidroxi-propil)-, (hidroxi-etil)-, glükozil-, maltozil-, vagy maltotriazolilszármazékainak stabilizáló, szolubilizáló mennyiségét tartalmazzák.
A 4 983 586 számú, amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban módszert közölnek lipofil és/vagy vízzel szemben labilis hatóanyagnak az injekció helyén végbemenő kicsapódása csökkentésére a hatóanyag parenterális adagolása során. Ez a módszer abban áll, hogy a hatóanyagot körülbelül 20-50 % (hidroxi-propil)^-ciklodextrint tartalmazó vizes oldatban adagolják. Közük e módszer alkalmazását számos hatóanyagra, ilyenek például: a daganatgátlók, szedatívumok (nyugtatok), trankvillánsok, görcsgátlók, depresszió elleni hatóanyagok, altatók, izomrelaxánsok, görcsoldók, gyulladáscsökkentők, antikoagulánsok, kardiotóniás hatású anyagok, értágítók és antiarritmikumok.
• · · · · • · · · • · · · · · • · · · · · « »· ···< • · · · • · • • » ·
- 8 -
Meglepő módon azt találtuk, hogy olyan liofilizált,
parenterális adagolásra alkalmas készítmények, amelyek
„csekély-diol” típusú poli(alkilén-oxid)-dal kapcsolt, fiziológiai-
lag hatásos fehérjét vagy polipeptidet ciklodextrinnel alkotott komplex alakjában tartalmaznak, hosszabb tárolási idő során a készítményeknek intermolekuláris aggregáció nélküli stabilitást biztosítsanak.
Ennek alapján lehetővé válik csekély-diol típusú poli(alkilén-oxid)-dal (azt alábbiakban röviden: LDPAO), előnyösen csekély dioltartalmú polietilénglikollal (az alábbiakban röviden: LDPEG) kovalensen kapcsolt, fiziológiailag hatásos fehérjék ciklodextrinnel alkotott komplexeinek átalakítása stabilis, parenterális készítményekké.
A találmány szerint tehát megvalósítható olyan vizes, fiziológiailag hatásos, fehérje jellegű, liofilizálható készítmény, amely körülbelül 150 és körülbelül 150 000 egység/ml közötti mennyiségben csekély-diol típusú, poli(alkilén-oxid)-dal kovalensen kapcsolt fehérjét, körülbelül 0,1 és körülbelül 20 tömeg/térf.% közötti mennyiségben ciklodextrint, és körülbelül 0,01-től körülbelül 50 mM koncentrációban puffért tartalmaz, s amely készítmény pH-értéke körülbelül 5,7 és körülbelül 6,5 között van.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a készítmény körülbelül 25 000 és körülbelül 150 000 egység/ml, legelőnyösebben körülbelül 50 000 és körülbelül 150 000 egység/ml közötti · · ·
4 4 44 · · ·4 • 4· • ·« 4444·
- 9 mennyiségű, (pοIiaIkilén-oxid)-daI kapcsolt fehérjét és körülbelül 1,0-tól körülbelül 15 tömeg/térf.%-ig terjedő mennyiségű, legelőnyösebben körülbelül 5 és körülbelül 10 tömeg/térf.% mennyiségű ciklodextrint tartalmaz.
E leírásban a „csekély-diol” típusú kifejezés - a poIi(aIkiIén-oxid), így a polietilénglikol vonatkozásában olyan lineáris poli(alkilén-oxid)-ot jelent, amely legfeljebb körülbelül 10 % nem-monoalkoxilezett poli(alkilén-oxid)-ot, előnyösen nem-monometoxilezett polietilénglikolt tartalmaz.
A találmány megvalósítása során alkalmazott előnyös, csekély-diol típusú poli(alkilén-oxid)-ok előnyösen olyan polietilénglikol-polimerek, amelyek legfeljebb körülbelül 10 tömeg% nem-monometoxilezett polietilénglikolt tartalmaznak, és átlagos molekulatömegük körülbelül 1000 és körülbelül 15000 dalion között van; ezek különösen alkalmasak biológiailag hatásos fehérjékkel, kiváltképpen szuperoxid-diszmutázzal kovalens kötés kialakítására. A találmány szerint még előnyösebben polietilénglikolokat alkalmazunk, amelyek átlagos molekulatömege körülbelül 2000 és körülbelül 10 000 dalton közötti, legelőnyösebben körülbelül 4000 és körülbelül 6000 dalton közötti, és ahol a polietilénglikol előnyösen körülbelül 7 tömeg%-nál, legelőnyösebben körülbelül 5 tömeg%-nál kevesebb nem-monometoxilezett polietilénglikolt tartalmaz.
A találmány megvalósítása során például a következő biológiailag/fiziológiailag hatásos fehérjéket, polipeptideket és hormonokat alkalmazzuk:
Rekombináns emberi interleukin-4 (rhulL4);
Carlsberg-féle szubtilizin proteáz;
• · · ·4 ··»« • · « · · · • · ··· · · • · · · « · • ·· ···· « szuperoxid-diszmutázok, így a szarvasmarha-, emberi- és különböző rekombináns szuperoxid-diszmutázok, például a rekombináns emberi szuperoxid-diszmutáz (rhuSOD); valamint
Oxidoreduktázok, transzferázok, hidrolázok, liázok, izomerázok és ligázok, például a fentebb felsoroltak, valamint a már fentebb felsorolt peptidhormonokon kívül az alábbiak:
interferonok (α-, β- és γ-); antitestek (IgG, IgE, IgM, IgD); az interleukin-1, -2, -3, -4 és -7; a granulocita-kolónia-stimuláló faktor (GCSF); granulocita-makrofág kolóniát stimuláló faktor (GM-CSF); a daganatnekrózis faktor (TNF); a trombocita-eredetű növekedési faktor (PDGF); az epidermisből eredő növekedési faktor (EGF); idegnövekedési faktor (NGF); csontnövekedési faktor (BGF); a növekedési hormont felszabadító faktor (GNRH); papain; kimotripszin; termolizin; valamint a sztreptokináz és az aktiváz.
A találmány szerint alkalmazott ciklodextrinek 6, 7, illetve 8 glükózegységből álló α-, β- és γ-ciklodextrinek. Ezek ismertek; valamint ismert, hogy képesek zárványkomplexek kialakítására egyes gyógyszerhatóanyagokkal, fehérjékkel és polipeptidekkel, továbbá ezzel együttjáró szolubilizáló sajátságokkal rendelkeznek.
A ciklodextrin belső ürege lipofil, a ciklodextrin külső felülete viszont hidrofil. E sajátságok alapján a ciklodextrineket felhasználták zárványkomplexek kialakítására gyógyszeranyagokkal. A csekély-diol típusú poli(alkilén-oxid) és fehérjék • · · »· ···« • « · · 9 · • · ··· « « • · · · · · · • ·· ···· <
- 11 konjugátumainak stabilizálására a β-ciklodextrin hidroxi-etil-, hidroxi-propil-, glükozil-, maltozil- és maltotriozil-származékai különösen alkalmasak.
A találmány megvalósítása során alkalmazott, gyógyászati szempontból elfogadható vizes vivőanyag nemtoxikus, közömbös (inért) közeg, amelyben a ciklodextrinnek a csekély dioltartalmú poli(alkilén-oxid)-dal konjugált pepiiddel alkotott komplexét és gyógyászati szempontból elfogadható puffért - így nátrium-foszfátot, nátrium-acetátot, nátrium-karbonátot - valamint ásványi és szerves savakból eredő pufferokat oldunk. Gyógyászati szempontból elfogadható puffereken azt értjük, hogy a puffer az emlősök organizmusára a pufferanyagok szokásos orvosi adagjaiban viszonylag ártalmatlan, tehát a hatásos komplex kedvező sajátságait a pufferoknak tulajdonítható mellékhatások nem rontják.
A találmány szerinti készítmények előállítási eljárásában először a csekély-diol típusú polialkilénglikölt - ez esetben polietilénglikolt - kovalensen kötjük a biológiailag hatásos fehérjéhez, vázlatosan a következő módon:
a) LDPEG + karboxilező szer......-> LDPEG-COOH
b) LDPEG-COOH + karboxilcsoportot aktiváló szer.....->
az LDPEG-COOH aktív észtere
c) n(LDPEG-COOH aktív észter) + fehérje-----> (LDPEG-
-CO)n-fehérje ahol
LDPEG-COOH jelentése: a hidroxilcsoportos helyeken karboxilezett LDPEG; és «··«
- 12 n jelentése: az LDPEG fehérjével végbement kapcsolás helyeinek száma.
Az LDPEG-et a hidroxilcsoportok helyein karboxilezzük, majd a karboxilcsoportokat karboxil-aktiváló szerrel észterezzük, s így aktív észtereket alakítunk ki, amelyeket azután a fehérjemolekulával kapcsolunk. A fehérjéhez kötött LDPEG molekulák száma a proteinmolekulán jelenlévő reakcióképes csoportok - például aminocsoportok - számától függ.
Ezt követően az LDPEG-t gyógyászatilag elfogadható vizes vivőanyagban oldjuk, majd a kívánt ciklodextrint hozzáadjuk és feloldjuk. Ekkor az oldatot liofilizáló berendezésben liofilizáljuk. A liofilizált oldatot a betegnek végzett adagolás előtt steril vízzel helyreállítjuk (rekonstituáljuk).
A találmány egy másik jellemző sajátsága eljárást tesz lehetővé liofilizált, biológiailag hatásos, fehérje jellegű készítmény előállítására, amely a következő lépésekből áll:
a) 10 tömeg%-nál kevesebb nem-monoalkoxilezett poli(alkilén-oxid)-ot tartalmazó poli(alkilén-oxid)-ot karboxilezünk;
b) a karboxilezett poli(alkilén-oxid)-ot aktiválva aktív poli(alkilén-oxid)-észtert állítunk elő;
c) az így kapott, aktív poli(alkilén-oxid)-észtert kovalensen kapcsoljuk a biológiailag hatásos fehérjéhez;
d) az így kapott, poli(alkilén-oxid)-észtert a biológiailag hatásos fehérjével kovalensen kapcsolva víztartalmú közegben szolubilizáljuk;
• · * «4··« • · · · » · * · ··· «4 ···« 4 4·
44 «44««
e) az így létrehozott vizes közegen ciklodextrint oldva homogén oldatot képezünk;
f) az így kapott oldat pH-értékét körülbelül 5,7 és körülbelül
6,5 közötti értékre állítjuk; és
g) az oldatot liofifizáljuk.
A következőkben a találmányt konkrétan a szuperoxiddiszmutázra hivatkozva (egyes esetekben rövidítve: SÓD) részletesen ismertetjük.
A szuperoxid-diszmutáz sejten belüli (intracelluláris) enzim, amely valamennyi, az oxigént metabolizáló sejtben jelen van, és felelős a szuperoxid gyök oxigénné és hidrogén-peroxiddá végbemenő konverziójáért. A szuperoxid-gyökről és az abból származó egységekről úgy vélik, hogy többféle típusú gyulladásos megbetegedés kórokai. A szuperoxid-diszmutázt jelenleg is alkalmazzák egyes gyulladásos állapotok kezelésére Orgotein védett néven. Ezen túlmenően vizsgálták a SÓD alkalmazását bronchus-tüdőfejlődési rendellenességekben, túlnyomásos oxigén toxicitásában, égési sebek és fertőzések okozta heveny gyulladásban, szervátültetéseket követő reperfúziós károsodásban, szemlencse mögötti rostszövetképződés, valamint gyógyászati célból alkalmazott ionizáló sugárzás mellékhatásai és egyes kóros bőrállapotok eseteiben. Ha azonban a SOD-t egy emlősállatnak intravénás befecskendezéssel adagolják, akkor az enzim felezési ideje csupán néhány perc, majd a keringésből eltűnik. Ennek eredményeként az enzimaktivitás nem elegendő a toxikus anyagok eltávolítására a vérkeringésből. Másrészt az ismételt adagolás káros mellékhatásokkal jár.
