CZ306293B6 - Způsob purifikace betulinu a lupeolu, betulin a lupeol připravitelné tímto způsobem - Google Patents

Abstract

Předkládané řešení se týká způsobu purifikace betulinu a lupeolu z extraktu směsi triterpenů březové kůry, který obsahuje následující kroky: a) extrakt směsi triterpenů březové kůry se rozpustí v acetonu, s výhodou za varu; b) vzniklý roztok se za horka přefiltruje, filtrát se naředí destilovanou vodou, vzniklá suspenze se zfiltruje, promyje destilovanou vodou a vysuší; c) sraženina vzniklá v kroku b) se rozpustí v ethanolu za varu, k roztoku se přidá horký roztok CaCl.sub.2.n. v ethanolu a k takto vzniklému čirému roztoku se pomalu přidává horký ethanolový roztok NaOH, za postupného vzniku nerozpustného Ca(OH).sub.2.n., který se odfiltruje, přičemž filtrát se ponechá krystalizovat, vzniklá krystalická sraženina se zfiltruje, promyje ethanolem a vodou a vysuší; d) krystalická sraženina vzniklá v kroku c) se rozpustí v chloroformu, s výhodou za varu, a vzniklý roztok se vysráží petroléterem a/nebo benzinem a/nebo čistým nízkým uhlovodíkem, vybraným ze skupiny obsahující (C5 až C8) uhlovodíky, s výhodou pentan, hexan, cyklohexan, heptan, přičemž vzniklá sraženina betulinu se zfiltruje, promyje petroléterem a/nebo benzinem a/nebo čistým nízkým uhlovodíkem, vybranými ze skupiny obsahující (C5 až C8) uhlovodíky, s výhodou pentan, hexan, cyklohexan, heptan, a vysuší, přičemž proces vaření, filtrace a sušení je s výhodou alespoň ještě jednou zopakován; získaný filtrát obsahující lupeol se odpaří; e) sraženina nebo filtrát z kroku d) se rozpustí v minimálním množství chloroformu za laboratorní teploty, vzniklý roztok se selektivně přefiltruje přes silikagel v chloroformu a bezbarvý filtrát se odpaří dosucha. Předkládané řešení se dále týká betulinu a lupeolu připravitelných tímto způsobem.

Description

Předkládaný vynález se týká způsobu purifikace betulinu a lupeolu z extraktu březové kůry, betulinu a lupeolu připravitelných tímto způsobem.

Dosavadní stav techniky

Betulin (strukturní vzorec I) a lupeol (strukturní vzorec II) jsou pentacyklické triterpeny lupanového typu. Jedná se o lipofilní přírodní látky rostlinného původu, prakticky nerozpustné ve vodě.

Bohatým zdrojem lupeolu a zvláště betulinu je vnější kůra některých druhů bříz, např. druhu Betula pendula (syn. B. alba), široce rozšířeného ve střední Evropě. Břízy produkují i jiné triterpenoidy, např. kyselinu betulinovou, kyselinu oleanovou, erythrodiol, betulon apod., obvykle ale v podstatně menším množství a v závislosti na botanickém druhu. Samotná kůra, zdaleka nebohatší zdroj triterpenů z celé břízy, je pak masivním odpadem dřevařského a zvláště papírenského průmyslu a většinou je využívána jen jako palivo pro výrobu tepla resp. kombinovanou výrobu tepla a elektřiny.

Betulin vykazuje velmi širokou škálu biologických a medicínských účinků. Popsány byly účinky antimykotické, antibakteriální, protizánětlivé, antivirové, anti-HIV, hepatoprotektivní a především antiproliferativní a protinádorové. Navíc bylo prokázáno, že betulin velmi příznivě ovlivňuje léčbu aterosklerózy a obezity způsobené nevhodnou výživou a zvyšuje citlivost buněk na inzulín u diabetů II typu. Betulin je tak mimořádně perspektivní léčivo v mnohých oblastech humánní medicíny, přičemž je klasifikován jako prakticky netoxický. Betulin je také v mnohem větších množstvích dosud zpracováván do kosmetických výrobků a jako součást doplňků výživy.

Lupeol byl doposud zkoumán o něco méně než betulin. Hlavními příčinami mohou být jeho podstatně vyšší cena, než je u betulinu, a patrně také ještě menší rozpustnost ve vodě a v polárních organických rozpouštědlech. Lze však předpokládat, že díky své vysoké strukturní podobnosti (chybí jen OH-skupina na 28. uhlíku) bude vykazovat prakticky stejné biologické účinky jako betulin a bude tedy mít v budoucnu i podobné využití (M. Saleem, Cancer Lett, 2008, 285, 109115; S. Ciurlea et al., JAgroalimentary Processes and Technologies, 2010, 16(4), 427).

Betulin se zdaleka nejčastěji izoluje z kůry bříz. Aby se extrahovatelné látky získaly z přírodních materiálů efektivně, je obvykle nutné surovinu dostatečně rozmělnit. V průmyslovém měřítku se pro březovou kůru používají většinou mlýny. Pro lepší účinnost extrakce triterpenů je navíc vhodné alespoň hrubě oddělit vnější kůru s podstatně vyšším obsahem těchto látek od vnitřní kůry, což lze udělat průmyslově flotací částeček za přítomnosti smáčedla nebo např. selektivním fukarem využívajícím vyšší měrné hmotnosti částic vnitřní kůry.

- 1 CZ 306293 B6

Extrakci triterpenů z březové kůry lze po rozemletí nebo po rozdrcení suché kůry také usnadnit či urychlit působením ultrazvuku, aktivací kůry pomocí vodní páry nebo přehřáté vodní páry nebo působením mikrovln. Vlastní extrakce triterpenů má velké množství modifikací, lišících se především použitými extrakčními činidly. Mnohá z nich však jsou pro průmyslové využití nevhodná, buď pro svou vyšší cenu a menší dostupnost, pro svou horší recyklovatelnost (např. destilací), nebo pro nebezpečnost pro zdraví či pro životní prostředí. V literatuře se lze setkat např. s použitím methanolu, ethanolu, propanolu, butanolu, heptanu, hexanu, cyklohexanu, petroléteru, toluenu, xylenů, acetonu a jiných ketonů, dichlorethanu, chloroformu, ethylacetátu a jiných esterů, limonenu, éterů a dokonce i iontových látek na bázi imidazolu. Velmi často se také používají různé směsi organických rozpouštědel, někdy i směsi obsahující nezanedbatelné množství vody (WO 2005/047 304 a EP 2 514 430).

Poněkud složitější a technicky náročnější jsou superkritické extrakce využívající jako extrakční činidlo oxid uhličitý v superkritickém stavu (EP 2 125 860) nebo oxid uhličitý ve směsi s methanolem, ethanolem nebo acetonem v superkritickém stavu (CN 1 634 972, US 2005/158414). Betulin však může být před vlastní extrakcí převeden ještě v kůře na diacetát (EP 2 125 860).

Je také známá metoda sublimační, kdy je vysušená kůra zahřívána na vysokou teplotu (až přes 300 °C) při atmosférickém tlaku nebo za podtlaku a betulin (patrně s lupeolem) je vysublimován (M. Guidoin et al., Themochim. Acta, 2003, 398, 153).

Ze způsobů purifikace betulinu z primárních extraktů se v laboratorním měřítku používají převážně metody založené na kapalinové chromatografii, resp. flash-chromatografii, které jsou ale použitelné víceméně jen pro laboratorní přípravu, protože kapalinová chromatografie by v poloprovozním nebo průmyslovém měřítku byla při purifikaci triterpenů příliš náročná na čas, na materiál použitý jako stacionární fáze (po několika purifikacích by i přes promývání kolon nakonec došlo k jejich zanesení; u flash-chromatografie jsou pak kolony jednorázové) a hlavně na množství použitých elučních činidel, tedy organických rozpouštědel. Proto se pro použití ve výrobě větších množství betulinu a jiných triterpenů mnohem lépe hodí metody založené na rozdílné rozpustnosti v různých rozpouštědlech a na rekrystalizaci.

Lupeol se obvykle izoluje z jiných rostlin, které většinou neobsahují betulin a není jej tak třeba oddělovat, např. z rostlin rodu Lupinus, Calotropis, Oxystelma a mnoha dalších. Nicméně pro průmyslovou výrobu lupeolu se jeví jako nejvýhodnější zdroj březová kůra hlavně díky masivní dostupnosti této suroviny.

Izolaci lupeolu z březové kůry popisuje CN 1 793 161. Metoda je zpočátku relativně jednoduchá, založená na extrakci dichlormethanem, přečištění cyklohexanem a dvojí krystalizací ze směsi ethanol/aceton. Takto byla získána frakce obohacená lupeolem až na cca 80 %. Ovšem další přečištění na „pure lupeol“ se již děje klasickou chromatografii na silikagelu elucí směsí petroléter/ethylacetát, což metodu pro průmyslové použití výrazně komplikuje. Zmíněný patent nijak neřeší izolaci a případnou purifikaci betulinu, která by mohla probíhat současně.

US 2003/0 153 776 popisuje izolaci a purifikaci betulinu z březové kůry. Používá málo dostupná a drahá rozpouštědla, z hlediska ekologického nevhodná (toluen, xylen, vyšší étery společně s vodou, se kterou tato rozpouštědla tvoří azeotropickou směs a jejich část je tudíž obtížně recyklovatelná). Deklarovaná čistota konečného produktu je pod 96 %, přičemž autoři uvádějí o 3 °C vyšší teplotu tání, než je všeobecně publikovaná. Způsob extrakce z kůry pak vykazuje relativně velmi malou účinnost. Obdobně je tomu - včetně dosažené čistoty - i u DE 10204278.

WO 2005/047 304 využívá k izolaci a purifikaci betulinu, lupeolu a kyseliny betulinové systém extrakcí, srážení a krystalizací s použitím organických rozpouštědel (xylenu, acetonu, cyklohexanu a isopropanolu). Není zde vyřešen problém s recyklací značného množství použitého xylenu tvořícího s vodou azeotropickou směs.

-2CZ 306293 B6

RU 2 270 202 popisuje pro oddělení a purifíkaci betulinu a lupeolu systém extrakcí, rozpouštění, filtrací a krystalizací. Extrakční kroky jsou mnohokrát opakovány (např. na dvou místech purifikačního procesu 5 stejných extrakcí najeden purifikační krok), což nejenže zvyšuje ztráty v procesu, především však proces velmi prodlužuje. Získané produkty mají čistotu deklarovanou pod 96 %.

EP 2 514 430 nárokuje metodu kontinuální purifikace betulinu a kyseliny betulinové z extraktu březové kůry. Základem „kontinuality“ purifikace jsou 4 chromatografické/filtrační kolony s náplní silikagelu nebo hydratovaného oxidu hlinitého propojené důmyslným systémem ventilů. Na kolonách má dojít k účinné separaci betulinu, kyseliny betulinové a polárních barevných komponent. Tento systém má nevýhody snižující hodnotu tohoto náročného technického uspořádáni, a to zejména fakt, že výchozí surovinou pro purifikační krok je extrakt z březové kůry minimálně dvakrát předčištěný krystalizací, což se vše děje vsádkové, takže „kontinualita“ vlastní purifikace je diskutabilní. Dále je to vysoká spotřeba rozpouštědel použitých jak pro eluci purifikovaných látek, tak pro následné recyklační promývání kolon, přičemž jejich recyklace je kvůli vzájemnému míchání různých rozpouštědel velmi náročná. Složitá aparatura kolon, potrubí, ventilů a pump je náročná na údržbu, zvláště tehdy, když nebude možný kontinuální přísun dávkovou extrakcí získaného a krystalizací přečištěného výchozího materiálu a v aparatuře se začnou usazovat nečistoty a rozpouštědla se budou postupně vypařovat. Také recyklační promytí kolon nemůže být při rozumné spotřebě promývacích rozpouštědel dokonalé, bude nejspíše nutné adsorpční materiál kolon častěji vyměňovat, což nejenže prodraží výrobu, ale také naruší onu „kontinuální“ purifíkaci. Celý popsaný systém purifikace je založen na předpokladu, že ve výchozím materiálu není přítomen lupeol či další neuvedené triterpenoidy. To možná splňuje druh břízy, který autoři použili (B. papyrifera), u jiných druhů však je lupeol jako nečistota triterpenoidní povahy při purifíkaci betulinu majoritní a dosahuje až 20 % obsahu betulinu (např. u v Evropě nejrozšířenější B. pendula). Snaha o izolaci a purifíkaci kyseliny betulinové může být vzhledem k jejímu malému obsahu u mnoha druhů bříz poněkud neefektivní (viz. vysoká spotřeba rozpouštědel při purifíkaci), zvláště, vezme-li se v úvahu relativní snadnost její chemické výroby oxidací betulinu přes kyselinu betulonovou.

RU 2 192 879 (EP 2842 564) popisuje relativně jednoduchou přípravu betulinu z březové kůry včetně popisu technického zařízení, čistota získaného betulinu je však nízká (v nejlepším případě pod 95 %). Jako hlavní nečistota je uveden lupeol (přes 7 %).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález řeší problémy stavu techniky poskytnutím způsobu purifikace betulinu a lupeolu systémem extrakcí, rozpouštění, filtrací a krystalizací, který vede k získání těchto látek v alespoň 99% čistotě, s použitím dobře recyklovatelných (pomocí destilace), levných a dostupných rozpouštědel, což snižuje celkovou spotřebu energie. Díky využití vhodných způsobů srážení z roztoku jsou purifikační kroky velmi účinné a celý extrakční a purifikační proces je bezpochyby podstatně rychlejší a čistota získaného betulinu a lupeolu je zřetelně vyšší než v dosavadním stavu techniky (přesahuje 99 % pro betulin a 95 % pro lupeol).

Předmětem předkládaného vynálezu je způsob purifikace betulinu a lupeolu z extraktu směsi triterpenů březové kůry. Způsob purifikace betulinu a lupeolu z extraktu směsi triterpenů březové kůry obsahuje následující kroky:

a) Pro odstranění polárních nečistot se extrakt směsi triterpenů březové kůry rozpustí v acetonu, s výhodou v 45 až 50násobném objemu acetonu vzhledem k hmotnosti extraktu, s výhodou za varu.

-3CZ 306293 B6

b) Vzniklý roztok se přefiltruje, s výhodou za horka, filtrát se naředí destilovanou vodou, s výhodou polovičního až stejného objemu jako aceton a vzniklá suspenze, s výhodou nejprve přivedená k varu a poté ochlazena na laboratorní teplotu, se přefiltruje. Sraženina obsahující triterpeny a méně polární nečistoty se promyje destilovanou vodou a vysuší. Po vysušení a případném smíchání jednotlivých subfrakcí je získána první purifikovaná frakce triterpenů v celkovém množství přesahujícím cca 80 % původní hmotnosti extraktu směsi triterpenů březové kůry. Jako filtr lze s výhodou použít papírový nebo keramický filtr.

Tento purifikační krok mj. velice usnadňuje další práci s materiálem, neboť všechny meziprodukty pro získání čistého betulinu a lupeolu jsou nadále buď krystalické, nebo jako amorfní dostatečně hrubé, a tudíž jsou dobře filtrovatelné, snadno promývatelné a dobře sušitelné. V tomto kroku téměř vymizí i kyselina betulinová, která jako polárnější triterpen zůstává rozpuštěna ve zředěném acetonu.

Postupné srážení triterpenů vodou z acetonového roztoku může též napomoci získat různé subfrakce s odlišným poměrem zastoupení lupeolu a betulinu. Čím menší množství vody je použito, tím je ve sraženině více zastoupen lupeol.

Z odpadního filtrátu je možné prostou destilací s následnou frakční destilací recyklovat většinu použitého acetonu. Nahnědlý odpad zbývající ve vodném roztoku po oddestilování podstatného množství acetonu nebyl analyzován ani nijak využit.

c) Pro odstranění látek kyselé povahy včetně zbytků kyseliny betulinové a dalších nečistot se sraženina vzniklá v kroku b) rozpustí v ethanolu za varu. S výhodou se použije 35násobný objem ethanolu vzhledem k hmotnosti frakce. Hmotnostně pětinové množství NaOH vzhledem k množství sraženiny vzniklé v kroku b) je rozpuštěno v 25násobném objemu ethanolu o teplotě v rozmezí mezi 40 °C a teplotou varu rozpouštědla (vzhledem k hmotnosti NaOH) a ekvimolámí množství bezvodého CaCI₂ vzhledem k použitému NaOH je odděleně rozpuštěno v 17násobném objemu ethanolu o teplotě v rozmezí mezi 40 °C a teplotou varu rozpouštědla (vzhledem k hmotnosti CaCl₂). K ethanolovému roztoku triterpenů se za intenzivního míchání přidá roztok CaCl₂ v ethanolu o teplotě v rozmezí mezi 40 °C a teplotou varu roztoku, a k takto vzniklému čirému roztoku se pomalu přidává ethanolový roztok NaOH o teplotě v rozmezí mezi 40 °C a teplotou varu roztoku, za postupného vzniku nerozpustného Ca(OH)₂, zpočátku jako bílá sraženina, při zvyšujícím se pH však stále intenzivněji hnědnoucí. Suspenze se přivede k varu a následně se sraženina odfiltruje a promyje ethanolem o teplotě v rozmezí mezi 40 °C a teplotou varu. Tato sraženina může být dále použita k získání látek vysrážených převážně jako nerozpustné vápenaté sloučeniny či adsorbovaných na sraženinu (vč. určité části betulinu). Nahnědlý filtrát, obsahující převážně betulin a lupeol, se odpaří na přibližně třetinový objem a ponechá se krystalizovat, s výhodou při teplotě nižší než 25 °C, výhodněji při teplotě nižší než 10 °C. Vzniklá krystalická sraženina se zfiltruje, promyje ethanolem a vodou a vysuší. Po vysušení je získáno cca 65 % (vzhledem k výchozímu množství sraženiny v kroku c)) velice světlé, slabě béžové jemně krystalické látky.

Filtrát lze destilací ethanolu odpařit dosucha a odparek použít jako přídavek k výchozí sraženině při příštím cyklu purifíkace, čímž se výrazně zvýší celkový výtěžek, aniž by se snížila čistota konečného produktu.

Tento purifikační krok odstraňuje převážnou část látek kyselé povahy a látek výrazně barevných v alkalickém prostředí, patrně polyfenolické povahy, taninů, mastných kyselin a jejich esterů. Rovněž odstraňuje zbytky kyseliny betulinové, vždy doprovázející betulin a lupeol v březové kůře.

V kroku d) se krystalická sraženina vzniklá v kroku c) rozpustí v chloroformu, s výhodou v 16násobném objemu chloroformu vzhledem k hmotnosti frakce, za varu, a vzniklý roztok se vysráží petroléterem a/nebo benzinem a/nebo (C5 až C8) uhlovodíkem, s výhodou vybraným ze skupiny

-4CZ 306293 B6 obsahující pentan, hexan, cyklohexan a heptan. Vzniklá suspenze se s výhodou přivede k varu, zfiltruje a sraženina betulinu se promyje petroléterem a/nebo benzinem a/nebo (C5 až C8) uhlovodíkem, s výhodou vybraným ze skupiny obsahující pentan, hexan, cyklohexan a heptan, a vysuší, přičemž proces varu, filtrace a sušení je s výhodou alespoň ještě jednou zopakován. S výhodou je ke srážení použit 20násobek (vzhledem k hmotnosti frakce) objemu petroléteru, benzinu nebo (C5 až C8) uhlovodíku, s výhodou vybraného ze skupiny obsahující pentan, hexan, cyklohexan a heptan. Filtrát získaný odfiltrováním téměř bílé, jen velmi slabě nažloutlé amorfní sraženiny betulinu, obsahující lupeol, se odpaří dosucha. Takto se získá cca 5 až 10 hmotnostních % (vzhledem k hmotnosti sraženiny vzniklé v kroku c)) téměř bílé amorfní frakce lupeolu použitelné dále k získání a případné další purifíkaci lupeolu.

Tento purifikační krok využívá velice rozdílné rozpustnosti betulinu a lupeolu v nízkých uhlovodících nebo jejich směsích (petroléteru, benzinu). Zatímco petroléter je častým extrakčním činidlem při získávání lupeolu, betulin je v něm málo rozpustný. Jako velmi málo účinnou se však ukázala přímá extrakce lupeolu z původní jemně krystalické frakce získané v kroku c). Příčinou byla bezpochyby právě krystaličnost oné frakce, kdy povrch směsných krystalů nerozpustného betulinu s lupeolem neumožnily vniknutí petroléteru dovnitř krystalů a vymytí většiny lupeolu. Proto je zvoleno srážení betulinu uhlovodíky z jeho chloroformového roztoku, což se ukázalo jako mimořádně účinné. Z filtrátů lze recyklovat chloroform a použité uhlovodíky pro opakované použití frakční destilací.

e) sraženina betulinu nebo odparek filtrátu s lupeolovou frakcí z kroku d) se rozpustí v chloroformu, s výhodou v co nejmenším množství chloroformu, za laboratorní teploty, vzniklý roztok se přefiltruje přes silikagel v chloroformu a bezbarvý filtrát se odpaří dosucha. V tomto kroku se odstraní poslední zbytky polárních nečistot. Množství použitého silikagelu je s výhodou cca dvojnásobek hmotnosti použité frakce z kroku d) v malé chromatografícké kolonce, kde výška sloupce silikagelu je 1,5 až dvojnásobná oproti průměru kolony. Malé zbytky barevných nečistot se zcela zachytí v prvních přibližně 20 % výšky sloupce silikagelu. Kolona se následně promyje ještě asi polovičním množstvím chloroformu použitého pro rozpuštění frakce z kroku d). Z naprosto bezbarvého filtrátu se poté zcela oddestiluje chloroform, čímž se získá čistě bílý odparek amorfního prášku betulinu nebo lupeolu.

Tento krok využívá vyšší afinity polárních nečistot k povrchu polárního silikagelu v nepolárním prostředí chloroformu. Jedná se o filtraci, která je oproti klasické chromatografii mnohem rychlejší a nesrovnatelně méně náročná na materiál, rozpouštědla a vybavení. Prakticky veškerý chloroform použitý v tomto purifikačním krokuje recyklovatelný prostou destilací.

Ve výhodném provedení se acetonový filtrát vzniklý v kroku b) naředí destilovanou vodou a vzniklá suspenze se zfiltruje, promyje destilovanou vodou a vysuší pro získání další frakce betulinu a lupeolu, přičemž tento postup se může opakovat vícekrát.

Ve výhodném provedení následuje po kroku e) ještě krok f), ve kterém se odparek z předchozího kroku e) dále čistí rekrystalizací. Jako rozpouštědlo pro rekrystalizaci se s výhodou použije ethanol pro betulin (resp. hexan pro lupeol). Při rekrystalizaci betulinu z ethanolu se odparek betulinu s výhodou rozpustí ve 40násobku objemu vroucího 96% čistého ethanolu (vzhledem k hmotnosti použitého odparku) a po úplném rozpuštění se roztok rychle zfiltruje za horka. Následně se čirý filtrát ponechá volně krystalizovat, s výhodou při teplotě nižší než 25 °C, výhodněji při teplotě nižší než 10 °C. Krystalická sraženina se poté zfiltruje za sníženého tlaku, promyje malým množstvím ledového ethanolu a vysuší za laboratorní teploty na vzduchu. Získá se takto přibližně 70 % z původního množství použitého odparku. Ethanol (resp. hexan) lze recyklovat prostou destilací filtrátu.

Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž betulin připravitelný výše uvedeným způsobem, který má čistotu alespoň 99 %.

-5 CZ 306293 B6

Dále je předmětem vynálezu lupeol připravitelný výše uvedeným způsobem, kteiý má čistotu alespoň 95 %.

K získání extraktu směsi triterpenů březové kůry, ze kterého vychází způsob purifikace betulinu a lupeolu podle předkládaného vynálezu, vede několik způsobů již dříve popsaných v literatuře. Jako nejúčinnější a nej efektivnější způsob jak z hlediska časového, tak z hlediska spotřeby rozpouštědla a energie vynaložené na jeho recyklaci se jeví extrakce v Soxhletově aparatuře. Výchozí surovinou pro extrakt směsi triterpenů je vnější kůra břízy, která je po vysušení náležitě rozemleta či rozdrcena. Pro průmyslové využití jako zdroj připadá v úvahu hlavně odpadní kůra při zpracování březového dřeva např. v papírenském průmyslu, která by byla rozmělněna a případně její vnější vrstva vytříděna některým ze známých způsobů. Jako extrakční krok pro získání triterpenů z vnější březové kůry může být zvolena jednoduchá extrakce technickým ethanolem denaturovaným benzinem v Soxhletově extraktoru, která je mimořádně účinná a rychlá (celý extrakční proces i s vysušením produktu trvá pouze 1 až 2 hodiny). K extrakci triterpenů z březové kůry lze však použít libovolný jiný způsob uvedený ve výše uvedených patentech či jiných odborných článcích.

Objasnění výkresů

Obr. 1: Chromatogramy GC-MS pro frakce: B0, Bia, Blb, Bic, Bid, B2, B3, L3 a B5 (neuvedená frakce B4 má prakticky totožný chromatogram jako frakce B5)

Obr. 2: Tabulka zastoupení triterpenů ve všech frakcích

Obr. 3: A - krystalky frakce B5, B - drúzy krystalů frakce B5b po volném odpaření ethanolu

Obr. 4: Schéma extrakce a purifikace použité v předkládaném vynálezu

Příklady uskutečnění vynálezu

Všechny frakce jsou označeny písmenem (B - betulinová frakce, L - lupeolová frakce) a číslem označujícím číslo purifikačního kroku (0 pro původní extrakt z kůry, 1 pro krok b), 2 pro krok c), 4 pro krok e), 5 pro krok f)). Z každé frakce bylo odebráno jisté množství pro analýzu a pro další případné účely, takže do dalšího purifikačního krokuje použito menší množství, než bylo získáno v předešlém kroku. Čistota vzorků byla kontrolována pomocí GC-MS: Vzorky všech frakcí a subfrakcí v množstvích 1 až 2 mg byly rozpuštěny v pyridinu a derivatizovány N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamidem. Poté byly analyzovány plynovou kapilární chromatografii s hmotnostně-spektrometrickou detekcí. Jako standardy pro určení elučních časů byly použity betulin (min. 98 %), lupeol (min. 94 %) a kyselina betulinová (min. 98 %) od firmy Sigma— Aldrich (USA).

Příklad 1: Extrakce triterpenů z březové kůry g vysušené ručně oloupané vnější kůry z pokácené břízy Betula pendula (lokalita Hradec Králové) bylo nastříháno na malé kousky a rozsekáno sekáčkem kuchyňského mixeru. Takto upravená kůra byla podrobena extrakci technickým ethanolem denaturovaným benzinem v Soxhletově extraktoru, přičemž byl zkondenzovaný teplý ethanol z extrakční nádobky jen sedmkrát vyprázdněn. Ze získaného ethanolového roztoku byl ethanol destilací úplně odstraněn. Takto bylo získáno 12,9 g suchého hrubého extraktu B0 (B0 na obr. 1 a 2).

-6CZ 306293 B6

Příklad 2: Purifikační krok b): částečné odstranění polárních nečistot z hrubého extraktu B0 g hrubého extraktu B0 bylo rozpuštěno v 500 ml acetonu za varu. Ještě horký roztok byl zfiltrován na papírovém filtru malé hustoty. Nerozpuštěný sediment o hmotnosti 0,91 g po vysušení byl označen jako frakce Bia a obsahoval přes 24 % lupeolu a 75 % betulinu (Bia na obr. 1 a 2). Filtrát byl naředěn asi 200 ml destilované vody a vzniklá suspenze byla krátce povařena. Světlá sraženina triterpenů a méně polárních nečistot byla po zchlazení zfiltrována opět na papírovém filtru, promyta destilovanou vodou a vysušena. Takto bylo získáno 1,7 g frakce Blb s obsahem přes 22 % lupeolu a přes 77 % betulinu (Blb na obr. 1 a 2). Do filtrátu bylo následně přilito dalších asi 200 ml vody, nově vzniklá sraženina byla opět zfiltrována a promyta vodou. Takto bylo získáno 4,96 g frakce Blc s obsahem přes 19 % lupeolu a přes 80 % betulinu (Blc na obr. 1 a 2). Do filtrátu bylo přilito následně ještě asi 100 ml destilované vody a obdobným způsobem bylo získáno 3,19 g frakce Bid s obsahem přes 8 % lupeolu a přes 91 % betulinu (Bid na obr. 1 a 2). Celkem tedy bylo získáno cca 10,76 g první purifikované frakce triterpenů Bl. Kyselina betulinová a případné další triterpeny se od této frakce vyskytují prakticky jen ve stopách.

Výsledky analýzy ukazují, že zastoupení lupeolu a betulinu ve sraženině do značné míry závisí na poměru aceton/voda při srážení. Pro přípravu či výrobu samotného lupeolu je vhodnější použít k prvnímu srážení méně vody. V každém případě však je možno další vodou nakonec vysrážet prakticky veškeré zbylé množství betulinu a lupeolu a po vysušení konečnou sraženinu znovu použít spolu s výchozím extraktem při purifíkaci v další várce purifikačního cyklu.

Příklad 3: Purifikační krok c): odstranění látek kyselé povahy a dalších nečistot z frakce Bl

5,5 g směsné frakce Bl bylo rozpuštěno ve 200 ml ethanolu za varu. Vedle toho byl připraven horký roztok 1,1 g NaOH ve 20 ml ethanolu a horký roztok 3 g bezvodého CaCl₂ v 50 ml ethanolu. K vroucímu roztoku frakce Bl byl za intenzivního míchání přilit horký roztok CaCl₂ a k takto vzniklému čirému roztoku byl přidáván horký ethanolový roztok NaOH pozvolna po dobu cca 30 sekund. Okamžitě začala vznikat sraženina v ethanolu nerozpustného Ca(OH)₂, zpočátku bílá, při zvyšujícím se pH však stále intenzivněji hnědnoucí. Po krátkém povaření byla tmavě hnědá sraženina za horka zfiltrována. Z čirého nahnědlého filtrátu bylo následně oddestilováno asi 100 ml ethanolu a zbytek byl ponechán cca 3 h při 7 °C krystalizovat. Po odfiltrování, promytí malým množstvím ethanolu a vysušení bylo takto získáno 3,55 g velice světlé, slabě béžové jemně krystalické frakce B2 s obsahem přes 80 % betulinu a přes 19 % lupeolu (B2 na obr. 1 a 2).

Příklad 4: Purifikační krok d): oddělení betulinu a lupeolu z frakce B2

2,5 g frakce B2 bylo rozpuštěno ve 40 ml chloroformu za varu. Do takto vzniklého čirého roztoku bylo poté přidáno 100 ml petroléteru 40 až 60 °C. Okamžitě začala vznikat sraženina v petroléteru málo rozpustného betulinu. Po cca 10 minutovém povaření a následném zchlazení byla sraženina zfiltrována na papírovém filtru a promyta cca 30 ml čistého petroléteru. Vysušená sraženina byla opět rozpuštěna, tentokrát ve 30 ml vroucího chloroformu, a po úplném rozpuštění bylo přidáno 80 ml petroléteru. Vzniklá sraženina byla zfiltrována na fritě a promyta cca 30 ml petroléteru. Po vysušení sraženiny bylo získáno 1,61 g téměř bílé, jen velmi slabě nažloutlé amorfní frakce B3 s obsahem betulinu téměř 99 % (B3 na obr. 1 a 2). Při použití heptanu místo petroléteru vzniká sraženina betulinu pozvolna a je zapotřebí delšího času po zchlazení a před filtrací. Sraženina se zdá být jemnější a o trochu hůře filtrovatelná, než při použití petroléteru jako srážecího činidla a oddělení lupeolu je méně účinné (o cca 10 %). Naproti tomu je snadnější recyklace původních rozpouštědel frakční destilací na koloně.

-7 CZ 306293 B6

Odpařením prvního filtrátu a vysušením bylo získáno 0,126 g bílého prášku obsahujícího odstraněný lupeol o čistotě téměř 89 % a označeného jako frakce L3 (L3 na obr. 1 a 2). Další purifikace probíhala jednou z následujících variant:

a) rozpuštění frakce L3 v minimálním množství horkého chloroformu a opětovné vysrážení znečišťujícího betulinu 2 až 3 násobným objemem petroléteru, filtrace a odpaření čirého filtrátu nebo

b) rozpuštění většiny frakce L3 v minimálním množství petroléteru za horka tak, aby zbyla nejméně % původního množství nerozpuštěna. Po zchlazení roztoku (čímž se část lupeolu vysráží, spolu však strhne i většinu zbylého znečišťujícího betulinu) se roztok rychle zfiltruje a filtrát nechá odpařit. Takto se odstraní alespoň poloviční množství betulinu a čistota lupeolu je cca 95 % nebo více.

Příklad 5: Purifikační krok e): vyčištění betulinu od zbytku polárních nečistot z frakce B3 g frakce B3 bylo na fritě promyto malým množstvím (cca 10 ml) petroléteru a po vysušení následně rozpuštěno v cca 40 ml chloroformu za laboratorní teploty. Takto vzniklý roztok byl přefiltrován přes 2 g silikagelu nasypaného do malé kolonky s chloroformem. Vrstva silikagelu byla 1,5 cm silná. Malé zbytky barevných nečistot byly beze zbytku zachyceny v horních cca 3 mm sloupce silikagelu. Kolona byla následně promyta ještě 20 ml chloroformu. Ze zcela bezbarvého filtrátu byl poté úplně oddestilován chloroform, přičemž byl získán čistě bílý odparek amorfního prášku - frakce B4 (B4 na obr. 2). Tato frakce s obsahem přes 99 % betulinu nebyla vážena a po odebrání malého množství vzorku k analýze (do 50 mg) bylo veškeré zbylé množství použito pro poslední purifikační krok.

Příklad 6: Purifikační krok e): vyčištění lupeolu od zbytku polárních nečistot z frakce L3

Konečné vyčištění lupeolu od zbytku nečistot bylo obdobné, jako je uvedené u betulinu, tedy filtrací chloroformového roztoku produktu na silikagelu (viz příklad 5). V případě menších množství lupeolové frakce by byla možná jako vysoce účinný purifikační krok lupeolu i kapalinová chromatografie využívající mírně rozdílné lipofility lupeolu a betulinu (viz např. CN 1793161). Přečištěná lupeolová frakce L4 měla čistotu cca 95 %.

Příklad 7: Rekrystalizace čistého betulinu z ethanolu

Téměř veškerá frakce B4 byla rozpuštěna ve 40 ml vroucího 96% čistého ethanolu a po úplném rozpuštění byl roztok rychle zfiltrován za horka. Následně byl původně čirý filtrát, při postupném chladnutí stále více se zakalující postupně vznikajícími zárodečnými krystalky, ponechán k volné krystalizaci cca 3 hodiny při 7 °C. Krystalická sraženina byla poté zfiltrována na fritě za podtlaku, promyta malým množstvím ledového ethanolu a vysušena za laboratorní teploty na vzduchu. Bylo získáno 0,693 g zcela bílé krystalické frakce B5 představující betulin o čistotě 99,6 % (B5 na obr. I a 2). Drobné orthorhombické krystalky betulinu se jevily při pozorování v mikroskopu zcela průhledné a bezbarvé, žádné nečistoty nebyly pozorovány (obr. 3A). Teplota tání tohoto konečného produktu byla zjištěna mikroskopickým bodotávkem a jeho hodnota činila 255 až 256 °C, což zcela odpovídá literárním údajům a je o cca 1 °C vyšší, než standard betulinu od firmy Sigma-Aldrich s deklarovanou čistotou vyšší než 98 %.

Matečný louh po krystalizaci frakce B5 byl v misce ponechán na vzduchu do úplného odpaření ethanolu. Byly získány jehličkovité drúzy dlouhých tenkých krystalů ukázaných na obr. 3B. Matečný louh lze také s výhodou použít místo čistého ethanolu pro rozpuštění frakce B4 při příští purifikaci.

-8CZ 306293 B6

Pro krystalizaci je využit velký rozdíl rozpustnosti betulinu v ethanolu za normální teploty a za varu, kdy je rozpustnost zhruba pětinásobná. Ethanol je však také krystaliformní látkou a nejen rozpouštědlem, neboť betulin krystaluje v průhledných bezbarvých orthorhombických krystalech s jednou molekulou ethanolu na jednu molekulu betulinu, kde jsou vzájemně provázány vodíkovými můstky (S.A. Kuznetsova et al, Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2014, 40, 742). Po ztrátě krystalického ethanolu se krystaly betulinu rozpadají na amorfní bílý prášek.

Schéma celého provedeného procesu izolace a purifikace betulinu a lupeolu z březové kůry je uvedeno na obr. 4.

Příklad 8: Rekrystalizace čistého lupeolu z hexanu

Rekrystalizace frakce L4 lupeolu byla provedena analogicky jako v příkladu 7, rozpouštědlem byl v tomto případě hexan a nikoli ethanol (krystalická sraženina má pak mnohem lepší a hrubší strukturu).

Průmyslová využitelnost

Navržený postup je pro svou technologickou jednoduchost (v podstatě pouze rozpouštění, srážení, filtrace a destilace) a nízkou náročnost na spotřebovaný materiál velice vhodný pro poloprovozní nebo průmyslovou výrobu velmi čistého betulinu a čistého lupeolu z odpadní březové kůry pro medicínské, farmaceutické, kosmetické či výzkumné použití. Použitá rozpouštědla jsou levná, recyklovatelná, s výjimkou chloroformu netoxická a prakticky neškodí životnímu prostředí. Většinu všech použitých rozpouštědel lze recyklovat pomocí prosté nebo frakční destilace.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob purifikace betulinu a lupeolu z extraktu směsi triterpenů z březové kůry, s výhodou ethanolového extraktu, vyznačený tím, že obsahuje následující kroky:

   a) extrakt směsi triterpenů z březové kůry se rozpustí v acetonu, s výhodou za varu;

   b) vzniklý roztok se přefiltruje, s výhodou za horka, triterpeny se vysráží destilovanou vodou, vzniklá suspenze se zfiltruje, sraženina se promyje destilovanou vodou a vysuší;

   c) vysušená sraženina vzniklá v kroku b) se rozpustí v ethanolu za varu, k roztoku se přidá roztok CaCI₂ v ethanolu o teplotě v rozmezí mezi 40 °C a teplotou varu roztoku, a k takto vzniklému čirému roztoku se pomalu přidává ethanolový roztok NaOH o teplotě v rozmezí mezi 40 °C a teplotou varu roztoku, za postupného vzniku nerozpustného Ca(OH)₂, který se odfiltruje, přičemž filtrát se ponechá krystalizovat, vzniklá krystalická sraženina se zfiltruje, promyje ethanolem a vodou a vysuší;

   d) krystalická sraženina vzniklá v kroku c) se rozpustí v chloroformu, s výhodou za varu, a vzniklý roztok se vysráží petroléterem a/nebo benzinem a/nebo (C5 až C8) uhlovodíkem, s výhodou vybraným ze skupiny obsahující pentan, hexan, cyklohexan a heptan, přičemž vzniklá sraženina betulinu se zfiltruje, promyje petroléterem a/nebo benzinem a/nebo (C5 až C8) uhlovodíkem, s výhodou vybraným ze skupiny obsahující pentan, hexan, cyklohexan a heptan, a vysuší; získaný filtrát obsahující lupeol se odpaří;

   -9CZ 306293 B6 a dále krok e 1) a/nebo e2), kde el) sraženina betulinu vzniklá v kroku d) se rozpustí v chloroformu za laboratorní teploty, vzniklý roztok se přefiltruje přes silikagel v chloroformu a bezbarvý filtrát se odpaří dosucha;

   e2) odparek filtrátu z kroku d) obsahující lupeol se rozpustí v chloroformu za laboratorní teploty, vzniklý roztok se přefiltruje přes silikagel v chloroformu a bezbarvý filtrát se odpaří dosucha.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že acetonový roztok se postupně sráží vodou za vzniku subfrakcí s odlišným poměrem zastoupení lupeolu a betulinu.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že po kroku el) následuje krok fl), ve kterém se výsledný odparek betulinu dále čistí rekrystalizaci z ethanolu.
4. 4. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že po kroku e2) následuje krok f2), ve kterém se výsledný odparek lupeolu dále čistí rekrystalizaci z hexanu.