CZ301696B6

CZ301696B6 - Peptidová sloucenina, farmaceutická kompozice tuto peptidovou slouceninu obsahující a použití této peptidové slouceniny

Info

Publication number: CZ301696B6
Application number: CZ20013318A
Authority: CZ
Inventors: Bernd@Michael; Kutscher@Bernhard; Günther@Eckhard; Romeis@Peter; Reissmann@Thomas; Beckers@Thomas
Original assignee: Zentaris Gmbh
Priority date: 1999-03-17
Filing date: 2000-03-11
Publication date: 2010-05-26
Also published as: CN1348462A; TR200103339T2; BR0009472A; HUP0200363A2; AR022970A1; YU68702A; CZ20013318A3; RU2227145C2; SI1268522T1; ES2225103T3; HK1045531A1; PL351792A1; JP2002543045A; ZA200107753B; AU759442B2; NO20014486L; EP1163264B1; BG65283B1; JP3801867B2; IL145484A

Abstract

Peptidová sloucenina obecného vzorce I A-Xxx.sup.1.n.-Xxx.sup.2.n.-Xxx.sup.3.n.-Xxx.sup.4.n.-Xxx.sup.5.n.-Xxx.sup.6.n.-Xxx.sup.7.n.-Xxx.sup.8.n.-Xxx.sup.9.n.-Xxx.sup.10.n.-NH.sub.2.n., ve kterém A znamená acetylovou skupinu, Xxx.sup.1.n. znamená D-Nal (1) nebo D-Nal (2), Xxx.sup.2.n.-Xxx.sup.3.n. znamená D-Cpa-D-Pal (3), Xxx.sup.4.n. znamená Ser, Xxx.sup.5.n. znamená N-Me-Tyr, Xxx.sup.6.n. znamená D-Hci, Xxx.sup.7.n. znamená Nle, Xxx.sup.8.n. znamená Arg nebo Lys (iPr), Xxx.sup.9.n. znamená Pro a Xxx.sup.10.n. znamená Ala nebo Sar, a její soli s farmaceuticky prijatelnými kyselinami, jakož i farmaceutické kompozice obsahující uvedenou peptidovou slouceninu jako úcinnou látku a použití uvedené peptidové slouceniny pro výrobu léciva pro lécení hormonálne podmínených nádoru.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká peptidové sloučeniny mající schopnost LHRH-antagonisty se zlepšenou rozpustností, farmaceutické kompozice, která tuto sloučeninu obsahuje jako účinnou látku, a použití uvedené peptidové sloučeniny pro výrobu léčiva.

Dosavadní stav techniky

Nomenklatura používaná pro definování peptidů souhlasí s nomenklaturou vysvětlenou ILJPAC15 IUB-komisí o biochemické nomenklatuře (European J. Biochem. 1984, 138, 9-37), kde v souhlasu s obvyklou představou se aminoskupiny u N-terminálního konce objevují ve směru nalevo a karboxylové skupiny se u C-terminálního konce objevují ve směru napravo LH-RH antagonisté jako peptidy podle vynálezu zahrnují v přírodě se vyskytující a syntetické aminokyseliny, přičemž první zahrnují Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Gly, Cys, Met,

Phe, Tyr, Pro, Trp a His. Zkratky jednotlivých zbytků aminokyselin jsou odvozeny od triviálních názvů aminokyselin a jsou Ala = alanin, Arg = arginin, Gly = glycin, Leu = leucin, Lys = Lysin, Pal(3) - 3-(3-pyridyl)alanin, Nal(2) = 3-(2-naftyl)alanin, Phe = fenylalanin, Cpa = 4chlorfenylalnin, Pro = prolin, Ser = serin, Thr = threonin, Trp = tryptofan, Tyr = tyrosin a Sar = sarkosin. Všechny zde popsané aminokyseliny pochází zL-série, pokud není uvedeno jinak. Například je D-Nal(2) zkratka pro 3-(2-naftyl)-D-alanin a Ser zkratka pro L-serin. Substituce na ε-aminoskupině v postranním řetězci lysinu jsou znázorněny výrazem uvedeným za Lys v závorce, popřípadě ve formě zkratky.

Jiné použité zkratky jsou:

30	Ac	acetyl
	Atz	3-amino-1,2,4-triazol-5-kabony 1
	B	4-(4-amÍdinofenyl)-amino~ 1,4-dioxobutyl
	Boc	terc-butyloxykabonyl
	Bop	benzotriazol-l-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfoniumhexaflurofosfát
35	DCC	dicyklohexylkarbodiimid
	DCM	dichlormethan
	Ddz	dímethoxyfenyldimethylmethylenoxykarbonyl(dimethoxyimethyl-Z)
	DIC	diisopropylkarbodiimid
	DIPEA	N,N-diisopropylethylamin
40	DMF	dimethy lformamid
	Fmoc	fiuorenylmethyloxykarbonyl
	HF	kyselina fluorovodíková
	HOBt	l -hydroxybenzotriazol
	HPLC	vysokotlaká kapalinová chromatografíe
45	Me	methyl
	TFA	kyselina trifluoroctová
	Z	benzyloxykarbonyl
	Hci	homocitrullin
	Cpa	4-chlorfenylalanin

-ICZ 301696 B6

Peptidy podle vynálezu představují analogy hormonu uvolňujícího luteinizující hormon (LHRH), který má následující strukturu:

p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro—Gly-NH₂, (LH-RH, gonadorelin)

Po dobu více než 20 let pátrali vědci po selektivně potentních antagonistech LH-RH-dekapeptidu [M. Karten a J. Rivier, Endocrine Reviews 7,44-66 /1986)]. Velký zájem o takovéto antagonisty spočívá v jejich prospěšnosti v oblasti endokrinologie, gynekologie, zamezení otěhotnění a v oblasti rakoviny. Velký počet sloučenin byl vyroben ve formě potenciálních LH-RH-antagonístů. Nejzajímavější sloučeniny, které byly až dosud nalezeny, jsou ty sloučeniny, jejichž strukio tury představují modifikaci LH-RH-struktury.