*♦· » · ··· • *·· γ
- 14 Ha az LDPAD-t - amely különböző molekulatömegű poli(alkilén-oxid)-ok láncait és lánconként legalább egy hidroxilcsoportot tartalmaz - amilyen például az LDPEG - a SOD-hoz kapcsoljuk, akkor olyan biológiailag hatásos készítményt alakíthatunk ki, amelynek felezési ideje hosszabb és immunogenitása csekélyebb, mint akár a natív SÓD vagy a PAO-SOD készítményé. A liofilizálás során az LDPEG nemkivánt halmazokat alkot, amelyek biológiai hatásosságát befolyásolják. Az LDPEG ciklodextrinnel képezett komplexe a halmaz kialakulását kiküszöböli, és a rekonstituált készítményt tartós tárolásra is stabillá teszi.
Az LDPEG SOD-hoz kapcsolódásának eljárása (esetenként a továbbiakban: LDPEG-kapcsolás) az alábbi lépésekből áll:
A kevés dióit tartalmazó metoxi-PEG-t - amelynek átlagos molekulatömege körülbelül 1000 és körülbelül 15 000 közötti, még előnyösebben körülbelül 2000 és körülbelül 10 000 közötti, legelőnyösebben körülbelül 4000 és körülbelül 6000 dalton közötti, és amely legfeljebb körülbelül 10 % nem-monometoxilezett PEG-t tartalmaz - szukcinilezés útján, előnyösen borostyánkősavanhidriddel (a továbbiakban röviden: SA), a reakcióképes észterszármazékká aktiváljuk; ezt előnyösen N-hidroxi-szukcinimiddel (NHS) végezzük, amellyel LDPEG-SS-t alakítunk ki, majd az így kapott LDPEG-SS terméket reagáltatjuk a SÓSAV-OLDATTAL enzim valamely hozzáférhető reakcióképes helyével, előnyösen az SOD-on jelenlévő primer aminnal, főként a lizin ε-aminocsoportjával.
Az LDPEG-SOD esetében az eljárás konkrétan az alábbi:
• r*.·
- 15 LDPEG-OH
SA
Ψ
LDPEG-S
NHS/DCC
Ψ
LDPEG-SS + bSOD
LDPEG-SS + H2O (LDPEG)n.,bSOD-(S)2 + LDPEG-OH h2o
Ki
------> (LDPEG)nbSOD + nNHS
Kobs
--> LDPEG-S + NHS k2
H2O
LDPEG-OH + Sacid ahol:
LDPEG-OH =
LDPEG-S
LDPEG-SS =
DCC bSOD csekély-diol típusú CH3O-PEG-0H, amely legfeljebb körülbelül 10 tömeg/térf.% HO-PEG-OH-t tartalmaz;
csekély-diol típusú CH3O-PEG-OCOCH2CH2COOH, amely legfeljebb 10 % [HOOC-CH2CH2-COO]2PEG-t tartalmaz;
csekély-diol típusú CH3O-PEG-OCOCH2CH2COO(C4H4NO2), amely legfeljebb 10 % [(C4H4O2N)OOC-CH2CH2COO]2-PEG-t tartalmaz;
diciklohexil-karbodiimid; szarvasmarha-eredetű szuperoxid-diszmutáz;
• · ·
- 16 NHS = (C4H4NO2)OH, N-hidroxi-szukcinimid;
(LDPEG)nbSOD = csekély-diol típusú (CH3O-PEG-OCOCH2CH2CO)n-bSOD;
(LDPEG),,.!bSOD-S = csekély-diolt tartalmazó (CH3O-PEG-OCOCH2CH2CO)n.1-bSOD-COCH2CH2COOH;
Sacid: borostyánkősav;
n = a csekély dióit tartalmazó PEG száma SOD-onként; és
K1, Kobs, k2, valamint k3 a reakciók sebességi állandói.
Az alábbiakban ismertetjük a találmány szerinti készítményekben felhasznált, alapvetően fontos komponenseket.
Kiindulási anyagok, közbenső termékek és reagensek
Szuperoxid-diszmutáz (röviden: SÓD)
A szuperoxid-diszmutáz olyan enzimcsoport neve, amelynek tagjai katalizálják a szuperoxid gyökanion (O2 ) lebomlását oxigénre és hidrogén-peroxidra.
A SÓD a Nemzetközi Biokémiai Egyesület rendszeres nómenklatúrájában szuperoxid-oxidoreduktáz néven ismert, az Enzim Katalógusban a száma 1.15.1.1. Ezeket az anyagokat orgoteineknek, hemokupreineknek, valamint szuperoxid-diszmutázoknak is nevezték; molekulatömegük körülbelül 4000-től körülbelül 48000-ig terjed. A réz-cink-diszmutázok figyelemre méltóan egységes vegyületcsoport, ha a szerkezeti sajátságaikat nagyjából vesszük figyelembe. Kimutatták, hogy a tisztított enzimek kivétel nélkül dimerek (molekulatömegük általában
- 17 31000-33000), és molekulánként két atom réziont és két atom cinkiont tartalmaznak. A mangán-vas enzimcsoport az alapvető sajátságok szempontjából - amilyen a molekulatömeg, az alegységek szerkezete és a fémtartalom - nem ilyen egységesek. Egyesek dimerek, mások tetramerek. Fémtartalmúk a polipeptid láncú alegység 1 molekulájára számítva körülbelül 0,5 - 1 mól. Az emlősökből származó, természetes előfordulású cink-réz-tartalmú enzimeket és ezek funkcionálisan kompetens analógjait és muteinjeit tekintik emlős cink/réz-szuperoxid-diszmutázoknak (mSOD).
A találmány szerinti készítményekben jelenlévő mSOD bármilyen eredetű lehet. Iparilag szarvasmarha-eritrocitákból és emberi eritrocitákból, valamint mikroorganizmusokban, így E. coli-ban és élesztőben lejátszódó, rekombináns szintézis útján állítják elő. Egyéb források közül a szarvasmarha májában lévő réz-cink-szuperoxid-diszmutáz (SÓD, EC 1.15.1.1) („EC” jelentése: Enzim-Katalógus) például a DDI Pharmaceuticals, Inc. cégtől szerezhető be (Mountain View, California).
Pol i(a Iki lén-οχ id), amelyet itt a polietilénglikol példáján mutatunk be
A találmány gyakorlati megvalósítása során biológiailag hatásos fehérjékhez kapcsolás céljára előnyösen a csekély-diol típusú PEG-t használjuk. Jóllehet bizonyos molekulatömegű metoxi-polietilénglikolok kereskedelmi forgalomból beszerezhetők (így például a metoxi-PEG50oo beszerezhető a Unión Carbide Corporation cégtől kétféle formában: egyik a szokásos úton beszerezhető „sok diói” típusú metoxi-PEG5000, amely 14-17 % magasabb molekulatömegű PEG-diolt tartalmaz; a másik forma • ·· ·· ···· • · · · · · * • · · · · · «
- 18 egy csekély-diol típusú termék, amely legfeljebb 4 % PEG-diolt tartalmaz); egyeseket elő kellett állítanunk és tisztítanunk, hogy kevéssé immunogén kapcsolt fehérjét kapjunk. így például SÓD kapcsolása egyes kereskedelmi forrásokból származó metoxi-PEG-SS-anyaggal olyan terméket eredményez, amely magas molekulatömegű komponenseket tartalmaz, amint ezt mérethatár-kizárásos kromatográfiával igazoltuk. Úgy véljük, hogy ez a nagy molekulatömegű termék a fehérjének aktivált diészterrel végbemenő térhálósításából ered; ez az aktív diészter az M-PEG kereskedelmi forrásaiban található PEG-diol különböző mennyiségeiből keletkezik. Az egyes aktív észterek - jóllehet azonos polimer láncon helyezkednek el - kémiailag egymástól távol állnak. így a polimeren egy második reakcióképes funkciós csoport jelenléte mindinkább elhanyagolható hatást fejt ki az első reaktív funkciós csoport reakcióképességére, amint a két funkciós csoport közötti távolság növekszik. Ennek következtében a csoportok egyedi reakcióképessége hajlamos függetlenné válni a polimer lánc két ellenkező végén elhelyezkedő egységektől, és a reagensek végtelen hígítása nélkül a térhálósítás nem kerülhető el. Ennek megfelelően lényeges szempont olyan M-PEG-SS szintetizálása, amelyről tudjuk, hogy nagyon csekély mennyiségű vagy egyáltalán semmi diésztert nem tartalmaz. S. Zalipsky és munkatársai [J. of Bioactive and Compatible Polymers 5, 227-231 (1990)] közölték polietilénglikol 2000 megtisztítását a metoxi-etilénglikol 2000-től. A szukcinát-észtereket is előállítottuk, és kimutattuk, hogy DEAE-Sephadex ioncserélő gyantán kromatografálva elkülöníthetők. A preparatív módszert a 3. példában mutatjuk be.
- 19 Bár a 3. példában közölt eljárás a PEG-2000 esetében jól használható, nagyobb molekulatömegéi PEG-ok esetében csődöt mond. Magasabb molekulatömegű PEG-savak anionos vagy kationos gyantákhoz nem kötődnek; nézetünk szerint a polietilén-váz nagyobb tömege az adott sav ionos sajátságait elfedi (maszkírozza). Úgy találtuk, hogy rendkívül csekély ionerősségű puffer szükséges a PEG-szukcinátok kötésére, és a PEG-szukcinátok az ionerősség igen csekély növelése útján eluálhatók. Ez arra utal, hogy a gyantához csak nagyon gyengén kötődnek.
Azt találtuk, hogy magasabb molekulatömegű metoxi-PEG-ok a diol-komponensektől elválaszthatók, ha a hidroxil funkciós csoportokat előbb - a fordított fázisú vékonyrétegkromatográfia alkalmazása előtt - dimetoxi-tritil (DMT) éter-csoportokká alakítjuk. Savas kezeléssel a hidroxilcsoportok felszabadíthatok.
Az alábbiakban vázlatosan ismertetjük PEG5000 dimetoxi-tritil-származékainak (M-PEG-DMT) az előállítását és tisztítását. Erre vonatkozó részleteket a 4.-7. példákban írunk le.
Az M-PEG-DMT-t és DMT-PEG-DMT-t ugyanúgy állítjuk elő. A poliétert etanolmentes kloroformban oldjuk, és az oldatot úgy szárítjuk, hogy a kloroformnak mintegy felét argongáz alatt atmoszféranyomáson ledesztilláljuk. Ezután az oldatot szobahőmérsékletre hűlni hagyjuk argongáz alatt, majd 1,5 ekvivalens, azaz fölös diizopropil-amint, 10 mól% 4-(dimetil-amino)-piridint katalizátorként, végül 1,2 ekvivalens, fölös mennyiségben 4,4-dimetoxi-tritil-kloridot adunk hozzá. 15 órás reakció után az oldatot forgóbepárlón (rotavaporon) bepároljuk, majd az oldatot vízmentes éttérhez adva a tritilezett PEG-t lecsapjuk. Normál fázisú vékonyrétegkromatográfiával a kiindulási anyagtól a termék világosan elkülönül, mivel a PEG váza Dragendorf-reagenssel festődik. Jóllehet M-PEG-DMT normál fázisú vékonyrétegkromatográfia (VRK) segítségével nem különíthető el a DMT-PEG-DMT-től, fordított fázisú C-18 VRK lemezeken az M-PEG-DMT, DMT-PEG-DMT, DMT-klorid és DMT-alkohol világosan elkülönülnek egymástól (mozgó fázisként acetonitril, víz és izopropanol 4:1:1 arányú elegyét alkalmazzuk). A PEG-vázat alátámasztja, hogy a Dragendorf-reagenssel narancsvörösre színeződik; a tritilcsoportok beépülését azzal támasztjuk alá, hogy a lemezt savgőzök hatásának tesszük ki; ekkor narancsszínűre festődik.
