CZ20003178A3

CZ20003178A3 - Deriváty 5-imino-13-deoxyanthracyklinu, jejich použití a způsob přípravy

Info

Publication number: CZ20003178A3
Application number: CZ20003178A
Authority: CZ
Inventors: Xini Zhang; Richard D. Olson
Original assignee: Gem Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 1998-03-03
Filing date: 1999-03-03
Publication date: 2001-02-14
Also published as: CA2322424A1; ID28174A; DE69917440D1; KR100456088B1; ATE267206T1; KR20010034550A; AU767348B2; CZ301493B6; AU2982099A; ES2222692T3; HUP0102518A2; SI1064294T1; HUP0102518A3; WO1999045015A1; NZ507300A; JP4615712B2; BR9908387A; JP2002518293A; US5942605A; CN1154652C

Description

DERIVÁTY 5-IMINO-13-DEOXYANTHRACYKLINU, JEJICH POUŽITÍ A ZPŮSOB

PŘÍPRAVY

Vynález se týká derivátů 5-imino-13-deoxyanthracyklinu, léčebného využití 5-imino13-deoxyanthracyklinu a způsobů přípravy derivátů 5-imino-13-deoxyanthracyklinu.

Dosavadní stav techniky

Nej známější anthracy klínová léčiva proti rakovině jsou doxorubicin a daunorubicin, které obsahují 13-keto a 5-keto skupinu. Doxorubicin, publikovaný v patentu US číslo 3,590,028, má široké spektrum použitelnosti jako protirakovinný prostředek a je používán při léčbě leukémií, lymfomů a solidních nádorů. Daunorubicin, publikovaný v patentu US číslo 3,616,242, je účinný při léčbě akutních leukémií. Nicméně použitelnost těchto léčiv je omezena závažnými vedlejšími účinky, tj. kardiotoxicitou, tak, že celkové množství léčiva, které může být podáno pacientovi, nesmí přesáhnout 550 mg/M (E.A. Lefrak et al., Cancer, 32:302, 1973). I při doporučené maximální celkové kumulativní dávce nebo v její blízkosti (430 až 650 mg/M²) se u 60 % pacientů vyskytují závažné a přetrvávající srdeční dysfunkce a u 14 % pacientů se vyskytuje městnavé srdeční selhání (A. Dresdale et al., Cancer, 52:51, 1983). I když jsou tedy tato léčiva účinná k inhibování růstu rakovinných nádorů, mohou pacienti v důsledku vedlejších kardiotoxických účinků léčiv zemřít na městnavé srdeční selhání.

Někteří výzkumní pracovníci se domnívají, že kardiotoxicita je výsledkem tvoření volných radikálů chinonovou částí molekuly anthracy klinu (J. Dorowshow et al., J. Clin. Invest., 68:1053, 1981; D.V. Uverferth et al., Cancer Treat. Rev., 9:149, 1982; J. Goodman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 77:797, 1977; J.L. Zweier, J. Biol. Chem., 259:6056, 1984). Naproti tomu existuje dobrý důkaz o tom, že tvoření volných radikálů nemůže být jediným mechanismem způsobujícím kardiotoxicitu, protože léčiva i za přítomnosti akceptoru volných radikálů stále poškozují srdce (J.F. VanVleet et al., Am. J. Pathol., 99:13, 1980; D.V. Unverferth et al., Am. J. Cardiol., 56:157, 1985; C. Myers et al., Seminars in Oncology, 10:53, 1983; R.H.M. Julicher et al., J. Pharm. Pharmacol., 38:277, 1986; E.A. Porta et al., Res. Comm. Chem. Pathol Pharmacol., 41:125, 1983).

tf. · • · ··

Bylo také zjištěno, že inhibice tvoření volných radikálů neodstraní kardiotoxicitu těchto anthracyklinů (P.S. Mushlin et al., Fed. Proč., 45:809, 1986). Místo toho tento výzkum ukazuje, že kardiotoxicita doxorubicinu a daunorubicinu, projevující se redukcí kontraktility myokardu, je také závislá na metabolické redukci 13-keto části na 13-dihydro metabolit. V testovacích systémech, kde doxorubicin není výrazně metabolizován na 13-dihydro metabolit, byly zjištěny kardiotoxické účinky pouze při vysokých koncentracích (200 - 400 mikrogramů/ml) (P.S. Mushlin et al., Fed. Proč., 44:1274, 1985; R.D. Olson et al., Fed. Proč., 45:809, 1986). Na rozdíl od 13-dihydro metabolitů mají doxorubicinol a daunorubicinol kardiotoxické účinky ve stejných testovacích systémech při relativně nízkých koncentracích (1 - 2 mikrogramů/ml, R.D. Olson et al., Proceed. Am. Assoc. Cancer Res.., 26:227, 1985; R.D. Olson et al., Proceed. Am. Assoc. Cancer Res., 28:441, 1987).