První série potentních antagonistů byla získána zavedením aromatických zbytků aminokyselin do poloh 1,2,3 a 6 nebo 2,3 a 6. Obvyklý zápis sloučenin vypadá následovně: nejdříve se udávají aminokyseliny, které vstoupily v řetězci peptidů LH-RH na místo původně přítomných amino15 kyselin, přičemž polohy, ve kterých došlo k výměně, jsou označeny číslicemi uváděnými jako horní index. Dále se následujícím označením „LH-RH“ vyjadřuje, že se jedná o LH-RH-analogy, u kterých došlo k výměně.

Známí antagonisté jsou:

[Ac-D-Cpa^1,2, D-Trp^3,6] LH-RH (D, H. Coy et al., v: Gross E. and Meienhofer, J, (Eds) peptides; Proceedings of the 6th American Petid Symposium, s. 775-779, Pierce Chem. Co. Rockville

111.(1979):

[Ac-Pro',D-Cpa²,D-Arg⁶] LH-RH (ORG-30276) (H.D. Coy, etal. Endocrinology 100, 1445,

1982), a [Ac-D-Na(2)', D-Phe(4-F)², D-Trp³, D-Arg⁶] LH-RH /ORF 18260) (J.E. Rivier etal.: ve Vickery B.H. Nestor, Jr. J.J. Hafex, E.S.E (Eds). LH-RH and its Analogs. s. 11-2 MPT Press, Lancaster, UK 1984).

Další potentní LH-RH-antagonisté jsou popsány ve WO 92/19651, WO 94/19370, WO92/17025, WO94/I3313, US-A 5 300 492, US-A 5 140009, EP0413 209 Al a DE 195 44 212 Al.

Poslední jsou zveřejněné sloučeniny se stavebním kamenem modifikovaným omithinem nebo lysinem v poloze 6, které odpovídají následujícímu vzorci:

Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-Tyr⁵-D-Xxx⁶-Leu⁷-Arg⁸-Pro’-D-Ala’-NH2, kde DXxx představují skupinu aminokyseliny obecného vzorce (VI) —HN—CH—CO— (CH₂)„

NH

CO—R (VI)

LH-RH-antagonistéjsou dále popsány ve WO 97/19953 a EP-A 0 326 090 Další známí antagonisté jsou antarelix, ganirelix a cetrorelix.

-2CZ 301696 B6

Antarelix

Ac-D-Nal(2)^I-D-Cpa²-D-Pal(3)³“Ser⁴-Tyr⁵-D-hArg(Et)2⁶-Leu⁷-hArg(Et)2⁶-Pro⁹-D-Ala^!0NH2

Cetrorelix

Ao-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-Tyr^í-D-Cit⁶-Leu⁷-Arg’-Pro’-D-Ala⁾-NH2

Cílem vynálezu je vytvořit nové LH-RH-antagonisty, které vykazují zvýšenou enzymatickou stabilitu a význačně zlepšenou rozpustnost ve vodě.

Podstata vynálezu

Výše uvedeného cíle je dosaženo peptidovou sloučeninou obecného vzorce I

Α-Χχχ'-Χχχ²-Χχχ³-Χχχ⁴-Χχχ⁵-Χχχ⁶-Χχχ⁷“Χχχ⁸-Χχχ⁹-Χχχ¹⁰-ΝΗ₂ (I) ve kterém

A znamená acetylovou skupinu,

Xxx¹ znamená D-Nal( 1) nebo D-Nal(2)

Xxx²-XXX³znamená D-Cpa-D-Pal(3),

Xxx⁴ znamená Ser,

Xxx⁵ znamená N-Me-Tyr,

Xxx⁶ znamená D-Hci,

Xxx⁷ znamená Nle,

Xxx⁸ znamená Arg nebo Lys(iPr),

Xxx⁹ znamená Pro a

Xxx¹⁰ znamená Ala nebo Sar, a její sole s farmaceuticky přijatelnými kyselinami.

Výhodně je peptidová sloučenina obecného vzorce I ve formě octanu, trifluoroctanu nebo embo35 nátu.

Výhodně má uvedená peptidová sloučenina vzorec Ac-D-Nal(2)^,-D-Cpa²-Í>-Pal(3)³-Ser⁴-NMe-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Arg⁸-Pro⁹-D-Ala¹⁰-NH2.

Výhodně má uvedená peptidová sloučenina vzorec Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)^?-Ser⁴-NMe-Tyrⁱ-I>-Hci⁶-Nle⁷-Lys(iPr)⁸-Pro⁹-Ala^lí)-NH₂.