Kimutattuk, hogy autentikus M-PEG-DMT 5000 világosan elkülönül az autentikus DMT-PEG-DMT 8000-től egy Waters C-8 300 A pórusméretű, 15-20 mikronos részecskeméretű Prep-Pak Bondapak tölteten. A nyers M-PEG-DMT-t ultrahangkezelés közben 30 % acetonitrilt tartalmazó vízben megközelítőleg 12 mg/ml koncentrációban oldottuk, majd 2,5 mikron szűrőnyílású szűrőn vezettük át. A mintát két oszlopra vittük fel (25 ml-ben 2 9) 30 % acetonitrilt tartalmazó vízben, mint mozgó fázisban. Nyolc perces izokratikus eluálással eluálható volt egy szennyező csúcs (amelyet nem azonosítottunk; 280 nm hullámhosszon magas abszorbanciát mutatott, viszonylagos tömege azonban nagyon csekély). 30-70 % acetonitrilt tartalmazó vízzel gradiens eluálást kezdtünk 21 percig, és a kívánt M-PEG-DMT-t 58-60 % acetonitriltartalomnál eluáltuk. Az autentikus DMT-PEG-DMT általában 80 % acetonitriltartalomnál eluálható. A kívánt csúcs első 3/4 részét gyűjtjük, az utolsó 1/4 részét elvetjük. Ezen az
- 21 úton 22,6 g nyers M-PEG-DMT-ből tisztítás után 15,4 g M-PEG-DMT-t kaptunk.
A tritilcsoportot az M-PEG-DMT-ből a következőképpen hasítjuk le.
Ha az M-PEG-DMT-ből a DMT csoportot HCI-val kíséreltük meg eltávolítani, akkor a nyers, hígítatlan reakcióelegy VRK vizsgálata a tritilcsoport teljes eltávolítására utal. A kloroformos kivonat bepárlása azonban egy visszafelé irányuló reakcióhoz vezetett, amelynek eredményeként a PEG jelentős hányada ismét tritileződött. Ezt a terméket szelektív kicsapással nem lehetett tisztítani. A hidratált tritil-kation és klorid látszólag egyensúlyban vannak, s ennek eredményeként- amint ez oldószer eltávolítása során történik - jelentős mennyiségű DMT-klorid termelődik. E retritilezés kiküszöbölhető egy egyensúlyban részt nem vevő társion alkalmazásával. Kimutattuk, hogy kénsavval az M-PEG-DMT irreverzibilisen detritilezhető. A kénsavval végzett hasítás után az M-PEG kloroformmal extrahálható, az oldatot bepároljuk, és éterrel végzett kicsapás után tiszta, dióit nem tartalmazó M-PEG-t kapunk. Ezzel a módszerrel 10 g M-PEG-DMT-ből hasítás útján 8,68 g zérus diol-tartalmú M-PEG-t kaptunk. A méretkizáró kromatográfia mutatja, hogy ez a termék 0,3 %-nál kevesebb dióit tartalmaz.
Hasonló eljárással más, magasabb molekulatömegű metoxi-PEG-származékok is készíthetők.
Az alábbiakban a találmányt példákban (részletesen) mutatjuk be. E példák szemléltetik a csekély-diol típusú PEG és fehérje jellegű anyagok konjugátumainak az előállítását • ·· ·
- 22 ciklodextrin-komplex kialakítása céljából; azonban a példák a találmány oltalmi körét semmiképpen sem korlátozzák.
1. példa
A. (Metoxi-polietilén-glikol)-szukcinát (M-PEG-S) literes lombikban 100 g (0,02 mól) metoxi-PEG5000 (M-PEG) terméket keverés közben 300 ml meleg (40 °C hőmérsékletű) vízmentes toluolban oldunk. Ezután a térfogatot úgy csökkentjük, hogy 147 ml toluolt nitrogéngáz alatt azeotróposan ledesztillálunk, s így az M-PEG eredeti 1,73 % víztartalmát 0,23 %-ra csökkentjük. Környezeti hőmérsékletre hülés után előbb 233 ml száraz diklór-metánt (a továbbiakban esetenként: DKM), s utána 3,0 g (0,09 mól) borostyánkősavanhidridet és 1,1 g (0,01 mól) 4-(dimetil-amino)-piridint (DMAP) adunk hozzá. A reakcióelegyet éjszakán át keverés közben visszafolyató hűtő alatt forraljuk, majd 200 ml DKM-t vákuumban lepárolunk. A maradékot keverés közben 4 literes lombikba helyezett 1,6 literes éterbe öntjük, az elegyet 45 percig keverjük, majd szűrjük. így
100,4 g nyers, fehér, szilárd M-PEG-szukcinátot kapunk (M-PEG-S), amely DAMP-t tartalmaz.
100 g M-PEG-S nyersterméket 633 ml DKM-ban oldunk, és 114 g (előzőleg 272 ml dioxánnal, majd 316 ml száraz DKM-mal mosott Dowex 50x8-100H+ gyantát tartalmazó oszlopon vezetjük át, utána az oszlopot további 316 ml DKM-nal mossuk, az eluátumokat egyesítjük, és vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. A DKM-t (800 ml) vákuumban lepároljuk, és a visszamaradó oldatot keverés közben 4 literes lombikban elhelyezett 1600 ml éterhez adjuk. 30 perces keverés után a szuszpenziót 30 percig állni hagyjuk, majd szűrjük. A szűrőkalácsot 75 ml • · • · · · · · • · · · · · • · · · · · · ··♦· · · · • ·· ···· ·
- 23 éterrel mossuk, utána vákuumban szárítjuk. így 96,0 g (94 %) hozammal fehér, szilárd M-PEG-S-t kapunk, amely a várt szerkezettel megegyező 1H-NMR színképet mutatott.
1H-NMR (CDCI3) δ: 4,27 (triplett, 2H, -CH2-O-C(=O)-), 3,68 (széles szingulett, PEG metilén O-CH2-k),
3,39 (szingulett, 3H, OCH3) és 2,65 ppm (szűk multiplett, 4H, -C(=O)-CH2-CH2-
-C( = O)-). Titrálással mérve a karbonsavtartalmat 0,000207 mol/g-nak találtuk.
B. (Metoxi-polietilénglikol)-(N-szukcinimidil-szukcinát) (M-PEG-SS)
98,48 g (0,0192 mól) (metoxi-polietilénglikol-szukcinát)-ot (M-PEG-S) 2 literes lombikban, 40 °C hőmérsékleten 468 ml száraz toluolban oldunk. Az oldatot szűrjük, és a szűrlet térfogatát azeotrópos desztillációval nitrogéngáz alatt 263 ml-rel csökkentjük. Az így kapott, viszkózus folyadékot nitrogéngáz alatt 225 ml száraz DKM hozzáadásával 1 literes háromnyakú lombikba visszük át, 2,22 g (0,0192 mól) N-hidroxi-szukcinimidet (NHS) adunk hozzá, és a reakcióelegyet az NHS oldódásáig keverjük, majd 5 °C-ra hűtjük jégfürdőben, és 4,44 g (0,0125 mól) DCC 24 ml DKM-nal készült oldatát 5 perc alatt hozzácsepegtetjük. A DKM-DCC oldat hozzáadása során a reakcióelegyből diciklohexil-karbamid (DCU) kezd kikristályosodni. A reakcióelegyet szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni, majd éjszakán át keverjük. Ekkor a lombik tartalmát 25 ml DKM alkalmazásával (ezzel öblítünk) 2 literes lombikba visszük át.
• · • · ·
250 ml DKM-t 30 ’C hőmérsékleten vákuumban eltávolítunk, a visszamaradó szuszpenziót szűrjük, és a szűrőkalácsot 25 ml száraz toluollal mossuk. A szűrletet 1,2 liter vízmentes éterhez adjuk keverés közben, és szűrés előtt az így kapott szuszpenziót 45 percig keverjük. A szűrőkalácsot 100 ml száraz éterrel mossuk és 2 órán át szárítjuk. Az így kapott, szilárd terméket ezután igen jó vákuumban szárítjuk, majd argongáz alatt lombikba visszük át. így 96,13 g (96,1 %) cím szerinti vegyületet kapunk (M-PEG-SS) fehér, szilárd termékként amelynek 1H-NMR színképe a várható szerkezettel összhangban van.
’H-NMR (CDCI3) δ: 4,32 (triplett, 2H, -CH2-O-C(=O)-)-, 3,68 (széles szingulett, PEG metilén-O-CH2-k),
3,39 (szingulett, 3H, OCH3), 2,99 és 2,80 (triplettpár, egyenként 2H, szukcinát -C(=O)-CH2-CH2-C)=O)-) és 2,85 ppm (szingulett, 4H, szukcinimid -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-).
A termék aktív észter tartalmát úgy határozzuk meg, hogy feleslegben vett benzil-aminnal reagáltatjuk toluolban, majd dioxánban perklórsavval visszatitráljuk a bázis maradékát metilvörös indikátor végpontjáig. Az aktív-észter-tartalmat 0,000182 mól/g értéknek találtuk.
C. Csekély diói típusú PEG-SOD
82, 1 mg/g fehérjét tartalmazó 11,8 g vizes SOD-oldatot 0,1 M nátrium-foszfát pufferoldattal 7,8 pH-n 200 g összes tömegre hígítunk, és a kapott oldathoz 30 ’C hőmérsékleten, mágneses keverés közben 3,4 g csekély-diol típusú metoxi-PEG-SS-t adunk (amelyet az 1B. példa szerint állítottunk elő). A reakció- 25 elegy pH-értékét pH-sztat üzemmódra programozott Mettler DL25 titrátor alkalmazásával, 0,5 N nátronlúgoldat szükség szerinti hozzáadásával 7,8 pH-η tartjuk. Egy óra elmúltával a reakcióelegyet egy 0,2 mikron szitanyílású, csekély fehérjekötésű poliszulfon-szűrőn szűrjük, rozsdamentes acél Millipore Mini-tan eszköz alkalmazásával körülbelül 60 ml-re töményítjük, majd diaszűrésnek (dializáló szűrésnek) vetjük alá 2 liter 50 mM nátrium-foszfáttal pufferolt 0,85 %-os konyhasóoldattal szemben
6,2-6,3 pH-értéken. A csekély diol-tartalmú PEG-SOD terméket tartalmazó, visszamaradó oldatot 0,2 mikronos szűrőn szűrjük.
2. példa
A. (Monometoxi-polietilénglikol)-szukcinát literes, háromnyakú lombikban 4 liter toluolt és 2212 g metoxi-polietilénglikolt teszünk, melyeket nitrogéngáz alatt előzőleg 70 °C-ra melegítettünk. Az oldat térfogatát azeotróposan vákuumban 1,3 liter toluol ledesztillálásával csökkentjük. A visszamaradó oldatot 30 eC-ra hűtjük, előbb 4 liter DKM-t, utána
66,4 g borostyánkősavanhidridet (SA-t), majd 4-(dimetil-amino)-piridint adunk hozzá, és a reakcióelegyet 32 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Ezután környezeti nyomáson 3,8 liter DKM-t lepárolunk, a reakcióelegyet lehűtjük, és 28 liter metil-(terc-butil)-étert tartalmazó üvegballonba öntjük keverés közben. Az így kapott szuszpenziót 1 órán át keverjük, majd Lapp-szűrőn szűrjük. A szűrőkalácsot 1 liter metil-(terc-butil)-éterrel mossuk, másnapig szobahőmérsékleten vákuumban szárítjuk, s így 2,252 kg cím szerinti nyers, fehér szilárd vegyületet kapunk.
A cím szerinti nyersterméket 8 liter DKM-ban oldjuk, és 3,0 kg - előzőleg 5 liter acetonnal és utána 4 liter DKM-mal mosott • · · · · · • · ··· · · ···· · · · • »♦ «··· ·
- 26 Dowex 50W-X8 kationcserélő, hidrogénfázisban lévő, nyomásálló üvegoszlopban elhelyezett gyantán vezetjük át. Ezt kővetően az oszlopot 3 liter DKM-nal mossuk. Az oszlopról kapott eluátumokat egyesítjük, és környezeti nyomáson 10 liter DKM-t eltávolítunk. A visszamaradó oldatot keverés közben 26 liter metil-(terc-butil)-éterbe öntjük. Az így kapott szuszpenziót 45 percig keverjük, majd a szilárd terméket szűrjük, 3 liter metil-(terc-butil)-éterrel mossuk, és vákuumkemencében szobahőmérsékleten szárítjuk. így 2,46 kg (95 %) cím szerinti, fehér, szilárd anyagot kapunk, amely 1,5 % metoxi-polietilénglikolt tartalmaz, mért értéke 2,72 x 10'4 mól/g (elméletileg 1,96 x 10'4 mól/g).
