CZ2000471A3

CZ2000471A3 - 13-deoxyanthracyklinové deriváty a způsoby jejich přípravy

Info

Publication number: CZ2000471A3
Application number: CZ2000471A
Authority: CZ
Inventors: Xini Zhang; Richard D. Olson; Gerald M. Walsh
Original assignee: Gem Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 1997-08-13
Filing date: 1998-08-13
Publication date: 2000-11-15
Also published as: EP1600161A2; CZ302124B6; HUP0002717A3; ID26230A; US5948896A; CN1270522A; IL134494A0; BR9811147A; BR9811147B1; WO1999008687A1; KR20010022848A; HU0002717D0; CA2297149A1; EP1011687A1; EP1011687A4; AU739033B2; NZ502247A; IL134494A; EP1600161A3; JP2001515040A

Description

13-deoxyanthracyklinové deriváty a způsoby jejich přípravy

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká 13-deoxyanthracyklinových derivátů, které nemají kardiotoxické vedlejší účinky, a způsob přípravy takových 13-deoxyanthracyklinových derivátů.

Dosavadní stav techniky

Anthracykliny mají nej širší spektrum protinádorové aktivity ze všech cytostatik. Nejznámějšími antracyklinovými cytostatiky jsou doxorubicin a daunorubicin, které obsahují 13-keto skupinu. Z těchto má doxorubicin, popsaný v U.S. patentu č. 3 590 028, široké spektrum protinádorové účinnosti a je jedním z nejúčinejších léků pro léčbu sarkomů a karcinomů, a také pro léčbu leukémií, lymfomů a solidních nádorů.

Blízký strukturální analog, daunorubicin, popsaný v U.S. patentu č. 3 616 242, není účinný u sarkomů a karcinomů a zdá se, že tento rozdíl v účinnosti je způsoben absencí 14-OH u daunorubicinu. Nicméně, daunorubicin je účinný pro léčbu akutních leukémií.

Kumulativní kardiotoxicita omezuje použitelnost těchto léků. Kardiotoxicita obvykle omezuje dobu trvání léčby doxorubicinem při obvyklých dávkách na přibližně 9 měsíců. Celková kumulativní dávka doxorubicinu nebo daunorubicinu by. neměla přesáhnout 550 mg/m^z (E.A. Lefrak et al., Cancer, 32: 302,

1973). I při podání přibližně maximální doporučené celkové kumulativní dávky (430-650 mg/m²) se významná a trvalá dysfunkce srdce vyskytuje u 60% pacientů a u 14% pacientů dojde ke vzniku městnavého srdečního selhání (A. Dresdale et al. , • · · · • · • · · » · · · • · ··· · · * • ·· · · · · · • · · · · · ··

Cancer, 52: 51, 1983). Ačkoliv jsou tedy tyto léky účinné pro inhibici růstu zhoubných nádorů, mohou pacienti zemřít v důsledku městnavého srdečního selhání způsobeného zavážnými kardiotoxickými nežádoucími účinky léků.

Kromě kardiotoxických účinků sloučenin samotných mají známé způsoby pro přípravu anthracyklinových sloučenin relativně malou výtěžnost, v řádu přibližně 30% (viz Smith et al., J.

Med. Chem. 21: 280-283, 1978).

Účinnost doxorubicinu v léčbě nádorů a jeho omezení v klinickém použití byly důvodem snahy výzkumníků v celém světě vyvinout lepší doxorubicin. Stále trvá v oboru potřeba analogu doxorubicinu, který není limitován kumulativní ireversibilní kardiotoxicitou. Ačkoliv bylo v uplynulých 25 letech syntetizováno více než 2000 analogů, neznamenal žádný z nich významné zlepšení ve srovnání s doxorubicinem (R.B. Weis, The anthracyclines: Will we ever find a better doxorubicin?, Seminars in Oncology, 19: 670-686, 1992) .

Během posledních 25 let byl proveden rozsáhlý výzkum zaměřený na pochopení mechanismu kardiotoxicity anthracyklinů. Populární teorií byla teorie volných radikálů. Podle této teorie je kardiotoxicita anthracyklinů důsledkem tvorby volných radikálů chinonovou skupinou v anthracyklínové molekule (J. Dorowshow et al., J. Clin. Invest., 68: 1053, 1981; D.V. Unverferth et al., Cancer Treat. Rev. 9: 149, 1982; J. Goodman et al., Biocehm. Biophys. Res. Commun. 77: 797, 1977; J. L. Zweier, J. Biol. Chem. 259: 6056, 1984).

Nicméně, tato teorie byla zklamáním, protože činidla vychytávající volné radikály a antioxidační činidla selhaly v prevenci kumulativní kardiotoxicity (D. Propper and E. Masér,

A A · · · · • · • · · · • · • · AAA · A A A • · · A · A A A A A A * A AAAA AAAA

AAAA · AAAA AAAA

Carbonyl reduction of daunorubicin in rabbit liver and heart, Pharmacology and Toxicology, 80: 240-245, 1997; J. F. VanVleet et al., Am. J. Pathol. 99: 13, 1980; D.V. Unverferth et al.,

Am. J. Cardiol. 56: 157, 1985; C. Myers et al., Seminars in Oncology, 10: 53, 1983; R.H.M. Julicher et al., J. Pharm. Pharmacol. 38: 277, 1986; a E.A. Porta et al., Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol. 41: 125, 1983).

Jinými slovy, bylo zjištěno, že inhibice tvorby volných radikálů neeliminuje kardiotoxicitu těchto anthracyklinů (P.S. Mushlin et al., Fed. Proč. 45: 809, 1986). Dr. Richard D. Olson a Dr. Tihillip S. Mushlin strávili posledních 15 let studiem mechanismu anthracykliny indukované kardiotoxicity a vyvinuli metabolitovou teorii, která se patrně stane hlavní teorií (R.D. Olson and P.S. Mushlin, Doxorubicin cardiotoxicity: Analysisi of prevailing hypotheses, FASEB Journal, 4: 30763086, 1990). Podle této teorie je anthracyklinová kardiotoxicita způsobena 13-OH metabolitem původní sloučeniny.

Tento výzkum ukazuje, že kardiotoxicita doxorubicinu a daunorubicínu, jak je manifestována redukcí kontraktility myokardu, závisí na metabolické redukci 13-keto- skupiny na 13dihydro- metabolit. V testovacích systémech, ve kterých není doxorubicin významně metabolizován na 13-dighydro- sloučeninu, jsou pozorovány kardiotoxické účinky pouze při velmi vysokých koncentracích (200 - 400 μρ/πιΐ) (P.S. Mushlin et al., Fed.

Proč. 45: 809, 1985; R.D. Olson et al., Fed. Proč. 45: 809, 1986).

Když se ponechá doxorubicin v testovacím systému pouze krátkou dobu, proběhne i tehdy určitá metabolická konverse a 13-dihydro- metabolit vznikne v dostatečném množství pro vznik kardiotoxicity (L. Rossini et al., Arch. Toxicol., suppl., 9:

tt · · · · · · • · · · • · • · · · · · · · · • · · · · *····« • · · · 9 · · · · ·

9999 9 99 99 99 9 9

474, 1986; M. Del Tocca et al·., Pharmacol. Res. Commun., 17: 1073, 1985). Tak byl získán významný důkaz toho, že kardiotoxicita léků jako je doxorubicin a daunorubicin vzniká v důsledku silných kardiotoxických účinků způsobených jejich 13dihydro- metabolity (P. Mushlin et al, Rational Drug Therapy, 22: 1, 1988; S. Kuyper et al., FASEP Journal, 2: A1133, 1988;

R. Bouček et al., J. Biol. Chem. 262: 15851, 1987; a R. Olson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 85: 3585, 1988).

Naopak, 13-dihydro- metabolity, doxorubicinol a daunorubicinol, produkují kardiotoxicitu ve stejných testovacích systémech v relativně nízkých koncentracích (1-2 μς/ιηΐ, R.D. Olson et al., Proceed. Am. Assoc. Cancer .Res., 26: 227, 1985; R.D. Olson et al., Proceed. Am. Assoc. Cancer Res., 28: 441, 1987).

Podle uvedené teorie je doxorubicin přeměněn intracelulární karbonyl-reduktasou na doxorubicinol, ve kterém je 13-ketoskupina redukována na alkohol, jak je uvedeno dále:

Tato teorie nabízí vysvětlení časového oddálení kardiotoxicity anthracyklinů. Výzkumy Olsona a Mushlina byly nedávno přezkoumány a mnoho zjištění bylo potvrzeno (D. Propper and E. Masér, Carbonyl reduction of daunorubicin in rabbit » A A A

9 AAAA

9 · · • «

AAAA A liver and heart, Pharmacology and Toxicology, 80: 240-245,

1997).

Výzkumy ukázaly například přímý vztah mezi intrakardiální akumulací C13-alkoholového metabolitu a narušením jak kontraktility, tak relaxace srdečního svalu. Také během chronického podávání doxorubicinu se jeho 13-alkoholový metabolit doxorubicinol akumuloval selektivně v srdeční tkáni krys a králíků. Dále výzkumy prokázaly, že kardiotoxický efekt daunorubicinolu in vitro je významně vyšší než kardiotoxický efekt původního léku.

Dále výzkumy prokázaly, že doxorubicinol byl 30-krát účinější než doxorubicin v inhibici srdeční kontraktility v králičích papilárních svalech. Ještě dále výzkumy prokázaly, že mechanismus srdeční dysfunkce souvisí s inhibici ATPasy, protože doxorubicinol, nikoliv však doxorubicin, je účinným inhibitorem Ca²⁺-Mg²⁺ATPasy sarkoplasmatického retikula, Mg²⁺ATPasy v mitochondriích a Na⁺-K⁺-ATPasy v sarkolemmu. Kromě toho, přítomnost daunorubicinolu, nikoliv však daunorubicinu, byla v srdeční tkáni zvířecího modelu zjištěna dva dny po podání daunorubicinu.