Je-li doxorubicinu umožněno setrvávat v testovacích systémech i jen po krátkou dobu, dojde k určité metabolické konverzi a 13-dihydro metabolit vzniká v dostatečném množství k tomu, aby se projevila kardiotoxicita (L. Rossini et al., Arch. Toxicol. suppl., 9:474,1986; M. Del Tocca et al., Pharmacol. Res. Commun., 17:1073, 1985). Tak byly nahromaděny podstatné důkazy o tom, že kardiotoxicita léčiv jako např. doxorubicinu a daunorubicinu vzniká ze silných kardiotoxických účinků vyvolávaných jejich 13-dihydro metabolity (P. Mushlin et al., Rational Drug Therapy, 22:1, 1988; S. Kuyper et al., FASEP Journal, 2:A1133, 1988; R. Bouček et al., J. Biol. Chem., 262:15851, 1987; a R. Olson et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 85:3585, 1988).

Předložený vynález využívá skutečnost, že 13-deoxy formy doxorubicinu, daunorubicinu nebo jiných podobných anthracyklinů nebudou metabolicky přeměněny na kardiotoxické 13-dihydro formy, a že 5-keto skupina je modifikována na formu, která bude méně ochotně vytvářet radikály, čímž poskytuje možnost aplikování sloučenin předloženého vynálezu v nekardiotoxických množstvích bez omezení celkové kumulativní dávky.

Podstata vynálezu

Předložený vynález je zaměřen na poskytnutí nových derivátů 5-imino-13deoxyanthracyklinů, které mají méně vedlejších účinků.

• ·

I ι ··

V souladu s předmětem předloženého vynálezu je záměr poskytnout způsob přípravy derivátů 5-imino-13-deoxyanthracyklinu.

Podle těchto a dalších předmětů a zvýhodnění poskytují výhodné aspekty předloženého vynálezu způsob přípravy derivátů 5-imino-13-deoxyanthracyklinu.

Obecně jsou anthracykliny vzorce I,

kde substituenty Ri, R2 a R3 jsou H, OH nebo OCH3 a substituent R⁴ je cukerná část jiná než morfolinylem substituovaná cukerná část, snadno konvertovány známými způsoby na 13tosylhydrazony.

13-Tosylhydrazony anthracyklinu se redukují na deriváty 13-deoxyanthracyklinu kyanohydroboritanem sodným za kyselých podmínek. Samozřejmě, že morfolinyl zahrnuje i substituované morfolinylové části. Produkty se pak čistí preparativní chromatografií bez extrakce. Purifikované deriváty 13-deoxyanthracyklinu se konvertují na N-Boc deriváty, a pak nechají reagovat s NH3 k vytvoření N-Boc-5-imino-13-deoxyanthracyklinů. Odstraněním N-Boc za kyselých podmínek vzniknou deriváty 5-imino-13-deoxyanthracyklinu. Bylo zjištěno, že postupy mají výtěžky od asi 50% do asi 60%.

Další výhodné aspekty předloženého vynálezu poskytují způsob přípravy derivátů 5imino-13-deoxydeoxyanhtracyklinu. Postup zahrnuje formování kyselého roztoku 13tosylhydrazonu anthracyklinu pomocí kyanohydroboritanu. Roztok se jemně refluxuje. Reakční směs se zchladí. Do roztoku se přidá malé množství vodý, a poté halogenované uhlovodíkové rozpouštědlo. Směs se filtruje. Filtrát se podrobí preparativní chromatografií k izolování derivátů 13-deoxyanthracyklinu. Na purifikované deriváty se zavede chránící skupina tert-butoxykarbonylu k vytvoření 3 '-N-Boc derivátů, které se pak nechají reagovat s amoniakem k vytvoření 3'-N-Boc-5-imino-13-deoxyanthracyklinů. Sejmutím skupiny

99 » · · 4 ) 9 9 4 t 9 9 4 » 9 9 4

9 9 9 chránící amino skupinu za kyselých podmínek vzniknou 5-imino-13-deoxyanthracykliny, které se pak čistí chromatografii.

Další výhodné aspekty předloženého vynálezu poskytují způsob přípravy derivátů 5imino-13-deoxyanthracyklinu. Postup zahrnuje formování roztoku rozpuštění asi 1 g 13tosylhydrazonhydrochloridu doxorubicinu a asi 2,4 g kyseliny p-toluensulfonové kyseliny v asi 50 ml bezvodého methanolu. Do roztoku se přidá asi 0,8 g kyanohydroboritanu sodného.

Roztok se zahřívá při teplotě od asi 68°C do asi 72°C, pak se jemně refluxuje po dobu asi jedné hodiny pod atmosférou dusíku.

Reakční směs se koncentruje na asi 20 ml, pak ochladí v mrazicím boxu na teplotu od asi 0°C do asi 4°C.

Do reakční směsi se přidá asi 0,5 ml vody, asi 200 ml chloroformu a bezvodý síran sodný. Vzniklé soli se odfiltrují.

Filtrát se nechá projet sloupcem silikagelu. Sloupec se dále promývá chloroform/methanolem dokud není eluát bezbarvý.

Frakce obsahující produkt se eluuje methanolem. Methanolový eluát se odpařuje a výsledný zbytek se rozpustí ve 30% acetonitrilu v pufru mravenčanu amonného.

