CZ301493B6

CZ301493B6 - Deriváty 5-imino-13-deoxyanthracyklinu, jejich použití a zpusob prípravy

Info

Publication number: CZ301493B6
Application number: CZ20003178A
Authority: CZ
Inventors: Zhang@Xini; D. Olson@Richard
Original assignee: Gem Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 1998-03-03
Filing date: 1999-03-03
Publication date: 2010-03-24
Also published as: WO1999045015A1; HUP0102518A3; EP1064294A1; BR9908387A; KR20010034550A; DE69917440T2; NZ507300A; SI1064294T1; PT1064294E; CN1154652C; DE69917440D1; CN1299366A; CZ20003178A3; JP2002518293A; HU228590B1; IL138117A; KR100456088B1; ATE267206T1; EP1064294B1; CA2322424A1

Abstract

Deriváty 5-imino-13-deoxyanthracyklinu vzorce I, kde: R.sub.1.n., R.sub.2.n. a R.sub.3.n. každé nezávisle znamená substituent vybraný ze skupiny sestávající z H, OH a OCH.sub.3.n. a R.sub.4.n. je cukerná cást vybraná ze skupiny sestávající z cukerných zbytku vzorce II, zpusob jejich prípravy a jejich lécebné využití k lécení rakoviny, autoimunitních chorob nebo poruch deficitu imunity.

Description

Deriváty 5-imino-13—deoxyanthracyklinu, jejich použití a způsob přípravy

Vynález se týká derivátů 5-imino-13-deoxyanthracyklinu. léčebného využití 5-imino-13-de5 oxyanthracyklinu a způsobů přípravy derivátů 5-imino-13-deoxyanthracyklinu.

Dosavadní stav techniky io Nejznámější anthracyklínová léčiva proti rakovině jsou doxorubicin a daunorubícin, které obsahují 13-keto a 5-keto skupinu. Doxorubicin, publikovaný v patentu US 3 590 028 má široké spektrum použitelnosti jako protirakovinný prostředek a je používán při léčbě leukémií, lymfomů a solidních nádorů. Daunorubícin, publikovaný v patentu US 3 616 242 je účinný při léčbě akutních leukémií. Nicméně použitelnost těchto léčiv je omezena závažnými vedlejšími účinky, tj.

kardiotoxicitou, tak, že celkové množství léčiva, které může být podáno pacientovi, nesmi přesáhnout 550 mg/m² (E. A. Lefrak et aí, Cancer, 32:302, 1973). I při doporučené maximální celkové kumulativní dávce nebo v její blízkosti (430 až 650 mg/m²) se u 60 % pacientů vyskytují závažné a přetrvávající srdeční dysfunkce au 14 % pacientů se vyskytuje městnavé srdeční selhání (A. Dresdale et aí, Cancer, 52:51, 1983). I když jsou tedy tato léčiva účinná k inhibování růstu rakovinných nádorů, mohou pacienti v důsledku vedlejších kardiotoxických účinků léčiv zemřít na městnavé srdeční seihání.

Někteří výzkumní pracovníci se domnívají, že kardiotoxicita je výsledkem tvoření volných radikálů chinonovou částí molekuly anthracyklinu (J. Dorowshow et aí, i. Clin. Invest., 68:1053,

1981; D. V. Uverferth et aí, Cancer Treat. Rev., 9:149, 1982; J. Goodman et aí, Biochem. Biophys. Res. Commun., 77:797, 1977; J. L. Tweier, J. Biol. Chem., 259:6056, 1984). Naproti tomu existuje dobrý důkaz o tom, že tvoření volných radikálů nemůže být jediným mechanismem způsobujícím kardiotoxicitu, protože léčiva i za přítomnosti akceptoru volných radikálů stále poškozují srdce (J. F. Van Vleet et aí, Am. J. Pathol., 99:13, 1980; D. V. Unverferh et aí, Am. J.

Cardiol., 56:157, 1985; C. Myers et aí, Seminars in Oncology, 10:53, 1983; R. Η. M. Julicher et aí, J. Pharm. Pharmacol., 38:277, 1986; E. A. Porta et aí, Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol., 41:125, 1983).

Bylo také zjištěno, že inhibice tvoření volných radikálů neodstraní kardiotoxicitu těchto anthra35 cyklinů (P. S. Mushlin et al., Fed. Proč., 45:809, 1986). Místo toho tento výzkum ukazuje, že kardiotoxicita doxorubicinu a daunorubicinu, projevující se redukcí kontraktility myokardu, je také závislá na metabolické redukci 13-keto části na 13-dihydro metabolit. V testovacích systémech, kde doxorubicin není výrazně metabolizován na 13-dihydro metabolit, byly zjištěny kardiotoxické účinky pouze při vysokých koncentracích (200 - 400 mikrogramů/mi) (P. S. Mushlin etaí, Fed. Proč., 44:1274, 1985; R. D. Olson et aí, Fed. Proč., 45:809, 1986). Na rozdíl od 13dihydro metabolitů mají doxorubicinol a daunorubicinol kardiotoxické účinky ve stejných testovacích systémech při relativně nízkých koncentracích (1 -· 2 mikrogramů/mi, R. D. Olson et aí, Proceed. Am. Assoc. Cancer Res., 26:227, 1985; R. D. Olson et aí., Proceed. Am. Assoc. Cancer Res., 28:441, 1987).