Nedávno byl mechanismus alkoholovými metabolity anthracyklinů indukované kardiotoxicity zkoumán Minotti et al., The secondary alcohol metabolite of doxorubicin irreversibly inactivates aconitase/iron regulátory protein 1 in cytosolic fractions from human myocardium, FASEB Journal, 12, v tisku, 1998. Minotti et al. prokázali, že doxorubicinol, ne však doxorubicin, interferuje s metabolismem železa a ireversibilně inaktivuje regulační protein-I pro železo (IRP-I). V důsledku toho není železo dostupné pro enzymy vyžadující železo ke své funkci. Inaktivace těchto enzymů vede ke vzniku kardiotoxicity.

Těmto objevům odpovídá skutečnost, že chelační činidlo dexrazoxan je použitelné pro redukci kardiotoxicity doxorubicinu (G. Weiss et al., Modulation of transferrin receptor expression by dexrazoxan (ICRF-187) via activation of iron regulátory protein, Biochemical Pharmacology, 53: 14191424, 1997). Zdá se, že dexrazoxan stimuluje aktivitu IRP-I, která působí proti účinkům doxorubicinolu.

Olson a Mushlin vytvořili teorii, že analog 13-ketoanthracyklinu, který nemůže tvořit alkoholový metabolit, by neměl být kardiotoxický. Nej atraktivnější možností byla redukce 13-keto- skupiny na methylenovou skupinu. Nejsou známé enzymy, které by metabolizovaly tuto skupinu na alkohol. V souladu s touto teorií byly výsledky získané s anthracyklinem aclarubicinem.

·'«« · · ···· ·· ·· • ·· · · 9 · 9 • · · · ···· 9 ·· · · · · · · 9 • · · ♦ · · · · 9

9· 99 99 99 ' · .:λ

Aclarubicin má mnohé modifikace ve srovnání s doxorubičinem, včetně nepřítomnosti 14-OH skupiny. Tento lék nebyl účinný proti sarkomům nebo karcinomům, což odpovídá nepřítomnosti 14OH skupiny. Nicméně, byl účinný proti akutním leukémiím. Aklarubicin také neobsahuje 13-keto- skupinu, ale obsahuje 13methylenovou skupinu.

Tento lék je komerčně používán ve Francii a v Japonsku. Aclarubicin nemá ireversibilní kumulativní kardiotoxicitu. Pacientům bylo podáno až 3000 mg/m² bez známek srdeční dysfunkce či kardiomyopatie (D.C. Čase et al. , Phase II study of aclarubicin in acute myeloblastic leukemia, American Journal of Clinical Oncology, 10: 523-526, 1987). Odborníci v oboru nepochopili mechanismus nepřítomnosti kardiotoxicity aclarubicinu a nesprávně předpokládali, že je způsobeno distribucí a farmakokinetikou aclarubicinu. Nicméně, Olson a Mushlin věří, že se potvrdí význam nepřítomnosti 13-ketoskupiny pro kardiotoxicitu.

Podstata vynálezu

Jedním předmětem předkládaného vynálezu je důkaz, že 13deoxyanthracyklinové deriváty nejsou kardiotoxické.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je vylepšený způsob přípravy takových 13-deoxyanthracyklinových derivátů.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou prekursory některých 13-deoxyanthracyklinových derivátů a způsoby přípravy takových prekursorů.

V souladu s těmito a jinými předměty a výhodami obsahuje předkládaný vynález 13-deoxyanthracyklinové deriváty vzorce I:

kde Ri je Η nebo OH; R₂ je H, OH nebo OHe; R₃ je H nebo OH; R₄ je H nebo OH; a R₅ je uhlovodík nebo substituovaný uhlovodík. Předkládaný vynález také obsahuje farmaceuticky přijatelné soli sloučenin vzorce 1. Mezi farmaceuticky přijatelné soli patří soli s farmaceuticky přijatelnými anorganickými a organickými kyselinami a zásadami. Příklady vhodných kyselin jsou kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, dusičná, chloristá, fumarová, maleinová, fosforečná, glykolová, mléčná, salicylová, jantarová, toluen-p-sulfonová, vinná, octová, citrónová, methansulfonová, mravenčí, benzoová, jablečná, naftalen-2sulfonová, trifluoroctová a benzensulfonová. Mezi soli odvozené od vhodných baží patří alkalické soli, jako soli Sodíku a amoniaku.

Jedním aspektem předkládaného vynálezu je také způsob léčby savců vyžadujících protinádorovou terapii. V tomto způsobu je pacientovi podáno účinné protinádorové množství alespoň jedné sloučeniny vzorce I

)R₅

O

Ή (I) .0, Μ

99 • « · 9

9 9 9 kde R_x je H nebo OH; R₂ je H, OH nebo OMe; R₃ je H nebo OH; R₄ je H nebo OH; a R_s je uhlovodík nebo substituovaný uhlovodík.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je způsob přípravy 13deoxyanthracyklinových derivátů. Způsob obsahuje přípravu acidického roztoku anthracyklinu 13-tosylhydrazonu s kyanborohydridem jako redukčním činidlem. Roztok se opatrné zahřívá při teplotě zpětného toku. Reakční směs se ochladí. Do roztoku se potom přidá nasycený vodný roztok NaHC0₃ a potom roztok halogenuhlíku. Směs se přefiltruje. Filtrát se okyselí. Filtrát se zpracuje preparativní chromatografií pro izolaci 13deoxyanthracyklinového derivátu.

Dále předkládaný vynález řeší výše popsané nedostatky známých způsobů pro přípravu 13-deoxyanthracyklinových derivátů.

V souladu s tím předkládaný vynález obsahuje zlepšené způsoby přípravy 13-deoxyanthracyklinových derivátů, které mají vyšší výtěžnost ve srovnání se známými způsoby.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je tedy způsob přípravy 13-deoxyanthracyklinových derivátů.

Obecně mají anthracykliny vzorec I*

kde R_1Z R₂, R₃, R₄ a snadno přeměněny na

R₅ jsou popsány výše. Anthracykliny jsou 13-tosylhydrazony za použití známých

Μ 9«·· ·· ···· ·· ·· • 9 9 99 · 99··

999 · · · ·

9 9 · · ♦ · · · · ·

9 9 9 9 · 9··· ιθ ..... ·· ·· ·· ·· způsobů. Anthracykliny-13-tosylhydrazony jsou redukovány na 13deoxyanthracyklinové deriváty za použití kyanborohydridu sodného za kyselých podmínek. Výsledné materiály jsou přečištěny preparativní chromatografíí bez extrakce. Bylo zjištěno, že tyto způsoby mají výtěžnost od 70% do přibližně 80%.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je způsob přípravy 13deoxyanthracyklinových derivátů. Způsob obsahuje přípravu acidického roztoku anthracyklinu 13-tosylhydrazonu s kyanborohydridem. Roztok se opatrně zahřívá při teplotě zpětného toku. Reakční směs se ochladí. Do roztoku se potom přidá nasycený vodný roztok NaHCO₃ a potom roztok halogenuhlíku. Směs se přefiltruje. Filtrát se okyselí. Filtrát se zpracuje preparativní chromatografíí pro izolaci 13deoxyanthracyklinového derivátu.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je způsob přípravy 13-deoxyanthracyklinových derivátů. Způsob obsahuje přípravu roztoku 1 g doxorubicin-13-tosylharazon hydrochloridu a asi 2,4 g kyseliny p-toluensulfonové v asi 50 ml bezvodého methanolu.

Do roztoku se přidá asi 0,8 g kyanborohydridu sodného. Roztok se zahřeje na teplotu od asi 68 °C do asi 72 °C. Roztok se opatrně zahřívá při- teplotě zpětného toku po dobu asi hodiny v atmosféře dusíku. Reakční směs se koncentruje na asi 20 ml. Reakční směs se ochladí v chladničce na teplotu asi 0 °C až asi 4 °C. Do reakční směsi se přidají asi 2 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. K reakční směsi se přidá asi 200 ml chloroformu. Do reakční směsi se přidá bezvodý síran sodný. Soli se odfiltrují. Filtrát se okyselí chlorovodíkem v diethyletheru. Roztok se zpracuje na silikagelová koloně.

Kolona se promývá chloroformem/methanolem do té doby, dokud není eluat bezbarvý.

•9 9999

99

9· 9 9 9 9 9

999 9 9 9 9

9 9· 9 999 99 9

9 9999 9999

9999 9 99 99 99 99

Frakce obsahující cílový materiál je eluována methanolem. Zbytek získaný po odpaření se rozpustí v 30% acetonitrilu v pufru tvořeném mravenčnanem amonným. Výsledný materiál se izoluje preparativní HPLC za použití fenylové kolony. Získaný materiál se zbaví nečistot za použití gradientu acetonitril/mravenčnan amonný. Frakce přečištěné HPLC je potom lyofilizována za zisku &Si 600 mg 13~deoxydoxorubicin hydrochloridu.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 je vývojový diagram ilustrující mechanismus kardiotoxicity.

Obr. 2 je graf ukazující koncentraci doxorubicinolu v materiálu z pravé síně a komory inkubovaného s 175 μΜ sloučeniny podle předkládaného vynálezu nebo s doxorubicinem v závislosti na čase.

Obr. 3 je graf ukazující vychytávání [³H]-thymidinu v HL-60 buňkách inkubovaných se sloučeninou podle předkládaného vynálezu nebo s doxorubicinem, kde tento graf ukazuje inhibici růstu buněk.

Obr. 4 je graf ukazující vychytávání [³H]-thymidinu v P38 8 buňkách inkubovaných se sloučeninou podle předkládaného vynálezu nebo s doxorubicinem, kde tento graf ukazuje inhibici růstu buněk.