B. (M etoxi - po I i etil én g likol)-(N-szu kein imidil)-szu kei nát literes lombikban nitrogéngáz alatt 1,5 kg (monometoxi-polietilénglikol)-szukcinátot 7,2 liter toluolban melegítéssel oldunk. Az oldat térfogatát 2,8 liter toluol vákuum alatti lepárlásával csökkentjük, így víztartalmát eltávolítjuk. Az így kapott viszkózus folyadékot 40-45 °C-ra hűtjük, és 3,4 liter DKM-t, majd utána 33,89 g NHS-t adunk hozzá. A reakcióelegyet 1 órán át keverjük, míg az NHS teljesen fel nem oldódik, majd a reakcióelegyet 10 °C-ra hűtjük, és 30 perc alatt 368 ml, 67,75 g DCC-t tartalmazó DKM-oldatot csepegtetünk hozzá. A reakcióelegyet 18 órán át keverés közben, lassan szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni, utána 3,2 litert ledesztillálunk környezeti nyomáson, s így térfogatát csökkentjük. Ekkor a szuszpenziót 0-5 °C-ra hűtjük, 30 percig keverjük, majd szűrjük, és a szűrőkalácsot 250 ml toluollal mossuk. A szűrletet és mosófolyadékot egyesítjük, és keverés közben 28 liter metil-(terc-butil)-éterhez adagol- 27 juk. Az így kapott szuszpenziót 45 percig keverjük, majd Lapp-szűrőn szűrjük. A szűrőkalácsot 1 liter metil-(terc-butil)-éterrel mossuk, és 4 órán át szárítjuk, majd a szárítást szobahőmérsékleten, vákuumkemencében másnapig folytatjuk. így 1,5 kg (100 %) fehér, szilárd terméket kapunk. Mérésünk szerint ez a termék 1,79 x 10'4 mól/g-t tartalmaz (az elméleti érték 1,92 x 10’4 mól/g).
c. (Metoxi-polietilénglikol)-szukcinoil-(szarvasmarha szuperoxid-d iszmutáz) literes, pH-elektróddal felszerelt reaktorban elhelyezett 32 liter 29-30 °C hőmérsékletű, 7,8 pH-értékű foszfátpufferoldathoz 194,0 g szarvasmarha-eritrocitából származó szuperoxid-diszmutázt adunk. A térfogatot 39,5 literre állítjuk be, és a reakcióelegyet 29 °C-ra melegítjük. A pH-titráló műszer nátrium-hidroxidos adagoló csövét a reaktor középtengelyében, közvetlenül a folyadék felszíne alá helyezzük. A pH-titrálót megindítjuk, és a pH értékét 0,5 n nátrium-hidroxid-oldattal 7,8-ra állítjuk. Ekkor az elegyhez 2 perc alatt 614,7 g (metoxi-polietilénglikol)-(N-szukcinimidil)-szukcinátot adunk, és a reakcióelegyet 41 percig keverjük, mialatt a pH-értékét 0,5 n nátrium-hidroxid-oldattal 7,8-ra állítjuk, és a reakció hőmérsékletét állandóan 30 °C-on tartjuk. A reakcióelegyet 200 Millipak szűrőn, és rozsdamentes acélból készült Millipora Pellicon dializáló szűrőrendszeren átszűrjük, a betöményített oldathoz adjuk, így a koncentrátumnak a végtérfogata körülbelül 9 litert tesz ki. ekkor a koncentrátumot dializáló szűrésnek vetjük alá Millipore Pellicon diaszűrőrendszeren 200 liter 6,2 pH-értékű foszfátpufferrel szemben 2,17 órán át. A diaszűrő rendszert 1,5 • · ·· • · • * · • · · ···· ·
- 28 liter 6,2 pH-értékű foszfátpuffer-oldattal öblítjük. A koncentrátum végtérfogata körülbelül 8 liter. Ezután a koncentrátumot átvisszük egy tiszta, 30 literes üvegballonba, miközben egy, a műveleti sorban elhelyezett Millipore 200 Mii)ipák szűrőn átszűrjük, és a szűrőt 500 ml, 6,2 pH-értékű foszfátpufferoldattal öblítjük. így 11,98 kg (91,4 %) cím szerinti vegyületet kapunk tiszta, zöldeskék oldat alakjában. (Aktivitása 32,960 egység/ml).
3. példa
A. Parciálisán karboxi-metilezett poli(etilén-oxid) előállítása g 2000 molekulatömegű poli(etilén-oxidot) (Fluka, 25 milliekvivalens OH) 120 ml toluolban oldunk, és azeotróposan desztillálva addig szárítjuk, amíg a Dean-Stark feltétben vízleválás már nem figyelhető meg (ehhez körülbelül 25 ml toluol ledesztillálása szükséges). Az oldatot 50 °C-ra hűtjük, és 15 mmól (1,7 g) kálium-terc-butanolátot adunk hozzá, majd forráspontra hevítjük, és körülbelül 25 ml oldószert ledesztillálunk. Ekkor a reakcióelegyet keverés közben 25 °C-ra hűtjük, és 3,4 ml (16 mmól) bróm-ecetsav-etil-észter hozzáadása után másnapig állni hagyjuk. A kicsapódott sókat normál nyomáson szűrjük, 30 ml DKM-nal mossuk. A polimert úgy nyerjük ki, hogy a szűrletet részlegesen (körülbelül 60 ml-re) töményítjük, és töményített oldatot 5 °C hőmérsékleten erélyes keverés közben lassan 300 ml dietil-éterbe öntjük. A fehér, porszerű polimert összegyűjtjük, vákuumban szárítjuk, így 24 g polimert kapunk, amelynek IR színképében (önmagában felvéve) 1753 cm'1-nél jelentkező észter-abszorpció figyelhető meg. Ezt a polimert 50 ml 1 n nátrium-hidroxid-oldatban oldjuk, 10 g nátrium-kloridot • · • · 99 • · 9 · ·· • * 9 » · 9φ •999 999
- 29 adunk hozzá, mintegy 45 perc múlva az oldatot 6 N sósavoldattal 3,0 pH-értékre savanyítjuk, és háromszor extraháljuk 60 ml DKM-nal. Az egyesített szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk, megközelítőleg 50 ml-re töményítjük, és keverés közben 300 ml jéghideg éterbe öntjük. A kapott csapadékot szűrőre gyűjtjük, vákuumban szárítjuk, így 22 g terméket kapunk, amelynek önmagában felvett IR színképe az ω-karboxil-csoportnak megfelelően 1730 cm'1-nél mutat abszorpciót.
B. Tiszta α-hidroxi-o-(karboxi-metil)-poIi(etilén-oxid) előállítása a részben karboxi-metilezett PEO DEAE-Sephad ex-en végzett elkülönítése útján
A homo- és heterobifunkciós poli(etilén-oxid)-ok 22 g tömegű keverékét 40 ml vízben oldjuk, és (a Sigma cégtől beszerezhető) 27 g (0,1 mól ioncserélő hellyel rendelkező) DEAE-Sephadex A-25 gyantát tetraborát-alakban tartalmazó oszlopra visszük fel. Az első frakciót ionmentesített vízzel eluáljuk, ez a származékképzés nélküli (nem derivatizált) polimert tartalmazza. Amikor az eluátum poliakrilsav (PAA) próbára negatívvá válik (ezzel a megmaradt PEG-t mutatjuk ki), akkor fokozatosan 6-22 mM ammónium-bikarbonáttal (minden 100 ml-ben 1-2 mM koncentrációval növelve) gradiensen eluálunk, és egyenként körülbelül 40 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A 2-21. frakciók PAA próbára negatívak, és tiszta monokarboxilezett poli(etilén-oxid)-ot tartalmaznak (Rí = 0,49). A következő három frakció poli(etilén-oxid)-ot nem tartalmaz; míg a 25-36. frakciók tiszta PEO-dikarbonsavat tartalmaznak (Rí = 0,26). Az oc-hidroxi-ω-(karboxi-metil)-poli(etilén-oxid)-ot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és körülbelül 100 ml-re töményítjük. Az így kapott oldat• » «« · ···« • < · * · • · · » · • * ♦ ·* ·«>· ·
- 30 bán 35 g nátrium-kloridot oldunk, majd pH 3-ra savanyítjuk, és 3 x 100 ml DKM-nal extraháljuk. Az egyesített DKM-oldatot magnézium-szulfáton szárítjuk, mintegy 100 ml-re betöményítjük, és lassan, keverés közben 500 ml jéghideg éterbe öntjük. A kicsapódott polimert összegyűjtjük, vákuumban alaposan szárítjuk, és így 8,8 g terméket kapunk.
13C-NMR (CDCI3) δ: 172,7 (COOH), 72,4 (CH2CH2OH), 70,4 (PEO), 69,0 (CH2COOH), 61,3 (CH2OH) ppm.
Az oszlopról izolált bisz(karboxi-metil)-poli(etilén-oxid)-ot szintén elemezzük.
13C-NMR (CDCI3) δ: 172,4 (COOH), 70,4 (PEO), 68,8 (CH2COOH) ppm.
4. példa (Dimetoxi-tritil)-(metoxi-poljetiiénglikol) szintézise
36,3 g (7,26 mmól) 5000 dalton átlagos molekulatömegű metoxi-polietilénglikolt 500 ml kloroformban oldunk, és a víztartalmat 250 ml kloroform ledesztillálásával eltávolítjuk. A lombikra szárítócsövet szerelünk, az oldatot körülbelül 50 °C-ra hagyjuk lehűlni, és sorrendben előbb 1,8 ml (10,3 mmól) N,N-diizopropil-etil-amin, utána 100 mg (0,8 mmól, 10 mól%) 4-(dimetil-amino)-piridint és 2,9 g (98 %-os) (4,4-dimetoxi-tritil)-kloridot adunk hozzá.
A keveréket éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, majd az oldószert rotavaporon 60 °C hőmérsékleten eltávolítjuk. A maradékot csekély mennyiségű kloroformban felvesszük, és a (dimetoxi-tritil)-(metoxi-polietilénglikol)-t (M-PEG-DMT) 2 liter vízmentes éter hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot szűrőre ··· • · 4 · · ·4 to 4 4 4 «4 ·« A · ·4*
- 31 gyűjtjük, és C-8 300A fordított fázisú preparatív oszlopon, Waters LC4000 rendszerben 30-95 % acetonitril gradiens alkalmazásával (vízzel szemben) 20 percig kromatografáljuk. A kívánt terméket 50-60 % acetonitril-tartalomnál eluáljuk. 2 g mintát 20 ml 30 % acetonitrilt tartalmazó vizes oldatban viszünk az oszlop tetejére 50 ml/perc áramlási sebességgel. Ezt az eluenst (30 % acetonitrilt tartalmazó víz) izokratikusan engedjük folyamatosan áramlani, amíg egy terjedelmes szennyező csúcsot eluálunk, általában 3-5 percnél, mv 280 gm. Ennek az első csúcsnak az eluálása után indítjuk a gradiens elúciót. A következő csúcs eluálása a kívánt, 5000 molekulatömegű metoxi-PEG-DMT 5000-et adja. A csúcs első 3/4-ét gyűjtjük, a csúcsnak a farokrészét elvetjük. így 22,6 g nyers M-PEG-DMT 5000 tisztításával 2 g-os részletekben 15,44 g cím szerinti vegyületet kapunk.
5. példa
Zérus-diol típusú metoxi-polietilénglikol szintézise (dimetoxi-tritil)-(metoxi-polietilénglikol)-ból g M-PEG-DMT 5000 terméket 500 ml-es lombikban 320 ml Milli-Q vízben oldunk, 80 ml kénsavat adunk hozzá lassú befolyatással, s így a koncentrációt 20 %-ra állítjuk. Az oldat vörös szint ölt, és homogénné válik. Éjszakán át keverjük, majd a savas oldatot 2 x 500 ml kloroformmal extraháljuk, az egyesített kivonatott magnézium-szulfáton szárítjuk, betöményítjük, és a vörös, olajszerű maradékot vékony sugárban, 20 °C hőmérsékleten 2 liter vízmentes éterbe folyatjuk. A csapadékot 24 órán át ülepítjük, majd zsugorított üvegszűrőre gyűjtjük, és 2 x 20 ml vízmentes éterrel mossuk. A csapadékból álló szűrőkalácsot • ♦·· * · · 9* ♦ · · ·ν < *9 • ·4 9999·
- 32 porítjuk, vákuumban szárítjuk, így 8,68 g zérus-diol típusú metoxi-PEG 5000 terméket kapunk.