Je-li doxorubicinu umožněno setrvávat v testovacích systémech í jen po krátkou dobu, dojde k určité metabolické konverzi a 13—dihydro metabolit vzniká v dostatečném množství ktomu, aby se projevila kardiotoxicita (L. Rossim ei aí., Arch. Foxícoí. suppl., 9:474, 1986; M. Del Tocca et aí, Pharmacol. Res. Commun., 17:1073, 1985). Tak byly nahromaděny podstatné důka50 zy o tom, že kardiotoxicita léčiv jako např. doxorubicinu a daunorubicinu vzniká za silných kardiotoxických účinků vyvolávaných jejich 13-dihydro metabolity (P. Mushlin et aí, Rational Drug Therapy, 22:1, 1988; S. Kuypere/Λ., FASEP Journal, 2:A1133, 1988; R. Bouček et aí, J. Biol. Chem., 261:15851, 1987; a R. Olson et aí. Proč. Nati. Acad. Sci., 85:3585, 1988).

-1 Předložený vynález využívá skutečnost, že 13 deoxv formy doxorubicinu, daunorubicinu nebo jiných podobných anthracyklínů nebudou metabolicky přeměněny na kardiotoxické 13—dihydro formy, a že 5-keto skupina je modifikována na formu, která bude méně ochotně vytvářet radikály. čímž poskytuje možnost aplikování sloučenin předloženého vynálezu v nekardiotoxiekých množstvích bez omezení celkové kumulativní dávky.

C7. 301493 B6

Podstata vynálezu io Předložený vynález je zaměřen na poskytnutí nových derivátů 5-imino-13-deoxyanthracyklinu, které mají méně vedlejších účinků.

Předmětem vynálezu jsou deriváty 5-imino- 15 deoxyanthracyklinu vzorce

kde:

Ri, R₂ a Rs každé nezávisle znamená substituent vybraný ze skupiny sestávající z H, OH a OCH₄ a

R₄ je cukerná část vybraná ze skupiny sestávající z

Obecné jsou tyto anthracykliny snadno konvertovány známými způsoby na 13-tosylhydrazony.

Tosylhydrazony anthracyklínů se redukují na deriváty 13 deoxyanthracyklinu kyanohydro’ boritanem sodným za kyselých podmínek. Produkty se pak Čistí preparativní chromatografií bez ni extrakce. Purifíkované deriváty 13-deoxyanthracyklinu se konvertují na N-Boe deriváty, a pak nechají reagovat sNH₄ k vytvoření N-Boc-5-imino-l3-deoxyanthracyklinů. Odstraněním NBoc za kyselých podmínek vzniknou deriváty 5 - imino-13-deoxyanthracyklinu. Bylo zjištěno, že postupy mají výtěžky od asi 50 do asi 60 %,

Předmětem vynálezu je dále způsob přípravy derivátů 5-imino 13 deoxyanthracyklinu podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, který zahrnuje kroky:

(a) vytvoření kyselého roztoku 13-tosylhydrazonu anthracyklínů kyanohydrobori taném.

CZ JU 149.5 tíř) (b) mírné refluxování roztoku, (c) ochlazení reakční směsi, (d) přidání vody a halogenuhlovodíku do reakční směsi, (e) přidání bezvodého síranu sodného, (f) filtrování precipitátu, (g) okyselení filtrátu, (h) podrobení filtrátu preparativní chromatografíi k izolaci 13·-deoxyanthracyklínového derixátli (í) podrobení HPLC-přečištěné frakce metodě HPLC s reverzními fázemi k odstranění anorgaio nických solí, (j) vytvoření bazického roztoku přečištěného 13 deoxyanihracvklinu s di-/erc-butylkarbonálem, (k) zreagování roztoku při teplotě místnosti, (l) extrahování derivátů chráněných skupinou Boc, (m) vytvoření roztoku Boc chráněných derivátů, (n) zpracování roztoku amoniakem za teploty místnosti, (o) odpaření rozpouštědla a amoniaku, (p) zpracování zbytku kyselým roztokem, (q) odpaření roztoku;

(r) podrobení roztoku preparativní HPLC k izolaci 5-imino-l 3-deoxyanthracyklinů.

(s) podrobení 1IPLC-přečištěné frakce metodě HPLC s reverzními fázemi k odstranění anorganických solí a (t) eluování a izolování 5-imino-l3-deoxyanthracyklinových derivátů.

Výhodně postup zahrnuje formování kyselého roztoku 13 tosylhydrazonu anthracyklinu pomocí kyanohydroboritanu. Roztok se jemně refluxuje. Reakční směs se zchladí. Do roztoku se přidá malé množství vody, a poté halogenované uhlovodíkové rozpouštědlo. Směs se filtruje. Filtrát se podrobí preparativní chromatografíi k izolování derivátů 13-deoxyanthracyklinu. Na puntíkované deriváty se zavede chránící skupina /erc-butoxykarbonylu k vytvoření 3-N-Boe derivátů, které se pak nechají reagovat s amoniakem k vytvoření 3'-N-Boc-5-immo-l3-deoxyanthracyklinú. Sejmutím skupiny chránící amino skupinu za kyselých podmínek vzniknou 5-imino13-deoxy anthracykliny, které se pak čistí chromatografíi.

Další výhodné aspekty předloženého vynálezu poskytují způsob přípravy derivátů 5 imino-1335 deoxyanthracyklinu. Postup zahrnuje formování roztoku rozpuštění asi 1 g 13-tosylhydrazonhydrochloridu doxorubicinu a asi 2,4 g kyseliny p-toluensulfonové kyseliny v asi 50 ml bezvodého methanolu. Do roztoku se přidá asi 0,8 g kyanohydroboritanu sodného.

Roztok se zahřívá při teplotě od asi 68 do asi 72 °C, pak se jemně refluxuje po dobu asi jedné hodiny pod atmosférou dusíku.

Reakční směs se koncentruje na asi 20 ml, pak ochladí v mrazicím boxu na teplotu od asi do asi 4°C.

4? Do reakční směsi se přidá asi 0,5 ml vody, asi 200 ml chloroformu a bezvodý síran sodný. Vzniklé soli se odfiltrují.

Filtrát se nechá projet sloupcem silikagelu. Sloupec se dále promývá chloroform/methanolem dokud není eluát bezbarvý.

-3CZ 301493 B6

Frakce obsahující produkt se eluuje methanolem. Methanolový eluát se odpařuje a výsledný zbytek se rozpustí ve 30% acetonitrílu v pufru mravenčanu amonného.

Produkt se izoluje preparativní HPLC s použitím fenylového sloupce a separuje od dalších nečistot pomocí gradientu aceton itril/mravenčanu amonného. Frakce purifíkované HPLC se pak zředí přibližně stejným objemem vody jako nashromážděné frakce a tento roztok sc nechá projet preparativní HPLC s použitím fenylového sloupce. Produkt se eluuje methanolem. Methanolový eluát se koncentruje a stejný produkt se precipituje přidáním ethyletheru. Tuhý produkt se izoluje filtrací k získání asi 600 mg 13-deoxydoxorubicinu.

]o

Asi 600 mg purifikovaného i 3 dcoxydoxonibicinu se rozpustí v asi 60 ml methylenchloridu a asi 10 ml vody a nechá reagovat s asi 180 mg hydrouhličitanu draselného a asi 180 mg ái-tercbutyldikarbonátu při pokojové teplotě po dobu asi 2 hodin. Organický roztok se separuje, promyje vodou a suší bezvodým síranem sodným. Roztok se odpařuje do sucha. Zbytek se rozpustí v asi 100 ml bezvodého methanolu. Roztok se udržuje nasyceným pomocí amoniaku při teplotě od 0 do asi 4 °C po dobu 48 hodin. Rozpouštědlo a amoniak se odstraní ve vakuu k získání 3'-NBoc-5-ímino-13-deoxydoxorubicinu. Výše obdržený 3'-N-Boc-5-imino-l3-deoxydoxorubicin se nechá reagovat s asi 60 ml bezvodého methanolu obsahujícího asi 0,1 M chlorovodíku při pokojové teplotě po dobu asi 2 hodin k odstranění 3'-N-Boc skupiny. Výsledný roztok se kon20 centruje na asi 5 ml.

Koncentrovaný roztok se izoluje preparativní HPLC s použitím fenylového sloupce. Produkt sc separuje od dalších nečistot použitím gradientu aceton itril/mravenčanu amonného. Frakce purifí kované HPLC se zředí přibližně stejným objemem vody, vstřiknou na fenylový sloupec prepara2? tivní HPLC a proplachují vodou k odstranění solí. Produkt se pak eluuje methanolem.

Methanolový eluát se okyselí asi 0.5 ml chlorovodíku v ethyletheru. Roztok se pak koncentruje na asi 5 ml. K precipitování produktu se přidá 10 ml ethyletheru. Preeipitát se filtruje k získání asi 360 mg 5-imino-13-deoxydoxorubicinhydrochloridu.

so

Předložený vynález také poskytuje sloučeniny mající následující vzorec:

kde substituenty R,, R₂ a IC jsou H, OH nebo OMe a substituent R₄ je cukerná část jiná než morfolinylem substituovaná cukerná část. Samozřejmě, že morfolinyl zahrnuje i substituované morfol iny lové části. Sloučeniny, které obsahují morfol iny lem substituované cukerné části vykazují významně zvýšenou toxicitu.

Dále předložený vynález poskytuje farmaceutický přípravek obsahující alespoň jeden derivát 5i m i η o-13 -d c o xy an t h racy k 1 ί n u.

Dále ještě předložený vynález poskytuje způsob léčby rakoviny, včetně leukémií, lymfomů a pevných nádorů, zahrnující krok aplikování účinného množství alespoň jednoho derivátu 545 ímíno-13- deoxyanthracyklinu.

následujícího popisu budou odborné veřejnosti patrné ještě další předměty a zvýhodnění předloženého vynálezu. Podrobný popis vynálezu ukazuje a popisuje pouze výhodná provedení

-4CZ 301493 B6 vynálezu tak, aby ilustroval nej lepší zamýšlený způsob pro provedení vynálezu. Odborné veřejnosti je zřejmé, že vynález zahrnuje další a různá provedení. Detaily vynálezu mohou být modifikovány 7 různých hledisek bez odchýlení se od vynálezu. Obdobně na výkresy a na popis je třeba pohlížet jako na ilustraci podstaty vynálezu a nikoliv jako omezení.

Podrobný popis vynálezu

Předložený vynález poskytuje deriváty 5-imíno-l3-deoxyanthracyklinu, jejich použití a způsob přípravy derivátů 5-imino-13 -deoxyanthracyklinu. Obr. 3 uvádí příklady derivátů 5-imino-13deoxyanthracv klinu, které mohou být syntetizovány podle předloženého vynálezu. Jak již bylo uvedeno výše, je známo, že sloučeniny jako např. na obr. 3 mají protinádorově vlastnosti a také méně vedlejších účinků.

Postupy podie předloženého vynálezu mohou být prováděny při teplotě od asi 0 do asi 75 ⁿC. Výhodné jsou postupy prováděny při teplotě od asi 65 do asi 75 °C. Výhodněji se mohou postupy provádět při teplotě od asi 68 do asi 72 °C. Teploty přesahující asi 72 °C vedou obvykle k rozložení reaktantů a produktů.

Postup podle předloženého vynálezu zahrnuje množství obecných podmínek. Například redukční reakce se výhodné provádí za kyselých podmínek, jinými slovy hodnota pH by měla být asi 7,0 nebo menší, Bylo zjištěno, že známé postupy přípravy výše uvedených sloučenin, které používají bazické podmínky v rámci reakční směsi, způsobují rozklad reaktantů a produktů.

Navíc by měl být z. redukční reakce vyloučen jak kyslík, tak i voda. Výhodné se reakce provádí v atmosféře dusíku nebo inertního plynu s použitím bezvodých rozpouštědel.

Dále by se aminace měla provádět při teplotě 0 - 4 °C. Vyšší teploty by mohly způsobit rozklad reaktantů a produktů.

Dále by se z aminace měla vyloučit voda. Výhodně se reakce provádí v bezvodých rozpouštědlech.

Dále by se také z hydrolýzy měla vyloučit voda. Výhodně se reakce provádí v bezvodých rozpouštědlech.

Následující popis poskytuje příklad transformace molekuly a její vývoj během postupu.

-5CZ 301493 B6

-6CZ 301493 B6

O OH

-7CZ 301493 B6

R X

a. OMe OH

b. OMe H

c. Η H

Následující blokové schéma ilustruje příklad provedení způsobu podle předloženého vynálezu 10 pro přípravu 5-imino-13-deoxydoxorubicinu, což je derivát 13 deoxvanthracyklinu.

-8CZ JU14W bO redukce reakční směsi • jemný reflux

- ochlazeni na teplotu 0’C přidání vody • přidání CHjCI přidání Να.κω, • filtrace filtrát soli chromatografie na sloupci silikagelu ~ odstranění eluování S 10/1:CHCL₃ : CH₃OH •eluování sCH₃OH

Frakce 1

Frakce 2

- odstranění • koncentrování ♦ preparativní HPLC frakce čistého 13-deoxyanthracyklínu • přidání vody • roztok se projede HPLC s použitím Tenylového sloupce • eluování s vodou (odstranění) • eluování s MeOH • koncentrování roztoku MeOH tuhé 13-deoxyanthracykliny rozpuštění v CHjCha H,0 • přidáni KHCOj a Boc^O míchání při pokojové teplotě po dobu 2 hodin

- separování vrstvy CHjCG • promytí roztoku CHjCIj vodou • sušení roztoku CH₂CI₂ na Na₂SO₄ • odstraněni rozpouštědla

3'-N’-Boc-13-deoxyanthracykliny • rozpuštění v MeOH • ochlazení roztoku na teplotu 0‘- 4*C

- nasycený roztok s ΝΗ₂po dobu asi 24 hodin

-9CZ 301493 Bó odstranění rozpouštědla

	3 -N-Boc-5-imino-13-deoxyanthracykliny
		»rozpuštění v MeOH přidáni HCl v Et₂O • mícháni při pokojové teplotě po dobu 2 hodin koncentrování roztoku • izolování produktů preparativní HPLC
	frakce 5-imino-13-deoxyanthracyklinů
	• přidání vody . roztok se projede HPLC s použitím Tenylového sloupce • eluování s vodou (odstranění) • eluování s MeOH • přidání HCI/Et₂O - koncentrování roztoku MeOH • přidání Et₂O • filtrování precipitátu
tuhé 5-imino-13-deoxyanthracyklinhydrochloridy

Následující popis znázorňuje příklady derivátu anthracyklinu jejichž syntézaje zde popsána.

O R₂

Ri				Analog
OMe	OH	OH	NHj	doxorubicinu

- 10CZ ÚU1W Bó

Ri		K₃	R<	Analog
OMe	OH	H	Z nh₂	daunorubicinu
OH	OH	H	z NHj	karminomycínu
OMe	OH	OH	ng	epirubicinu
H	OH	H	Z HHi	idarubidnu
H	OH	OH	κΠ	annamycinu

Ve sloučeninách může být substituent R₄ modifikovanou verzi různých analog anthracyklinu.

Také kruh O může být substituován halogenem nebo hydroxylovou skupinou. Například kruh D by mohl být substituován fluorem, jodem nebo jakýmkoliv jiným halogenem.

Obecně postup podle předloženého vynálezu zahrnuje formování kyselého roztoku 5--imino-~ 13deoxyanthracyklinu. Roztok se jemné refluxuje. Pak se může reakční směs ochladit. Podle jednoio ho příkladu se reakční směs ochladí na teplotu od asi 0 do asi 4 °C. Pak se může přidat malé množství vody k hydrolyzování produktu. Halogenované uhlovodíkové rozpouštědlo může být studené a může se přidat do reakční směsi. Například může být halogenované uhlovodíkové rozpouštědlo při teplotě od asi 0 do asi 4 °C. Příklad halogenovaného uhlovodíkového rozpouštědla, které může být používáno je chloroform. Po přidání bezvodého síranu sodného se pak reakční is směs filtruje. Filtrace se může také provádět za sníženého teploty. Například filtrace se může provádět za teploty od asi 4 do asi 15 °C.

Výše uvedené přidání vody spíše iniciuje hydrolýzu. Přebytek vody může být odstraněn přidáním bezvodého síranu sodného. Výhodně se pak anorganické soli odfiltrují z reakční směsi. Filtrát se pak podrobí chromatografii na sloupci silikagelu. Hydrofóbní nečistoty se pak izolují eluováním méně polárními rozpouštědly. Produkty 13-deoxyanthracyklinu se pak mohou eluovat a eluát dále čistit.

- II CZ 301493 B6

Purifikované deriváty 13-deoxyanhtracyklinu mohou být rozpuštěny v roztoku methylenchloridu a vody obsahujícím bázi a di-terc-butyld i karbonát. Roztok se může míchat při asi pokojové teplotě po dobu 2 hodin. Organický roztok se může izolovat a promýt vodou, poté se odstraní rozpouštědlo a zbytek se rozpustí v alkoholovém rozpouštědle. Alkoholový roztok se může sytit amoniakem pri teplotě asi 0 °C do asi 4 °C po dobu 24 hodin. Rozpouštědlo se odstraní a suchý zbytek se nechá reagovat s kyselým alkoholovým rozpouštědlem při pokojové teplotě po dobu asi 2 hodin. Výsledný roztok se koncentruje a podrobí dalšímu čištění, pak okyselí a precipituje v etheru k získání hydrochloridové soli 5-imino-13-deoxyanthracyklinu.

io Výhodně zahrnuje postup podle předloženého vynálezu formování roztoku 13-tosylhydrazonů anthracyklinu v bezvodém methanolu s p-toluensulfonovou kyselinou a kyanoborohydridem sodným. Roztok se jemně refluxuje pod atmosférou dusíku a pak zchladí. Přidá se voda a poté chloroform. Precipitované soli se filtrují a filtrát se izoluje na sloupci silikagelu. Hydroťóbní nečistoty vzniklé z rozkladu se eluují roztokem chloroformu a methanolu. Produkty, 13-de15 oxyanthracy klíny, se eluují methanolem. Methanolový eluát se dále čistí preparativní HPLC.

Purifikované 13-deoxyanthracykliny se rozpustí ve směsi methylenchloridu a vody a nechají reagovat s hydrouhličitanem draselným a di-tert-butyldikarbonátem. Roztok se míchá při pokojové teplotě po dobu 2 hodin. Organická vrstva sc izoluje, promyje vodou a suší na bezvodém síranu sodném. Rozpouštědlo se pak odstraní ve vakuu. Zbytek se rozpustí v bezvodém methanolu a udržuje nasyceným pomocí amoniaku při teplotě od asi 0 do 4 °C po dobu 48 hodin. Methanol a amoniak se odstraní z reakčního produktu, který se pak nechá reagovat se zředěnou kyselinou v alkoholu při asi pokojové teplotě po dobu 2 hodin k získání 5-imino-13-deoxyanthracyklinu. Tato sloučenina, v roztoku, se koncentruje, a poté čistí preparativní HPLC k odstranění nečistot a solí. Produkt se eluuje methanolem, okyselí a precipituje k získání hydroehlorídové soli 5-imino-13-deoxyanthracyklínu.

Následující popis poskytuje příklad postupu podle předloženého vynálezu.

Příklad provedení vynálezu

Příprava 5-imino-13-deoxydoxorubicinhydrochloridu

Asi 1 g 13-tosylhydrazonhydroehloridu doxorubicinu a asi 2,4 g p-toluensulionové kyseliny se rozpustí v asi 50 ml bezvodého methanolu. Do tohoto roztoku se přidá asi 0,8 g kyanohydroboritanu sodného. Výsledný roztok se zahřívá při teplotě 68 až 72 °C a udržuje pri jemném refluxu po dobu 1 hodiny pod atmosférou dusíku.

Pak se reakční směs koncentruje na asi 20 ml a ochladí v mrazicím boxu na teplotu asi 0 až 4 °C. Přidá se 0,5 ml vody a 200 ml chloroformu. Poté se přidá bezvodý síran sodný a po protřepaní se soli filtrují.

Roztok se nechá projet sloupcem silikagelu (2,5 x 5 eni). Sloupec se dále promývá chloro4? form/methanolem (10/1) dokud není eluát bezbarvý. Vázané frakce obsahující produkt se eluují methanolem. Methanolový eluát se odpařuje a zbytek se rozpustí v 30% acetonitrilu v pufru mravenčanu amonného (pH = 4,0; 0,5%) a izoluje preparativní HPLC. Použije se feny lový sloupec a použitím gradientu acetonitril/mravenčanu amonného (od 27% do 30% acetonitrilu po dobu 30 minut) se dosáhne separace produktu od dalších nečistot.

Frakce purifikované HPLC se zředí přibližně stejným objemem vody. Roztok se projede preparativní HPLC s použitím fenylového sloupce. Sloupec se eluuje vodou k odstranění solí. Poté se produkt eluuje methanolem. Produkt se koncentruje a přidáním ethyletheru, který obsahuje chlorovodík, precipituje a po spojení filtrací poskytne 600 mg 13~deoxydoxonibicinhydrochloridu.

Výtěžek činí 80%.

TLC: R_f=0.38 CITC1 : MeOH : H₂O 30 10 1

U.V.: X_max - 233, 252. 293. 485 nm 5 MS: 530 (M+H),

383(M+H)

MH, 'HNMR (methanol d₄): (viz níže) io δ. 1,30 (d, 3H, 6'-CH₃),

1.85 (m,2H, 13-HJ,

2.05 (m, 2H, 10- H₂),

2,60 (d, IH, 12-H),

3,05 (d, IH, 12-H),

3,55 (m, IH, 5-H),

3,90 (m, 2H, 14-ΗΛ 4,05 (s, 3H, O-CHJ,

4,25 (m, III. 4'-H).

4.95 (m, IH, 3 -H), :o 5,40 (m, IH, Γ-Η),

7,55 (d, IH,3-H),

7.85 (d, IH, 2-H), a

7.95 (d, Η, 1-H).

Přibližně 600 mg čištěného 13-deoxydoxorubicinu se rozpustí v asi 60 ml methylenchloridu a asi 10 ml vody a nechá reagovat s přibližně 180 mg hydrouhličitanu draselného a přibližně 180 mg di-zerc-butyldikarbonátu při asi pokojové teplotě po dobu 2 hodin. Organický roztok se separuje, promyje vodou a suší na bezvodém síranu sodném. Roztok se odpařuje do sucha a zbytek se rozpustí vaši 100 ml bezvodého methanolu. Roztok se udržuje nasyceným pomocí amoniaku při .io teplotě od asi 0 do asi 4 °C po dobu 48 hodin. Rozpouštědlo a amoniak se odstraní ve vakuu k získání 3^ř-N-Boc-5-imino- 13-deoxydoxorubicinu, který se nechá reagovat s přibližně 60 ml bezvodého methanolu obsahujícího asi 0,1 M chlorovodíku při asi pokojové teplotě po dobu 2 hodin k odstranění 3'-N Boc skupiny. Výsledný roztok se koncentruje a produkt izoluje preparativní HPLC. Frakce purifikované HPTC se zředí stejným objemem vody. Roztok se přidá na fenylový sloupec preparativní HPLC a eluuje vodou k odstranění solí. Produkt se eluuje methanolem, Methanolový eluát se okyselí chlorovodíkem v ethyletheru a roztok se koncentruje. Přidá se ethylether a výsledný precipitát se filtruje k získání přibližně 360 mg 5-imino-13-deoxydoxorubicinhydrochloridu.

TLC: R,-0.35

U.V.: λ_1113χ = 222, 251, 310, 544, 585 nm 'HNMR (MeOH-da) δ 1,30 (d, 3H, 6'=GT)

1,85 (m,2H, 13-H_:)

2,10 (m,2H, 10-IT)

2,60 (d, lil, 12-H)

2,75 (d, IH, 12-H)

- 13 CZ 301493 B6

2,95 (d, III, 12—H)

3.50 (m, H,5'-H) 3,90 (m,2H, 14-Ik) 4,15 (s, 311, O-CFk) s 4,25 (m, IH, 4'-H)

5,10(m, 1H,3-H)

5,60 (m, IH, 1' H)

7.50 (d, IH, 3-H) 7,80 (d, IH, 2-H) io 8,05 (d, IH, 1-H)

MS: 529 (M+H) )O

400 (M+H) +H)

Dále předložený vynález poskytuje farmaceutický přípravek obsahující alespoň jeden derivát 5imino-13-deoxyanthracyklinu,

Dále předložený vynález poskytuje způsob ošetření rakoviny, včetně leukémií, lymfomu, a pevných nádorů, Způsob zahrnuje krok. při kterém se aplikuje účinné množství alespoň jednoho derivátu 5-imino-13-deoxyanthracyklinu. Dávky mohou být podobné jako u známých sloučenin. Díky jejich podobnostem se známými sloučeninami bude odborná veřejnost schopna určit reakční podmínky s podobnou účinností bez nepřiměřeného experimentování. Nicméně, jak je uvedeno výše, umožňuje předložený vynález podstatně snížit vedlejší účinky včetně snížení kardiotoxicity.

Předložený vynález také poskytuje způsob ošetření autoimunních chorob nebo poruch deficitu imunity jako např. AIDS. Způsob zahrnuje krok, při kterém se aplikuje účinné množství alespoň jednoho derivátu 5-imino--13-deoxyanthraeyklinu.

Předchozí popis vynálezu ilustruje a popisuje předložený vynález. Navíc údaje ukazují a popisují pouze výhodná provedení vynálezu, ale jak je výše uvedeno, je jasné, že předložený vynález je použitelný v různých dalších kombinacích, modifikacích a prostředích a jc ho možné změnit nebo modifikovat v rámci rozsahu vynálezu, jak je zde uveden, odpovídající výše uvedeným popisům a/nebo schopnosti nebo znalosti příslušné techniky. Výše popsaná provedení jsou dále určena k vysvětlení nej lepších způsobů podle předloženého vynálezu a k umožnění dalším odborně kvalifikovaným pracovníkům využívat vynález v těchto nebo jiných provedení a s různými modifí- 14 CZ J0I49J BĎ kacemi požadovanými pro jednotlivé aplikace nebo využití vynálezu. Proto popis není zaměřen na omezení vynálezu podle zde popsané formy a přiložené patentové nároky jsou interpretovány tak. aby zahrnovaly alternativní provedení.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY io

1. Deriváty 5-imino-13-deoxyanlhracyk!inu vzorce r₃

15 kde:

Ri a Rj každé nezávisle znamená substituent vybraný ze skupiny sestávající z H, OH a OCH; a

20 R^ je cukerná část vybraná ze skupiny sestávající z

2. Sloučenina podle nároku 1, kde R_f je OCHj, R- a Rj je každé OH a R_: je

3. Sloučenina podle nároku /T°\

K®· /

NH:

kde Ri je OCHj, R.> je OH, R; je H a R4 je

- 15CZ 301493 B6 \

OF

NH,

4. Sloučenina podle nároku 1, kde Ri a R? je každé OH, R> je H a R₄ je

NH₂

5. Sloučenina podle nároku I, kde R) je OCHi, R_; je OH, Ri je OR a R₄ je io

6. Sloučenina podle nároku 1, kde R, a R-, je každé H, R₂ je OH a R₄ je

7. Sloučenina podle nároku 1, kde Ri je H, R₂ a R; je každé OH a R₄ je

OH I

8. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu slou20 ceninu podle kteréhokoli z nároků 1 až 7.

- 169. Použití alespoň jedné sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 pro výrobu léčiva k léčení rakoviny, autoimunitních chorob nebo poruch deficitu imunity.

10. Způsob přípravy derivátů 5-imino-l3-deoxyanthracyklinu podle kteréhokoli z nároků 1 až

5 7, vyznačující se t í m , že zahrnuje kroky:

(a) vytvoření kyselého roztoku 13-tosylhydrazonu anthracyklinu kyanohydroboritanem, (b) mírné refluxování roztoku, (c) ochlazení reakční směsi, (d) přidání vody a halogenuhlovodíku do reakční směsi, io (c) přidání bezvodého síranu sodného, (f) filtrování precipitátu, (g) okyselení filtrátu, (h) podrobení filtrátu preparativní chromatografií k izolaci 13-deoxyanthracyklinového derivátu,

15 (i) podrobení HPLC-přečištěnč frakce metodě HPLC s reverzními fázemi k odstranění anorganických solí, (j) vytvoření bazického roztoku přečištěného 13--deoxyanthracy klinu s di-řerc butyl karbonátem, (k) zreagování roztoku při teplotě místnosti,

20 (1) extrahování derivátů chráněných skupinou Boc, (m) vytvoření roztoku Boc-chraněných derivátů, (n) zpracování roztoku amoniakem za teploty místnosti, (o) odpaření rozpouštědla a amoniaku, (p) zpracování zbytku kyselým roztokem,

25 (q) odpaření roztoku;

(r) podrobení roztoku preparativní HPLC k izolaci 5-imino-13-deoxyanthracyklinů, (s) podrobení HPLC-přečištěnč frakce metodě HPLC s reverzními fázemi k odstranění anorganických solí a (t) eluování a izolování 5-imino-l3 -deoxyanthracyklínových derivátů.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že kyselým roztokem je redukční roztok 13-tosylhydrazonu anthracyklinu v bezvodém methanolu spara-toluensulfonovou kyselinou a kyanohydroboritanem sodným.