Obr. 5 je graf ukazující vychytávání [³H]-thymidinu v MCF7 buňkách inkubovaných se sloučeninou podle předkládaného

9 9 9 9 9 ·· 99 9 9

9 9 · ♦ ·

9 9 9 9 « 9 9 9 9 9 · 9 9 9 9

9999 9 9· *· vynálezu nebo s doxorubicinem, kde tento graf ukazuje inhibicí růstu buněk.

Obr. 6 je graf ukazující vychytávání [³H]-thymidinu v MDA-MB231 buňkách inkubovaných se sloučeninou podle předkládaného vynálezu nebo s doxorubicinem, kde tento graf ukazuje inhibicí růstu buněk.

Obr. 7 je graf ukazující vliv sloučeniny B podle předkládaného vynálezu a daunorubicinu na kontraktilitu.

Obr. 8a-c jsou, v příslušném pořadí, mikrofotografie při 200-násobném zvětšení, které ukazují histopatologii tkáně levé komory králíků léčených po dobu 20-23 týdnů sloučeninou podle předkládaného vynálezu, doxorubicinem nebo kontrolním roztokem, kde je patrna vakuolizace myocytů a ztráta myofibril ve vzorku králíka léčeného doxorubicinem,. ale ne vzorku králíka léčeného sloučeninou A podle předkládaného vynálezu nebo kontrolou.

Předkládaný vynález využívá skutečnosti, že 13-deoxy formy doxorubicinu, daunorubicinu nebo jiných podobných anthracykliriů nejsou metabolizovány na kardiotoxické 13-dihydro-formy, což umožňuje podání sloučenin podle předkládaného vynálezu v nekardiotoxickém množství bez omezení celkové kumulativní dávky.

Předkládaný vynález obsahuje vylepšený doxorubicin vzorce A:

»»·· 4» 4444 4 4 ··

4 4 · · · ♦ 4 4 4 • * · · ♦ · 4 · 4

4 4 4 · 4 4···· φ 4 4444 · · · 4

4444 · 44 44 44 44 který je zde dále označován jako sloučenina A.

Vylepšená sloučenina A byla syntetizována z doxorubicinu redukcí 13-keto- skupiny na methylenovou skupinu. Pokusy provedené in vitro prokázaly, že zlepšená sloučenina A není metabolizována srdeční tkání na doxorubicinol za stejných podmínek, za kterých je doxorubicin metabolizován na tento metabolit.

Pokusy provedené in vitro popsané dále studovaly biotransformaci vylepšeného doxorubicinu podle předkládaného vynálezu. Cílem studie bylo určit, zda je sloučenina A podle předkládaného vynálezu metabolizována na C-13 hydroxy-metabolit v preparátech izolovaných králičích srdečních svalů.

Doxorubicin, doxorubicinol a sloučenina A byly testovány na proužcích stěny pravé síně a pravé komory získaných od New\ Zeala^yd^bílých králíků za použití fluorescenční HPLC techniky. Tenké síňové a komorové proužky byly inkubovány v mediu pro inkubaci svalů (30 °C) obsahujícím oxygenovaný Krebsůvhydrogenuhličitanový pufr. Doxorubicin (175 μΜ) nebo sloučenina A (175 μΜ) byly přidány do media a síňové nebo komorové proužky byly vyjímány z media ve 30 minutových intervalech po dobu 210 minut. Každý proužek byl krátce promyt ve fyziologickém roztoku, byl vysušen savým papírem, byl rozstřižen na polovinu a byl zvážen. Tkáň byla skladována ve zkumavkách při -70 °C pro stanovení tkáňových koncentrací doxorubicinu, doxorubicinolu a sloučeniny A. Tkáňové koncentrace doxorubicinu, doxorubicinolu a sloučeniny A byly stanoveny ze standardních křivek ve třech nezávislých pokusech a jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Bylo pozorováno zvýšení koncentrace sloučeniny A a doxorubicinu v

9 9 • · · • * • · • ♦ • ·· · ·

9·99 * · · 9 9 9 9 » « · · · * · • · ····*♦ ···« · ♦ · · · © * · ·♦ síních a komorách, které bylo závislé na čase. Po 210 minutách inkubace se sinové tkáňové koncentrace (ng/mg hmotnosti před vysušením) sloučeniny A a doxorubicinu statisticky významně nelišily (sloučenina A: 743 ± 89; doxorubicin: 617 ± 35). Koncentrace sloučeniny A v komoře byly statisticky významně vyšší než komorové koncentrace doxorubicinu po 210 minutách inkubace (sloučenina A: 626 ± 31; doxorubicin: 407 ± 30, p < 0,05). Nicméně, pouze doxorubicin byl metabolizován na C-13 hydroxy-metabolit doxorubicinol. Nebyl prokázán žádný metabolismus sloučeniny A. Tyto pokusy ukazují, že sloučenina A netvoří C-13 hydroxy-metabolit ve preparátech izolovaného srdečního svalu.

Cílem studie bylo určit, zda je sloučenina A metabolizována na C-13 hydroxy-metabolit v preparátech izolovaných králičích srdečních svalů.

Tyto testy byly provedeny za použití sloučeniny A podle předkládaného vynálezu a doxorubicinu.

Testy byly provedeny za použití tkání z králičích komor, pravé a levé síně, volné stěny pravé komory, Krebsovahydrogenuhličitanového pufru (pH 7,4), normálního (0,9%) fyziologického roztoku, (NH₄)₂SO₄, isopropylalkoholu, chloroformu, daunorubicinu, doxorubicin, doxorubicinolu a methanolu.

Protokol testu byl následující: tenké proužky (80 až 100 mg) volné stěny pravé komory a síně z NZW králíků byly inkubovány v mediu pro kultivaci svalu (30 °C) obsahujícím oxygenovaný Krebsův-hydrogenuhličitanový pufr (pH 7,4) následujícího složení: 127 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂, 2,3 mM KC1, 25 mM NaHCO₃,

1,3 mM KH₂PO₄, 0,6 mM MgSO₄ a 5, 6 mM glukosy, jak bylo popsáno • 9 9999 • « * • 9

9

9 • 99 9 9

9*99

9 9

9 9 « e 9· ·

9 ·<

9 · • 9 9

9 9 9

9 9 <9 9« •

dříve (P.S. Mushlin et al., Br. J. Pharmacol., 110: 975-982, 1993).

Doxorubicinol byl syntetizován způsobem, který popsali Takanashi a Bachur (S. Takanashi and N.R. Bachur, Drug Metab. Disp. 4: 17-87, 1976) s mírnými úpravami (P.S. Mushlin et al., Br. J. Pharmacol., 110: 975-982, 1993).

Pro statistickou analýzu výsledků pokusů byly tkáňové koncentrace (ng/mg hmotnosti před vysušením) doxorubicinu, doxorubicinolu a sloučeniny A stanoveny ve třech samostatných pokusech a byly vyjádřeny jako průměr ± SEM. Pro analýzu efektu léčby v různých časových intervalech byla použita dvoufaktorová analýza (ANOVA) za použití Prizm (GraphPad) programu.

Výsledky zahrnují pozorování, že zvýšení koncentrace sloučeniny A a doxorubicinu v tkáni králičích síní (tabulka 1) a volné stěny pravé komory (tabulka 2) je závislé na čase (obr. 1). Koncentrace sloučeniny A v síních a komorách byly stejné nebo vyšší než sinové a komorové koncentrace doxorubicinu. Nicméně, pouze doxorubicin byl metabolizován na C-13 hydroxymetabolit doxorubicinol a byla pozorována akumulace doxorubicinolu ve tkáni králičích síní (tabulka 1) a komor (tabulka 2) závislá na čase (obr. 2). Nebyl zjištěn žádný metabolismus sloučeniny A (obr. 2).

Tabulka 1

Koncentrace (ng/mg hmotnosti před vysušením) testovaných sloučenin a doxorubicinolu ve tkáních králičích síní

Čas (min.)	Sloučenina	Sloučenina	Doxorubicin	Doxorubici-
	A	A - C-13		nol
		metabolit
30	242 ± 46	ND	179 ± 14	0,41 ± 0,32
60	412 ± 65	ND	256 ± 22	0,73 ± 0,10
90	453 ± 32	ND	361 ± 50	1,56 ± 0,24
120	518 ± 47	ND	434 ± 51	3,71 ± 0,77
150	550 ± 34	ND	542 ± 29	3,53 ± 0,23
180	624 ± 20	ND	584 ± 41	5,58 ± 1,15
210	743 ± 89	ND	617 ± 35	8,31 ± 1,30

ND znamená nedetekovatelné koncentrace C-13 hydroxy-metabolitu sloučeniny A. Tkáňové koncentrace ze tří samostatných pokusů jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. ND a průměrné hodnoty byly získány ze tří nezávislých pokusů.

Tabulka 2

Koncentrace (ng/mg hmotnosti před vysušením) testovaných sloučenin a doxorubicinolu ve tkáních z volné stěny králičích komor

Čas (min.)	Sloučenina A	Sloučenina A - C-13 metabolit	Doxorubicin	Doxorubici- nol
30	183 ± 9	ND	129 ± 19	0,03 ± 0,03
60	287 ± 28	ND	251 ± 34	0,12 ± 0,06

• ·

90	412 ± 87	ND	221 ± 21	0,22 ± 0,03
120	425 ± 23	ND	331 ± 27	0,80 ± 0,08
150	443 ± 19¹	ND	349 ± 26	1,04 ± 0,21
180	489 ± 13	ND	377 ± 47	1,27 ± 0,21
210	626 ± 31¹	ND	407 ± 30	2,00 ± 0,20

¹ p > 0,05, sloučenina A vs. doxorubicin. ND znamená nedetekovatelné koncentrace C-13 hydroxy-metabolitu sloučeniny A. Tkáňové koncentrace ze tří samostatných pokusů jsou vyjádřeny jako průměr + SEM. ND a průměrné hodnoty byly získány ze tří nezávislých pokusů.

Výsledky těchto pokusů ukazují, že sloučenina A nevytváří C13 hydroxy-metabolit v preparátu izolovaného králičího svalu, Nicméně, doxorubicin, strukturálně příbuzná sloučenina, byl metabolizován na doxorubicinol, C-13 hydroxy-metabolit. Dále výsledky těchto pokusů naznačují, že metabolismus doxorubicinu na doxorubicinol je větší v síních než v komorách.

Obr. 2 ukazuje koncentraci doxorubicinolu v preparátech pravé síně (A) a komory (V) inkubovaných se 175 μΜ sloučeniny A podle předkládaného vynálezu nebo doxorubicinem v závislosti na čase. Jak je vidět z obr. 2, sloučenina podle předkládaného vynalezu je přítomna v mnohem menších koncetracích než doxorubicin.

Jiné studie in vitro prokázaly, že sloučenina A podle předkládaného vynálezu je stejně účinná jako doxorubicin v inhibici růstu lidských nádorových buněk.

• 999 • · • ♦ · · 1 • 9 · · <

9*9 * * ’ * 9 * · «

9 * · 9 9

Pokusy prokazující účinnost sloučeniny podle předkládaného vynálezu v inhibici růstu nádorových buněk srovnávaly účinky sloučeniny A podle předkládaného vynálezu a doxorubicinu na proliferaci buněk in vitro.

V pokusech prokazujících účinnost sloučeniny podle předkládaného vynálezu byl anti-proliferativní účinek sloučeniny A srovnáván s antiproliferativním účinkem doxorubicinu v kulturách buněčných linií odvozených z lidské a myší leukemie (HL60 a P388) a lidského karcinomu prsu (MCF7 a MDA-MB 231). Inhibice proliferace nádorových buněk byla měřena podle inkorporace [³H]-thymidinu do buněk. Antiproliferativní účinek sloučeniny A byl srovnáván s antiproliferativním účinkem doxorubicinu za stejných kultivačních podmínek. Koncentrace způsobující 50% maximální inhibice (IC₅₀) byla získána z analýzy křivek. Průměrné hodnoty IC₅o (v nM) a 95% interval spolehlivosti jsou uvedeny dále. Průměry byly stanoveny ze 3 nebo 4 samostatných testů opakovaných třikrát.

Buněčná linie	Sloučenina A	Doxorubicin	Poměr účinnosti
HL60	127 (108-149)	58 (47-70)	2,2
P388	1980 (1830- 2140)	269 (242-299)	7,4
MCF7	72 (68-77)	17 (17-18)	4,2
MDA-MB231	182 (81-408)	43 (34-53)	4,2

Jak sloučenina A, tak doxorubicin, zcela zabránily inkorporaci [³H] thymidinu do buněk v každé ze čtyř studovaných buněčných linií. Tyto studie prokázaly, že sloučenina A a doxorubicin jsou účinnými inhibitory proliferace nádorových buněk in vitro, ačkoliv podle poměru IC₅₀ hodnot (poměru účinnosti) byl doxorubicin o něco účinější než sloučenina A v • 9 9 · •9 9 9· 9 9·99

999 9999

1> < · 999 9*9999 • · 9999 999 9 • 999 9 99 99 99 99 inhibici inkorporace [³Η] thymidinu do buněk v každé ze čtyř studovaných buněčných linií (p < 0,05).

Cílem pokusu bylo stanovení účinnosti sloučeniny A pro inhibici buněčného růstu (proliferace) v několika kultivovaných maligních buněčných liniích odvozených z lidské a myší leukemie (HL60 a P388) a lidského karcinomu prsu (MCF7 a MDA-MB 231), za použití dobře známého protokolu inkorporace thymidinu (E.

Severison and E.L. Larsson, Lymphocyte responses to polyclonal B and T cell activators, v D.M. Weir (vyd.), Cellular

Immunology, svazek 2, 4. vydání, Blackwell Scientific

Publications, str. 631, 1986) pro stanovení účinných koncentrací produkujících 50% maximální odpovědi (IC₅o) pro testovanou sloučeninu v každé ze čtyř buněčných linií a pomocí srovnání těchto hodnot s hodnotami získanými pro doxorubicin.

Ředění testovaných sloučenin bylo provedeno v mediu specifickém pro buňky v následujícím rozsahu:

Buněčná linie	Sloučenina A	Doxorubicin
HL60	10-300 nM	1,25-100 nM
P388	0,1-5 μΜ	0,05-1,5 μΜ
MCF7	0,025-2 μΜ	0,025-2 μΜ
MDA-MB231	10-300 nM	1,8-240 nM

Připravená ředění byla přidána do jamek (trojmo) ve formě 50 μΐ alikvot a buňky byly kultivovány v přítomnosti testované sloučeniny po dobu 24 hodin.

Statistická analýza byla provedena za použití nepárového ttestu, pokud byl vhodný. Hladiny statistické významnosti byla stanovena na p < 0,05.

• · · · • · · ·

Výsledky: Ve všech čtyřech testovaných nádorových liniích vyvolávaly sloučenina A a doxorubicin inhibici vychytávání [³H]thymidinu závislou na koncentraci. Koncentrace způsobující 50% maximální inhibice (IC₅₀) byla získána z analýzy křivek.

Hodnoty IC₅₀ (v nM) jsou uvedeny dále a jsou uvedeny jako průměr (s 95% intervalem spolehlivosti v závorkách) ze 3 nebo 4 samostatných testů opakovaných třikrát.

Buněčná linie	Sloučenina A	Doxorubicin
HL60	127 (108-149)	58 (47-70)
P388	1980 (1830- 2140)	269 (242-299)
MCF7	72 (68-77)	17 (17-18)
MDA-MB231	182 (81-408)	43 (34-53)

Výsledky ukazují, že sloučenina A je méně účinná než doxorubicin v inhibici proliferace buněk ve všech čtyřech buněčných liniích in vitro. Nicméně, obě sloučeniny byly stejně účinné.

Výsledky testů in vitro ukazují, že jak sloučenina A, tak doxorubicin, zcela zabránily inkorporaci [³H] thymidinu do buněk v každé ze čtyř studovaných buněčných linií. Jak ukazuje poměr IC₅₀ hodnot (poměru účinnosti), byl doxorubicin o něco účinějši než sloučenina A v inhibici inkorporace [³H] thymidinu do buněk v každé ze čtyř studovaných buněčných linií (p < 0,05) . Viz obr. 3-6. Tyto studie ukazují, že jak sloučenina A, tak doxorubicin jsou účinnými inhibitory proliferace nádorových buněk in vitro. Obr. 8a-c jsou mikrofotografie ukazující působení sloučenin podle předkládaného vynálezu na srdeční tkáň ve srovnání s působením doxorubicin a kontrolním vzorkem.

• · · ·

Studie in vivo prokázaly, že sloučenina A je účinná v prodloužení přežití hh myším modelu leukemie s nižší toxicotou než doxorubicin, jak je uvedeno dále.

Efekty sloučeniny A na P388 leukémii u myší jsou popsány dále.

Samci CDF1 myší byly inokulováni i.p. 10⁶ buňkami P388 myší leukemie v den 0. V den 1 až 9 byly myši léčeny i.p. doxorubicinem nebo sloučeninou A. Denně byly měřeny tělesné hmotnosti a bylo zaznamenáváno přežívání. V jedné takové studii byl myším podán doxorubicin nebo sloučenina A v dávce 0,8 mg/kg/den. V den 22^/8 přežívajících jedinců ve skupině léčené vehikulem, 7/<řve skupině léčené doxorubicinem a 5/8 ve skupině léčené sloučeninou A. Hodnoty pro doxorubicin a sloučeninu A se statisticky významně lišily od hodnot pro vehikulum, ale ne od sebe navzájem.

V jiné studii na stejném myším modelu leukemie byl doxorubicin podán v dávce 0,8 mg/kg/den a sloučenina A byla podána v dávce 1,6, 2,4 nebo 3,2 mg/kg/den.

• · · ♦ • « *·· ·

Tabulka 3

Dávka (mg/kg/den)	Přírůstek tělesné hmotnosti, gramy, den 19	Přežívající jedinci
Den 25 Den 35
Vehikulum
0	8,69 ± 1,17	2/10	1/10
Doxorubicin
0,8	3,44 ± 1,34*	8/10*	1/10
Sloučenina A
1,6	3,32 ± 0,85*	8/10*	1/10
2,4	1,23 ± 0,46*⁺	8/10	0/10
3,2	-0,87 ± 0,53*⁺	9/10	8/l0*⁺

Výše uvedené hodnoty jsou průměrné hodnoty ± SE; * p > 0,05 versus vehikulum; ⁺ p > 0,05 versus doxorubicin.

V den 19 byla sloučenina A v dávce 1,6 mg/kg/den téměř stejně účinná jako doxorubicin v potlačení hmotnostího přírůstku, který je důsledkem růstu leukemie a s ní spojeného ascitu. Dávky 2,4 a 3,2 mg/kg/den sloučeniny A byly účinejší než doxorubicin v potlačení hmotnostího přírůstku. V den 25 byly všechny dávky sloučeniny A stejně účinné jako doxorubicin v přežívání zvířat. V den 32 byla pouze sloučenina A v dávce 3,2 mg/kg/den účinná v prodloužení přežití ve srovnání s vehikulem a doxorubičinem. Dávka doxorubicinu použitá v této studii byla maximální účinná dávka v tomto modelu. Vyšší dávky doxorubicinu snižují přežívání. Proto, ačkoliv je sloučenina A méně účinná než doxorubicin, je účinšjší při vyšších dávkách než doxorubicin v prodloužení přežívání.

• ·

V in vitro studii srdeční kontraktility bylo prokázáno, že sloučenina B, 13-deoxy-analog daunorubicinu, nemá kardiotoxické vlastnosti daunorubicinu, kdy v této studii byl použit králičí model srdce popsaný Mushlinem et al., výše. Toto je ilustrováno na obr. 7.

Také na krysím modelu in vivo , že sloučenina B nemá kardiotoxické vlastnosti daunorubicinu, jak je popsáno dále. Následující popis demonstruje chybění kardiotoxických účinků sloučeniny B podle předkládaného vynálezu u krys po intravenosním podání.

Hydrochloridová sůl daunorubicinu nebo hydrochloridová sůl sloučeniny B ve vodě byly injekčně podávány v dávce 5 mg/kg/den denně po dobu 3 dnů (celková dávka 15 mg/kg) samcům SpragueDawley krys. Pro každou sloučeninu byla studována zvláštní skupina, které bylo podáno vehikulum. V den 7 po první dávce byly krysy uvedeny do anestesie pentobarbitalem, 50 mg/kg i.p. Byla provedena intubace do trachey a byla zahájena ventilace 100% kyslíkem. Tělesná teplota byla udržována na 37 °C pomocí ohřívací lampy a teploměru. Do pravé karotidy byl umístěn katetr a byl posunut do aorty pro snímání průměrného arteriálního tlaku (MAP) a tepové frekvence (TF) za použití Statham tlakoměru a Gouldova snímače. Katetr byl potom posunut do levé komory pro snímání systolického tlaku v levé komoře (LVSP), maximálního dP/dt levé komory (dP/dt) a koncového diastolického tlaku v levé komoře (LVEDP).

U krys léčených daunorubicinem byly MAP, LVSP a dP/dt signifikantně a významně sníženy, ve srovnání s kontrolou, které bylo podáváno vehikulum (tabulka 4). Tělesná hmotnost byla také významně snížena u krys léčených daunorubicinem. Naopak, MAP, LVSP, dP/dt a tělesná hmotnost byly podobné ve »9 9 · · ·

9 999· » ··

9 · skupinách krys léčených vehikulem a sloučeninou B (tabulka 5). Data ukazují, že sloučenina B není kardiotoxická v dávkách, při kterých způsobuje daunorubicin významné snížení kontraktility a výkonosti myokardu. Výsledky ukazují, že sloučenina B může být podána v terapeutických dávkách bez vzniku kardiotoxicity, zatímco stejné terapeutické dávky daunorubicinu způsobují poruchu srdeční funkce.

Tabulka 4: Efekty daunorubicinu a vehikula na funkci levé komory u krys po opakovaných dávkách

Léčba	MAP mmHg	TF t/min	LVSP mmHg	dP/dt mmHg/s	LVEDP mmHg	THI	g	TH2	g
Vehiku- lum n=5	113 ± 9	353 ± 21	126 ± 7	5 850 ± 400	3,9 ± 0, 8	358 13	±	381 13	±
Dauno- rubicin n=4	54* ± 10	325 ± 6	71* ± 13	3000* ± 500	5,6 + 1,3	397 12	+	309* 3	±

Hodnoty uvedené v tabulce 4 jsou průměry ± standardní odchylky; krysám byla podávána sloučenina v dávce 5 mg/kg/den intravenosně po dobu 3 dnů; měření byla provedena v den 7 po první injekci. THI = tělesná hmotnost v den 0; TH2 = tělesná hmotnost v den 7. * = p < 0,05 vzhledem k vehikulu.

XX>

♦ · ·» * ·

• ·

99

9 9

Tabulka 5: Efekty sloučeniny B a vehikula na funkci levé komory u krys po opakovaných dávkách

Léčba	Krysa č.	MAP mmHg	TF t/min	LVSP mmHg	dP/dt mmHg/s	LVEDP mmHg	TH1 g	TH2 g
Vehiku- lum	1	125	350	145	5500	2, 81	380	389
	2	127	335	150	5250	7,50	378	372
Průměr ± SE		126 ± 1	343 ± 8	148 ± 3	5375 ± 125	5,20 ± 2	379 ± 1	381 ± 9
Sloučenina B	3	112	410	135	5000	3,13	388	383
	4	125	340	163	6850	7, 50	373	373
Průměr ± SE		119 ± 7	375 ± 35	149 ± 14	6175 ± 675	5, 30 + 2, 19	381 ± 8	378 ± 5

Krysám byla podávána sloučenina v dávce 5 mg/kg/den intravenosně po dobu 3 dnů; měření byla provedena v den 7 po první injekci. TH1 = tělesná hmotnost v den 0; TH2 = tělesná hmotnost v den 7.

Sloučenina A byla také testována na králičím modelu chronické toxicity doxorubicinu. V tomto modelu způsobuje doxorubicin narušení srdeční funkce a histopatologické změny podobné změnám pozorovaným u lidí, kteří byli chronicky léčeni doxorubicinem. Histopatologické a/nebo funkční narušení králičího srdce bylo pozorováno u 5/6 králíků léčených doxorubicinem. Za stejných podmínek nezpůsobovala sloučenina A klinicky významnou kardiotoxicitu.

·«·· *· ····

Nekardiotoxický charakter sloučenin podle předkládaného vynálezu je podporován výsledky následujícího pokusu, který hodnotil kardiotoxicitu sloučeniny A v doxorubicinu na králičím modelu chronického podávání.

V tomto pokusu bylo 24 samců bílých králíků New Zealand náhodně rozčleněno do čtyř skupin. Šesti králíkům bylo injekčně podáváno 1 mg/kg doxorubicinu do marginální ušní žíly 2-krát týdně po dobu 8 týdnů. Šesti dalším králíkům bylo injekčně podáváno 1 mg/kg sloučeniny A do marginální ušní žíly 2-krát týdně po dobu 8 týdnů. Denně byl sledován příjem potravy králíků ve skupině léčené doxorubicinem a sloučeninou A a stejné množství potravy bylo podáváno kontrolním králíkům odpovídajícího pohlaví a věku, kterým bylo podáváno 2-krát týdně po dobu 8 týdnů do marginální ušní žíly vehikulum (0,9% NaCl). Jednou týdně byl po dobu pokusu sledován dopplerovým ultrazvukem průtok při odstupu aorty. Snížení ejekční frakce bylo sledováno každý druhý týden echokardiografíčky v M-modu, od začátku desátého týdne studie do konce studie. Králíci byli utraceni na začátku 20. týdne od zahájení pokusu nebo tehdy, když klesla ejekční frakce na 25% nebo zůstávala mezi 25-29% po dobu alespoň 3 týdnů. Pro histopatologickou analýzu byly připraveny vzorky z levého komorového papilárního svalu, volné stěny levé komory a hrotu levé komory od každého usmrceného králíka a vyšetření těchto vzorků bylo provedeno histopatologem neznajícím typ léčby. Leze byly klasifikovány jako mírné, střední nebo těžké, podle stupně vakuolizace, degenerace myofibril, mononukleární infiltrace a nekrosy. Abnormální snížení ejekční frakce bylo pozorováno u 4/6, 0/6, 1/6 a 0/6 králíků ve skupině léčené doxorubicinem, sloučeninou A, kontrolní skupině pro doxorubícínovou skupinu a kontrolní skupině pro skupinu léčenou sloučeninou A, v příslušném pořadí. Abnormální průtok v oblasti odstupu aorty (hodnoty nižší než 9 <· ··«* *· 9999

9 9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 • · · · · · 9999 9 99 99

99

9 9 » • ♦ · ♦ • 9 9 9

9 9 9

99 m/s/s) byl pozorován u 3/6, 0/6, 0/6 a 0/6 králíků ve skupině léčené doxorubičinem, sloučeninou A, kontrolní skupině pro doxorubicinovou skupinu a kontrolní skupině pro skupinu léčenou sloučeninou A, v příslušném pořadí. Všech 6 králíků ve skupině léčené doxorubicinem mělo abnormální histopatologické nálezy v rozsahu od mírných až po těžké; 2/6 králíků ve skupině léčené sloučeninou A měly mírně abnormální histopatologické nálezy. Žádné histopatologické léze nebyly pozorovány v srdeční tkáni králíků z kontrolních skupin. Celkový kardiální status byl definován jako abnormální tehdy, když alespoň 2 ze 3 testů na kardiotoxicitu byly abnormání. Za použití těchto kriterií mělo celkem 5/6 králíků ve skupině léčené doxorubicinem abnormální kardiální status; 0/6 králíků v dalších 3 skupinách mělo abnormální kardiální status (p < 0,05, Fisherův exaktní test). Při testované dávce neměla sloučenina A ve srovnání s doxorubicinem prakticky žádnou kardiotoxicitu. Kromě toho neměla sloučenina A žádné významné účinky na hematologické parametry nebo na přírůstek tělesné hmotnosti, zatímco doxorubicin významně měnil hematologické parametry a snižoval přírůstek tělesné hmotnosti. Při použité dávce způsobovala sloučenina A menší kardiotoxicitu a systémovou toxicitu u králíků než doxorubicin.

Cílem provedeného pokusu bylo srovnání kardiotoxicity sloučeniny A a doxorubicinu na králičím modelu chronické léčby.

U 67% (4/6) králíků léčených doxorubicinem došlo k abnormálnímu snížení ejekční frakce levé komory. U třech ze šesti králíků léčených doxorubicinem (50%) došlo ke vzniku abnormálního průtoku při odstupu aorty. Naopak, u žádného z králíků léčených sloučeninou A nebyly pozorovány jakékoliv funkční známky kardiotoxicity. Nej citlivějším ukazatelem kardiotoxicity bylo histopatologické vyšetření. U všech králíků • A · • A A A

A A

AAAA A

A A AAAA ·· · • A ·

A A ·

A A A A • A AA

A A • A A

A A A

A A ·

A· léčených doxorubicinem vznikly histopatologické léze charakterizované primárně vakuolizací myocytů a ztrátou myofibril. U 4 ze 6 králíků byla pozorována mírná kardiotoxicita, 1 králík měl středně těžké léze a 1 králík měl těžké léze. Dva ze šesti králíků léčených sloučeninou A měli mírné histopatologické léze (viz obr. 8). Když byly výsledky všech tří testů na kardiotoxicitu posuzovány společně, byl abnormální kardiální status pozorován u 5 ze 6 králíků ve skupině léčené doxorubicinem, ale u 0 ze 6 králíků ve skupině léčené sloučeninou A (p < 0,02, Fisherův exaktní test). Celkový kardiální status byl definován jako abnormální tehdy, když byly alespoň dva ze 3 testů na kardiotoxicitu abnormální. Během 8 týdnů studie byly odebírány vzorky krve z marginální ušní arterie na vyšetření krevního obrazu. Ve skupině léčené doxorubicinem bylo pozorováno významné snížení počtu bílých krvinek, červených krvinek, krevních destiček, hemoglobinu, průměrné koncentrace hemoglobinu v erytrocytech a distribuce objemu erytrocytů, ve srovnání se zvířaty léčenými vehikulem nebo sloučeninou A, p > 0,05. Sloučenina A neměnila tyto hodnoty ve srovnání s vehikulem s výjimkou mírného zvýšení distribuce objemu erytrocytů. Kromě toho, léčba doxorubicinem inhibovala přírůstek tělesné hmotnosti ve srovnání s léčbou sloučeninou A. Králíci léčení sloučeninou A měli na začátku pokusu hmotnost 3,17 ± 0,10 kg a na konci pokusu 4,10 ± 0,10 kg, zatímco králíci léčení doxorubicinem měli na začátku pokusu hmotnost 3,19 ± 0,10 kg a na konci pokusu 3,54 ± 0,06 kg (p > 0,05, 1-cestná anova, Duncan's New Multiple Range Test).

Abnormální akcelerace v odstupu aorty je definována jako hodnota nižší než 9,0. Jednotky akcelerace jsou m/s/s. N = normální srdeční funkce; A = abnormální srdeční funkce.

• 9 · 9 9 >····« • 9 9··· >999

9999 9 ·· 99 «· ·

Králíkům byl injekčně i.v. podáván 1 mg/kg doxorubicinu (DOX) nebo sloučeniny A (DOXA) 2-krát týdně po dobu 8 týdnů (celková kumulativní dávka 16 mg/kg). Kontrolním skupinám pro doxorubicínovou skupinu (C) nebo skupinu sloučeniny A (CX) odpovídajícího věku, které byly krmeny stejným způsobem, bylo podáno pouze vehikulum.

Skupina, které byl podáván doxorubicin, se významně lišila od skupiny, které byla podávána sloučenina A nebo CX nebo C skupiny (p < 0,05; 2X2 možnosti, chí kvadrát statistika dobré shody, dvoucestná).

Králíkům byl injekčně i.v. podáván 1 mg/kg doxorubicinu (DOX) nebo sloučeniny A (DOXA) 2-krát týdně po dobu 8 týdnů (celková kumulativní dávka 16 mg/kg). Kontrolním skupinám pro doxorubicinovou skupinu (C) nebo skupinu sloučeniny A (CX) odpovídajícího věku, které byly krmeny stejným způsobem, bylo podáno pouze vehikulum.

N = normální srdeční funkce nebo histopatologie; A = abnormální srdeční funkce nebo histopatologie. Celkový srdeční statut byl definován jako abnormální, jestliže byly 2 ze 3 testů na kardiotoxicitu abnormální. Abnormální ejekční frakce byla definována jako tendence nebo přetrvávající hodnoty okolo 25% nebo nižší. Abnormální aortální akcelerace byla definována jako hodnoty nižší než 9,0. Abnormální histopatologický nález byl definován jako vakuolizace, myofibrilární léze a mononukleární infiltrace (viz výše). Histopatologické nálezy byly označovány jako normální, mírné, střední nebo těžké, jak bylo popsáno výše. Ve skupině léčené doxorubicinem mělo významně více zvířat abnormální celkový kardiální status než ve skupině léčené sloučeninou A a ve skupinách C a CX (p < 0,02, Fisherův exaktní test, dvoucestný).

9* ····

9*99

9 * • ·

9

9999 ·

9 9 • 9*

9 »4

9 9 ·

9*

99 • 9 9 9

9 9 9 • 9 9 9

9 9 9

9»

Tabulka 6

Hodnocení kardiotoxicity sloučeniny A u králíků

Proj ev kardiotoxicity	Incidence
doxorubicin₁	sloučenina A
snížení ejekční frakce	4/6	0/6
snížení akcelerace při odstupu aorty	3/6	0/6
abnormální histo- patologický nález₂	6/6	2/6
celková kardiotoxicita	5/6	0/6₃

_xDávka: 1 mg/kg, dvakrát za týden po dobu 8 týdnů;

₂ Abnormální histopatologický nález: vakuoly, myofibrilární léze;

₃ p < 0,02 versus doxorubicin.

Jedním ze závěrů ze studií kardiotoxicity bylo, že sloučenina A neměnila srdeční funkce při použité dávce a způsobila pouze mírné histopatologické změny u 2/6 králíků. Na druhou stranu, doxorubicin měnil srdeční funkce u 5/6 králíků a všichni králíci měli abnormální histopatologický nález v tomto králičím modelu chronické kardiotoxicity. Při testované dávce nemá sloučenina A ve srovnání s doxorubicinem v podstatě žádnou kardiotoxicitu. Kromě toho, sloučenina A nemá žádné významné účinky na hematologické parametry ani na přírůstek tělesné hmotnosti. Při použitém dávkování způsobuje sloučenina A menší kardiotoxicitu a menší systémovou toxicitu u králíků ve srovnání s doxorubicinem.

V testech na subakutní toxicitu sloučeniny A provedených na myších bylo také prokázáno, že sloučenina A je méně toxická pro kostní dřeň než doxorubicin, jak je uvedeno dále.

·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · ·· · · · · · ·· ··· ···· * · · · · ······ • · · · · β · · · · • · · · · · · · · · · · ·

Tabulka 7

Efekt sloučeniny A na erytrocyty a lymfocyty kostní dřeně u myší (n = 4-5) .

Proměnná	Vehikulum	Doxorubicin 12 mg/kg	Sloučenina A 15 mg/kg
Erytrocyty, 10^b/mm^J
Samci	9,45 ± 0,31	6,79 ± 0,63 ⁺ -‘	8,43 ± 0,39
Samice	9,22 ± 0,19	6,51 ± 0,35⁺'*	8,59 ± 0,41
Hematokrit, %
Samci	45,6 ± 1,90	32,2 ± 2,80⁺'*	41,1 ± 1,48
Samice	46,1 ± 1,01	31,1 ± 1,58'	43,5 ± 2,32
Kostní dřeň: procentuální podíl lymfocytů
Samci	22,2 ± 2,6	6,3 ± 0,36⁺	8,6 ± 2,41⁺
Samice	35,3 ± 6,00	8,5 + 0,50⁺	10,5 ± 2,06⁺

Léky byly podávány intravenosnš v 1., 5. a 9. dnu. Měření byla provedena v 15. dnu. Hodnoty jsou průměry ± SE. ⁺ = odlišný od vehikula, p < 0,05; * = odlišný od sloučeniny A, p < 0,05. Obě dávky jsou maximální subletální dávky.

Výsledky výše popsané studie jasně ukazují, že sloučenina A je nekardiotoxickou formou doxorubicinu. Protože sloučenina A obsahuje 14-OH skupinu, je pravděpodobné, že bude kromě leukémií použitelná pro léčbu sarkomů a karcinomů.

Nepředpokládá se, že by sloučenina A způsobovala kardiotoxicitu omezující dávku, protože netvoří toxický 13-alkoholový metabolit. Proto může být sloučenina A, na rozdíl od doxorubicinu, podávána tak dlouho, jak je nutné pro dosažení remise a/nebo pro prevenci recidivy a metastas. Z tohoto důvodu představuje sloučenina A a jiné 13-deoxyanthracykliny hlavní průlom v anthracyklinové chemoterapii nádorů.

Výsledky naznačují, že anthracyklinové deriváty jako je sloučenina A mohou být klinicky účinnější než jejich non-13deoxyanthracyklinové protějšky, protože mohou být podávány ve vyšších účinných dávkách a po delší časové období, neboř mají menší systémovou toxicitu a žádnou kumulativní kardiotoxicitu limitující dávku. 13-deoxyanthracyklinové deriváty použité ve způsobu podle předkládaného vynálezu pro léčbu pacientů s nádorovým onemocněním léčitelným doxorubicinem a daunorubicinem je možno podat v dávkách nejméně 1,5-násobných, než jsou účinné a ekvipotentní kumulativní dávky příbuzných 13-keto-sloučenin.

Předkládaný vynález také obsahuje vylepšený způsob přípravy 13-deoxyanthracyklinových derivátů. Tabulka 8 uvádí příklady 13-deoxyanthracyklinových derivátů, které mohou být syntetizovány způsobem podle předkládaného vynálezu. Jak bylo uvedeno výše, bylo prokázáno, že sloučeniny, jako jsou například sloučeniny uvedené v tabulce 8, mají protinádorové vlastnosti.

Oproti známým způsobům je způsob podle předkládaného vynálezu méně citlivý na teplotu. Například mohou být způsoby prováděny při teplotách od asi 0 °C do asi 75 °C. Výhodně jsou způsoby přípravy prováděny při teplotách od asi 65 °C do asi 75 °C. Lépe jsou způsoby přípravy prováděny při teplotách od asi 68 °C do asi 72 °C. Teploty vyšší než asi 72 °C obyčejně vedou k rozkladu reakčních činidel a produktů reakce.

Způsoby přípravy podle předkládaného vynálezu vyžaduje různé obecné podmínky. Například jsou způsoby přípravy • · · · · · ·· ···· · · • · · · · · · · • · · · · · · · · · · · ·······

JJ ···· · ·· ·· ·· provedeny v acidickém prostředí. Jinými slovy, pH by mělo být asi 6,5 nebo nižší. Bylo zjištěno, že ve známých způsobech přípravy výše uvedených sloučenin, které využívají alkalické podmínky v reakční směsi, mohou tyto alkalické podmínky vést k rozkladu reakčních činidel a produktů reakce. Reakce, nebo jakákoliv její část, jako je například zahřívání při teplotě zpětného toku, mohou být provedeny při teplotách až do asi 75 °C, za absence kyslíku, za absence vody a/nebo pod dusíkovou atmosférou.

Dále, z reakce by měly být vyloučeny jak kyslík,tak voda.

Výhodně je reakce provedena pod atmosférou dusíku nebo inertního plynu, za použití bezvodých rozpouštědel.

Způsoby podle předkládaného vynálezu vedou k mnohem vyššímu výtěžku, než známé způsoby pro přípravu takových sloučenin. Například, bylo zjištěno, že známé způsoby mají výtěžek asi 30%. Na druhé straně, způsoby podle předkládaného vynálezu mají výtěžek asi 70% až asi 80%.

V souladu se skutečnostmi uvedenými výše obsahuje předkládaný vynález způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I, jak byly popsány výše.

Následuje příklad změn molekuly během způsobu.

I • · · ·

Následující vývojový diagram ilustruje příklad způsobu podle předkládaného vynálezu pro přípravu 13-deoxydoxorubicinu, který je 13-deoxyanthracyklinovým derivátem.

·· ···· ·· ···· ·· ·

13-deoxyanthracyklin v pevném stavu

► ···· ·· · • · · · · * · · · • · · · · · • · · · · · ► · · · · ·

Dále jej ichž	jsou uvedeny příklady anthracyklinových derivátů, syntéza je zde popsána.
		Ri	0	r₃
		o		y	OH
Tabulka	8	R₂	0	OH	ORs

Rx	r₂	r₃	r₄	R_s	Analog of
H	OMe	OH	OH	íp NH₂		doxorubicin
H	OMe	OH	H	„p nh₂		daunorubicin
H	OH	OH	H	•íp nh₂		carminomycin
OH	OH	. H	H	' y £)». 47

·· A· > A A 1 > A A · » A A <

> A A I

H	OMe	OH	OH	nh₂	epirubicin
H	H	OH	H	10 NH2		idarubicin
H	H, bez o hneš' R₂ a . molekulou	OH	OH	S		annamycin

Ve sloučeninách může být R_s- modifikovanou versí různých anthracyklinových analogů. Dále, D kruh může být substituovaný fluorem.

Obecně obsahuje způsob podle předkládaného vynálezu přípravu roztoku 13-deoxyanthracyklinu s redukčním činidlem. Roztok se jemně zahřívá při teplotě zpětného toku. Potom může být reakční směs ochlazena. V jednom příkladu je reakční směs ochlazena na teplotu od asi 0 °C do asi 4 °C. Potom se do reakční směsi přidá baze. Baze může být chladná. Například může mít baze teplotu od asi 0 °C do asi 4 °C. Jedním příkladem baze je nasycený vodný roztok NaHCO₃. Do reakční směsi může být přidáno halogenuhlíkové rozpouštědlo. Halogenuhlíkové rozpouštědlo může být přidáno do reakční směsi současně s baží. Halogenuhlíkové rozpouštědlo může být chladné. Například může mít halogenuhlíkové rozpouštědlo teplotu od ·· ··*· 99 ···· ·· ··

9« 9 99 9 999

999 999 • 9 999 999 99

9 9999 999

99999 99 99 99 99 asi O °C do asi 4 °C. Příkladem halogenuhlíkového rozpouštědla může být CHC1₃. Reakční směs může být potom filtrována.

Filtrace může být také provedena při snížené teplotě. Například může být filtrace provedena při teplotě od asi 4 °C do asi 15 °C.

Přidání baze a halogenuhlíkového rozpouštědla, jak bylo popsané výše, zahájí srážení hydrolýzou. Vznikne sraženina anorganických solí, které mohou být odfiltrovány z reakční směsi. Po filtraci může být filtrát okyselen. Filtrát může být zpracován chromatografií na silikagelové koloně. Hydrofobní nečistoty mohou být izolovány elucí méně polárními rozpouštědly. Výsledný 13-deoxyanthracyklin může být potom eluován a eluat může být dále přečištěn.

Výhodně obsahuje způsob podle předkládaného vynálezu přípravu roztoku anthracyklin-13-tosylhydražonu v bezvodém methanolu s kyselinou p-toluensulfonovou a kyanborohydridem sodným. Roztok se jemně zahřívá při teplotě zpětného toku pod atmosférou dusíku a potom se ochladí. Přidá ..se nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanů sodného a chloroform. Vysrážené soli se odfiltrují a filtrát se okyselí chlorovodíkem v diethyletheru a potom se provede izolace na silikagelové koloně. Hydrofobní nečistoty vzniklé rozkladem se eluují směsí chloroformu a methanolu. Výsledné materiály, 13deoxyanthracykliny, se eluují methanolem. Methanolový eluat se dále přečistí preparativní HPLC.

Ve způsobech popsaných výše může být před nebo po izolaci 13-deoxyanthracyklinů provedena reakce těchto 13deoxyanthracyklinů s jedním nebo více redukčními a/nebo jinými činidly, která jsou schopná redukce 13-keto- skupiny na methylenovou skupinu.

·· ··♦· ·· ···· ·· ·· ·· · ·· · · · · · • 9 · · · · · 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99999 99 99 99 99

Dále je uveden příklad způsobu podle předkládaného vynálezu.

Příklad provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava 13-deoxydoxorubicinu, hydrochloridu g doxorubicin-13-tosylhydrazon hydrochloridu a 2,4 g kyseliny p-toluensulfonové se rozpustí v 50 ml bezvodého methanolu. Do tohoto roztoku se přidá 0,8 g kyanborohydridu sodného. Vzniklý roztok se zahřeje na 68-72 °C a jemně se refluxuje po dobu 1 hodiny pod atmosférou dusíku.

Potom se reakční směs koncentruje na asi 20 ml a ochladí se v chladničce na 0-4 °C. Přidají se 2 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a potom 200 ml chloroformu.

Přidá se bezvodý síran sodný a po protřepání se odfiltrují soli. Filtrát se okyselí chlorovodíkem v diethyletheru.

Roztok se potom vnese do silikagelové kolony (2,5 x 5 cm).

Kolona se promývá chloroformem/methanolem (10/1), dokud není eluat bezbarvý. Navázaná frakce obsahující cílový materiál se eluuje methanolem. Methanolový eluat se odpaří a zbytek se rozpustí ve 30% acetonitrilu v pufru tvořeném mravenčnanem amonným (pH = 4,0, 0,5%) a izolace se provede preparativní HPLC. Použije se fenylová kolona a separace cílového materiálu od jiných nečistot se provede za použití gradientu acetonitril/mravenčnan amonný gradientu (od 27% do 30% acetonitrilu po dobu 30 minut). Frakce přečištěná HPLC se lyofilizuje za zisku pevného 13-deoxydoxorubicin hydroformiatu, který se potom rozpustí v methanolu obsahujícím chlorovodík. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se vysráží v • 9 ···· *9

9 9 9

9 9 * • * 9 9 * · · · methanolu/ethyletheru za zisku 600 mg 13-deoxydoxorubicinu, hydrochloridu. Výtěžek je 80%.

TLC: R_f = 0,38	CHC1₃ :	: MeOH :	H₂O
	30	10	1 /r%°
U.V.: = 233, MS: 530 (Μ + H),	252, 293, 485	^nm 383 (Μ- K¹® / +H)

HNMR (methanol	d₄ ) :	viz	dále
δ 1,30	(d,	3H,	6'-H₃) ,
1,85	(m,	2H,	13 -H₂) ,
2,05	(m,	2H,	10-HJ ,
2,60	(d,	1H,	12-H),
3,05	(d,	1H,	12-H),
3,55	(m,	1H,	5'-H),
3,90	(m,	2H,	14-H₂) ,
4,05	(m,	3H,	O-CH3) ,
4,25	(m,	1H,	4'-H),
4,95	(m,	1H,	3' -H) ,
5,40	(m,	1H,	1'-H),
7,50	(dd,	1H,	3-H) ,
7,80	(m,	2H,	1-a :

Předkládaný vynález také obsahuje způsoby pro léčbu savců, kteří potřebují protinádorovou léčbu. Způsoby obsahují podání účiného protinádorového množství alespoň jedné sloučeniny vzorce I pacientovi.

« (i)

9999

99 9 «9 »9

99 · 9999 «9 9 9999

9« 9 999 99 9

9999 9999

9» 4 9 ·9 49

Účinné protinádorové množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu závisí na druhu savce, tělesné hmotnosti, věku a stavu jedince, stejně jako na způsobu podání. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být podány běžnými prostředky společně s jinými farmaceutickými činidly, stejně jako mohou být podány jako samostatná terapeutická činidla nebo v kombinaci s jinými terapeutickými činidly. Mohou být podány samostatně, ale obvykle jsou podány s farmaceutickým nosičem vybraným podle způsobu podání a běžnou farmaceutickou praxí.

Dávka samozřejmě závisí na mnoha známých faktorech, jako jsou farmakodynamické charakteristiky konkrétního činidla a forma a způsob podání; věk, zdravotní stav a hmotnost jedince; charakter a rozsah příznaků, typ konkomitantní léčby; frekvence léčby; a požadovaný efekt léčby. Denní dávka aktivního činidla může být v rozmezí od přibližně 0,001 do 1000 mg na kg tělesné hmotnosti, lépe od 0,1 do přibližně 30 mg/kg.