Produkt se izoluje preparativní HPLC s použitím fenylového sloupce a separuje od dalších nečistot pomocí gradientu acetonitril/mravenčanu amonného. Frakce purifikované HPLC se pak zředí přibližně stejným objemem vody jako nashromážděné frakce a tento roztok se nechá projet preparativní HPLC s použitím fenylového sloupce. Produkt se eluuje methanolem. Methanolový eluát se koncentruje a stejný produkt se precipituje přidáním ethyletheru. Tuhý produkt se izoluje filtrací k získání asi 600 mg 13-deoxydoxorubicinu.

Asi 600 mg purifíkovaného 13-deoxydoxorubicinu se rozpustí v asi 60 ml methylenchloridu a asi 10 ml vody a nechá reagovat s asi 180 mg hydrouhličitanu draselného a asi 180 mg di-tert-butyldikarbonátu při pokojové teplotě po dobu asi 2 hodin. Organický roztok se separuje, promyje vodou a suší bezvodým síranem sodným. Roztok se odpařuje do

JWWWMWMWMIWI • 9 9 · 9 · * · · *' · · 9 • 99 · 9 9 9 ♦ »9 ♦ • 9 99 99 ·99«

9 99 99 999 99 9 • 9 9 9999 9999

999 99 99 99 99 sucha. Zbytek se rozpustí v asi 100 ml bezvodého methanolu. Roztok se udržuje nasyceným pomocí amoniaku při teplotě od 0°C do asi 4°C po dobu 48 hodin. Rozpouštědlo a amoniak se odstraní ve vakuu k získání 3'-N-Boc-5-imino-13-deoxydoxorubicinu. Výše obdržený 3'-NBoc-5-imino-13-deoxydoxorubicin se nechá reagovat s asi 60 ml bezvodého methanolu obsahujícího asi 0,1 M chlorovodíku při pokojové teplotě po dobu asi 2 hodin k odstranění 3 N-Boc skupiny. Výsledný roztok se koncentruje na asi 5 ml.

Koncentrovaný roztok se izoluje preparativní HPLC s použitím fenylového sloupce. Produkt se separuje od dalších nečistot použitím gradientu acetonitril/mravenčanu amonného. Frakce purifikované HPLC se zředí přibližně stejným objemem vody, vstřiknou na fenylový sloupec preparativní HPLC a proplachují vodou k odstranění solí. Produkt se pak eluuje methanolem.

Methanolový eluát se okyselí asi 0,5 ml chlorovodíku v ethyletheru. Roztok se pak koncentruje na asi 5 ml. K precipitování produktu se přidá 10 ml ethyletheru. Precipitát se filtruje k získání asi 360 mg 5-imino-13-deoxydoxorubicinhydrochloridu.

Předložený vynález také poskytuje sloučeniny mající následující vzorec:

kde substituenty Ri, R2 a R3 jsou H, OH nebo OMe a substituent R4 je cukerná část jiná než morfolinylem substituovaná cukerná část. Samozřejmě, že morfolinyl zahrnuje i substituované morfolinylové části. Sloučeniny, které obsahují morfolinylem substituované cukerné části vykazují významně zvýšenou toxicitu.

Dále předložený vynález poskytuje farmaceutický přípravek obsahující alespoň jeden derivát 5-imino-13-deoxyanthracyklinu.

• fcfcfc fc · » · · · · ·· • · · * fcfc · ♦ * · · « fc fc · · · fcfcfcfc • · · fcfcfc· fcfcfcfc

-- fcfc fcfcfc ·· fc· fcfc fcfc

O

Dále ještě předložený vynález poskytuje způsob léčby rakoviny, včetně leukémií, lymfomů a pevných nádorů, zahrnující krok aplikování účinného množství alespoň jednoho derivátu 5-imino-13-deoxyanthracyklinu.

Z následujícího popisu budou odborné veřejnosti patrné ještě další předměty a zvýhodnění předloženého vynálezu. Podrobný popis vynálezu ukazuje a popisuje pouze výhodná provedení vynálezu tak, aby ilustroval nejlepší zamýšlený způsob pro provedení vynálezu. Odborné veřejnosti je zřejmé, že vynález zahrnuje další a různá provedení. Detaily vynálezu mohou být modifikovány z různých hledisek bez odchýlení se od vynálezu. Obdobně na výkresy a na popis je třeba pohlížet jako na ilustraci podstaty vynálezu a nikoliv jako omezení.

Podrobný popis vynálezu

Předložený vynález poskytuje deriváty 5-imino-13-deoxyanthracyklinu, jejich použití a způsob přípravy derivátů 5-imino-13-deoxyanthracyklinu. Obr. 3 uvádí příklady derivátů 5imino-13-deoxyanthracyklinu, které mohou být syntetizovány podle předloženého vynálezu. Jak již bylo uvedeno výše, je známo, že sloučeniny jako např. na obr. 3 mají protinádorové vlastnosti a také méně vedlejších účinků.

