CZ20013318A3

CZ20013318A3 - Noví LH-RH-antagonisté se zlepąenými vlastnostmi rozpustnosti

Info

Publication number: CZ20013318A3
Application number: CZ20013318A
Authority: CZ
Inventors: Michael Bernd; Bernhard Kutscher; Eckhard Günther; Peter Romeis; Thomas Reissmann; Thomas Beckers
Original assignee: Zentaris Ag
Priority date: 1999-03-17
Filing date: 2000-03-11
Publication date: 2002-05-15
Also published as: NO20014486D0; JP2002543045A; AR022970A1; SI1163264T1; IL145484A0; BG106008A; HUP0200363A2; PL351792A1; NZ514830A; PT1163264E; JP3801867B2; TR200103339T2; NO327753B1; SI1268522T1; WO2000055190A1; HU229672B1; DE50007905D1; US7148195B2; DE19911771B4; BG65283B1

Description

Nove LH-RH-antagonisté se zlepšenými vlastnostmi rozpustnosti

Oblast techniky

Vynález se týká LHRH-antagonistů se zlepšenými vlastnostmi rozpustnosti, způsobijvýroby těchto sloučenin, léčivý ve kterých jsou tyto sloučeniny obsaženy, stejně tak jako použití léčiv pro léčení nádorů závisejících na hormonech a nezhoubných onemocnění ovlivněných hormony, jako benigní hyperplasie prostaty (BPH) a endometriosa.

Dosavadní stav techniky

Nomenklatura používaná pro definování peptidů souhlasí s nomenklaturní vysvětlenou IUPAC-IUB-komisí o biochemické nomenklatuř (Eurppean J. Biochem. 1984, 138, 9-37), kde v souhlasu s obvyklou představou se aminoskupiny u N-terminálního konce objevují ve směru nalevo a karboxylové skupiny se u C-terminálního konce objevují ve směru napravo.LH-RH antagonisté jako peptidy podle vynálezu zahrnují v přírodě se vyskytující a syntetické aminokyseliny, přičemž první zahrnují Ala, Val, Leu, Ile, Ser, ThrLys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Gys, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp a His. Zkratky jednotlivých zbytků aminokyselin jsou odvozeny od triviálních názvů aminokyselin a jsou Ala= alanin, Arg= arginin, Gly= glycin, Leu= leucin, Lys=Lysin, Pal(3)=3-(3-pyridyl)alanin, Nal(2)=3-(2naftyl)alanin, Phe=fenylalanin, Cpa=4-chlorfenylalnin, Pro=prolin, Ser=serin, Thr=threonin, Trp=tryptofan, Tyr=tyrosín a Sar=sarkosin. Všechny zde popsané aminokyseliny pochází z L-serie, pokud není uvedeno jinak. Například je D-Nal(2) zkratka pro 3-(2-naftyl)-D-alanin a Ser zkratka pro L-serin. Substituce na ε-aminoskupině v postranním řetězci ······ · ·· ·· · ··· ···· ·«·· ···· · · · ·· ·

- · ········· · · ··♦··· ···· ··· ··· ·· ·· _ttt lysinu jsou znázorněny výrazem uvedeným za Lys v závorce, popřípadě ve formě zkratky.

Jiné použité zkratky jsou :

Ac	acetyl
Atz	3-amino-l,2,4-triazol-5-karbonyl
B	4-(4-amidinofenyl)-amino-l,4-dioxobutyl
Boc	terč, butyloxykabonyl
Bop	benzotriazol-l-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfoniumhexaflu- rofosfát
DCC	dicyklohexylkarbodiimid
DCM	dichlormethan
Ddz	dimethoxyfenyldimethylmethylenoxykarbonyl(dimethoxyimethyl-Z)
DIC	diisopropylkarbodiimid
DIPEA	N,N-diisopropylethylamin
DMF	dimethylformamid
Fmoc	fluorenylmethyloxykarbonyl
HF	kyselina fluorovodíková
HOBt	1-hydroxybenzotriazol
HPLC	vysokotlaká kapalinová chromatografie
Me	methyl
TFA	kyselina trifluoroctová
Z	benzyloxykarbonyl
Hci	homocitrullin
Cpa	4-chlorfenylalanin

Peptidy podle vynálezu představují analogy hormonu uvolňujícího lutenizující hormon (LH-RH), který má následující strukturu:

• · ··· · • ♦ · • ·Φ· ·* Σ

p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, (LH-RH, gonadorelin)

Po dobu více než 20 let pátrali vědci po selektivně potentních antagonistech LH-RH-dekapeptidu [M. Karten a J. Rivier, Endocrine Reviews 7, 44-66 /1986)]. Velký zájem o takovéto antagonisty spočívá v jejich prospěšnosti v oblasti endokrinologie, gynekologie, zamezení otěhotnění a voblasti rakoviny. Velký počet sloučenin byl vyroben ve formě potenciálních LH-RH-antagonistů. Nejzajímavější sloučeniny, které byly až dosud nalezeny, jsou ty sloučeniny, jejichž struktury představují modifikaci LH-RH-struktury.

První série potentních antagonistů byla získána zavedením aromatických zbytků aminokyselin do poloh 1,2,3 a 6 nebo 2,3 a 6. Obvyklý zápis sloučenin vypadá následovně: nejdříve se udávají aminokyseliny, které vstoupily v řetězci peptidů LH-RH na místo původně přítomných aminokyselin, přičemž polohy, ve kterých došlo k výměně, jsou označeny číslicemi uváděnými jako horní index.Dále se následujícím označením LH-RH vyjádřuje , že se jedná o LH-RH-analogy, u kterých došlo k výměně.