12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím 7,0.

že redukční roztok má pH nižší než

13. Způsob podle nároku 10, vyznačující teplotě od 68 do 72 °C.

14. Způsob podle nároku 10, vyznačující teplotě od 65 do 75 °C.

15. Způsob podle nároku 10, vyznačující teplotě až 75 °C.

16. Způsob podle nároku 10, vyznačující nepřítomnosti kyslíku.

se tím, že krok refluxování se provádí při se tím. že krok refluxování se provádí při se tím, že krok refluxování se provádí při se tím, že krok refluxování se provádí za

- 17CZ 301493 B6

17. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že krok refluxování se provádí za nepřítomnosti vody.

18. Způsob podle nároku 10, v y z n a č u j í c í se tím atmosférou dusíku.

19. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím atmosférou inertního plynu.

že krok refluxování se provádí pod že krok refluxování se provádí pod io 20, Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že krok animace se provádí při teploté 0 až 4 °C.

21. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že krok animace se provádí za nepřítomnosti vody.

22. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že postup vede k výtěžku derivátu 5 imino l3 -deoxyanthracyklinu mezi 40 a 50 %.

23. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že dále zahrnuje kroky:

20 (a) vytvoření roztoku rozpuštěním lg 13-tosylhydrazonhydrochloridu doxorubicinu a 2,4 g para-toluensulfonové kyseliny v 50 ml bezvodého methanolu, (b) přidání 0,8 g kyanohydroboritanu sodného do roztoku, (c) zahřívání roztoku na teplotu od 68 do 72 °C, (d) mírné refluxování roztoku po dobu jedné hodiny pod atmosférou dusíku,

25 (e) koncentrování reakční směsi na 20 ml, (f) ochlazení reakční směsi v mrazicím boxu na teplotu od 0 do 4 °C.

(g) přidání 0,5 ml vody do reakční směsi, (h) přidání 200 ml chloroformu do reakční směsi, (i) přidání bezvodého síranu sodného do reakční směsi,

30 (j) filtrování solí z reakční směsi, (k) projetí roztoku sloupcem silikagelu, (l) další promytí sloupce chloroform/methanolem, dokud eluát není bezbarvý, (m) eluování frakce obsahující produkt methanolem, (n) odpařování methanolového eluátu,

35 (o) rozpuštění zbytku vzniklého / odpařování v 30% acetonitrilu v pufru mravenčanu amonného, (p) izolování produktu preparativní HPLC s použitím fenylového sloupce;

(q) separování produktu od dalších nečistot použitím gradientu aceton itri l/mravenčan amonný, (r) zředění HPLC-přečištěné frakce vodou,

40 (s) projetí roztoku fenýtovým sloupcem HPLC.

(t) eluování sloupce vodou, (u) eluování produktu methanolem, (v) koncentrování roztoku na 5 ml, (w) precipitování produktu s 10 ml diethyletheru,

45 (x) filtrování precipitátu k získání 600 mg tuhých 13-deoxyanthracyklinů, (y) vytvoření roztoku 600 mg 13-deoxyanthracyklinů v 60 ml methylenchloridu a 10 ml vody se 180 mg hydrogenuhličitanu draselného a 180 mg di-terc-butyldikarbonátu, (z) reakce roztoku při teplotě místnosti po dobu 2 hodin.

- !8(aa) separování organického roztoku, (bb) promývání organického roztoku vodou, (ce) sušení roztoku bezvodým síranem sodným, (dd) odpařování rozpouštědla, (ce) rozpuštění zbytku ve 100 ml bezvodého methanolu, (ff) udržování roztoku pod nasyceným amoniakem při teplotě 4 °C po dobu 48 hodin, (gg) odpařování roztoku, (nh) rozpuštění zbytku v 60 ml bezvodého methanolu obsahujícího 0,1 M chlorovodíku.

(ii) reakce roztoku při teplotě místnosti po dobu 2 hodin, io (jj) koncentrování roztoku na 5 ml, (kk) izolováni produktu preparativní HPLC s použitím fenylového sloupce, (N) separování produktu od dalších nečistot použitím gradientu acetonitril/mravenčan amonný, (mm) zředění HPLC-přečištěné frakce vodou, (nn) projetí roztoku fenylovým sloupcem HPLC,

15 (oo) eluování mravenčanu amonného vodou, (pp) eluování produktu methanolem, (qq) koncentrování roztoku na 5 ml, (rr) konvertování produktu na hydrochloridovou sůl, (ss) prccipitování produktu 10 ml diethyletheru a

2« (tt) filtrování precipitátu k získání 360 mg tuhého 5-ÍminO“13-deoxyanthracykIinhydrochlorídu.