6. példa
Zérus-diol típusú (metoxi-polietilénglikol)-szukcinát előállítása zérus-diol típusú metoxi-polietilénglikolból
4,7 g (0,94 mmól) M-PEG-OH 5000 zérus-diol típusú anyagot 100 ml toluolban oldunk, az oldatot visszafolyató hűtő alatt forraljuk, és a víztartalom eltávolítására Dean-Stark csapdát alkalmazunk. Egy óra visszafolyós forralás után összesen 80 ml toluolt desztillálunk le, és a 20 ml toluolt tartalmazó edényt pozitív argonnyomású atmoszférában lehűlni hagyjuk. Előbb 110 mg (1,1 mmól) borostyánkősavanhidridet, utána 137 mg (1,12 mmól) 4-(dimetil-amino)-piridint adunk hozzá. Mivel a borostyánkősavanhidrid nem oldódik, 10 ml kloroformmentes, vízmentes etanolt adunk hozzá, és az oldatot kemencében szárított hűtő alkalmazásával visszafolyatással forraljuk. 15 óra forralás után az oldatot lehűtjük, 10 g kationcserélő gyantával keverjük, szűrjük, és a szűrletet bepároljuk. így a cím szerinti vegyülethez jutunk.
7. példa
Zérus-diol típusú (metoxi-polietilénglikol)-szukcinimidil-szukcinát szintézise (metoxi-polietilénglikol)-szukcinátból
4,15 g (0,83 mmól) 6. példában előállított M-PEG-szukcinát 100 ml toluollal készült oldatát azeotróposan szárítjuk. A toluol egy részét ledesztilláljuk (60 ml-t), így a lombikban 40 ml marad. 100 mg (0,87 mmól) NHS-t, majd óvatosan 30 ml etanolmentes, vízmentes kloroformot adagolunk hozzá. További »* ·*·· ’ · ··* 9« ···· 9 9t • *· ·<··9
- 33 25 ml oldószerelegyet desztillálunk le, és utána az oldatot argongáz alatt szobahőmérsékletre hagyjuk lehűlni. Ekkor az oldathoz 200 mg (9,7 mmól) DCC-t adunk, és az oldatot keverjük. 10 perc múlva megkezdődik a diciklohexil-karbamid (DCU) kristályos kiválása. 2 nap keverés után még 25 mg (0,22 mmól) NHS-t adunk hozzá. A DCU szuszpenzióját szűrjük, és a csapadékot toluollal mossuk. A szűrletet rotavaporon bepárolva további DCU csapadék válik ki. A szűrt koncentrátumot 1 liter vízmentes éterbe csepegtetjük, a csapadékot Whatman 9 cm 6F/F üvegrostszűrőn szűrjük, igen jó vákuumban 15 órán át szárítjuk, s így 3,37 g M-PEG-SS terméket kapunk.
A termék aktív-észter-tartalma 1,71 x 10'4 mól/g; a HPLC vizsgálat szerint 1,3 % M-PEG-S-t és 1,2 % egyéb szennyezést tartalmaz; DCU nem mutatható ki; összes szennyezéstartalma 3 %.
8. példa
Zérus-diol típusú PEG-SOD szintézise mg/ml koncentrációjú törzsoldatból 1,33 ml szuperoxid-diszmutáz-oldatot 18,67 ml pufferoldathoz adunk (amely 100 mM nátrium-foszfátot tartalmaz, és pH-értéke 7,8), majd az oldatot 30 °C hőmérsékletre melegítjük. A 7. példában előállított 300 mg M-PEG-SS-t adunk hozzá egyszerre, és a pH-értékét pH-sztat alkalmazásával 7,8-on tartjuk. 28 perc múlva a reakcióelegy pH-értéke már nem változik, így a mintát Centrium centrifugális membránon - amelynek kizárási mérethatára 10000 MW (molekulatömeg) - betöményítjük. A töményített mintát ilyen módon 1 mólos sósav-oldattal 6,2 pH-ra beállított Dulbecco-féle PBS oldattal kicseréljük. Összesen 60 ml folyadékkal öt cserét • * · · · · • · ··· · · ••·· · · 4 • ·· ···· ·
- 34 hajtunk végre. A méretkizáró HPLC vizsgálat csupán elhanyagolható magas molekulatömegű csúcsot mutat, jelezve, hogy a cím szerinti vegyület (kívánt vegyület) a dióiból származó anyagot csak elhanyagolható mennyiségben tartalmazza (azaz „zérus-diol típusú”).
További, a PEG-hez kovalensen kötött, biológiailag hatásos fehérjék előállítása
9. példa
Csekély-diol típusú (metoxi-polietilénglikol)-szukcinoil-kataláz szintézise
4,17 ml vizes kataláz-szuszpenziót - amely ml-enként 24,0 mg fehérjét tartalmaz - 0,1 mólos, 7,8 pH-értékű nátrium-foszfát-pufferoldattal 15,84 ml-re hígítunk. Ehhez az oldathoz mágneses keverés közben, 30 °C hőmérsékleten 550 mg, csekély-diol típusú metoxi-PEG-SS-t adunk. A reakcióelegy pH-értékét pH-sztat üzemmódra programozott Mettler DL25 titráló műszer alkalmazásával 7,8-on tartjuk úgy, hogy a titrátor alkalmazásával szükség szerint 0,5 N nátrium-hidroxid-oldatot adagolunk hozzá. 30 perc múlva a reakcióelegyet 0,45 mikron szűrőnyílású, csekély fehérjekötésű poliszulfon-szűrőn szűrjük, két Amicon Centriprep 30 Concentratorba helyezzük (30K NMWL membrán), és a pufferoldatot többször kicseréljük Dulbecco-féle PBS-vel. A fennmaradó (visszatartott) részt - a csekély-diol típusú PEG-katalázt tartalmazó oldatot - ezután 0,2 mikron szűrőnyílású szűrőn szűrjük. A konjugátum kialakulását SEHPLC és gél-elektroforézis útján igazoljuk.
• · ·
10. példa
Csekély-diol típusú PEG-ovalbumin szintézise
503 mg (Sigma-cégtől beszerezhető) ovalbumint 50 g 0,25 mólos, 7,8 pH-értékű foszfátpufferoldatban szobahőmérsékleten teflon-bevonatos mágneses keverőrúddal ellátott polietilén hengerpohárban szobahőmérsékleten oldunk. 15 perc keverés után egyszerre hozzáadunk 1,900 g csekély-diol típusú M-PEG(5000)-SS-t, miközben a reakcióelegy pH-értékét 0,5 N nátrium-hidroxid-oldatot szükség szerint adagoló Mettler DL25 pH -sztat segítségével 7,8-on tartjuk. A reakciót szobahőmérsékleten még 1 órán át állni hagyjuk, majd a reakcióelegyet Amicon YM300 membránon, keverőcellás eszköz alkalmazásával diaszűrjük (a cellát éjszakán át a hűtőszekrényben 4 °C hőmérsékleten, 172 kPa argonnyomás alatt működtetjük). 800 ml pufferoldat diaszűrése után a terméket ultraszűréssel töményítjük, 0,2 mikron szűrőnyílású poliszulfon-szűrőn szűrjük, és steril üvegfiolákba osztjuk. így 44,3 g oldatot kapunk, amelynek fehérjetartalma 10,5 mg/ml. A lizin aminocsoportjának titráló elemzésével meghatározva a fehérje módosításának a mértéke 71,4 %-osnak adódott.
11. példa
Csekély-diol típusú mPEGSK-S-ovalbumin szintézise ml, 10 mg/ml koncentrációjú, hideg ovalbumint (Sigma-cég, VI. minőség) 0,25 mólos foszfátpufferben, amelynek pH-értéke 7,4, 382 mg csekély-diol típusú MPEGSK-SS termékhez adunk, és 16 órán át 5 ’C hőmérsékleten keverjük. A terméket Centriprep 30 Contcentrator eszközben (Amicon, 30K NMWL membrán) kicserélő pufferként Dulbecco-féle PBS alkalmazásá- 36 val tisztítjuk. A tisztított oldatot 0,2 pm szűrőnyílású szűrőn átszűrve 6,539 g oldat hozammal 13,8 mg/ml koncentrációban 74 %-os mértékben módosított fehérjét kapunk (a módosítás mértékét TNBS titráló módszerrel határoztuk meg).
Hasonló módon, 100 mg ovalbumint 283 mg csekély-diol típusú mPEGSK-SS-vel reagáltatva 6,274 g oldatot kapunk, amely
13.8 mg/ml koncentrációban 74 %-os mértékben módosított fehérjét tartalmaz.
Hasonló módon, 100 mg ovalbumint 190 mg csekély-diol típusú mPEGSK-SS-val reagáltatva 5,704 g oldatot kapunk, amely
16.8 mg/ml koncentrációban 67 %-os mértékben módosított fehérjét tartalmaz.
12. példa
Csekély-diol típusú mPEGSK-S-rhu-IL4 szintézise
190 μΙ 5,26 mg/ml koncentrációban rhu-IL4’-et (Immunex-et) tartalmazó oldatot 772 μΙ 8,5 pH-értékű, 0,1 mólos borátpufferrel hígítunk, majd ezt az rhu-IL4 oldatot 29,2 μΙ, 34 mg/ml oldat koncentrációban csekély-diol típusú metoxi-PEG-SS-t tartalmazó DMF-oldattal kezelünk. 80 perc múlva szobahőmérsékleten a reakcióelegyet centrifugáljuk, és közvetlenül visszük fel egy preparatív SEHPLC oszlopra. A tisztított konjugátumról kimutattuk, hogy gél-elektroforézis során lényegében egyetlen sávval jelentkezik.
13. példa
Csekély-diol típusú mPEGSK-S-NT szintézise
8,7 mg neurotenzint (röviden: NT; a BaChem-cég terméke) 2,175 ml 0,25 mólos, 7,8 pH-értékű foszfátpufferben tartalmazó oldatot 174 mg csekély-diol típusú MPEG5K-SS termékhez • · · adunk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten tartjuk 1,75 órán át, majd hűtjük. A tiszta mono-MPEG5K-S-NT terméket úgy kapjuk, hogy az NT-PEG8k-NT terméktől preparatív, fordított fázisú HPLC útján elkülönítjük C-8 oszlopon, eluálószerként víz/acetonitril gradiens alkalmazásával.
A találmány szerinti készítményeket a szokásos, a szakterületen jártas egyén számára ismert technológiával állítjuk elő. Adott esetben a készítmény szacharózt vagy trehalózt tartalmazhat.
Az 1. táblázatban konkrét készítményeket mutatunk be; HPCD jelentése (hidroxi-propil)-ciklodextrin.