Známí antagonisté jsou :

[Ac-D-Cpa¹’², D-Trp³’⁶] LH-RH (D, H. Coy et al., v: Gross E. and Meienhofer, J. (Eds) peptidesjProceedings of the 6th Američan Petid Symposium, s. 775-779, Pierce Chem. Co. Rockville III. (1979): [Ac-Pro¹,D-Cpa²,D-Arg⁶] LH-RH (ORG-30276) (H.D.Coy, et al. Endocrinology 100, 1445, 1982), a [Ac-D-Na(2)l, D-Phe(4-F)², D-Trp³, D-Arg⁶] LH-RH /ORF 18260) (J.E. Rivier et al.: ve Vickery B.H.Nestor, Jr. J.J. Hafex, E.S.E (Eds). LH-RH and its Analogs. s. 11-2 MPT Press, Lancaster, UK 1984).

• · · · · · • · · • · · ·

Další potentní LH-RH -antagonisté jsou popsány ve WO 92/19651, WO 94/19370, WO 92/17025, WO 94/13313, US-A 5, 300,492 USA5,140 009, EP 0 413 209 Al a DE 195 44 212 Al.

Poslední jsou zveřejněné sloučeniny se stavebním kamenem modiikovaným ornithinem nebo lysinem v poloze 6, které odpovídají následujícímu vzorci: Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-Tyr⁵-D-Xxx⁶-Leu⁷-Arg⁸-Pro⁹-DAla¹⁰-NH₂, kde D-Xxx představují skupinu aminokyseliny obecného vzorce (VI) —HN—CH—CO— (CH₂)_n

NH

I

CO—R

VI

LH-rh- antagonisté jsou dále popsány ve WO 97/19953 a EP-A 0 326 090 Další známí antagonisté jsou antarelix, ganirelix a cetrorelix.

Antarelix

Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-Tyr⁵-D-hArg(Et)2⁶-Leu⁷-hArg(Et)2⁶Pro⁹-D-Ala¹⁰-NH₂

Cetrorelix • · · · · · · · · · • · · · 9 · ···

9 99 ··· · « • · · ·«····

Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-Tyr⁵-D-Cit⁶-Leu⁷-Arg⁸-Pro⁹-DAla¹⁰-NH₂

Cílem vynálezu je vytvořit nové LH-RH-antagonisty, které vykazují zvýšenou enzymatickou stabilitu a význačně zlepšenou rozpustnost ve vodě.

Podstata vynálezu

Tato úloha je vyřešena sloučeninami následujícího vzorce (I)

A-Xxx¹-Xxx²-Xxx³-Xxx⁴-Xxx⁵-Xxx⁶-Xxx⁷-Xxx⁸-Xxx⁹-Xxx¹⁰-NH₂ kde znamenají

A acetyl nebo 3-(4-fluorfenyl)-propionylovou skupinu,

Xxx¹ D-Nal(l) nebo D-Nal(2),

Xxx²-Xxx³ D-Cpa-D-Pal(3) nebo jednoduchou vazbu,

Xxx⁴ Ser,

Xxx⁵ N-Me-Tyr,

Xxx⁶ D-Cit, D-Hci nebo skupinu D-aminokyseliny obecného vzorce (II)

(Π) ve kterém n znamená číslo 3 nebo 4, přičemž R¹ znamená skupinu obecného vzorce III —(CH₂)_p—CO—NR²R³ (III), kde p je celé číslo 1 až 4, R² vodík nebo alkylová skupina a R³ je nesubstituovaná nebo substituovaná arylová skupina nebo heteroarylová skupina, nebo R¹ znamená 3-amino-l,2,4-triazol-5-karbonylovou skupinu nebo R¹ představuje kruh obecného vzorce (IV) • · ··· · ·

• ·

(IV) ve kterém q znamená číslo 1 nebo 2, R⁴ je ato vodíku nebo alkylová skupina, R⁵ je atom vodíku nebo alkylová skupina a X atom kyslíku nebo atom síry,

Xxx⁷ Leu nebo Nle,

Xxx⁶ Arg nebo Lys(iPr)

Xxx⁹ Pro a

Xxx¹⁰ Ala nebo Ser, a jejich solemi s farmaceuticky přijatelnými kyselinami, zejména acetáty, embonáty a trifluoracetáty.

Ze sloučenin podle vynálezu jsou výhodné ty, kde Xxx⁶ znamená D[s-N-(imidazolidin-2-on-4-yl)-formyl]-Lys, D-(3-amino-1,2.4-triazol-3karbonyl)-Lys, zkráceně D-Lys(Atz) nebo D-[8-Ň'-(4-amidinofenyl)amino-l,4-dioxobutyl]-Lys, zkráceně D-Lys(B).

Další obvzláště výhodné sloučeniny podle vynálezu jsou : Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Arg⁸-Pro⁹D-Ala¹⁰-NH₂

Ac-D-Na(2)¹-D-Cpa²-D-Pa(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Lys(Atz)⁶-Leu⁷-Arg⁸Pro⁹-D-Ala¹⁰-NH₂ ·· · · · ·

9 • ···

Ac-D-Nal(2)¹--D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Lys(B)-Lys Leu⁷-Arg⁸-Pro⁹-D-Ala¹⁰-NH₂

Ac-D-Na(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-Lys(B)⁶-Leu⁷-Arg⁸-Pro⁹D-Ala¹⁰-NH₂

Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Lys(iPr)⁸Pro⁹-Ala¹⁰-NH₂

Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Lys(iPr)⁸Pro⁹-Sar¹⁰-NH₂

Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶Nle⁷-Arg⁸-Pro⁹Ser¹⁰-NH₂

3_(4_fluorfenyl)-propionyl-D-Nal(l)¹-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵—D-Lys(Atz)6-Leu⁷Arg⁸-Pro⁹-Ala¹⁰-NH₂, jakož i jejich sole s výše uvedenými farmaceuticky přijatelnými kyselinami.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou používat pro léčení nádorů podmíněných hormonálně, zejména rakoviny prostaty nebo rakoviny prsu, stejně tak jako nezhoubných indikací , jejichž léčení vyžaduje LH-RHhormonální supresi. Za tím účelem se směšují s obvyklými nosiči a pomocnými látkami a konfekcionují se jako léčiva.