Výhodně má uvedená peptidová sloučenina vzorec Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-NMe-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Lys(iPr)⁸-Pro⁹-Sar¹⁰-NH₂.

Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá v tom, že jako účinnou látku obsahuje výše definovanou peptidovou sloučeninu obecného vzorce I.

Předmětem vynálezu je rovněž použití výše definované peptidové sloučeniny obecného vzorce I so pro výrobu léčiva pro léčení hormonálně podmíněných nádorů, zejména rakoviny prostaty nebo rakoviny prsu, jakož i nezhoubných indikací, jejichž léčení vyžaduje supresi hormonu LH-RH.

-3CZ 301696 B6

Sloučeniny podle vynálezu se mohou používat pro léčení nádorů podmíněných hormonálně, zejména rakoviny prostaty nebo rakoviny prsu, stejně tak jako nezhoubných indikací, jejichž léčení vyžaduje LH-RH-hormonální supresi. Za tím účelem se směšují s obvyklými nosiči a pomocnými látkami a konfekcionují se jako léčiva.

Syntéza sloučenin podle obecného vzorce (I) se provádí buď klasickou kondenzací fragmentů/nebo pomocí syntézy pevných fází podle Merrifielda s po sobě následující výstavbou za použití D-lysinu acylovaného již v postraním řetězci karboxylovou kyselinou obecného vzorce R¹COOH, jakož i reakcí dekapaptidového stavebního kamene s odpovídajícími karboxylovými io kyselinami pomocí spojení amidu v postranním řetězci D-lysinu⁶. Podle toho se může zavedení skupiny R'-CO-provádět na třech různých stupních způsobu: před kondenzací jednotlivých stavebních kamenů na peptid, po vestavbě lysinu nebo omithinu do řetězce peptidu, ale před kondenzací následujícího stavebního kamene nebo po kondenzaci všech stavebních kamenů.

Sloučeniny obecného vzorce (I) se syntetizují známými metodami, jako například čistou technikou pevných fází, částečně technikou pevných fází (tak zvanou kondenzací fragmentů) nebo klasickou kopulací rozpouštěním (viz M. Bodanszky, „Principles of Peptide Synthesis“, SpringerVerlag, 1984).

Metody syntézy pevných fází jsou popsány například v učebnici „Solid Phase Peptide Synthesis“

J.M. Stewart and J.D. Young, Pierce Chem. Compagny, Rockford, III, 1984 a v G.Barany and R.B, Merrifield „The Peptides“, Ch. 1. s 1-285, 1979. Academie Press lne, Klasické syntézy rozpouštěním jsou obšírně popsány v pojednání“ Methoden der organischen Chemie (HoubenWeyl), Synthese von Peptiden“ E. Wiinsch (vydavatel) 1974, Georg Thieme Verlag, Stuttgart,

BRD.

Stupňová výstavba se provádí například tím, že se nejdříve kovalentné váže aminokyselina s terminální karboxyskupinou, jejíž aminoskupina je v poloze a chráněna, na nerozpustný nosič, který je pro tento účel běžný, chránící skupina α-aminokyseliny se odštěpí, na takto získanou volnou aminoskupinu se váže nejbližší chráněná aminokyselina pres její karboxyskupinu a tímto způsobem krok za krokem se připojují ostatní aminokyseliny peptidu, který se má syntetizovat, ve správném pořadí, a po připojení všech aminokyselin se hotový peptid odštěpí od nosiče a popřípadě se odštěpí další přítomné chránící skupiny bočních funkcí. Stupňová kondenzace se provádí syntézou z odpovídajících, obvyklým způsobem chráněných, aminokyselin běžným způ35 sobem.

Vzájemné spojení jednotlivých aminokyselin se provádí metodami, které jsou pro tento účel běžné, zejména přichází v úvahu:

metoda symetrických anhydridů v přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu karbodiimidová metoda všeobecně karbodiimidhydroxybenzotriazolová metoda (viz: The Peptides, Volume 2, Ed, E. Gross and J. Meienhofer).

U kopulace fragmentů se používá s výhodou bez racemizace probíhající kopulace azidu nebo DCC-l-hydroxybenzotriazolová metoda popřípadě i DC C-3 -hydroxy-4-oxo-3,4-d i hydro45 1,2,3-benzotriazinová metoda. Používat se mohou i aktivované estery fragmentů.

Pro stupňovou kondenzaci aminokyselin se hodí zejména dobře aktivované estery aminokyselin s chráněným N, jako například N-hydroxysukcinimidoester nebo 2,4,5-trichIorfenylester. Aminolysa se dá velmi dobře katalyzovat N-hydroxysloučeninami, které mají přibližně aciditu kyse50 líny octové, jako například 1-hydroxybenzotriazolem.

Jako intermediámí skupiny chránící aminoskupinu se nabízejí dehydrogenující skupiny, jako například benzyloxykarbonylový zbytek (= Z-zbytek) nebo slabě kyselé odštěpitelné skupiny.