1. táblázat
A példa PEG-SOD Foszfát- pH HPCD Szacharóz
száma (E/ml) (nM) puffer tömeg/térf.% tömeg/térf.%
14. 25000 10 6,2 5
15. 50000 10 6,2 5
16. 75000 10 6,2 5
17. 100000 10 6,2 5
18. 125000 10 6,2 5
19. 150000 10 6,2 5
20. 25000 10 6,2 10
21. 50000 10 6,2 10
22. 75000 10 6,2 10
23. 100000 10 6,2 10
24. 125000 10 6,2 10
25. 150000 10 6,2 - 10
• · · • · ·
1. táblázat (folytatás)
A példa száma PEG-SOD (E/ml) (nM) Foszfátpuffer pH HPCD tömeg/térf.% Szacharóz tömeg/térf.%
26. 25000 10 6.2 20
27. 50000 10 6,2 20
28. 75000 10 6,2 20
29. 100000 10 6,2 20
30. 125000 10 6,2 20
31. 150000 10 6,2 20
32. 25000 10 6,2 5
33. 50000 10 6,2 5
34. 75000 10 6,2 5
35. 100000 10 6,2 5
36. 125000 10 6,2 5
37. 150000 10 6,2 5
38. 25000 10 6,2 10
39. 50000 10 6,2 10
40. 75000 10 6,2 10
41. 100000 10 6,2 10
42. 125000 10 6,2 10
43. 150000 10 6,2 10
44. 25000 10 6,2 20
45. 50000 10 6,2 20
46. 75000 10 6,2 20
47. 100000 10 6,2 20
48. 125000 10 6,2 20
• ·
1. táblázat (folytatás)
A példa száma PEG-SOD (E/ml) (nM) Foszfátpuffer pH HPCD tömeg/térf.% Szacharóz tömeg/térf.%
49. 150000 10 6,2 20
50. 25000 10 6,2 5 5
51. 50000 10 6,2 5 5
52. 75000 10 6,2 5 5
53. 100000 10 6,2 5 5
54. 125000 10 6,2 5 5
55. 150000 10 6,2 5 5
56. 25000 10 6,2 10 10
57. 50000 10 6,2 10 10
58. 75000 10 6,2 10 10
59. 100000 10 6,2 10 10
60. 125000 10 6,2 10 10
61. 150000 10 6,2 10 10
62. 25000 10 6,2 15 5
63. 50000 10 6,2 15 5
64. 75000 10 6,2 15 5
65. 100000 10 6,2 15 5
66. 125000 10 6,2 15 5
67. 150000 10 6,2 15 5
68. 25000 10 6,2 5 15
69. 50000 10 6,2 5 15
70. 75000 10 6,2 5 15
71. 100000 10 6,2 5 15
• · · » • ·
1. táblázat (folytatás)
A példa száma PEG-SOD (E/ml) (nM) Foszfátpuffer PH HPCD tömeg/térf.% Szacharóz tömeg/térf.%
72. 125000 10 6,2 5 15
73. 150000 10 6,2 5 15
A találmány szerinti készítményeket az alábbi eljárással liofilizáljuk.
Kiválasztjuk a megfelelő méretű fiolákat, amelyeket a kívánt adagokra alapozott készítményekkel töltünk meg. A dózisnak megfelelő fiolák megválasztása során a töltőtérfogat nem haladhatja meg a fiola átmérőjét. így például 5 ml térfogatnál többet nem vihetünk be egy 10 ml-nél kisebb térfogatú fiolába. Töltés után a fiolákat szárítókamrába helyezzük, és közvetlenül a hűtött polcokra helyezzük, amelyeket előzetesen 4 °C-ra hűtöttünk. A fiolák meghatározott számába termoelemeket helyezünk a készítmény hőmérsékletének monitorozására a liofilizálási folyamat során. Ezután a fiolákat egyensúlyba hozzuk a polcok hőmérsékletével (4 °C), mielőtt a polcok hőmérsékletét -40 °C-ra hűtjük. A -40 °C hőmérséklet elérése után a fiolákat ezen a hőmérsékleten tartjuk körülbelül 6 órán át a készítmény teljes megfagyasztása céljáéból. E periódus után a hűtőkígyókat -80 °C-ra hűtjük, és a vákuumszivattyú bekapcsolásával a kondenzáló kamrát evakuáljuk, majd ezt követi a primer és szekunder szárítás folyamata. A primer (elsődleges) szárítási folyamat során a szárítókamra és a kondenzáló egység között a főszelep nyitva van, és a szárítókamrát körülbelül 100 mikronos nyomás• ·
- 41 ra evakuáljuk egy nitrogén-gázöblítőcső alkalmazásával. Amikor a 100 mikronos nyomást elérjük, a polchőmérsékletet -20 °C-ra emeljük a szublimációs folyamat megindítása céljából. A liofilizáló ciklusnak ez az időszaka körülbelül 10-18 órát vesz igénybe. A primer szárítási folyamat akkor teljes, ha a fagyasztott mátrixról a jég teljesen eltűnik, és a termoelem hőmérséklete a -20 °C-ot eléri. A szekunder szárítás során a hőmérsékletet -20 °C-ról +25 °C-ra emeljük, s így valamennyi jeget eltávolítjuk, amely a liofilizálási folyamat alatt még nem távozott el. Ez az eltávolítás! eljárás mintegy 4-8 órát igényel.
A szekunder szárítási folyamat befejezése után a főszelepet zárjuk, és a szárítókamrát nitrogénnel töltjük úgy, hogy a kamrában egy enyhe vákuum még megmaradjon. Ekkor működésbe hozzuk a zárófejet, és a zárat a fiolába nyomjuk. Majd a szárítókamrát a környezeti nyomással egyensúlyba hozzuk, és a kamra ajtaját a fiolák eltávolítása és a betétzár felrakása céljából keményítjük. Utána a fiolákat az előírt hőmérsékleten tároljuk egészen a befecskendezés céljából vízzel végzett oldás (rekonstituálás) időpontjáig.
A találmány szerinti készítmények tárolási élettartamát kitűnőnek találtuk. A tárolási élettartamot az alábbi összehasonlító vizsgálatokkal illusztráljuk rekonstituált oldatok alkalmazásával a készítmények külsejének vizuális megfigyelése céljából; valamint mérethatár-kizáró túlnyomásos folyadékkromatográfia (röviden: SEHPLC) használatával a 74. és 75. példákban bemutatott készítményekben jelenlévő, nagy molekulatömegű (HMW) anyag százalékos értékének meghatározására.
A találmány szerinti „A” készítmény 2 % HPCD-t tartalmaz.
- 42 Az összehasonlítás céljára készült „B” készítmény 10 % szacharózt tartalmaz HPCD nélkül.
Mindkét készítmény 10 mM 6,2 pH-értékű foszfátpuffert, valamint 75000 HE/ml PEG-SOD terméket tartalmaz. A fiolák töltőtérfogata 0,5 ml; a hőmérsékleti körülmények: 4 eC, 22 °C, 30 °C és 50 ’C. Mindkét készítményt előzőleg liofilizáljuk, és a fenti hőmérsékleten 30 hónapon át tároltuk, majd rekonstituáltuk, és az alább leírt módon vizsgáltuk.
74. példa
Rekonstituált készítmények külleme
„A” készítmény Küllem „B” készítmény Küllem
4 °C átlátszó, kékeszöld 4 ’C átlátszó, kékeszöld
22 °C átlátszó, kékeszöld 22 ’C átlátszó, kékeszöld
30 ’C átlátszó, kékeszöld 30 ’C átlátszó, kékeszöld
50 ’C átlátszó, kékeszöld 50 oC zavaros, sárgásbarna
A nagy molekulatömegű anyag meghatározása méretkizáró, túlnyomásos folyadékkromatográfiával (SEHPLC)
Az SDEHPLC műveletet úgy végezzük, hogy 0,8 x 30 cm méretű Shodex WS-803F oszlopon 0,1 mólos, 6,5 pH-értékű, 0,15 M nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldatot bocsátunk át 1 ml/perc áramlási sebességgel, és egy 280 nm hullámhosszon működő detektor-berendezésen át nyomjuk. Ez az oszlop képes frakcionális tartománya és méretkizáró határa alapján 1 000 000-nál nagyobb molekulatömegek különbségeinek a fel- 43 oldására (megkülönböztetésére). E körülmények között a nagy molekulatömegű anyag a kis molekulatömegű anyagok (sók és kis molekulatömegű komponensek) előtt eluálódik. A detektort számítóghéphez kapcsoljuk, amelyet úgy programozunk, hogy a számos paraméterre alapozott csúcsokat integrálja, és a csúcsok mennyiségét százalékos alapon mennyiségileg megadja.
A 75. példában talált és bemutatott, magas molekulatömegű anyagok százalékos mennyisége a polipeptid tárolása során végbemenő aggregációjának a mértéke. A 75. példában megmutatjuk a „szabad PEG” arányát (amely jelzi a szukcinát-észterkötés hidrolízisének mértékét), valamint az enzimaktivitás százalékos értékét is.
• · · «
• · · « • · · · • · · · · ··· . · ·
75. példa
Stabilitási vizsgálatok különböző hőmérsékleteken1 2, illetve 10 hónapon át tárolt, 10 % szacharózt vagy 10 % (β-hidroxi-propil)-ciklodextrint (ΗΡβ CD)-t tartalmazó, liofilizált PEG-SOD készítményeken
Készítmény Hőmérséklet HMW1 2 Szabad PEG3 Aktivitás %4
(75000 E/mg) CO (%) (mg/ml)
2 mo 10 mo 2 mo 1 0 mo 2 mo 10 mo
10 % szacharóz 4 0,3 0,2 0,35 0,1 99
22 0,4 0,6 0,36 0 100
30 0,7 0,9 0,44 0 98 100
50 20 >50 3,45 = 10 71
10 % HPpCD 4 0,3 0,12 100 ..
22 0,4 0,08 99
30 0,4 0,7 0,14 0,9 100 100
50 0,6 4,8 0,87 3,23 95 92
1 A liofilizált termékek vizuális vizsgálata rekonstituálás előtt azt mutatta, hogy a szacharóztartalmú készítmény 50 °C-on elszineződött.
2 A HMW (magas molekulatömegű) szennyezések polipeptidaggregációra vallanak; ezt a kontrollkörülményektől (időtartalmtól) eltérő különbség százalékában fejezzük ki.
3 A szabad PEG a szukcinil-észter-kötés hidrolízisének mértéke, amelyet a kontrolikörülményektől (idő) eltérő különbség százalékában fejezünk ki.
4 A kezdeti érték százalékában fejezzük ki.
• · · ·« ···« • · · · · « • · · · · · · ···· · · ·
- 45 A 75. példa adataiból látható, hogy a HPpCD-t tartalmazó készítmény 30 °C-on végzett tárolás során kiváló stabilitást mutat. Az enzimaktivitásban még 10 hónapos tárolás során sem figyeltük meg az enzimaktivitás jelentős változását; ez arra utal, hogy az enzim kielégítő stabilitása megmarad. A ΗΡβΟϋ kifejezetten kedvezőbb stabilizálószer; ez kitűnik akkor, ha a HMW anyagok százalékos értékét a szacharózos készítmény és a ΗΡβΟϋ készítmények 50 °C-on végzett tárolása után összehasonlítjuk: a ΗΡβΟϋ készítmény esetén a HMW értéke a hőstressz - 50 °C 10 hónapon át - után mindössze 4,8 %, míg azonos körülmények között a szacharózt tartalmazó készítmény esetén ez az érték 50 %-nál nagyobb. A HPβCD-nek még magas hőmérsékleten végzett tárolása során is megfigyelhető drámai stabilizáló képessége egy különleges stabilizáló mechanizmus jele - amelyet ez a stabilizáló anyag nyújt - amely minimálissá teszi a fehérje kölcsönhatását, s így csökkenti HMW anyagok kialakulását. Elméletileg feltételezhető, hogy - mivel a ciklodextrin szerkezeti üregeket tartalmaz - a védőmechanizmus kapcsolatban áll bizonyos reakcióképes centrumok betokolódásával [ami magas molekulatömegű (HMW) aggregátumok kialakulásával jár együtt], és ez a betokolódás a kölcsönhatást, így az aggregációt minimálisra csökkenti.
A jelen találmány útján megvalósított, fokozott stabilitás lehetővé teszi a termék tárolását szobahőmérsékleten, és tárolási élettartamát („polc-élettartamát”) növeli. A liofilizált termék alkalmas akár közönséges üvegfiolákba, akár előre töltött injekciós tűkbe való csomagolásra. Az előre töltött injekciós tű a terméknek „felhasználásra kész” jelleget biztosit, amely csupán • · · ·· ···· • · < · · * • · · · · · · • · ·· · · « * · · «··· ·
- 46 minimális kezelést igényel, és szükséghelyzeti alkalmazásra igen hasznos. A készítmények használhatósága az eddig ismert megoldásoknál mind klinikai, mind kórházi és szükséghelyzeti (vészhelyzeti) körülmények között kedvezőbb.