Syntéza sloučenin podle obecného vzorce (I( se provádí buď klasickou kondenzací fragmentů nebo pomocí syntézy pevných fází podle Merrifielda s po sobě následující výstavbou za použití D-lysinu acylovaného již v postraním řetězci karboxylovou kyselinou obecného vzorce ·· ···· « ·· • · · · * · · • ··· · · · • · · · · *

R^-COOH, jakož i reakcí dekapaptidového stavebního kamene s odpovídajícími karboxylovými kyselinami pomocí spojeni amidu v postranním řetězci D-lysinu⁶ Podle toho se může zavedení skupiny RZ-CO-provádět na třech různých stupních způsobu: před kondenzací jednotlivých stavebních kamenů na peptid, po vestavbě lysinu nebo ornithinu do řetězce peptidu, ale před kondenzací následujícícho stavebního kamene nebo po kondenzaci všech stavebních kamenů.

Sloučeniny obecného vzorce (I) se syntetizují známými methodami, jako například čistou technikou pevných fází, částečně technikou pevných fází ( tak zvanou kondenzací fragmentů) nebo klasickou kopulací rozpouštěním (viz M. Bodanszky, Principies of Peptide Synthesis, Springer Verlag, 1984).

Methody syntézy pevných fází jsou popsány například v učebnici Solid Phase Peptide Synthesis J.M. Stewart and J.D.Young, Pierce Chem. Compagny, Rockford, III, 1984 a v G.Barany and R.B. Merrifield The Peptides , Ch. 1. s 1-285, 1979. Academie Press lne, Klasické syntézy rozpouštěním jsou obšírně popsány v pojednání Methoden der 4®rganischen Chemie (Houben-Weyl), Synthese von Peptiden E.Wůnsch (vydavatel) 1974, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, BRD.

Stupňová výstavba se provádí například tím, že se nejdříve kovalentně váže aminokyselina s terminální karboxyskupinou, jejíž aminoskupina je v poloze a chráněna, na nerozpustný nosič.který je pro teňto účel běžný, chránící skupina α-aminokyseliny se odštěpí, na takto získanou volnou aminoskupinu se váže nejbližší chráněná aminokyselina přes její karboxyskupinu a tímto způsobem krok za krokem se připojují ostatní aminokyseliny peptidu, který se má syntetizovat, ve správném pořadí, | g^p připojení všech aminokyselin se hotový peptid odštěpí od nosiče a popřípadě se odštěpí další přítomné chránící skupiny bočních funkcí. Stupňová , kondenzace se provádí syntézou z odpovídajících , obvyklým způsobem chráněných, aminokyselin běžným způsobem.

Vzájemné spojení jednotlivých aminokyselin se provádí methodami, které jsou pro tento účel běžné, zejména přichází v úvahu:

methoda symetrických anhydridů v přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu karbodiimidová methoda všeobecně karbodiimidhydroxybenzotriazolová methoda (viz : The Peptides, Volume 2, Ed. E. Gross and J. Meienhofer).

U kopulace fragmentů se používá s výhodou bez racemizace probíhající kopulace azidu nebo DCC-l-hydroxybenzotriazolová methoda popřípadě i DCC-3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazinová methoda.. Používat se mohou i aktivované estery fragmentů.

Pro stupňovou kondenzaci aminokyselin se hodí zejména dobře aktivované estery aminokyselin s chráněným N, jako například N-hydroxysukcinimidoester nebo 2,4,5-trichlorfenylester. Aminolysa se dá velmi dobře katalyzovat N-hydroxysloUčeninami , které mají přibližně aciditu kyseliny octové, jako například 1-hydroxybenzotriazolem.

Jako intermediární skupiny chránící aminoskupinu se nabízejí dehydrogenující skupiny Jako například benzyloxykarbonylový zbytek (= Z-zbytek) nebo slabě kyselé odštěpitelné skupiny. Jako chránící skupiny pro aminoskupiny , které jsou v poloze a, přichází v úvahu: terciární butyloxykarbonylové skupiny, fluorenylmethyloxykarbonylové skupiny, karbobenzoxyskupiny popřípadě karbobenzthioskupiny (popřípadě nyní s p-brom nebo nebo p-nitrobenzylovým zbytkem), trifluoracetylová skupina, ftalylový zbytek, o-nitrofenoxyacetylová skupina, tritylová skupina, p-toluensulfonylová skupina, benzylová * *<f · i ·· ♦ · · · · skupina, v benzenovém kruhu substituovaný benzylový zbytek ( p-brom nebo p-nitrobenzylový zbytek) a α-fenylethylový zbytek. Za tím účelem se poukazuje na Jesse P. Greenstein und Milion Winitz: Chemistry of Amino Acids, New York 1961, John Wiley and Sons, lne. Volume2, například s. 883 a následující, Principies of peptide Synthesis, Springer Vrlag 1984, Solid Phase peptide Synthesis, J.M. Stewart und J.D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford, III. 1984, G. Baranyand R.B. Merrifield The Peptides. Ch. 1. s. 1-285, 1979, Academie Presslnc. jakož i The Peptides, Volume 2.,Ed.E. Gross and J.Maienhofer, Academie Press. New Zork. Tyto chránícíá skipiny přichází v úvahu v zásadě i pro ochranu dalších funkčních bočních skupin (OH-skupin, NBh-skupin) odpovídajících aminokyselin.

Přítomné hydroxyskupiny (serin, threonin) jsou s výhodou chráněny benzylovými nebo podobnými skupinami. Další aminoskupiny, které nejsou v poloze a (například aminoskupiny v poloze ω, guanidinová skupina argininu) jsou s výhodou chráněny ortogonálně.

Jednotlivé stavební kameny aminokyselin se dají, vyjma lysinu modifikovaného skupinou R^CO- nebo ornithinu, běžně koupit. Možný průběh způsobu výroby posledních sloučenin je následující :

1. skupina α-karboxykyseliny se amiduje

2. ε-aminoskupina se chrání skupinou Z,

3. α-aminoskuina se chrání Boc-skupinou, takže se vytvoří selektivita s ohledem na pozdější odštěpení chránících skupin aminoskupiny

4. Z-skupina na ε-aminoskupine se odštěpí

5. Na ε-aminoskupinu se zavede požadovaná skupina R⁴-CO-

6. Odštěpí se Boc-skupina na ar-aminoskupině

7. na α-aminoskupinu se zavede Z-skupina.

··«Μ»» •Φ •·«·

4			«
» ·	•	«	• Φ	··
•	♦	•		Φ	•
•	• *	• 9	Φ	•
•	• ·	• ·	Φ
♦ ··		4Φ '	• · ·

• · Φ • Φ

ΦΦΦΦ φ·$»

Pro zavedení skupiny R^CO-přichází v úvahu v zásadě stejné způsoby, jaké byly výše popsány pro spojení aminokyselin. Obvzláště výhodná je ale kondenzace za použití karbodiimidu, například l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-karbodiimidu a 1-hydroxybenzotriazolu.

Reakce pro spojení aminokyselin se provádí v indiferentním rozpouštědle nebo suspenzním prostředku, které jsou pro tento účel běžné (například dichlormethanu), přičemž se popřípadě může pro zlepšení rozpustnosti přidávat dimethylformamid.

Jako syntetický materiál nosiče přichází v úvahu nerozpustné polymery, například polystyrénová pryskyřice ve formě perel, botnající v organickém rozpouštědle, (například kopolymer z polystyrenu a 1 % divinylbenzenu). Výstavba chráněného dekapeptidamidu na methylbepzhydrylamidové pryskyřici (MBHA-pryskyřici, to znamená polystyrénové pryskyřici s methylbenzhydrylamidovými skupinami ), která poskytuje požadovanou C-terminální funkci amidu peptidu po odštěpení HF od nosiče, se může provést podle následujícícho schématu:

Schéma diagramu

Protokol syntézy peptidů stupeň funkce rozpouštědlo/činidlo (v/v) doba

1	promývání	mthanol	2x2 min
2	promývání	DCM	3x3 min
3	odštěpení	DCM/TFA (1:1)	1x30 min
4	pomývání	isopropanol	2x2 min
5	promývání	methanol	2x2 min
6	promývání	DCM	2x3 min
7	neutralizace	DCM/DIPEA(9:1)	3x5 min
8	promývání	methanol	2x2 min
9	promývání	DCM	3x3 min
10	STOP	přídavek Boc-As
		v DCM + DIC + HOBt
11	kopulace	DCM, popřípadě
		DCM/DCF	asi 90 min
12	promývání	methanol	3x2 min
13	promývání	DCM	2x3 min

Aminokyseliny chráněné Να-Boc se kopulují obvykle ve trojnásobném přebytku v přítomnosti diisopropylkarbodiimidu a 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) v CH2CI2/DMF po dobu 90 minut a Boc-chránící skupina se odštěpí půlhodinovým působením 50% trifluoroctové kyseliny (TFA)v CH2CI2. Pro kontrolu úplného zreagování může sloužit chloranilový test podle Christesena a Kaisrův ninhydrinový test Zbytky volné aminofunkce se blokují acetylací v pětinásobném přebytku acetylimidazolu v CH2CI2. Sled reakčních kroků výstavby peptidů na pryskyřici vyplývá ze schématu. Pro odštěpení peptidů vázaného na • 44 4 4 4 4 4·· ···· ··· 44

1'4 pryskyřici se nynější konečný produkt syntézy pevných fází suší ve vakuu nadsPzOs a zpracovává se v 500násobném přebytku HF/anisolu 10:1 V: V po dobu 60 minut při 0 °C.

Po jOddestilování HF a anisolu ve vakuu vypadnou peptidamidy vymícháním s bezvodým ethyletherem jako bílá pevná látka, oddělení od současně vypadnuvšího polymerního nosiče se provádí vymytím s 50% vodnou kyselinou octovou. Pomocí šetrného zahuštění roztoků okyselených kyselinou octovou ve vekuu se mohou peptidy získat jako vysoceviskózní oleje, které se po přídavku absolutního etheru přemění za studená v bílé pevné látky.

Další čištění se provádí rutiními methodami preparativní vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC)

Převedení peptidů v jejich adiční sole se může provádět jejich reakcí s kyselinami o sobě známým způsobem. Obráceně se volné peptidy mohou získat reakcí jejich adičních solí s kyselinami s bázemi. Peptidembonáty se mohou získat reakcí solí trifluoroctové kyseliny (TFA-solí) peptidů s volnou kyselinou embonovou (pamoovou kyselinu) nebo odpovídající dvojsodnou solí embonové kyseliny. Za tím účelem se sůl peptidů ve vodném roztoku doplní roztokem dvojsodné soli embonátové kyseliny v-polárním aprotickém médiu, s výhodou dimethylacetamidu a tvořící se světle žlutá sraženina se izoluje.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady slouží pro vysvětlení vynálezu aniž by tento omezovaly.

Příklad 1 ··* · · · · ··· ···· ··· · ·

Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Arg⁸Pro⁹-.D-Ala¹⁰-NH₂

Syntéza se prováděla podle schématu diagramu pevných fází (Peptid-Synthese, s. 11) s kopulací DIC(HOBt, vycházeje od 3,3 g MBHA-pryskyřice (hustota cyklu 1,08 mmol/g). Po odštěpení HF od polymerníhonosiče vypadlo 3,4 g surového peptidu, který se vyčistil standardním způsobem preparativní HPLC. Po následujícím sušení vymrazováním se získalo 1,43 g HPCL-jednotného produktu sumárního vzorce C72, H96, N17.O14,C1 s korektním FAB-hmotovým spektrem :1458.7 (M+H⁺) / vypoč. 1457,7), a odpovídajícím ^XH-NMR spektrem.

T-I.NMR (500 MHz, D₂O/DMSO-d₆, δ v ppm)

8,7 až 7,2, několik m, arom-H neúplně vyměněný NH;6,92 a 6.58,2d,2x2H, arom. H p.Cl-Phe, 5,2 až 3,5,několik m , Ca.H a. alif. H,

3,2 až 2,6, několik m arom C0-H, 2,1 až 0,7, několik m, zbýv alif. H;l,70,s, 3H, acetyl, 1,20, d, 3H, Όβ-Η Leu.

Příklad 2

Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Lys(B)⁶-Leu⁷Lys(iPr)⁸-Pro⁹-D-Ala¹⁰-NH₂

Syntéza se prováděla podle schématu diagramu pevných fází (Peptidsynthesé-Protokoll, s. 11) s kopulací DIC/HOBt, vycházeje od 4,0 g MBHA prys-kyřice (hustota cyklu 1,11 mmol/g). Po odštěpení HF od polymerního nosiče vypadlo 4,87 g surového peptidu, který se vyčistil standardním způsobem preparativní HPLC. Po následujícím sušení vymrazováním se získá 0,93 g HPLC-jednotného produktu, který se nechal zreagovat s 4-amidinofenylamino-4-oxomáselnou kyselinou v přítomnosti BOP jako kopulačního činidla na požadovanou sloučeninu. Po novém čištění HPLC se získá 148 mg cílové sloučeniny se sumárním • · ··· 9 9 9 9 · * * • · 9 · · · · ' · · .· vzorcem C85H112, N17, 015, Cl s korekční ESI hmotovým spektrem: 1647,6 (M+H⁺) (vypoč. 1645,8), a odpovídajícím H^X-NMR spektrem.

’Η-ΝΜ^δΟΟ MHz, DSMO-d₆, δ v ppm)

10,4 s, 1 H a. 9,13 s, 2H a 8,94,s.2H, NH's4-amidinoanilinu, 8,6 až7,35, několik m. arom. H a NH, 7,22 a 7.18, 2d,4 H. arom. H (pCl)Phe. 6,95 a 6,58 , 2d, 4H, arom. H Tyr;5,2 až 3,5, několik m, Ca-H a alif. H;3,3 až

2.4, několik m, Οβ-Η, a N-CH₃2,1 až 1,1, několik m, zbyt. alif. H, 1,68, s, 3H, acetyl;l,20,d,3H, C3-H-Ala;0,83, dd, 6H, C8-H-Leu.

Příklad 3

Ac-D-Nal(2)i-D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Lys(B)⁶-Leu⁷-Arg⁸Pro⁹-D-Ala¹⁰-NH₂

Syntéza se prováděla podle schématu diagramu pevných fází (Peptidsynthese-Protokoll, s. 11) s kopulací DIC/HOBt, vycházeje od 4,0 g MBHA-prys-kyřice (hustota cyklu 0,97 mmol/g). Po odštěpení HF od polymerního no-siče vypadlo 4,0 g surového peptídu . který se vyčistil standardním způso-bem preparativní HPLC. Po následujícím sušení vymrazováním se získá 1,39 g HPLC-jednotného produktu . který se nechal zreagovat se 4-amidi-nofenylamino-4-oxomáselnou kyselinou v přítomnostiBOP jako kopulační-ho činidla na požadovanou sloučeninu. Po novém vyčištění HPLC se získá 440 mg cílové sloučeniny sumárního vzorce C82, H106, N19, Cl s korekt-ním ESi hmotovým spektrem :1632,7 (M+ H⁺) (vypoč. 1632,7) a odpoví-dajícím *H-NMR spektrem.

/H-NMR (500 MHz, DMSO-de,8 v pm)

10.4, s,lH a 9,15.s.2H, a 9.0,s,2H, NH's 4-amidinoanilinu; 8,60, m, 2H. arom, H;8,3 až 7,2, několik m, arom. H a NH;7,27 a 7,20 . 2d,4H.

arom.H(pCl)Phe, 6,96 a 6,60 , 2d, 4H, arom. H Tyr;5,2 až 3,5, několik m, Ca-H a alif. H, 3,2 až 2,4. několik m ,Οβ-Η, a N-CH₃, 2,1 až 1,1, několik m, zbyt. alif. H, l,70,s,3H, acetyl;l,20, d, 3H, Οβ-Η Ala;0,85, dd, ,6H, Cy-H-Leu.

Příklad 4

Syntéza se prováděla potfle schématu diagramu pevných fází (Peptidsynthese-Protokoll, s. 11) s kopulací DIC/HOBt, vycházeje od 2,5 g MBHA-prys-kyřice (hustota cyklu 1,08 mmol/g). Po odštěpení HF od polymerního nosiče vypadlo 2,78 surového peptidu. který se vyčistil standardním způ-sobem preparativní HPLC. Po následujícím sušení vymrazováním se zí-skalo 400 mg HPLC-jednotného produktu se sumárním vzorcem C75, H102, N15. 014, Cl s korektním ESl-hmotovým spektrem: 1472,6 (M+H⁺) (vypoč. 1471,7) a odpovídajícím 'H-NMRspektrem.

'H-NMR /500 MHz, D₂O/DMSO-d₆, δ v ppm)

8,62,m,2H, 8,30,m, 2H, 7,80,m,4H, 7,66,s,lH, 7,47,m, 2H, 7,36, d, 1H. arom. H, 7,25 a 7,20, 2 d, 4H, arom. H/pClúPhe, 6,96 a 6,63, 2 d, 4H, arom. H Tyr, 5.10 až 4,0, několik m, Ca-H a alif. H, 3,75 až 2,65, několik m. Οβ-H-a N-CH₃;“2,1 až 1.05, několik, m. zbyt. alif. H; 1,74, s, 3H, acetyl; 1,23, d, 3H, 0β-Η-Ala; 1,20, m, CH₃, isoprop., 0,8, m, 3H, C8-H-Nle

Příklad 5

Ac-D-Nal(2)¹D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Lys(iPr)⁸Pro⁹-Sar¹⁰-NH₂

Syntéza se prováděla podle schématu digramu pevných fází (Peptidsythese-Protokoll, s. 11) s kopulací DIC/HOBt, vycházeje od 2,5 g MBHA-pryskyřice (hustota cyklu 1,08 mmol/g). Po odštěpení HFod pólymerního nosiče vypadlo 2,74 g surového peptidu, který se vyčistil standardním způsobem preparativní HPLC. Po následujícím sušení vymrazováním se získalo 840 mg HPLC-jednotného produktu sumárního vzorce C75, H102, N15,C14,C1 s korektním ESI hmotovým spektrem (M + H⁺) (vypoč. 1471,7) a s odpovídjícím 'H-NMR spektrem.

Ή-NMR (500MHz, D₂O/DMSO-d₆,6v ppm)

8,6,m,2H, 8,3, m, 2H, 7,85, m, 2H. 7,8, m;2H, 7,65, s, 1H, 7,46, m, 2H. 7,35, d;lH, arom. H;7,23 a 7,17, 2 d, 4H, arom.H(pCl)Phe;3,75 až 2,6, několik m , CP-H a N-CH₃;2.2 až 1,5, několik m, zbyt. alif. H, 1,70, s, 3H, acetyl, 1,23, d, 3H, CpAla;l,20,m CH₃ isoprop : 0,8,m,3H, CÓNle

Příklad 6

3-/4.fluorfenyl)-propionyl-D-Nai(l)¹-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Lys(Atz)⁶-Leu⁷Arg⁸-Pró⁹-D-Ala¹⁰-NH₂

Syntéza se prováděla podle schématu diagramu pevných fází (Peptidsynthese-Protokoll, . 11) s kopulací DIC/HOBt, vycházeje od 9.2 g MBHA.pryskyřice (hustota cyklu 1.08 mmol/g). Po odštěpení HF od polymerního nosiče vypadlo 5,8 g surového peptidu, který se vyčistil standardním způsobem preparativní HPLC. Po následujícím sušení vymrazováním se získaly 2,0 g HPLC jednotného nesubstituovaného oktapeptidu, z něhož se nechaly 0,4 mmolu zreagovat s 0,5 mmolu 3-amino-l,2,4-triazol-5-karboxylové kyseliny v přítomnoti PyBOP jako kopulačního činidla na • 9 • · ·

9 9 9

9 9 9 9

790 mg surového produktu požadované sloučeniny .Po novém vyčištění pomocí HPLCse získalo 200mg cílené sloučeniny sumárního vzorce C64, H86, N17, 012, F s korektním FAB hmotovým spektrem :1304,6 (M+H⁺)(vypoč. 1303,6).

8, 14. m, 1H, 7,90, m, 1H, 7,80, m, 1H, 7.50,m, 2H, 7.35, m, 2H, 7.0, m, 6H, 7.63, m, 2H, aromat. H, 5.0, m, 1H, 4.83, m, 2H, 4.41, m, 1H, 4.304.05, několik m,4H, Ca-H;3,66 až 2,25, s, N-Me;2,05 až 1.1, několik m , zbyt, alif, a aromat. bočních řetězců-H;2.95, s, a 2.75, s, N-Me, 2,05 až 1.1, někólik m , zbyt. alif. H;1.20, d, Cp-H-Ala;0,75, m, 6H, CÓ-H Leu.

Sloučeniny podle vynálezu obecného vzorce I byly zkoumány co se týká jejich vazby receptoru. Způsob se opíral těsně o způsob popsaný v Beckers et al. : Eur. J. Biochem. 231, 535-643(1995) Cetrorelix, získaný podle výše zveřejněné syntézy byl jodován [¹²⁵J] (Amersham , specifická aktivita 80,5 Bq/fmol za použití činidla s genem jodu (Pierce). Reakční směs byla čištěna vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi, přičemž monojodovaný cetrorelix se získal bez neznačeného peptidu . Poté se asi 80 % [¹²⁵J]-cetrorelixu a neznačená sloučenina podle vynálezu hodily ke specifické asociaci receptoru.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou testovat následujícími methodami 1 a 2 na jejich účinek in vitro, přičemž vazební afinity byly určovány zkouškou vazby s [¹²⁵J]-centrorelixem (methoda 1) a funkční aktivity s triptorelinem jako agonistickým stimulem ( methoda 2).

Methoda 1

Zkoučka vazby receptoru podle Beckers ,Marheineke.K.Reilánder, H., Hilgard P (1995) Selektion qnd charakterization of manxAlian cell •9 9999

9

9 99

99 99

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 • · · ···»♦· • 4 · · · · ·

9 999 99 9 9 9 9 9 9 lineš with stable ovrexpression of human pituitary receptors for gonadoliberin /GnRH) Eur.J. Biochem. 231, 535-543.

Pro zkoumání vazby receptoru byl cetrorlix jodován za použití činidla s genem jodu (Pierce) s [¹²⁵J] (Amershm;80,5 Bq/fmol specifická aktivita). Reakční směs byla čištěna vysocevýkonnou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi, přičemž se získal monojodovaný eetrorelix bez neznačeného peptidů. Asi 80 % [¹²⁵j] cetrorelixu bylo vhodných pro spefickou asociaci.

Zkouška vazby receptoru se prováděla s intaktními buňkami za fyziologických podmínek, jak to bylo popsáno (Beckers et al. 1995). Subkonfluentní kultůry stabilně transfikovaných LTK’buněk, které exprimují humánní LHRH-receptor, se oddělily inkubací v NaCl/Pj(137mM NaCl, 2,7M KC1, 8,1 mMNa₂HP0₄, 11,47 mM KH₂PO₄)/lmM EDTA a byly shromážděny odstředěním. Peleta buněk byla resuspendována ve vazbovém pufru (DMEM bez H₂CO₃, se 4,5 g/1 glukózy, lOmM hepes pH7,5, 0,5 %, 0,5 % (hmotnost/objem) BSA, 1 g/1 bacitracinu , 0,1 g/1 SBD1, 0,1 % (hmotnost/objem) NaN₃). Pro zkoušku vypírání bylo 0,25x10⁶buněk/ΙΟΟμΙ inkubováno s asi 225 pM [¹²⁵J]-cetrorelixu (specifická aktivita 5 - 10xl0⁵ dpm/pmol a různými koncentracemi neznačené sloučeniny podle vynálezu jako kompetitoru. Suspense buněk ve ΙΟΟμΙ vazebného media senavrstvilo ve 400 μΐ zkušebních trubičkách nad 200 μΐ 84 % obj. silikonového oleje (Měrek Typ 550)/16 % obj. parafinového oleje. Po inkubaci, trvající 1 h, se při 37 °C za pomalého, kontinuálního třepání oddělily buňky 2minutovým odstřeďováním při 9000 rpm (Rotortyp HTA 13,8;Heraeus Sepatec, Osterode/Germany) od inkubačního média. Špičky trubiček, které obsahovaly peletu buněk , se odřízly. Peleta buněk a přesah byly nakonec analyzovány pomocí indikace ý-záření. Množství nespecificky vázaných buněk byl stanoven za vyloučení neznačeného cetrorelixu při konečné koncentraci ΙμΜ a činila typicky < 10 %

	• 44
* · ·	4 4 4	4		♦	4 4
• 444	4 4	4	•	4	4

4 ·	4 4 44·	• • 4	4 • 4	4	4 44 ·

ze všech vázaných buněk. Analýza vazebních dat byla prováděna s EBDA/ligandovým programem analýzy (Biosoft V3,0).

Methoda 2

Fnkční zkouška pro stanovení antagonistická účinnosti

Zkouška byla s několika modifikacemi prováděna tak jak to bylo popsáno v Beckers,T. Reilánder, H. Hilgard, P. /1997) Characterization of gonadotropin-reelasing hormone analogs based on a sensitive cellular luciferase reportér gene assay,, Analyt. Biochem. 251, 17-23 (Beckers et al. 1997). 10 000 buněk na jamku , které exprimují humánní LHRH-receptor a přenášecí gen luciferázy, se kultivovalo 24 h v mikrotitračních deskách za použití DMEM s přísadami a 1 % (v:v). Buňky byly potom stimulovány 6 h 1 nM [D-Trp⁶]LHRH. Antagonistické sloučeniny podle vynálezu byly přidány před stimulací a buňky se nakonec pro kvantifikaci buněčné Luc-aktivity lysovaly. Výpočet lCso-hodnot se prováděl z křivek dávek-účinku pomocí nelineární regresivní analýzy za použití Hill-modelu (Programm EDX 2,0 C.Grunwald, Arzneimittelwerk Dresden).

Kvantifikace Luc-aktivity byla v podstatě prováděna jak to bylo popsámno (Promega Technical Bulletins & 101/161) za použití nynějšího zkušebního systému luciferázy (Promega E4030) v duplikátech. Pomocí přídavku koenzymu A (CoA) se provedla oxidace Luciferyl-CoA s výhodnou kinetikou. Po odstranění kultivačního média z mikrotitrační desky byly buňky lyžovány přídavkem 100 μΐ lyzačního pufru (25 mM trisfosfátu, pH 7.8, 8,2 mM dithiotretolu, 2 mM l,2-diaminocyklohexan-N,N,N',N'tetraoctové kyseliny (CDTA), 10 % (v/v) glycerinu, 1 % Triton-X-100), Po 15 min inkubace při teplotě místnosti bylo převedeno 10 μΐ lyzátu buněk do bílé mikrotitrační desky (Dynatech), vhodné pro lumino22 »* ·· • ♦ * · · • ♦ · « zkušebního pufru (20mM tricinu pH 7,8, l,07mM (MgCO3)₄Mg(OH)₂, 2,67 MgSO₄, 0,1 mM ethylenimintetraoctová kyselina (EDTA), 33,3 mM dithiothreitolu, 270 μΜ koenzymu A, 470 μΜ světlušky(Photinus pyralis)luciferinu , 530 μΜι·ΤΡ^₂). Po jedné minutě byla určována pro celkový čas jedné sekundy luminiscence s poloviční dobou trvání pěti minut za použití EG&G Berthol MicrolLumat LB 96 P.