Jako chránící skupiny pro aminoskupiny, které jsou v poloze a, přichází v úvahu: terciární butyl-4CZ 3lHb9ft B6 oxykarbonylové skupiny, fluorenylmethyloxykarbonylové skupiny, karbobenzoxyskupiny popřípadě karbobenzthioskupiny (popřípadě nyní s p-brom nebo p-nitrobenzylovým zbytkem), trifluoracetýlová skupina, ftalylový zbytek, o-nitrofenoxyacetylová skupina, tritylová skupina, ptoluensulfonylová skupina, benzylová skupina, v benzenovém kruhu substituovaný benzylový zbytek (p-brom nebo p-nitrobenzylový zbytek) a α-fenylethylový zbytek. Za tím účelem se poukazuje na Jesse P. Greenstein und Milton Winitz: Chemistry of Amino Acids, New York 1961, John Wiley and Sons, lne. Volume 2, například s. 883 a následující, „Principles of peptide Synthesis“, Springer Verlag 1984, „Solid Phase peptide Synthesis“, J.M. Stewart und J.D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford, III. 1984, G. Baranyand R.B. Merrifield „The io Peptidesll. Ch. 1. s. 1-285, 1979, Academie Pressinc. jakož i The Peptides, Volume 2., Ed.E. Gross and J. Maienhofer, Academie Press. New York. Tyto chránící skupiny přichází v úvahu v zásadě i pro ochranu dalších funkčních bočních skupin (OH-skupin, NHj-skupin) odpovídajících aminokyselin.

Přítomné hydroxyskupiny (serin, threonin) jsou s výhodou chráněny benzylovými nebo podobnými skupinami. Další amínoskupiny, které nejsou v poloze a (například amínoskupiny v poloze ω, guanidinová skupina argininu) jsou s výhodou chráněny ortogonálně.

Jednotlivé stavební kameny aminokyselin se dají, vyjma lysinu modifikovaného skupinou R¹20 CO-nebo omithinu, běžně koupit. Možný průběh způsobu výroby posledních sloučenin je následující:

1. skupina α-karboxykyseliny se amiduje

2. ε-aminoskupina se chrání skupinou Z,

3. α-aminoskupina se chrání Boc-skupinou, takže se vytvoří selektivita s ohledem na pozdější odštěpení chránících skupin amínoskupiny

4. Z-skupina na ε-aminoskupině se odštěpí

5. Na ε-aminoskupinu se zavede požadovaná skupina R⁴-CO6. Odštěpí se Boc-skupina na a-aminoskupině

7. na α-aminoskupinu se zavede Z-skupina.

Pro zavedení skupiny R^O-přichází v úvahu v zásadě stejné způsoby, jaké byly výše popsány pro spojení aminokyselin. Obzvláště výhodná je ale kondenzace za použití karbodiimidu, například l-ethyI-3-(3-dimethyIaminopropyl)-karbodiimidu a 1-hydroxybenzotriazolu.

Reakce pro spojení aminokyselin se provádí v indiferentním rozpouštědle nebo suspenzním prostředku, které jsou pro tento účel běžné (například dichlormethanu), přičemž se popřípadě může pro zlepšení rozpustnosti přidávat dimethylformamid.

Jako syntetický materiál nosiče přichází v úvahu nerozpustné polymery, například polystyrénová pryskyřice ve formě perel, botnající v organickém rozpouštědle, (například kopolymer z polystyrenu a 1 % divinylbenzenu), Výstavba chráněného dekapeptidamidu na methylbenzhydrylamidové pryskyřici (MBHA-pryskyřici, to znamená polystyrénové pryskyřici s methylbenzhydrylamidovými skupinami), která poskytuje požadovanou C-terminální funkci amidu peptidu po odštěpení HF od nosiče, se může provést podle následujícího schématu:

5CZ 301696 B6

Schéma diagramu

Protokol syntézy peptidů

stupeň	funkce	rozpouštědlo/činidlo (v/v)	doba
1	promývání	methanol	2x2 min
2	promývání	DCM	3x3 min
3	odštěpení	DCM/TFA(1:1)	1x30 min
4	promývání	isopropanol	2x2 min
5	promývání	methanol	2x2 min
6	promývání	DCM	2x3 min
7	neutralizace	DCM/DIPEA (9:1)	3x5 min
8	promývání	methanol	2x2 min
9	promývání	DCM	3x3 min
10 11	STOP kopulace	přípravek Boc-As v DCM+DIC+HOBt DCM, popřípadě DCM/DCF	asi 90 min
12	promývání	methanol	3x2 min
13	promývání	DCM	2x3 min

Aminokyseliny chráněné Να-Boc se kopulují obvykle ve trojnásobném přebytku v přítomnosti diisopropylkarbodiimidu a 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) v CH₂C1₂/DMF po dobu 90 minut a Boc-chránicí skupina se odštěpí půlhodinovým působením 50% trifluoroctové kyseliny (TFA) v CH₂C1₂. Pro kontrolu úplného zreagování může sloužit chloranilový test podle Christesena a io Kaisrův ninhydrinový test. Zbytky volné aminofunkce se blokují acetylací v pětinásobném přebytku acetylimidazolu v CH₂C1₂. Sled reakčních kroků výstavby peptidů na pryskyřici vyplývá ze schématu. Pro odštěpení peptidů vázaného na pryskyřici se nynější konečný produkt syntézy pevných fází suší ve vakuu nad P₂O₅ a zpracovává se v 500násobném přebytku HF/anisolu 10:1

V: V po dobu 60 minut při 0 °C.

Po oddestilování HF a anisolu ve vakuu vypadnou peptidamidy vymícháním s bezvodým ethyletherem jako bílá pevná látka, oddělení od současně vypadnuvšího polymemího nosiče se provádí vymytím s 50% vodnou kyselinou octovou. Pomocí šetrného zahuštění roztoků okyselených kyselinou octovou ve vakuu se mohou peptidy získat jako vysoceviskózní oleje, které se po pří20 dávku absolutního etheru přemění za studená v bílé pevné látky.

Další čištění se provádí rutinními metodami preparativní vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC)

Převedení peptidů v jejich adični sole se může provádět jejich reakcí s kyselinami o sobě známým způsobem. Obráceně se volné peptidy mohou získat reakcí jejich adičních solí s kyselinami s bázemi. Peptidembonáty se mohou získat reakcí solí trifluoroctové kyseliny (TFA-solí) peptidů s volnou kyselinou embonovou (pamoovou kyselinu) nebo odpovídající dvoj sodnou solí embonové kyseliny. Za tím účelem se sůl peptidů ve vodném roztoku doplní roztokem dvoj sodné soli embonátové kyseliny v polárním aprotickém médiu, s výhodou dimethylacetamidu a tvořící se světle žlutá sraženina se izoluje.

Příklady provedeni vynálezu

Následující příklady slouží pro vysvětlení vynálezu aniž by tento omezovaly.

-6CZ 3Ulb9b B6

Příklad 1

Ac-D-Nal(2)¹-D-^jCpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Arg⁸-Pro⁹-D-Ala¹⁰-NH₂.

Syntéza se prováděla podle schématu diagramu pevných fází (Peptid-Synthese, s. 11) s kopulací DIC (HOBt, vycházeje od 3,3 g MBHA-pryskyříce (hustota cyklu 1,08 mmol/g). Po odštěpení HF od polymemího nosiče vypadlo 3,4 g surového peptidů, kteiý se vyčistil standardním způsobem preparativní HPLC. Po následujícím sušení vymrazováním se získalo 1,43 g HPCL-jednotného produktu sumárního vzorce C72, H96, NI7, 014, Cl s korektním FAB-hmotovým spekt10 rem: 1458.7 (M+H^T) / vypoč. 1457,7), a odpovídajícím ¹ H-NMR spektrem.

‘H.NMR (500 MHz, DjO/DMSO-d^ δ v ppm)

8,7 až 7,2, několik m, arom-H neúplně vyměněný NH; 6,92 a 6.58,2d, 2x2H, arom. H p.Cl-Phe, 5,2 až 3,5, několik m, Ca.H a. alif. H, 3,2 až 2,6, několik m arom Cp-H, 2,1 až 0,7, několik m, is zbýv alif. H; 1,70, s, 3H, acetyl, 1,20, d, 3H, C|3-H Leu.

Příklad 2

Ac-D-Nal(2)'-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr'-D-Lys(B)⁶-Leu’-Lys(iPr)⁸-Pro’-DAla'°-NH₂.

Syntéza se prováděla podle schématu diagramu pevných fází (Peptidsynthese-Protokoll, s. 11) s kopulací DIC/HOBt, vycházeje od 4,0 g MBHA pryskyřice (hustota cyklu 1,11 mmol/g). Po odštěpení HF od polymemího nosiče vypadlo 4,87 g surového peptidů, který se vyčistil standardním způsobem preparativní HPLC. Po následujícím sušení vymrazováním se získá 0,93 g HPLCjednotného produktu, který se nechal zreagovat s 4-amidinofenyIamino-4-oxomáselnou kyselinou v přítomnosti BOP jako kopulačního činidla na požadovanou sloučeninu. Po novém čištění HPLC se získá 148 mg cílové sloučeniny se sumárním vzorcem C85, H112, N17, 015, Cl s korekční £SÍ hmotovým spektrem: 1647,6 (M+H⁺) (vypoč. 1645,8), a odpovídajícím Η'-NMR spektrem.

'H-NMR (500 MHz, DSMO-dí, δ v ppm)

10,4 s, IH a 9,13 s, 2H a 8,94, s. 2H, NH's 4-amidinoanilinu, 8,6 až7,35, několik m, arom. H a

NH, 7,22 a 7,18, 2d, 4H. arom. H (pCl)Phe. 6,95 a 6,58,2d, 4H, arom. H Tyr; 5,2 až 3,5, několik m, Ca-H a alif. H; 3,3 až 2,4, několik m, Cp-H, a N-CH₃ 2,1 až 1,1, několik m, zbyt. alif. H, 1,68, s, 3H, acetyl; 1,20, d, 3H, C^H-Ala; 0,83, dd, 6H, C55-H-Leu.

Příklad 3

Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyrⁱ-D-Lys(B)⁶-Leu’-Arg⁸-Pro^,-D-Ala¹⁰NH₂.

Syntéza se prováděla podle schématu diagramu pevných fází (Peptidsynthese-Protokoll, s. 11) s kopulací DIC/HOBt, vycházeje od 4,0 g MBHA-pryskyrice (hustota cyklu 0,97 mmol/g). Po odštěpení HF od polymemího nosiče vypadlo 4,0 g surového peptidů, který se vyčistil standardním způsobem preparativní HPLC. Po následujícím sušení vymrazováním se získá 1,39 g HPLC50 jednotného produktu, který se nechal zreagovat se 4^amidinofenylamino-4-oxomáselnou kyselinou v přítomnosti BOP jako kopulačního činidla na požadovanou sloučeninu. Po novém vyčištění HPLC se získá 440 mg cílové sloučeniny sumárního vzorce C82, H106, NI9, Cl s korektním ESi hmotovým spektrem: 1632,7 (M+H*) (vypoč, 1632,7) a odpovídajícím 'H-NMR spektrem.

'H-NMR (500 MHz, DMSO-dé, δ v pm)

-7CZ 301696 B6

10,4, s, IH a 9,15, s, 2H, a 9,0, s, 2H, NH's 4-amidinoanilinu; 8,60, m, 2H. arom, H; 8,3 až 7,2, několik m, arom. H a NH; 7,27 a 7,20.2d, 4H. arom. H(pCl)Phe, 6,96 a 6,60, 2d, 4H, arom. H

Tyr; 5,2 až 3,5, několik m, Ca-H a alif. H, 3,2 až 2,4, několik m, Cp-H, a N-CH₃, 2,1 až 1,1, několik m, zbyt. alif. Η, 1,70, s, 3H, acetyl; 1,20, d, 3H, Cp~H Ala; 0,85, dd, 6H, Cy-H-Leu.

Příklad 4 io Ac-D-Nal(2)’-I>Cpa²-E)-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr-D-Hci⁶-Nle⁷-Lys(iPr)⁸-Pro⁹-D-Ala^lí)NH₂.

Syntéza se prováděla podle schématu diagramu pevných fází (Peptidsynthese-Piotokoll, s. 11) s kopulací DIC/HOBt, vycházeje od 2,5 g MBHA-pryskyrice (hustota cyklu 1,08 mmol/g). Po odštěpení HF od polymemího nosiče vypadlo 2,78 surového peptidu, který se vyčistil standardním způsobem preparativní HPLC. Po následujícím sušení vymrazováním se získalo 400 mg HPLC-jednotného produktu se sumárním vzorcem C75, Hl02, NI5, 014, Cl s korektním ESIhmotovým spektrem: 1472,6 (M+H*) (vypoč. 1471,7) a odpovídajícím 'H-NMR-spektrem.

¹ H-NMR /500 MHz, D₂O/DMSO-d6, δ v ppm)

8,62, m, 2H, 8,30, m, 2H, 7,80, m, 4H, 7,66, s, IH, 7,47, m, 2H, 7,36, d, IH. arom. H, 7,25 a 7,20,2 d, 4H, arom, H/pClúPhe, 6,96 a 6,63,2 d, 4H, arom. H Tyr, 5,10 až 4,0, několik m, Ca-H a alif. H, 3,75 až 2,65, několik m, CJ3-H-a N-CH₃; 2,1 až 1,05, několik, m. zbyt. alif. H; 1,74, s,

3H, acetyl; 1,23, d, 3H, Cp-H-Ala; 1,20, m, CH₃, isoprop., 0,8, m, 3H, Có5-H-Nle

Příklad 5

Ac-D-Nal(2)¹-DCpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Lys(iPr)⁸-Pro-D-Sar¹⁰NH₂.

Syntéza se prováděla podle schématu digramu pevných fází (Peptidsythese-Protokoll, s. 11) s kopulací DIC/HOBt, vycházeje od 2,5 g MBHA-pryskyřice (hustota cyklu 1,08 mmol/g). Po odštěpení HF od polymemího nosiče vypadlo 2,74 g surového peptidu, který se vyčistil standardním způsobem preparativní HPLC. Po následujícím sušení vymrazováním se získalo 840 mg HPLC-jednotného produktu sumárního vzorce C75, H102, NI5, 04, Cl s korektním ESI hmotovým spektrem (M+H⁺) (vypoč. 1471,7) a s odpovídajícím ¹ H-NMR spektrem.

'H-NMR (500 MHz, D₂O/DMSOM₆, δ v ppm)

8,6, m, 2H, 8,3, m, 2H, 7,85, m, 2H, 7,8, m; 2H, 7,65, s, IH, 7,46, m, 2H. 7,35, d; IH, arom. H; 7,23 a 7,17,2 d, 4H, arom. H(pCl)Phe; 3,75 až 2,6, několik m, C(3-H a N-CH₃; 2,2 až 1,5, několik m, zbyt. alif. H, 1,70, s, 3H, acetyl, 1,23, d, 3H, CpAla; 1,20, m CH₃ isoprop: 0,8, m, 3H,

C6Nle

Příklad 6

3-(4-fluorfenyl)-propionyl-D-Nal( 1 )^l-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Lys(Atz)⁶-Leu⁷-Arg⁸-Pro⁹-DAla'°-NH₂

Syntéza se prováděla podle schématu diagramu pevných fází (Peptidsynthese-Protokoll, s. 11) s kopulací DIC/HOBt, vycházeje od 9,2 g MBHA pryskyřice (hustota cyklu 1,08 mmol/g). Po

-8tz juioyo bo odštěpení HF od polymemího nosiče vypadlo 5,8 g surového peptidu, který se vyčistil standardním způsobem preparativní HPLC. Po následujícím sušení vymrazováním se získaly 2,0 g HPLC jednotného nesubstituovaného oktapeptidu, z něhož se nechaly 0,4 mmolu zreagovat s 0,5 mmolu 3-amÍno-l,2,4-triazol-5-karboxylové kyseliny v přítomnosti PyBOP jako kopulačního činidla s na 790 mg surového produktu požadované sloučeniny. Po novém vyčištění pomocí HPLC se získalo 200mg cílené sloučeniny sumárního vzorce C64, H86, NI7, 012, F s korektním FAB hmotovým spektrem: 1304,6 (M+H^vypoč. 1303,6).

io 8, 14, m, IH, 7,90, m, IH, 7,80, m, IH, 7,50, m, 2H, 7,35, m, 2H, 7,0, m, 6H, 7,63, m, 2H, aromát. H, 5.D, m, IH, 4,83, m, 2H, 4,41, m, IH, 4,30-4,05, několik m, 4H, Cct-H; 3,66 až 2,25, s, N-Me; 2,05 až 1,1, několik m, zbyt. alif. a aromat. bočních řetězců-H; 2,95, s, a 2,75, s, N-Me, 2,05 až 1,1, několik m, zbyt. alif. H; 1,20, d, C(3-H-Ala; 0,75, m, 6H, Cp-H Leu.

Sloučeniny podle vynálezu obecného vzorce I byly zkoumány co se týká jejich vazby receptoru. Způsob se opíral těsně o způsob popsaný v Beckers et al.: Eur. J. Biochem. 231, 535-643 (1995) Cetrorelix, získaný podle výše zveřejněné syntézy byl jodován [¹²⁵I] (Amersham, specifická aktivita 80,5 Bq/fmol za použití činidla jodogen (Pierce). Reakční směs byla čištěna vysoce výkonnou kapalinovou chromatografii s obrácenými fázemi, přičemž monojodovaný cetrorelix se získal bez neznačeného peptidu. Poté se asi 80 % [¹²⁵I]-cetrorelixu a neznačená sloučenina podle vynálezu hodily ke specifické asociaci receptoru.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou testovat následujícími metodami 1 a 2 na jejich účinek in vitro, přičemž vazebné afinity byly určovány zkouškou vazby s [’²⁵I]-centrorelixem (meto25 da 1) a funkční aktivity s triptorelinem jako agonistickým stimulem (metoda 2).

Metoda 1

Zkouška vazby receptoru podle Beckers, Marheíneke, K. Reiiander, H., Hilgard P (1995) „Selek30 tion and charakterization of mamalian cell lineš with stable overexpression of human pituitary receptors for gonadoliberin /GnRH)“ Eur. J. Biochem. 231,535-543.

Pro zkoumání vazby receptoru byl cetrorelix jodován za použití činidla jodogen (Pierce) s [^l25I] (Amersham, 80,5 B,q/fmol specifická aktivita). Reakční směs byla čištěna vysocevýkonnou kapalinovou chromatografii s obrácenými fázemi, přičemž se získal monojodovaný cetrorelix bez neznačeného peptidu. Asi 80 % [^I25I] cetrorelixu bylo vhodných pro spefickou asociaci.

Zkouška vazby receptoru se prováděla s intaktními buňkami za fyziologických podmínek, jak to bylo popsáno (Beckers et al. 1995). Subkonfluentní kultury stabilně transfekovaných LTKbuněk, které exprimují humánní LHRH-receptor, se oddělily inkubaci vNaCl/Pi(137mM NaCl, 2,7M KC1, 8,1 mM Na₂HPO₄, 11,47 mM KH₂PO₄)/1 mM EDTA a byly shromážděny odstředěním. Peleta buněk byla resuspendována ve vazbovém pufru (DMEM bez H₂CO₃, se 4,5 g/1 glukózy, lOmM hepes pH 7,5, 0,5 %, 0,5 % (hmotnost/objem) BSA, 1 g/1 bacitracinu, 0,1 g/1 SBD1, 0,1 % (hmotnost/objem) NaN₃). Pro zkoušku vypírání bylo 0,25x10⁶ buněk/100μ1 inkubováno s asi 225 pM [ⁱ²⁵I]-cetrorelixu (specifická aktivita 5 - 10xl0³ dpm/pmol a různými koncentracemi neznačené sloučeniny podle vynálezu jako kompetitoru. Suspense buněk ve 100μΙ vazebného média se navrstvilo ve 400 μΐ zkušebních trubičkách nad 200 μΙ 84 % obj. silikonového oleje (Merck Typ 550)/16 % obj. parafinového oleje. Po inkubaci, trvající 1 h, se při 37 °C za pomalého, kontinuálního třepání oddělily buňky 2minutovým odstřeďováním při 9 000 rpm (Rotortyp

HTA 13,8; Heraeus Sepatec, Osterode/Germany) od inkubačního média. Špíčky trubiček, které obsahovaly peletu buněk, se odřízly. Peleta buněk a přesah byly nakonec analyzovány pomocí indikace γ-zárení. Množství nespecificky vázaných buněk byl stanoven za vyloučení neznačeného cetrorelixu při konečné koncentraci 1 μΜ a činila typicky < 10 % ze všech vázaných buněk.

Analýza vazebních dat byla prováděna s EBDA/ligandovým programem analýzy (Biosoft V3,0).