Claims (15)

1. Vizes, fiziológiailag hatásos, fehérje jellegű, liofilizálásra alkalmas készítmény, amely körülbelül 150 és körülbelül 150 000 egység/ml közötti mennyiségben csekély-diol típusú, poli(alkilén-oxid)-dal kovalensen kapcsolt fehérjét, körülbelül 0,1 és körülbelül 20 tömeg/térf.% közötti mennyiségben ciklodextrint, és körülbelül 0,01-től körülbelül 50 mM koncentrációban puffért tartalmaz, s amely készítmény pH-értéke körülbelül 5,7 és körülbelül 6,5 között van.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a ciklodextrint körülbelül 1,0 tömeg/térf.%-tól körülbelül 15 tömeg/térf.%-ig terjedő mennyiségben alkalmazzuk.
3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy csekély-diol típusú poli(alkilén-oxid)-ként legfeljebb körülbelül 10 tömeg% nem-monoalkoxilezett poli(alkilén-oxid)-ot tartalmazó, lineáris poli(alkilén-oxid)-ot tartalmaz.
4. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy nem-monoalkoxilezett poli(alkilén-oxid)-ként nem-monometoxilezett polietilénglikolt tartalmaz.
5. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy körülbelül 1000 daltontól körülbelül 15000 daltonig terjedő átlagos molekulatömegű polietilénglikolt tartalmaz.
6. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy ciklodextrinként β-ciklodextrin valamilyen származékát tartalmazza.
• · · · · 4 * • · · · · » » • *· 4
7. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy fehérjeként rekombináns emberi interleukin-4-et (rhulL-4), Carlsberg-féle szubtilizin-proteázt, oxidoreduktázt, katalázt, koleszterin, redukált-NADP: (20-p-hidroxilező) oxigén-oxidoreduktázt (1.14.1.9 katalógusszámú „koleszterin-20-hidroxilázt”), transzferázt, UDP glükózt, hidrolázt, tripszint (katalógusszáma 3.4.4.4.), L-aszparagin-aminohidrolázt (katalógusszáma 3.5.1.1. „aszparagináz”), liázt, izomerázt, illetve ligázt tartalmaz.
8. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy fehérjeként inzulint, ACTH-t, glukagont, szomatotropint, szomatosztatint, timozint, paratiroid hormont, pigmenthormont, szomatomedint, eritropoietint, illetve luteinizáló hormont tartalmaz.
9. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy fehérjeként korion-gonadotropint, hipotalamuszból származó felszabadító faktort, antidiuretikus hormont, pajzsmirigy-stimuláló hormont, kalcitonint, prolektint, alfa-, béta- vagy gamma-interferont, antitesteket (IgG, IgE, IgM, IgD, interleukin-1-, -2-, -3-, -4- vagy -7-et, granulocita-kolónia-stimuláló faktort (GCSF) vagy granulocita-makrofág-kolónia stimuláló faktort (GM-CSF) tartalmaz.
10. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jelle- mezve, hogy fehérjeként daganat-elhalási faktort (tumornekrózis-faktor, röviden: TNF), trombocitából (vérlemezkéből) származó növekedési faktort (PDGF), epidermis-növekedési faktort (EGF), idegnövekedési faktort (NGF), csontnövekedési faktort (BGF), növekedési hormont fel- 49 szabadító faktort (GHRF), papaint, kimotripszint, termolizint, sztreptokinázt vagy aktivázt tartalmaz.
11. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy fehérjeként szuperoxid-diszmutázt tartalmaz.
12. A 11. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy szuperoxid-diszmutázként rekombináns emberi szuperoxid-diszmutázt tartalmaz.
13. Eljárás liofilizált, biológiailag hatásos, fehérje jellegű készítmény előállítására, a z z a I jellemezve, hogy
a) 10 tömeg%-nál kevesebb nem-monoalkoxilezett poli(alkilén-oxid)-ot tartalmazó poli(alkilén-oxid)-ot karboxilezünk;
b) a karboxilezett pol i (a I ki I én-oxid)-ot aktiválva aktív poli(alkilén-oxid)-észtert állítunk elő;
c) az így kapott, aktív poli(alkilén-oxid)-észtert kovalensen kapcsoljuk a biológiailag hatásos fehérjéhez;
d) az így kapott, poli(alkilén-oxid)-észtert a biológiailag hatásos fehérjével kovalensen kapcsolva víztartalmú közegben szolubilizáljuk;
e) az így létrehozott vizes közegen ciklodextrint oldva homogén oldatot képezünk;
f) az így kapott oldat pH-értékét körülbelül 5,7 és körülbelül
6,5 közötti értékre állítjuk; és
g) az oldatot liofilizáljuk.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti készítmény előállítására alkalmazzuk.
• «1 ·* ·»·· • · 4 r V· • · 444 4· *··· · ·4 • 44 44*44
15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása emlősök szöveteiben a szuperoxid-anionok által előidézett kóros állapot kezelésére alkalmazható gyógyszer előállítására.
HU9400561A 1993-02-25 1994-02-25 Process for producing lyp0philized polyalkyene oxide modified protein and polypeptide complexes with cyclodextrin HUT71586A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/023,182 US5298410A (en) 1993-02-25 1993-02-25 Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9400561D0 HU9400561D0 (en) 1994-05-30
HUT71586A true HUT71586A (en) 1995-12-28

Family

ID=21813561

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9400561A HUT71586A (en) 1993-02-25 1994-02-25 Process for producing lyp0philized polyalkyene oxide modified protein and polypeptide complexes with cyclodextrin

Country Status (18)

Country Link
US (4) US5298410A (hu)
EP (1) EP0614666A1 (hu)
JP (1) JPH06256222A (hu)
KR (1) KR940019312A (hu)
AU (1) AU660843B2 (hu)
CA (1) CA2106519A1 (hu)
CZ (1) CZ38194A3 (hu)
FI (1) FI940909A (hu)
HU (1) HUT71586A (hu)
IL (1) IL108777A (hu)
MX (1) MX9305528A (hu)
MY (1) MY131553A (hu)
NO (1) NO940663L (hu)
NZ (1) NZ248590A (hu)
PH (1) PH30462A (hu)
RU (1) RU94006023A (hu)
SK (1) SK23294A3 (hu)
TW (1) TW260611B (hu)

Families Citing this family (117)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
DE4239877C1 (de) * 1992-11-27 1994-03-17 Boehringer Ingelheim Int Stabilisierte Superoxid-Dismutase (SOD)-Zusammensetzung
CA2114163C (en) * 1993-01-29 2002-04-30 Nobuo Nishiki Method for stabilizing antigenicity of myeloperoxidase
US5298410A (en) * 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US6090925A (en) 1993-03-09 2000-07-18 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
US5981719A (en) 1993-03-09 1999-11-09 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
FR2703927B1 (fr) * 1993-04-13 1995-07-13 Coletica Utilisation d'une réaction de transacylation entre un polysaccharide estérifié et une polyamine pour former en milieu aqueux une membrane au moins en surface de particules gélifiées.
US7070790B1 (en) * 1993-06-29 2006-07-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 and core genes of isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines
JPH0776700A (ja) * 1993-07-14 1995-03-20 Senju Pharmaceut Co Ltd コンタクトレンズ用剤の安定化方法
US5605976A (en) * 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
DE4423131A1 (de) * 1994-07-01 1996-01-04 Bayer Ag Neue hIL-4-Mutantenproteine als Antagonisten oder partielle Agonisten des humanen Interleukin 4
AU697440B2 (en) * 1994-12-07 1998-10-08 Novozymes A/S Polypeptide with reduced allergenicity
JP3708151B2 (ja) * 1994-12-15 2005-10-19 協和醗酵工業株式会社 Ｐｅｇ化したヒト顆粒球コロニー刺激因子の定量法
US5861148A (en) * 1995-01-23 1999-01-19 Smith; Stewart Gregory Ophthalmic compositions and process of using
WO1996028475A1 (fr) * 1995-03-10 1996-09-19 Nakamura, Toshikazu Facteur de croissance des hepatocytes modifie a l'aide de polyethylene glycol
US5756593A (en) * 1995-05-15 1998-05-26 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkyene oxide carboxylic acids
US5868868A (en) * 1995-06-19 1999-02-09 Alcon Laboratories, Inc. Peg-modified proteases and methods of use in contact lens cleaning
JPH11502255A (ja) * 1995-12-29 1999-02-23 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー 固定化酵素を含有する洗剤組成物
CA2252374C (en) 1996-04-19 2007-08-07 Alpha Therapeutic Corporation A process for viral inactivation of lyophilized blood proteins
US6072040A (en) * 1996-10-15 2000-06-06 Medical Analysis Systems, Inc. Stabilized conjugates of uncomplexed subunits of multimeric proteins
US6321909B1 (en) * 1997-02-13 2001-11-27 Sky High, Llc System for storing polyethylene glycol solutions
GB9711643D0 (en) * 1997-06-05 1997-07-30 Janssen Pharmaceutica Nv Glass thermoplastic systems
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US7642323B2 (en) * 1997-11-06 2010-01-05 Nektar Therapeutics Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
GB9815785D0 (en) * 1998-07-20 1998-09-16 Cerebrus Ltd Chemical compounds
DK1588716T3 (da) 1998-08-06 2011-05-23 Mountain View Pharmaceuticals Peg-uratoxidase-konjugater og anvendelse deraf
US6994686B2 (en) * 1998-08-26 2006-02-07 Neomend, Inc. Systems for applying cross-linked mechanical barriers
PL200586B1 (pl) * 1998-10-16 2009-01-30 Biogen Idec Inc Polipeptydy zawierające mutanty interferonu-beta-1a, kodujące je cząsteczki kwasów nukleinowych, komórki gospodarza transformowane tymi cząsteczkami, sposób wytwarzania polipeptydów, zawierające je kompozycje farmaceutyczne i zastosowania polipeptydów
EP1656952B1 (en) 1998-10-16 2013-12-18 Biogen Idec MA Inc. Polyalkylene glycol conjugates of interferon beta-1A and uses thereof
US7279001B2 (en) * 1998-11-06 2007-10-09 Neomend, Inc. Systems, methods, and compositions for achieving closure of vascular puncture sites
US6716452B1 (en) 2000-08-22 2004-04-06 New River Pharmaceuticals Inc. Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents
US7169889B1 (en) * 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
WO2001080849A1 (en) * 2000-04-26 2001-11-01 Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority D/B/A Carolinas Medical Center Method of treating cancer
US6756480B2 (en) * 2000-04-27 2004-06-29 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
US20050124537A1 (en) * 2000-04-27 2005-06-09 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
SG98393A1 (en) * 2000-05-19 2003-09-19 Inst Materials Research & Eng Injectable drug delivery systems with cyclodextrin-polymer based hydrogels
US6468989B1 (en) * 2000-07-13 2002-10-22 Dow Pharmaceutical Sciences Gel compositions containing metronidazole
US8394813B2 (en) * 2000-11-14 2013-03-12 Shire Llc Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents
KR20030005204A (ko) * 2000-12-25 2003-01-17 가부시키가이샤 시세이도 교감신경 활성화 향료 조성물
US20020146409A1 (en) * 2001-01-30 2002-10-10 Herring Steven W. Methods for stabilizing lyophilized blood proteins
US7195923B2 (en) * 2001-01-31 2007-03-27 Scripps Laboratories, Inc. Ratiometric determination of glycated protein
US7060675B2 (en) * 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
US6867183B2 (en) * 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
WO2002094324A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-28 Institute Of Materials Research & Engineering Injectable drug delivery systems with cyclodextrin-polymer based hydrogels
US6713452B2 (en) 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828305B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7713932B2 (en) * 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6828297B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6835802B2 (en) 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US6858580B2 (en) 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
EP1419191B1 (en) 2001-08-22 2007-10-17 Bioartificial Gel Technologies Inc. Process for the preparation of activated polyethylene glycols
US20060014697A1 (en) * 2001-08-22 2006-01-19 Travis Mickle Pharmaceutical compositions for prevention of overdose or abuse
US7169752B2 (en) * 2003-09-30 2007-01-30 New River Pharmaceuticals Inc. Compounds and compositions for prevention of overdose of oxycodone
US7312192B2 (en) * 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7030082B2 (en) * 2001-09-07 2006-04-18 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith
US7166571B2 (en) * 2001-09-07 2007-01-23 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US6913903B2 (en) 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7196059B2 (en) * 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US6770625B2 (en) 2001-09-07 2004-08-03 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
DE10149030A1 (de) * 2001-10-05 2003-04-10 Viscum Ag Stabile galenische gefriergetrocknete Arzneimittelzubereitung von rViscumin
US7060498B1 (en) 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
AU2002358468A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-15 Rigshospitalet Igamete recruitment and developmental competence in mammals by inhibiting the de novo sterol biosynthesis and/or promoting sterol efflux
US20050132430A1 (en) * 2001-12-21 2005-06-16 Mogens Baltsen Igamete recruitment and developmental competence in mammals by inhibiting the de-nova sterol biosynthesis and/or promoting sterol efflux
EP1476181B1 (en) * 2002-01-18 2016-03-23 Biogen MA Inc. Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
EP2266590A3 (en) * 2002-02-22 2011-04-20 Shire LLC Active agent delivery sytems and methods for protecting and administering active agents
US7105486B2 (en) * 2002-02-22 2006-09-12 New River Pharmaceuticals Inc. Abuse-resistant amphetamine compounds
CN1305932C (zh) * 2002-02-22 2007-03-21 植入疗法公司 碳水化合物修饰的聚合物、其组合物及其应用
US7700561B2 (en) * 2002-02-22 2010-04-20 Shire Llc Abuse-resistant amphetamine prodrugs
US7659253B2 (en) * 2002-02-22 2010-02-09 Shire Llc Abuse-resistant amphetamine prodrugs
AU2003219863C1 (en) * 2002-02-22 2009-03-05 Shire Llc Novel sustained release pharmaceutical compounds to prevent abuse of controlled substances
AU2003236521A1 (en) * 2002-06-13 2003-12-31 Nobex Corporation Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus
CA2490007C (en) 2002-07-19 2011-05-24 Omeros Corporation Biodegradable triblock copolymers, synthesis methods therefor, and hydrogels and biomaterials made there from
MX367615B (es) 2002-09-06 2019-08-28 Cerulean Pharma Inc Polimeros a base de ciclodextrina para el suministro de agentes terapeuticos.