Tímto způsobem byly získány následující data in vitro, přičemž Kd odpovídá za vazební afinity a IC50 za fukční afinitu a pM znamená pikomol na litr sloučenina

KdÍP-M1 lCgoýpM cetrorelix____________________170 )21)________________198(5) příklad 1 (sůl octanu) nestaoveno

242(3) píklad 2

181(1)

684(2) příklad 3_____________________154(1) _________________492(2) přiklad 6____________________nestanoveno______________221(2)

() = počet vzáemně nezávislých pokus ··* · ·· ···· • ·

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučeniny obecného vzorce I

Α-Χχχ¹-Χχχ²-Χχχ³-Χχχ⁴-Χ xx⁵-Xxx⁶-Xxx⁷-Xxx⁸-Xxx⁹-Xxx¹⁰’NH₂ kde znamenají

A acetylovou kupinu nebo 3-(fluorfenyl)-propionylovou skupinu,

Xxx¹ D-Nal(l) ebo D-Nal/2)

Xxx²-Xxx³ D-Cpa-D-Pal(3) nebo jednoduchou vazbu,

Xxx⁴-Ser,

Xxx⁵ N-Me-Tyr

D-Cit, D-Hci nebo skupina D-aminokyseliny obecného vzorce (II) (Π) ve kterém n znamená číslo 3 nebo 4, přičemž R¹ znamená skupinu obecného vzorce III —(CH₂)_p—CO—NR²R³ (ΠΙ) kde p znamená celé číslo od 1 až do 4, R² je vodík nebo alkylová skupina a R² nesubstituovaná nebo substituovaná arylová skupina nebo heteroarylová skupina, nebo R¹ znamená 3-amino-l,2,4-triazol-5-karbonylovou skupinu nebo R¹ je kruh obecného vzorce IV ve kterém q je číslo 1 nebo 2, R⁴ je atom vodíku nebo alkylová skupina , R⁵ je atom vodíku nebo alkylová skupina a X je atom kyslíku nebo atom

síry, Xxx⁷ znamená Leu nebo Nle Xxx⁸ Arg nebo Lys(iPr), Xxx⁹ Pro a Xxx¹⁰ Ala nebo Ser

a jejich sole s farmaceuticky přijatelnými kyselinami
2. Sloučeniny podle nároku 1, kde sůl je octan, trifluoroctan nebo embonát.
3. Sloučeniny podle nároku 1 nebo 2, kde Xxx⁶ znamená D-[e-N'-( imidazolidin-2-on-4-yl)-formyl]-Lys, D-(3-amino-1,2,4-triazol-3karbonyl)-Lys, zkráceně D-Lys(Atz) nebo D-[8-N'-4-(4-amidinofenyl)amino-l,4-dioxobutyl]-Lys. zkráceně D-Lys(B).
4. Sloučenina podle nároku 1. se vzorcem Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-DPal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Arg⁸-Pro⁹-D-Ala^I()-NH₂.
5. Sloučenina podle nároku 1, se vzorm Ac-D-Na(2)¹-D-Cpa²-DPal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Lys(Atz)⁶-Leu⁷-Arg⁸-Pro⁹-D-Ala¹⁰-NH₂.
6. Sloučenina podle nároku 1 se vzorcem Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-DPal(3 )³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Lys(B)⁶-Leu⁷-Lys(iPr(^x-Pro⁹-D-Ala¹⁰-NH₂.
7. Sloučenina podle nároku 1 se vzorcem Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-DPal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Lys(B)⁶-Leu⁷-Arg⁸-Pro⁹-D-Ala¹⁰-NH₂.
8. Sloučenina podle nároku 1 se vzorcem Ac-D-Nal(2)¹-D*Cpa²-DPal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Lys(iPr)⁸-Pro⁹Ala¹⁰-NH₂.
9. Slobčeina podle nároku 1 se vzorcem Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-DPal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Lys(iPr)⁸-Pro⁹-Sar¹⁰-NH₂.
10. Sloučenina podle nároku 1 se vzorcem Ac-D-Nal(2)¹-D-Cpa²-DPal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Hci⁶-Nle⁷-Arg⁸-Pro⁹-Sar¹⁰-NH₂
11. Sloučenina podle nároku 1 se vzorcem 3-(fůuorfenyl)-propionylD-Nal(l)¹-Ser⁴-N..-Me-Tyr⁵-D-Lys/Atz)⁶-Leu⁷-Arg⁸-Pro⁹-D-Ala¹⁰-NH₂

···· ·» · • ♦ · ·· · * • 9 9 9 • ··· • · • 9 9 • · ♦ · 0 9 • ··· ·· 99 9 9
12.Farmaceutické složení zahrnující sloučeninu podle jednoho z nároků 1 až 11.
13. Způsob výroby sloučenin obecného vzorce I podle nároku 1, v y z n a č u j i c i s e t í m, že se fragmenty ze stavebních kamenů Xxx^m, opatřené vhodnými chránícími skupinami, u kterých m znamená celé číslo 1 až 10 a Xxx¹ je acetylován, vystaví obvyklými způsoby na pevné fázi nebo v roztoku, potom se fragmenty připojí na pevnou fázi kopulací segmentů q po ukončení kopulace sloučenin obecného vzorce I se odštěpí obvyklými způsoby za amidace na stavebním kamni Xxx¹⁰ od pevné fáze.
14. Použití substancí podle nároků 1 až 11 pro výrobu léčiv pro i nádorů podmíněných hormonálně, zejména rakoviny prostaty nebo «síťoviny prsu, jakož i nezhoubných indikací, jejichž léčení vyžaduje su presi LH-RH-hormonu.
15. Způsob výroby léčiv při kterém se sloučeniny podle nároků 1 až 11 smísí s běžnými nosiči a pomocnými látkami a jako léčivo se konfekcionují.