-9CZ 301696 B6

Metoda 2

Funkční zkouška pro stanovení antagonistické účinnosti

Zkouška byla s několika modifikacemi prováděna tak, jak to bylo popsáno v Beckers, T. Reilánder, H. Hilgard, P. (1997) „Characterization of gonadotropin-releasíng hormone analogs based on a sensitive cellular luciferase reportergene assay“ Analyt. Biochem. 251, 17-23 (Beckers et al. 1997). 10 000 buněk na jamku, které exprimují humánní LHRH-receptor a přenáio šecí gen luciferázy, se kultivovalo 24 h v mikrotitračních deskách za použití DMEM s přísadami a 1 % (v:v) FCSi. Buňky byly potom stimulovány 6 h s 1 nM [D-Trp^ó]LHRH. Antagonistické sloučeniny podle vynálezu byly přidány před stimulací a buňky se nakonec pro kvantifikaci buněčné Luc-aktivity lysovaly. Výpočet IC₅₀-hodnot se prováděl z křivek dávek-účinku pomocí nelineární regresivní analýzy za použití Hill-modelu (Programm EDX 2,0 C. Grunwald,

Arzneimittelwerk Dresden).

Kvantifikace Luc-aktivity byla v podstatě prováděna jak to bylo popsáno (Promega Technical Bulletine # 101/161) za použití nynějšího zkušebního systému luciferázy (Promega E4030) v duplikátech. Pomocí přídavku koenzymu A (CoA) se provedla oxidace Luciferyl-CoA s výhodnou kinetikou. Po odstranění kultivačního média z mikrotitrační desky byly buňky lyžovány přídavkem 100 μΐ lyzačního pufru (25 mM trisfosfátu pH 7,8, 8,2 mM dithiotretolu, 2 mM 1,2-diaminocyklohexan-N,Ν,Ν',Ν -tetraoctové kyseliny (CDTA), 10% (v/v) glycerinu, 1% Triton-X-100). Po 15 min inkubace při teplotě místnosti bylo převedeno 10 μΐ lyzátu buněk do bílé mikrotitrační desky (Dynatech), vhodné pro luminometrickou detekci.

Enzymatická reakce byla zahájena přídavkem 50 μΐ zkušebního pufru (20mM tricinu pH 7,8, I,07mM (MgCO₃)₄Mg(OH)₂, 2,67MgSO₄, 0,1 mM ethylediamintetraoctová kyselina (EDTA), 33,3 mM dithiothreitolu, 270 μΜ koenzymu A, 470 μΜ světí ušky(Photinus pyralis)-luciferinu, 530 pMrATPNa₂). Po jedné minutě byla určována pro celkový čas jedné sekundy luminiscence s poloviční dobou trvání pěti minut za použití EG&G Berthol Microllumat LB 96 P.

Tímto způsobem byly získány následující data in vitro, přičemž Kd odpovídá za vazební afinity a IC₅o za funkční afinitu a pM znamená pikomol na litr sloučenina_K_D(pM)IC_So(pM)

centrorelix	170 (21)	198(5)
příklad 1 (sůl octanu)	nestanoveno	242(3)
příklad 2	181(1)	684(2)
příklad 3	154(1)	492(2)
příklad 6	nestanoveno	221(2)

() = počet vzájemně nezávislých pokusů

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Peptidová sloučenina obecného vzorce 1

A-Xxx'-Xxx²-Xxx³-Xxx⁴-Xxx⁵-Xxx⁶-Xxx⁷-Xxx^g-Xxx⁹-Xxx^l0-NH₂ (I) ve kterém io A znamená acetylovou skupinu,

Xxx¹ znamená D-Nal(l) nebo D-Nal(2)

Xxx²-Xxx³ znamená D-Cpa-D-Pal(3),

Xxx⁴ znamená Ser,

Xxx⁵ znamená N-Me-Tyr,

15 Xxx⁶ znamená D-Hci,

Xxx⁷ znamená Nle,

Xxx⁸ znamená Arg nebo Lys(iPr),

Xxx⁹ znamená Pro a Xxx¹⁰ znamená Ala nebo Sar,

20 a její sole s farmaceuticky přijatelnými kyselinami.
2, Peptidová sloučenina podle nároku 1 obecného vzorce I ve formě octanu, trifluoroctanu nebo embonátu,

25
3. Peptidová sloučenina podle nároku 1 mající vzorec Ac-D-Nal(2)’-D-Cpa²-D-Pal(3)³Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Arg⁸-Pro-IKAla^l0-NH₂.
4. Peptidová sloučenina podle nároku 1 mající vzorec Ac-D-Nal(2)’-D-Cpa²-D-Pal(3)³Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Lys(iPr)-Pro-Ala^,0-NH₂.
5. Peptidová sloučenina podle nároku 1 mající vzorec Ac-D-Nal(2)’-D-Cpa²-D-Pal(3)³Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Lys(iPr)⁸-Pro⁹-Sar^,0-NH₂.
6. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že jako účinnou látku obsahuje peptído35 vou sloučeninu podle některého z nároků 1 až 5.
7. Použití peptidové sloučeniny podle některého z nároků 1 až 5 pro výrobu léčiva pro léčení hormonálně podmíněných nádorů, zejména rakoviny prostaty nebo rakoviny prsu, jakož i nezhoubných indikací, jejichž léčení vyžaduje supresi hormonu LH-RH.