Dávkové formy (prostředky vhodné pro podání) obsahují od asi 1 mg do asi 100 mg aktivní složky na jednotku. V těchto farmaceutických prostředcích je obyčejně aktivní složka přítomná v množství asi 0,5 - 95% hmotnostních, vzhledem k celkové hmotnosti prostředku.

Aktivní složka může být podána orálně v pevných dávkových formách, jako jsou kapsle, tablety a prášky, nebo může být podána v kapalných dávkových formách, jako jsou elixíry, sirupy a suspenze. Může být také podána parenterálně, ve sterilních kapalných dávkových formách. Aktivní složka může být také podána intranasálně (v nosních kapkách) nebo inhalačně. Také jiné dávkové formy jsou potenciálně použitelné, jako je podání transdermální, za použití náplastí nebo mastí.

*· t··· • · » € · • β » · · · « · % « * » * « · « a β

a· · · · · *· · ···· »··« ·· *· ·· «>·

Želatinové kapsle obsahují aktivní složku a práškové nosiče, jako je laktosa, škrob, deriváty celulosy, stearan hořečnatý, kyselina stearová a podobně. Podobná ředidla mohou být použita pro výrobu stlačených tablet. Jak tablety, tak kapsle mohou být vyrobeny jako prostředky se zpomaleným uvolňováním, které umožňují kontinuální uvolňování aktivní složky během určitého časového období. Stlačené tablety mohou být potažené cukrem nebo potahem, který může maskovat nepříjemnou chuť a který může chránit tabletu před atmosferickými vlivy, nebo mohou být potažené enterálním potahem, který umožní selektivní rozpadání tablet v gastrointestinálním traktu.

Kapalné dávkové formy pro orální podáni mohou obsahovat barvíva a chuťová korigens pro zlepšení přijatelnosti těchto forem pro pacienta.

Pro parenterální roztoky jsou vhodnými nosiči voda, vhodné oleje, fyziologický roztok, vodný roztok dextrosy (glukosy) a vodné roztoky příbuzných cukrů a glykolů jako je propylenglykol nebo polyethylenglykoly. Roztoky pro parenterální podání výhodně obsahují soli aktivní složky rozpustné ve vodě, vhodná stabilizační činidla a pokud je to vhodné, tak pufry. Vhodnými stabilizačními činidly jsou antioxidační činidla jako je hydrogensiřičitan sodný, siřičitan sodný nebo kyselina askorbová, buď samostatně, nebo v kombinaci. Také je možno použít kyselinu citrónovou a její soli a sodnou sůl EDTA.

Dále, dávkové formy pro intravenosní nebo i.p. podání zahrnují lyofilizovaný prášek pro rekonstituci sterilní vodou nebo sterilním fyziologickým roztokem pro injekce. Tyto roztoky mohou obsahovat konzervační činidla, jako je benzalkoniumchlorid, methyl- nebo propylparaben a chlorbutanol.

• · · · · ·

Vhodné farmaceutické nosiče jsou popsány v Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, což je standardní učebnice v tomto oboru.

Claims

1. Použití kompozice obsahující, jako účinnou složku, alespoň jednu sloučeninu vzorce (I) kde Ri je H nebo OH; R2 je H, OH nebo OMe; R3 je H nebo OH; R₄je H nebo OH; a R5 je uhlovodík nebo substituovaný uhlovodík, pro přípravu léčiva pro léčení rakoviny.

2. Použití podle nároku 1, kde sloučeninou je 13deoxydaunorubicin.

3. Použití podle nároku 1, kde sloučenina má vzorec:

h₃c

HO ·· ·· ·· ·· • · · · • · φ • · · • · · ·· ···· • ·· • · · * • · · · ·· ··

4. Způsob přípravy 13-deoxyant-hracyklinových derivátů, vyznačující s e t í m, že obsahuje stupně:

- přípravu roztoku anthracyklin-13-tosylhydrazonu;

- přidání redukčního činidla pro redukci 13-keto- skupiny na methylenovou skupinu;

- zahřívání roztoku při teplotě zpětného toku;

- ochlazení reakční směsi;

- přidání nasyceného vodného roztoku NaHCCh;

- přidání halogenuhlíkového rozpouštědla do reakční směsi;

- filtraci reakční směsi;

- okyselení filtrátu; a

- zpracování filtrátu chromatografií pro izolaci

13-deoxyanthracyklinových derivátů.

5. Způsob přípravy 13-deoxyanthracyklinových derivátů, vyznačující se tím, že obsahuje stupně: -přípravu roztoku anthracyklin-13-tosylhydrazonu v bezvodém methanolu s kyselinou p-toluensulfonovou a kyanborohydridem sodným;

- jemné zahřívání roztoku při teplotě zpětného toku pod atmosférou dusíku;

- ochlazení roztoku;

- přidání nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a chloroformu do roztoku za vzniku sraženiny;

- filtraci sraženiny;

- okyselení filtrátu chlorovodíkem v diethyletheru;

- izolaci solí obsažených ve filtrátu za použití silikagelové kolony;

- eluci hydrofobních nečistot vzniklých rozkladem solí za použití směsi chloroformu a methanolu;

- eluci 13-deoxyanthracyklinového výsledného materiálu methanolem; a

- další přečištění methanolového eluatu preparativní HPLC.

• · «· ····

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedený roztok má pH 6,5 nebo nižší.

7. Způsob podle nároku'5, vyznačující se tím, že uvedené zahřívání při teplotě zpětného toku je provedeno při teplotě od asi 68 °C do asi 72 °C.

8. Způsob podle nároku 5, vyznačuj že uvedené zahřívání při teplotě zpětného při teplotě od asi 65 °C do asi 75 °C.

ící se tím, toku je provedeno

9. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedené zahřívání při teplotě zpětného toku je provedeno při teplotě do asi 75 °C.

10. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedené zahřívání při teplotě zpětného toku je provedeno za nepřítomnosti kyslíku.

11. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedené zahřívání při teplotě zpětného toku je provedeno za nepřítomnosti vody.

12. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedené zahřívání při teplotě zpětného toku je provedeno v atmosféře dusíku.

13. Způsob podle nároku 5, vyznačuj ící se tím, že uvedené zahřívání při teplotě zpětného toku je provedeno v atmosféře inertního plynu.

14. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že jeho výtěžnost je od asi 70% do asi 80%.

15. Způsob přípravy 13-deoxyanthracyklinových derivátů, vyznačující se tím, že obsahuje stupně:

- přípravu roztoku anthracyklin-13-tosylhydrazonu;

♦ · 44 • 4 4 4 • 4 4 4 • » 4 4

4 4 4 4 ·* 44

- přidání redukčního činidla;

- zahřívání roztoku při teplotě zpětného toku;

- ochlazení reakční směsi;

- “přidání nasyceného vodného roztoku NáHCC>3;

- přidání halogenuhlíkového rozpouštědla do reakční směsi;

- filtraci reakční směsi;

- okyselení filtrátu; a

- zpracování filtrátu chromatografií pro izolaci

13-deoxyanthracyklinových derivátů.

16. Způsob přípravy 13-deoxyanthracyklinových derivátů, vyznačující se tím, že obsahuje stupně:

- přípravu roztoku rozpuštěním 1 g doxorubicin-13tosylhydrazonu hydrochloridové soli, a asi 2,4 g kyseliny ptoluensulfonové v asi 50 ml bezvodého methanolu;

- přidání asi 0,8 g kyanborohydridu sodného do roztoku;

- zahřátí roztoku na teplotu od asi 68 °C do asi 72 °C;

- jemné zahřívání roztoku při teplotě zpětného toku po dobu asi 1 hodiny pod atmosférou dusíku;

- koncentrování reakční směsi na asi 20 ml;

- ochlazení reakční směsi v chladničce na teplotu od asi 0 °C do asi 4 °C;

- přidání asi 2 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného do reakční směsi;

- přidání asi 200 ml chloroformu do reakční směsi;

- přidání bezvodého síranu sodného;

- po protřepání odfiltrování solí vzniklých v důsledku přidání bezvodého síranu sodného;

- okyselení filtrátu chlorovodíkem v diethyletheru;

- průtok roztoku silikagelovou kolonou;

- další promývání kolony chloroformem/methanolem do získání bezbarvého eluatu;

- eluci frakce obsahující cílový materiál methanolem;

- odpaření methanolového eluatu;

- rozpuštění zbytku vzniklého po odpaření ve 30% acetonitrilu v pufru tvořeném mravenčnanem amonným;

φφ ·· • · · • · • · · ♦ ·

99 ΦΦ

9 · Φ Φ ♦ Φ ΦΦ

- izolaci cílového materiálu preparativní HPLC za použití fenylové kolony;

- separaci cílového materiálu od jiných nečistot za použití gradientu acetonitril/mravenčnan amonný; a

- lyofilizaci frakce přečištěné HPLC za zisku asi 600 mg 13deoxydoxorubicinu hydrochloridové soli.

7/ ipw1/10

Reduktasa v srdci

Doxorubicin------------->Doxorubicinol-----> inhibice regulačního proteinu 1 pro železo (IRP-1) produkce volných radikálů

Φ poškození buněk

Φ kardiotoxicita Ť ochrana proti

Dexrazon ---> chránění ----> kardiotoxicitě doxorubicinu (Zinecard) před inhibici IRP1 použitý pro redukci kardiotoxicity doxorubicinu

Nežádoucí účinky Zinecardu jsou následující:

- snížená účinnost protinádorové terapie;

- toxicita pro kostní dřeň;

- riziko akutní myeloidní leukemie;

- chromosomální poškození;

- fetální malformace; a

- bolest při injekci.