Postupy podle předloženého vynálezu mohou být prováděny při teplotě od asi 0 °C do asi 75 °C. Výhodně jsou postupy prováděny při teplotě od asi 65 °C do asi 75 °C. Výhodněji se mohou postupy provádět při teplotě od asi 68 °C do asi 72 °C. Teploty přesahující asi 72 °C vedou obvykle k rozložení reaktantů a produktů.

Postup podle předloženého vynálezu zahrnuje množství obecných podmínek. Například redukční reakce se výhodně provádí za kyselých podmínek. Jinými slovy hodnota pH by měla být asi 7,0 nebo menší. Bylo zjištěno, že známé postupy přípravy výše uvedených sloučenin, které používají bazické podmínky v rámci reakční směsi, způsobují rozklad reaktantů a produktů.

Navíc by měl být z redukční reakce vyloučen jak kyslík, tak i voda. Výhodně se reakce provádí v atmosféře dusíku nebo inertního plynu s použitím bezvodých rozpouštědel.

• · · · · • · · • 4	• ♦ «4 • 4 4 4 • 4 44	«4 44 • · 4 ♦ 4 4 4 «


• · · 4 4	4 4 4 4	4 · 4 4

Dále by se aminace měla provádět při teplotě 0 - 4°C. Vyšší teploty by mohly způsobit rozklad reaktantů a produktů.

Dále by se z aminace měla vyloučit voda. Výhodně se reakce provádí v bezvodých rozpouštědlech.

Dále by se také z hydrolýzy měla vyloučit voda. Výhodně se reakce provádí v bezvodých rozpouštědlech.

Následující popis poskytuje příklad transformace molekuly a její vývoj během postupu.

nh₂ i

HÓ ]Boc

• · · 4 4 4 4 44

4 9 4 4 4

4 4994 •4 4 4 4 4 ·· 444 44 4»

Následující blokové schéma ilustruje příklad provedení způsobu podle předloženého vynálezu pro přípravu 5-imino-13-deoxydoxorubicinu, což je derivát 13-deoxyanthracyklinu.

BBSSSSSSS^ ·· »« * · <

> · · « redukce reakční směsi • jemný reflux • ochlazení na teplotu 0°C přidání vody • pndání CHjCI • přidání Na₂SO₄ • filtrace

frakce čistého 13-deoxyanthracyklinu • pndání vody • roztok se projede HPLC s použitím fenylového sloupce • eluování s vodou (odstranění) • eluování s MeOH • koncentrování roztoku MeOH

tuhé 13-deoxyanthracykliny
	• rozpuštění v CH₂CI₂a H₂O • pndání KHCOj a Boc₂O ’ míchání při pokojové teplotě po dobu 2 hodin • separování vrstvy CH₂CI₂ • promytí roztoku CH₂CI₂ vodou • sušení roztoku CH₂CI₂ na Na₂SO₄ • odstranění rozpouštědla
3 -N’-Boc-13-deoxyanthracykliny	-
	• rozpuštění v MeOH • ochlazení roztoku na teplotu 0°- 4°C • nasycený roztok s NH₃po dobu asi 24 hodin

•4 44 · 4 4 4 4 • · · 4 4 4 4

4 4 4 44 • 4 4 4 4 4 4

444 44 44

44 » · 4 <

► 4 4 I

Následující popis znázorňuje příklady derivátů anthracyklinu jejichž syntéza je zde popsána.

Ri	r₂	r₃		Analog
OMe	OH	OH	NHž	doxorubicinu

«0 00 • 0 0 · · 00

0 0 0

R_x		r₃		Analog
OMe	OH	H	jp NHj	daunorubicinu
OH	OH	H	.fp nh₂	karminomycinu
OMe	OH	OH	p NHj	epirubicinu
H	OH	H		idarubicinu
H	OH	OH	„n	annamycinu

Ve sloučeninách může být Substituent R* modifikovanou verzí různých analog anthracyklinu. Také kruh D může být substituován halogenem nebo hydroxylovou skupinou. Například kruh D by mohl být substituován fluorem, jodem nebo jakýmkoliv jiným halogenem.

Obecně postup podle předloženého vynálezu zahrnuje formování kyselého roztoku 5imino-13-deoxyanthracyklinu. Roztok se jemně refluxuje. Pak se může reakční směs ochladit. Podle jednoho příkladu se reakční směs ochladí na teplotu od asi 0°C do asi 4°C. Pak se může přidat malé množství vody k hydrolyzování produktu. Halogenované uhlovodíkové rozpouštědlo může být studené a může se přidat do reakční směsi. Například může být halogenované uhlovodíkové rozpouštědlo při teplotě od asi 0°C do asi 4°C. Příklad halogenovaného uhlovodíkového rozpouštědla, které může být používáno je chloroform. Po ·· ··

9 9 9 ·

9 99 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9

99

9 * • · · • · · ♦ · · přidání bezvodého síranu sodného se pak reakční směs filtruje. Filtrace se může také provádět za snížené teploty. Například filtrace se může provádět za teploty od asi 4°C do asi 15°C.

Výše uvedené přidání vody spíše iniciuje hydrolýzu. Přebytek vody může být odstraněn přidáním bezvodého síranu sodného. Výhodně se pak anorganické soli odfiltrují z reakční směsi. Filtrát se pak podrobí chromatografii na sloupci silikagelu. Hydrofóbní nečistoty se pak izolují eluováním méně polárními rozpouštědly. Produkty 13deoxyanthracylinu se pak mohou eluovat a eluát dále čistit.

Purifikované deriváty 13-deoxyanthracyklinu mohou být rozpuštěny v roztoku methylenchloridu a vody obsahujícím bázi a di-tert-butyldikarbonát. Roztok se může míchat při asi pokojové teplotě po dobu 2 hodin. Organický roztok se může izolovat a promýt vodou, poté se odstraní rozpouštědlo a zbytek se rozpustí v alkoholovém rozpouštědle. Alkoholový roz{;o/< se může sytit amoniakem při teplotě asi 0°C do asi 4°C po dobu 24 hodin. Rozpouštědlo se odstraní a suchý zbytek se nechá reagovat s kyselým alkoholovým rozpouštědlem při pokojové teplotě po dobu asi 2 hodin. Výsledný roztok se koncentruje a podrobí dalšímu čištění, pak okyselí a precipituje v etheru k získání hydrochloridové soli 5imino-13 -deoxyanthracyklinu.

Výhodně zahrnuje postup podle předloženého vynálezu formování roztoku 13tosylhydrazonů anthracyklinu v bezvodém methanolu s p-toluensulfonovou kyselinou a kyanoborohydridem sodným. Roztok se jemně refluxuje pod atmosférou dusíku a pak zchladí. Přidá se voda a poté chloroform. Precipitované soli se filtrují a filtrát se izoluje na sloupci silikagelu. Hydrofóbní nečistoty vzniklé z rozkladu se eluují roztokem chloroformu a methanolu. Produkty, 13-deoxyanthracykliny, se eluují methanolem. Methanolový eluát se dále čistí preparativní HPLC.

Purifikované 13-deoxyanthracykliny se rozpustí ve směsi methylenchloridu a vody a nechají reagovat s hydrouhličitanem draselným a di-tert-butyldikarbonátem. Roztok se míchá při pokojové teplotě po dobu 2 hodin. Organická vrstva se izoluje, promyje vodou a suší na bezvodém síranu sodném. Rozpouštědlo se pak odstraní ve vakuu. Zbytek se rozpustí v bezvodém methanolu a udržuje nasyceným pomocí amoniaku při teplotě od asi 0°C do 4°C po dobu 48 hodin. Methanol a amoniak se odstraní z reakčního produktu, který se pak nechá reagovat se zředěnou kyselinou v alkoholu při asi pokojové teplotě po dobu 2 hodin k získání • ΦΦΦ · φφ φφ φφ ·· • · · φ φ « φ · ♦ · φ • φ φφφφ «φφφ φ φ φφ φφ φφφ φφ · «φ φ «φφφ « · · φ φ« φφφ φφ φφ *♦ ««

5-imino-13-deoxyanthracyklinu. Tato sloučenina, v roztoku, se koncentruje, a poté čistí preparativní HPLC k odstranění nečistot a solí. Produkt se eluuje methanolem, okyselí a precipituje k získání hydrochloridové soli 5-imino-13-deoxyanthracyklinu.

Následující popis poskytuje příklad postupu podle předloženého vynálezu.

Příklad provedení vynálezu

Příprava 5 -imino-13 -deoxydoxorubicinhydrochloridu

Asi 1 g 13-tosylhydrazonhydrochloridu doxorubicinu a asi 2,4 g p-toluensulfonové kyseliny se rozpustí v asi 50 ml bezvodého methanolu. Do tohoto roztoku se přidá asi 0,8 g kyanohydroboritanu sodného. Výsledný roztok se zahřívá při teplotě 68 - 72°C a udržuje při jemném refluxu po dobu 1 hodiny pod atmosférou dusíku.

Pak se reakční směs koncentruje na asi 20 ml a ochladí v mrazicím boxu na teplotu asi 0 - 4°C. Přidá se 0,5 ml vody a 200 ml chloroformu. Poté se přidá bezvodý síran sodný a po protřepání se soli filtrují.

Roztok se nechá projet sloupcem silikagelu (2,5 x 5 cm). Sloupec se dále promývá chloroform/methanolem (10/1) dokud není eluát bezbarvý. Vázané frakce obsahující produkt se eluují methanolem. Methanolový eluát se odpařuje a zbytek se rozpustí v 30% acetonitrilu v pufru mravenčanu amonného (pH = 4,0; 0,5%) a izoluje preparativní HPLC. Použije se fenylový sloupec a použitím gradientu acetonitril/mravenčanu amonného ( od 27% do 30% acetonitrilu po dobu 30 minut) se dosáhne separace produktu od dalších nečistot.

Frakce purifíkované HPLC se zředí přibližně stejným objemem vody. Roztok se projede preparativní HPLC s použitím fenylového sloupce. Sloupec se eluuje vodou k odstranění solí. Poté se produkt eluuje methanolem. Produkt se koncentruje a přidáním ethyletheru, který obsahuje chlorovodík, precipituje a po spojení filtrací poskytne 600 mg 13deoxydoxorubicinhydrochloridu. Výtěžek činí 80%.

• 999	•				♦ 9		99	9-9
9	• 9	9		9	9 9	9	9	9	9
•	9	9		9	99	*	9	9	9
									•
« 9	♦	9		9	9 9	9	9	9	9
• 9	• 99		99		99		9 9	99

TLC: R_f=0.38 CH₃Cl : MeOH : H₂O

10 1

U.V.: X_ma>.=233, 252, 293, 485 nm

MS: 530(M+H), .—ογ

383 (M- $1/ +H)

NHj

^NMRlmetb	tanol	• d₄)	: (viz níže)
δ · 1.30	(d,	3H,	6' -CH₃) ,
1.85	(m,	2H,	13-H₂),
2.05	(m,	2H,	io-h₂) ,
2.60	(d,	1H,	12-Η),
3.05	(d,	1H,	12-H),
3.55	(m,	1H,	5'-H),
3.90	(m,	2H,	14-¾) ,
4.05	(s,	3H,	0-ch₃) ,
4.25	(m,	1H,	4'-H),
4.95	(m,	1H,	3' -H),
5.40	(m,	1H,	l'-H),
7.55	(d,	1H,	3-H) ,
7.85	(d,	1H,	2-H), a
7.95	(d,	Η, 1	-H) .

Přibližně 600 mg čištěného 13-deoxydoxorubicinu se rozpustí v asi 60 ml methylenchloridu a asi 10 ml vody a nechá reagovat s přibližně 180 mg hydrouhličitanu draselného a přibližně 180 mg di-tert-butyldikarbonátu při asi pokojové teplotě po dobu 2 hodin. Organický roztok se separuje, promyje vodou a suší na bezvodém síranu sodném. Roztok se odpařuje do sucha a zbytek se rozpustí v asi 100 ml bezvodého methanolu. Roztok se udržuje nasyceným pomocí amoniaku při teplotě od asi 0°C do asi 4°C po dobu 48 hodin.

9999	•	• 9	99	99	99
•	• 9	• 9	9 9	9 9	9	♦
•	•	9 9	99	9 9	9	9
						•
9 *	•	• 9	9 9	• 9	9	9
• 9	• 99	99	99	• 9	99

vakuu k získání 3'-N-Boc-5-imino-13s přibližně 60 ml bezvodého methanolu

Rozpouštědlo a amoniak se odstraní ve deoxydoxorubicinu, který se nechá reagovat obsahujícího asi 0,1 M chlorovodíku při asi pokojové teplotě po dobu 2 hodin k odstranění 3'N-Boc skupiny, Výsledný roztok se koncentruje a produkt izoluje preparativní HPLC. Frakce purifíkované HPLC se zředí stejným objemem vody. Roztok se přidá na fenylový sloupec preparativní HPLC a eluuje vodou k odstranění solí. Produkt se eluuje methanolem. Methanolý eluát se okyselí chlorovodíkem v ethyletheru a roztok se koncentruje. Přidá se ethylether a výsledný precipitát se filtruje k získání přibližně 360 mg 5-imino-13deoxydoxorubicinhydrochloridu.

TLC:		R_f =	0.35
UV:		Á(nax	= 222, 251,
^XHNMR	(MeO	H-da	.)
δ	1.30	(d,	3H, 6'-CH₃)
	1.85	(m,	2H, 13-H₂)
	2.10	(m,	2H, 10-H₂)
	2.60	(d,	1H, 12-H)
	2.75	(d,	1H, 12-H)
	2.95	(d,	1H, 12-H)
	3.50	(m,	H, 5'-H)
	3.90	(m,	2H, 14-H₂)
	4.15	(s,	3H, 0-CH₃)
	4.25	(m,	1H, 4'-H)
	5.10	(m,	1H, 3'H)
	5.60	(m,	1H, l'-H)
	7.50	(d,	1H, 3-H)
	7.80	(d,	1H, 2-H)
	8.05	(d,	1H, 1-H)

544, 585 nm ····

MS:

529 (M+H)

400 (Μ- _h£ +H)

82 (M- _u£ +H) ·· ·· • · · · • · ·· • · · t • · · · • · ·· ·« ·♦ • · · » • · · · • * · « • · » · ·» 99

Dále předložený vynález poskytuje způsob ošetření rakoviny, včetně leukémií, lymfomů, a pevných nádorů. Způsob zahrnuje krok, při kterém se aplikuje účinné množství alespoň jednoho derivátu 5-imino-13-deoxyanthracyklinu. Dávky mohou být podobné jako u známých sloučenin. Díky jejich podobnostem se známými sloučeninami bude odborná veřejnost schopna určit reakční podmínky s podobnou účinností bez nepřiměřeného experimentování. Nicméně, jak je uvedeno výše, umožňuje předložený vynález podstatně snížit vedlejší účinky včetně snížení kardiotoxicity.

Předložený vynález také poskytuje způsob ošetření autoimunních chorob nebo poruch deficitu imunity jako např. AIDS. Způsob zahrnuje krok, při kterém se aplikuje účinné množství alespoň jednoho derivátu 5-imino-13-deoxyanthracyklinu.

Předchozí popis vynálezu ilustruje a popisuje předložený vynález. Navíc údaje ukazují a popisují pouze výhodná provedení vynálezu, ale jak je výše uvedeno, je jasné, že ···· · ·· ·· ·· ··

4·· 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 « ··· · 4 · 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 předložený vynález je použitelný v různých dalších kombinacích, modifikacích a prostředích a je ho možné změnit nebo modifikovat v rámci rozsahu vynálezu, jak je zde uveden, odpovídající výše uvedeným popisům a/nebo schopnosti nebo znalosti příslušné techniky. Výše popsaná provedení jsou dále určena k vysvětlení nejlepších způsobů podle předloženého vynálezu a k umožnění dalším odborně kvalifikovaným pracovníkům využívat vynález v těchto nebo jiných provedení a s různými modifikacemi požadovanými pro jednotlivé aplikace nebo využití vynálezu. Proto popis není zaměřen na omezení vynálezu podle zde popsané formy a přiložené patentové nároky jsou interpretovány tak, aby zahrnovaly alternativní provedení.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučenina mající následující vzorec:

kde substituenty Ri, R2, a R3 jsou H, OH nebo OCH3 a substituent R4 je cukerná část jiná než morfolinylem substituovaná cukerná část.
2. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje:

alespoň jeden derivát 5-imino-13-deoxyanthracyklinu vzorce podle nároku 1.
3. Způsob léčby rakoviny, autoimunitních chorob nebo poruchdgficittrilííuníty, vyznačující se tím, že zahrnuje krok: --aplikování účinného^-množství alespoň jednoho derivátu 5-imino-13deoxyanthracyklintt:—
4. Způsob přípravy derivátů 5-imino-13-deoxyanthracyklinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

vytvoření redukčního roztoku 13-tosylhydrazonu anthracyklinu v bezvodém methanolu s p-toluensulfonovou kyselinou a kyanohydroboritanem sodným;

mírné refluxování roztoku pod atmosférou dusíku; ochlazení roztoku;

přidání vody a chloroformu do roztoku; přidání bezvodého síranu sodného; _ filtrování precipitátu;

izolování filtrátu na sloupci silikagelu;

eluováni hydrofóbní ch nečistot vznikajících z rozkladu s roztokem chloroformu a methanolu;

• 444 4 44 44 44 4·

4 · · 4 4 4 4 4 44 ♦ * 4 44 44 9444 • 4 44 44 444 44 4 • 4 4 444 4 4 49 4 • · 444 44 94 4 4 4· eluování produktu 13-deoxyanthracyklinu methanolem;

další čištění methanolového eluátu preparativní HPLC;

vytvoření roztoku purifikováných 13-deoxyanthracyklinů v methylenchloridu a vodě;

přidání hydrouhličitanu draselného a di-tert-butylkarbonátu; izolování produktů chráněných skupinou N-Boc; rozpuštění 3 '-N-Boc-13-deoxyanthracyklinů v bezvodém methanolu; ochlazení roztoku;

nasycení roztoku amoniakem k provedení aminace 3'-N-Boc-13deoxyanthracyklinů;

odstranění rozpouštědla a amoniaku; rozpuštění zbytku v bezvodém methanolu; přidání chlorovodíku a reakce k odstranění skupiny 3'-N-Boc; koncentrování roztoku;

izolování produktu preparativní HPLC;

konvertování produktu na hydrochlorid uvedeného produktu 5-imino-13deoxyanthracyklinu.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedený redukční roztok má hodnotu pH přibližně 7,0 nebo menší.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedené refluxování se provádí při teplotě od 68 °C do asi 72 °C.
7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedené refluxování se provádí při teplotě od 65 °C do asi 75 °C.
8. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedené refluxování se provádí až do teploty přibližně 72 °C.
9. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedené refluxování se provádí za nepřítomnosti kyslíku.

«I»· • · *

4 4« ·· ··· ·· 44

4 «4 4 • 444

4 4 4 4

4 4 44 • 4 44 • 4 4 4 • 4 4

44 44
10. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedené refluxování se provádí za nepřítomnosti vody.
11. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedené refluxování se provádí pod atmosférou dusíku.
12. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedené refluxování se provádí pod atmosférou inertního plynu.
13. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že aminace se provádí při teplotě asi 0 až 4 °C.
14. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že aminace se provádí za nepřítomnosti vody.
15. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že postup vede k obdržení derivátu

5-imino-13-deoxyanthracyklinu s výtěžkem mezi asi 40 a asi 50 %.
16. Způsob přípravy derivátů 5-imino-13-deoxyanthracyklinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

vytvoření kyselého roztoku 13-tosylhydrazonu anthracyklinu s kyanohydroboritanem;

mírné refluxování roztoku; ochlazení reakční směsi; přidání vody do reakční směsi;

přidání halogenovaného uhlovodíkového rozpouštědla do reakční směsi; přidání bezvodého síranu sodného; filtrování reakční směsi; okyselení filtrátu;

podrobení filtrátu preparativní chromatografií k izolování derivátu 13deoxyanthracyklinu;

podrobení pomocí HPLC purifikované frakce HPLC s reverzní fází k odstranění anorganických solí;

·· ·· ·>· ·· > · · 9 9 9 9 9 t 9 99 9 9 9 9 roztoku vytvoření bazického butyldikarbonátem;

reakce roztoku při pokojové teplotě; extrahování derivátů chráněných skupinou Boc; vytvoření roztoku derivátů chráněných skupinou Boc; reakce roztoku s amoniakem při přibližně pokojové teplotě; odpařování rozpouštědla a amoniaku; reakce zbytku s kyselým roztokem; odpařování rozpouštědla;

podrobení roztoku preparativní HPLC k izolování 5-imino- 13deoxyanthracyklinů;

podrobení pomocí HPLC purifikované frakce HPLC s reverzní fází k odstranění anorganických solí; a eluování a izolování derivátů 5-imino-13-deoxyanthracyklinu.

13-deoxyanthracyklinů s di-tert17. Způsob přípravy derivátů 5-imino-13-deoxyanthracyklinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

vytvoření roztoku rozpuštěním asi 1 g 13-tosylhydrazonhydrochloridu doxorubicinu a asi 2,4 g p-toluensulfonové kyseliny v asi 50 ml bezvodého methanolu;

přidání asi 0,8 g kyanohydroboritanu sodného do roztoku; zahřívání roztoku na teplotu od asi 68 °C do asi 72 °C; mírné refluxování roztoku po dobu jedné hodiny pod atmosférou dusíku; koncentrování reakční směsi na přibližně 20 ml;

ochlazení reakční směsi v mrazícím boxu na teplotu od asi 0 °C do asi 4 °C;

přidání asi 0,5 ml vody do reakční směsi;

přidání asi 200 ml chloroformu do reakční směsi;

přidání bezvodého síranu sodného do reakční směsi;

filtrování solí z reakční směsi;

projetí roztoku sloupcem silikagelu;

další promytí sloupce chloroform/methanolem dokud eluát není bezbarvý; eluování methanolové frakce obsahující produkt; odpařování methanolového eluátu;

AMJJMAv

*··· • 9 • · • • ·· • · 99 9 9 99 9 9 • « « • • · 9 9 • « • · • ··· • • • · • · • · • · 9 9 9 9 91

rozpuštění zbytku vzniklého z odpařování v 30% acetonitrilu v pufru mravenčanu amonného;

izolování produktu preparativní HPLC s použitím fenylového sloupce; separování produktu od dalších nečistot použitím gradientu acetonitril/mravenčanu amonného;

zředění frakce purifikované HPLC vodou; projetí roztoku fenylovým sloupcem HPLC; eluování sloupce vodou;

eluování produktu methanolem; koncentrování roztoku na asi 5 ml; precipitování produktu s asi 10 ml diethyletheru;

filtrování precipitátu k obdržení asi 600 mg tuhých 13-deoxyanthracyklinů; vytvoření roztoku asi 600 mg 13-deoxyanthracyklinů v asi 60 ml methylenchloridu a asi 10 ml vody s asi 180 mg hydrogenuhličitanu draselného a asi 180 mg di-tert-butyldikarbonátu;

reakce roztoku při pokojové teplotě po dobu asi 2 hodin; separování organického roztoku; promývání organického roztoku vodou; sušení roztoku bezvodým síranem sodným; odpařování rozpouštědla;

rozpuštění zbytku v asi 100 ml bezvodého methanolu;

udržování roztoku pod nasyceným amoniakem při teplotě asi 0 až asi 4 °C po dobu asi 48 hodin;

odpařování roztoku;

rozpuštění zbytku v přibližně 60 ml bezvodého methanolu obsahujícím 0,1 M chlorovodíku;

reakce roztoku při přibližně pokojové teplotě po dobu asi 2 hodin; koncentrování roztoku na asi 5 ml;

izolování produktu preparativní HPLC s použitím fenylového sloupce; separování produktu od dalších nečistot použitím gradientu acetonitril/mravenčanu amonného;

zředění frakce purifikované HPLC vodou;

···· • 9 •

• 9

9* · • 9 • 9 · • 9 • 9 9

9 9 9 • 9 •

9 9 • 9 99 • 9 9 • 9 9

9 9 9

9 9 9 projetí roztoku fenylovým sloupcem HPLC; eluování mravenčanu amonného vodou; eluování produktu methanolem; koncentrování roztoku na asi 5 ml; konvertování produktu na hydrochloridovou sůl; precipitování produktu 10 ml diethyletheru a filtrování precipitátu k obdržení asi 360 mg tuhého 5-imino-13deoxyanthracyklinhydrochloridu.