EP1644019B2 (en) * 2003-05-29 2018-02-21 Shire LLC Abuse resistant amphetamine compounds
EP1656410B1 (en) 2003-07-22 2010-03-10 Nektar Therapeutics Method for preparing functionalized polymers from polymer alcohols
US20060182692A1 (en) 2003-12-16 2006-08-17 Fishburn C S Chemically modified small molecules
ES2733764T3 (es) * 2003-12-16 2019-12-02 Nektar Therapeutics Método para la preparación de oligo etilenglicol monodisperso
US7351787B2 (en) * 2004-03-05 2008-04-01 Bioartificial Gel Technologies, Inc. Process for the preparation of activated polyethylene glycols
CN100355786C (zh) * 2004-04-28 2007-12-19 江苏豪森药业股份有限公司 聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物
EP2626368B1 (en) * 2004-07-19 2016-12-21 Biocon Limited Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof
US7772182B2 (en) 2004-08-05 2010-08-10 Alza Corporation Stable suspension formulations of erythropoietin receptor agonists
EP1788081A4 (en) * 2004-08-05 2008-09-10 Asahi Kasei Pharma Corp REAGENT CONTAINING PROTEASE REACTION PROMOTER AND / OR DYE STABILIZER
TW200640493A (en) * 2005-02-16 2006-12-01 Insert Therapeutics Inc Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
US8148123B2 (en) * 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
US20080159976A1 (en) * 2005-04-11 2008-07-03 Jacob Hartman Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
BRPI0612942A2 (pt) 2005-04-11 2012-10-09 Savient Pharmaceuticals Inc forma variante de oxidase de urato e uso do mesmo
SI3321359T1 (sl) 2005-04-11 2021-07-30 Horizon Pharma Rheumatology Llc Variantne oblike urat oksidaze in uporaba le-teh
WO2006119280A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 Handylab, Inc. Lyophilized pellets
SG162788A1 (en) 2005-06-14 2010-07-29 Amgen Inc Self-buffering protein formulations
US8568705B2 (en) 2005-07-18 2013-10-29 Nektar Therapeutics Method for preparing branched functionalized polymers using branched polyol cores
KR100664969B1 (ko) * 2005-08-26 2007-01-04 아이디비켐(주) 고순도의 메톡시폴리에틸렌글리콜 및 그들의 유도체의제조방법
CN100360666C (zh) * 2005-11-29 2008-01-09 沈阳农业大学 一种修饰玉米sod的方法
US7989554B2 (en) * 2006-01-10 2011-08-02 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Reacting polyalkylene oxide with base, tertiary alkyl haloacetate, then acid to prepare polyalkylene oxide carboxylic acid
US20070173634A1 (en) * 2006-01-24 2007-07-26 Olsson Nils U Methods for one-step purification of organic polymers using tangential flow filtration
JP5033177B2 (ja) * 2006-04-12 2012-09-26 サビエント ファーマセウティカルズ インク． 陽イオン界面活性剤によるタンパク質の精製
JP2010516625A (ja) 2007-01-24 2010-05-20 インサート セラピューティクス， インコーポレイテッド 制御された薬物送達のためのテザー基を有するポリマー−薬物コンジュゲート
US8222039B2 (en) * 2007-02-22 2012-07-17 Biovectra Inc. Process for purification of water soluble polymers
JP4697809B2 (ja) * 2007-02-22 2011-06-08 旭化成ファーマ株式会社 ロイコ色素の安定化方法
RU2007131782A (ru) * 2007-08-22 2009-02-27 Общество с ограниченной ответственностью "Концерн O3" (RU) Гипогликемическое средство и способ его получения
RU2007137044A (ru) * 2007-10-05 2009-04-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" (Ru) Лекарственное средство, обладающее гемопоэзстимулирующим и гепатопротекторным действием
RU2007137048A (ru) * 2007-10-05 2009-04-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" (Ru) Лекарственное средство для лечения и предупреждения осложнений при сахарном диабете
AU2008313248B2 (en) * 2007-10-16 2012-04-26 Biocon Limited An orally administerable solid pharmaceutical composition and a process thereof
JP5569787B2 (ja) * 2009-03-31 2014-08-13 日油株式会社 高分子量ポリエチレングリコール化合物の精製方法
JP5713274B2 (ja) 2009-03-31 2015-05-07 日油株式会社 高分子量ポリオキシアルキレン誘導体の精製方法
HUP1200205A3 (en) 2009-06-25 2012-09-28 Savient Pharmaceuticals Method and kits for perdicting infusion reaction risk and antibody-mediated low of response by monitoring serum uric acid during pegylated uricare therapy
CN102781237A (zh) * 2009-11-23 2012-11-14 天蓝制药公司 用于传递治疗剂的基于环糊精的聚合物
WO2011119995A2 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 Cerulean Pharma Inc. Formulations and methods of use
GB201008902D0 (en) 2010-05-27 2010-07-14 Imp Innovations Ltd Membrane enhanced polymer sythesis
US8163869B1 (en) 2010-12-27 2012-04-24 Nof Corporation Purification method of carboxyl group-containing polyoxyethylene derivative
RU2452509C1 (ru) * 2011-01-31 2012-06-10 Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" Средство для стимуляции роста организма
US9090769B2 (en) 2011-04-05 2015-07-28 Ticona Llc Molded articles having a swirl-like or marble-like appearance and compositions for producing same
US20120302505A1 (en) * 2011-04-21 2012-11-29 Fetzer Oliver S Cyclodextrin-based polymers for therapeutic delivery
US20140094432A1 (en) 2012-10-02 2014-04-03 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
MX2019004580A (es) 2016-10-21 2019-08-12 Amgen Inc Formulaciones farmaceuticas y metodos para prepararlas.
US11680137B2 (en) 2018-03-29 2023-06-20 Nof Corporation Method for purifying trityl group-containing monodispersed polyethylene glycol
HRP20231337T1 (hr) * 2018-06-07 2024-02-16 Pfizer Inc. Vodena formulacija koja sadrži 1-(4-{[4-(dimetilamino)piperidin-1-il]karbonil}fenil)-3-[4-(4,6-dimorfolin-4-il-1,3,5-triazin-2-il)fenil]ureu
CN109206598A (zh) * 2018-09-10 2019-01-15 武汉轻工大学 聚乙二醇-聚丙交酯嵌段共聚物的制备方法以及药物载体

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4727064A (en) * 1984-04-25 1988-02-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Pharmaceutical preparations containing cyclodextrin derivatives
US4596795A (en) * 1984-04-25 1986-06-24 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health & Human Services Administration of sex hormones in the form of hydrophilic cyclodextrin derivatives
JPH084504B2 (ja) * 1985-04-26 1996-01-24 味の素株式会社 安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ
US4970216A (en) * 1986-03-17 1990-11-13 Richardson Vicks, Inc. Skin treatment composition and method
US5080894A (en) * 1986-05-15 1992-01-14 Emory University Method and composition for reducing tissue damage
US4791192A (en) * 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5006333A (en) * 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5002935A (en) * 1987-12-30 1991-03-26 University Of Florida Improvements in redox systems for brain-targeted drug delivery
US5183809A (en) * 1990-02-15 1993-02-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania/Childrens Hospital Corporation Cyclodextrin polymers and cyclodextrins immobilized on a solid surface
US5153265A (en) * 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5997856A (en) * 1988-10-05 1999-12-07 Chiron Corporation Method and compositions for solubilization and stabilization of polypeptides, especially proteins
US5068227A (en) * 1989-01-18 1991-11-26 Cyclex, Inc. Cyclodextrins as carriers
US5182270A (en) * 1989-08-03 1993-01-26 Iolab Corporation Stabilizing preparation for thymoxamine
JP3051145B2 (ja) * 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5145644A (en) * 1990-12-20 1992-09-08 Allergan, Inc. Hydrogen peroxide destroying compositions and methods of making and using same
JPH04248984A (ja) * 1991-02-05 1992-09-04 Kuraray Co Ltd スーパーオキシドジスムターゼ誘導体およびその製造方法
CA2101361A1 (en) * 1992-08-27 1994-02-28 Robert A. Snow Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances
US5298410A (en) * 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life

Also Published As

Publication number Publication date
TW260611B (hu) 1995-10-21
KR940019312A (ko) 1994-09-14
FI940909A0 (fi) 1994-02-25
US5389381A (en) 1995-02-14
RU94006023A (ru) 1996-04-20
AU660843B2 (en) 1995-07-06
FI940909A (fi) 1994-08-26
IL108777A (en) 1998-02-08
MX9305528A (es) 1994-08-31
EP0614666A1 (en) 1994-09-14
MY131553A (en) 2007-08-30
JPH06256222A (ja) 1994-09-13
NO940663L (no) 1994-08-26
HU9400561D0 (en) 1994-05-30
US5298410A (en) 1994-03-29
US5529915A (en) 1996-06-25
NZ248590A (en) 1995-07-26
CZ38194A3 (en) 1994-10-19
IL108777A0 (en) 1994-06-24
CA2106519A1 (en) 1994-08-26
AU4616293A (en) 1994-09-01
US5334382A (en) 1994-08-02
NO940663D0 (no) 1994-02-25
SK23294A3 (en) 1995-02-08
PH30462A (en) 1997-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT71586A (en) Process for producing lyp0philized polyalkyene oxide modified protein and polypeptide complexes with cyclodextrin
JP5095061B2 (ja) ポリ（エチレングリコール）の１−ベンゾトリアゾリル炭酸エステルの調製のための方法
US5089261A (en) Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US4902502A (en) Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
EP3081233B1 (en) Glycopolysialylation of proteins other than blood coagulation proteins
US8784849B2 (en) Hydroxyapatite-targeting poly(ethylene glycol) and related polymers
HUT75533A (en) Improved interferon polymer conjugates
HUT66755A (en) Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances
UA79430C2 (en) Method for the stepwise attachment of polyethylene glycol to polypeptide
JP2003518178A (ja) 水溶性ポリマーの立体的に妨害される誘導体
JP2022058911A (ja) 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化
HU228877B1 (en) Formulations for stabilization of peg-interferon alpha conjugates and method for preparation such formulations
KR20040086521A (ko) 생물학적 활성물질과 생체적합성 고분자의 1:1 접합체,이의 제조방법과 이를 함유하는 약학 조성물
KR980009276A (ko) PVMA-Ara-C 결합체

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: SANOFI, FR

DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee