CZ301144B6 - Príprava monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu s použitím modifikovaných virum podobných cástic Masonova-Pfizerova opicího viru - Google Patents

Abstract

Fúzní protein tvorený kapsidovým a nukleokapsidovým proteinem (CANC) Masonova-Pfizerova opicího viru (M-PMV) a interním peptidem FoxP3 proteinu, který je pripojen na N-konec CANC. Virum podobné cástice tvorené in vitro z takto modifikovaného proteinu. Použití modifikovaných cástic pro imunizaci zvírecích modelu a produkci monoklonálních protilátek.

Description

Oblast techniky:

Vynález se týká přípravy monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu pro laboratorní a vědecké účely. Monoklonální protilátky jsou izolovány z laboratorních zvířecích modelů po jejich imunizaci modifikovanými virům podobnými částicemi Masonova-Pfizerova opičího viru.

Použití modifikovaných virových Částic pro přípravu monoklonálních protilátek je založeno na poznatku, že přítomnost virových proteinů při imunizaci a simulace tvaru virových částic zvyšují imunitní odpověď cílového organismu.

Dosavadní stav techniky:

Produkce samotných protilátek proti komerčně zajímavým peptidům je důležitým odvětvím farmaceutického průmyslu, a proto je na výzkum v této oblasti kladem velký důraz. Nároky na pro20 tilátky jsou zejména z hlediska jejich specifity, kvality a zároveň co nejlevnější produkce velmi vysoké. Nová generace imunizačních protokolů je založena na obecně přijímaném poznatku, že přítomnost virových proteinů při imunizaci a simulace tvaru virových částic zvyšují imunitní odpověď cílového organismu. Byly tedy navrženy a připraveny různé typy vakcín, které obsahují částí virových proteinů, nebo celé viry zbavené patogenity a byly jimi imunizovány živočišné organismy. Nespornou výhodou takto produkovaných protilátek je jejich vysoký titr v séru imunizovaného organismu a taky jejich vysoká specifita. Kromě toho je možné ze séra izolovat také protilátky proti všem virovým proteinům, které byly pro imunizaci užity.

FoxP3 protein je členem forkhead/winged-helix rodiny transkripčních regulátorů. Je specificky exprimován v lidských CD4+ a CD25+ regulačních T-buňkách. Protilátky proti tomuto proteinu jsou žádoucí hlavně pro experimentální a detekční účely. Zejména proto bylo přistoupeno k řešení problematiky jejich přípravy.

Modifikace virových částic s cílem exponovat na jejich povrch různé typy peptidů je v posledních letech vědci často využívaná metoda. Jsou známé i patentované postupy, kde například naN-konec hlavního obalového proteinu papilomavirů je fúzován příslušný peptid jako část sekvence proteinu viru (mezinárodní přihláška Číslo WO 99/50425). Známé je též vázání peptidů, resp. ligandů, na C-konec tzv. fiber proteinu adenovirů, čím je docíleno expozice ligandů na povrchu virové částice (mezinárodní přihláška číslo WO 99/36545). Nejčastěji jsou modifiko40 váné částice, například retrovirové, užívané k cílení do vybraných typů buněk s využitím v genových terapiích (mezinárodní přihláška číslo WO 99/28488). Retroviry patří do čeledi Retroviridae, dle morfogenetické cesty tvorby nezralých částic jsou retroviry děleny do dvou hlavních skupin, a to retroviry typu C (členem této skupiny je i Human immunodeficiency virus HIV) a typů A, B a D, kam se řadí také Masonův-Pfizerův opičí virus (Mason-Pfízer monkey virus, dále M-PMV). Nezralá částice M-PMV je složena z proteinových prekurzoru Gag, GagPro a Gag-Pro-Pol umístěných pod fosfolipidovou membránou, dále ze dvou kopií genomové RNA, tRNA a dalších nespecifických virových RNA, transmembránových a povrchových glykoproteinů, které jsou zakotveny ve fosfolipidové membráně [1]. Polyproteinový prekurzor Gag má následované uspořádání : MA (matrixový protein) - PP (fosfoprotein) - protein pl2 - CA so (kapsidový protein) - NC (nukleoprotein) - protein p4. Procesem maturace vzniká z nezralé virové částice zralá virová částice. Jedná se o proces proteolytického štěpení polyproteinů Gag, Gag-Pro a Gag-Pro-Pol aktivovanou virovou proteázou na jednotlivé proteiny. Produkty tohoto štěpení se pak reorganizují do struktury zralé virové částice. Matrixový protein vytváří vnější obalu virionu, zatímco kapsidový protein tvoří jádro virové částice tzv. „core“ které obklopuje komplex genomové RNA a nukleokapsidového proteinu.

Polyproteinový prekurzor Gag má schopnost asociovat a tvořit tak nezralou částici i za nepřítomnosti ostatních částí viru. Předchozí studie ukázaly, že exprese samotného genu gag je dostatečná pro tvorbu vírům podobných Částic v živočišných buňkách i v bakteriích [2, 3, 4, 5]. U těchto částic, na rozdíl od nezralých virů, nedochází kjejich zrání, neobsahují povrchové glykoproteiny a nejsou ani infekční. Pomocí elektronové mikroskopie bylo zjištěno, že jsou svou velikostí i strukturou nerozlišitelné od nezralých virů. Dle Rumlová-K Uková a kol. je fúzní protein tvořen kapsidovým (CA) a nukleokapsídovým proteinem (NC), dále CANC, postačující pro skládání do viru podobné částici. Tento fúzní protein může být dokonce zkrácen o jeden motiv zinkových io prstu vNC doméně bez významného vlivu na tvorbu částic. N-terminální prolin kapsidového proteinu má ovšem rozhodující vliv, a to na tvar částic vznikajících z CANC proteinu. Jestliže je deletován nebo skryt připojením dalšího proteinu, např, MA nebo p 12, dochází k tvorbě sférických částic, zatímco exprese CANC s koncovým prolinem vede ke skládání planámích útvarů [6]. Označením CANC je v našem případě míněn fúzní kapsidový - nukleokapsídový protein is včetně jeho mutantů, u kterých je zachovává schopnost tvořit viru podobné částice, například mutantů s deletovanou koncovou aminokyselinou prolin, dále CANCPro-. Byl navržen a zkonstruován vektor pro expresi CANC se sekvencí interního peptidu FoxP3 (FoxP3CANC) na Nkonci. Prostřednictvím transformovaných buněk £. coli B121 (DE3) byly produkovány molekuly FoxP3CANC fúzního proteinu, tj. každá molekula CANC měla na svém N-konci íuzován interní peptid FoxP3. Pro složení molekul proteinů do viru podobných částic je nutná jejich vzájemná interakce, což představuje vznik komplexu 1500 až 2000 molekul fúzního proteinu pro složení jediné částice. Tím je na povrchu částice exponován ekvivalentní počet molekul FoxP3, čím se zvyšuje efektivita procesu imunizace.

Podstata vynálezu:

Podstatou vynálezu je příprava fúzního proteinu FoxP3CANC tvořeného kapsidovým a nukleokapsidovým proteinem Masonova-Pfizerova opičího viru, na jehož N-konec je připojen interní

3o peptid FoxP3 proteinu sekvence QLSTVDAHARTPVLQ. Tento protein je vhodný pro přípravu monoklonálních protilátek.

Podstatou vynálezu je dále příprava monoklonálních protilátek pomocí modifikovaných retrovirových kapsid M-PMV, kdy na N-konec fázního kapsidového a nukleokapsidového proteinu byl připojen interní peptid FoxP3 proteinu. Pro produkci protilátek je třeba aby byl peptid exponován na povrchu částice. Proto je nutné umístit sekvenci pro FoxP3 peptid na N-konec sekvence CANC, kde je, jak je uvedeno výše, buď deletovaný N-terminální prolin neboje tento danou sekvencí skryt, pro dosažení tvorby sférických částic,

Přehled obrázků na výkresech:

Obr. 1:

Na obrázku č.l je SDS PAGE analýza úspěšnosti izolace jednotlivých fuzních proteinů. V sloupci označeném 1, je fúzní protein HisCANC, jehož velikost je 36,2 kDa, v sloupci označeném 2, je fúzní protein 3HisCACN, jehož velikosti je 37,88 kDa, v sloupci 3 je fúzní protein lFlagCANC, jehož velikost je 36,4 kDa, v sloupci 4 je fúzní protein 3FlagCANC, jehož velikost je 38,4 kDa a v sloupci 5 je fúzní protein FoxP3CANC, jehož velikost je 37,03 kDa.

Obr. 2:

Jedná se o elektronmikroskopické snímky sbalených viru podobných částic. Na obrázku 2A je možné vidět viru podobné částice složené z fúzního proteinu HisCANC, které jsou různých veli55 kostí, jsou prasklé a jsou v zanedbatelně malé koncentraci, proces skládání byl tedy neúspěšný.

CZ 3U1144 B6

Na obrázku 2B je zřejmé, že proces sbalování fúzního proteinu 3HisCANC byl taky neúspěšný.

Pozorovali jsme jenom pozadí tvořené nesloženým proteinem a zřídka proteinové agregáty , ktcrc ale neměly strukturu ani velikost odpovídající viru podobné částici. Na obrázku 2C jsou složeny částice z íuzního proteinu FlagCANC. Jsou v dostatečné koncentraci a mají strukturu odpovídají5 cí viru podobné částici. Tento proces skládání byl úspěšný a tyto viru podobné částice byly poskytnuty pro imunizaci zvířecích modelů. Z obrázku 2D je zřejmé, že proces skládání fúzního proteinu 3FlagCANC nebyl úspěšný. Pozorovali jsme jenom pozadí tvořené nesloženým proteinem a proteinové agregáty různých velikostí a tvarů. Na obrázku 2E jsou úspěšně složené viru podobné částice, které byly připraveny skládáním fúzního proteinu FoxP3CANC. Na obrázku ío jsou částice ve více vrstvách, proto je jejich struktura hůř pozorovatelná, nicméně tyto částice byly poskytnuty pro imunizace.

Příklady provedení vynálezu:

Příklad č.l:

Z kompletní aminokyselinové sekvence proteinu FoxP3 (s označením NP 054728 v NCBI geno20 vé databázi) byla pro omezení velikosti peptidů exponovatelného na povrchu viru podobné částici použita sekvence interního peptidů (QLSTVDAHARTPVLQ). Na základě této sekvence byly navrženy oligonukleotidové sekvence s přesahy, viz sekvence id. č. 5, které jsou komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými endonukleázami expresního vektoru pET22b. Byla připravena sekvence pro kapsidový a nukleokapsidový protein (CANC), viz sek25 vence id. č.4. Obě sekvence byly ligovány do vektoru, jehož schéma je na Obr. 3. Takto připraveným konstruktem byla transformována E. coli BL21(DE3).

Příklad ě. 2:

Fúzní protein FoxP3CANC byl z E. coli BL21(DE3) izolován lýzí a po převedení do fosfátového pufru (50mM NaH₂PO₄ + Na₂HPO₄, 500mM NaCl, pH 7,5) byl purifikován pomocí chelataěního nosiče „HiTrap™ Chelating HP Column“. Byla využita přítomnost motivů 2 zinkových prstů v nukleoproteinu, které mají afinitu k zinečnatým iontům vázaným na koloně. Po eluci proteinu z kolony a převedení proteinu do pufru s obsahem Tris-HCl (50mM Tris-HCl, lOOmM NaCl, 0,07% merkaptoetanol, ΙμΜ ZnSO₄) a do fosfátového pufru (50mM NaH₂PO₄ + Na₂HPO₄, 500mM NaCl, 0,07% merkaptoetanol, 1 μΜ ZnSO₄) byl protein zahuštěn na koncentraci 1 mg/ml. V této koncentraci byl použit k přípravě viru podobných částic in vitro.

Příklad č. 3:

Viru podobné částice byly z fúzního proteinu FoxP3CANC připraveny dvě hodiny trvající dialýzou směsi sestávající z alikvotní části proteinu a alikvotního množství MS2 RNA (genomová

RNA bakteriofága MS2, ale je možné použít i libovolnou jinou nukleovou kyselinu) proti pufru s obsahem 50mM Tris-HCl, lOOmM NaCl a ΙμΜ ZnSO₄ při pokojové teplotě za neustálého míchání. Proces správného skládání proteinu do viru podobných částic byl ověřován pomocí transmisní elektronové mikroskopie.

Příkladě. 4:

Připravenými viru podobnými částicemi byly imunizovány laboratorní myši kmene BALB/c (je možné použít i hybridní myši F| (BALB/c x BIO.A)) třemi dávkami podávanými subkutánně ve čtrnáctidenních intervalech. Před zahájením imunizace a dále po druhé a třetí imunizační dávce

-3CZ 301144 B6 byly odebírány vzorky krve. V séru připraveném z těchto vzorků byl stanoven titr protilátek u dané myši metodou detekce specifických protilátek v Terasakiho destičkách. Myším, jejichž sérum mělo nejsilnější reakci, se aplikovala intraperitoneálně Čtvrtá dávka antigenu (obvykle dvojnásobek předcházejících dávek). Imunizovaná myš byla usmrcena v souladu se zákonem

77/2004 Sb., v platném znění, na ochranu zvířat proti týrání. Z myší byla odebrána plná krev a slezina. Získané sérum se používá jako pozitivní kontrola při testu supematantu na obsah specifických protilátek. Část slezinných buněk byla resuspendovaná v kultivačním médiu, zcentrifugovaná a peleta byla resuspendovaná v kultivačním médiu bez séra. Takto připraveny slezinné buňky byly smíchány s myelomovými buňkami, rovněž centrifugovanými a resuspendovanými io v kultivačním médiu bez séra. Myelomové buňky byly připraveny týden před plánovanou fúzí, a to rozmražením a pasážováním s cílem dosáhnout co největšího počtu rychle proliferujících buněk, zcentrifugováním a resuspendováním v bezsérovém médiu. Takto připravené myelomové buňky byly smíchávány se slezinnými buňkami v poměru 15x10⁶ myelomových buněk k 100 až 200 x 10^ó slezinných buněk. Směs buněk byla následně centrifugovaná. Supematant byl odstra15 něn a buněčný sediment byl lehce roztřepán. Fúze byla provedena dle následujícího schématu:

0.-1.	min přidání 50% roztoku PEG (polyethylenglykol).....	.....1 ml
1.-2.	(pro vyvolání buněčných fúzí jsou hmotnosti 1000 až 6000 g/mol) min míchání	používány roztoky polyethylenglykolů o molekulové
2.-3.	min přidání bezsérového média ....	.....Iml
3.-4.	min přidání bezsérového média ....	.....1 ml
4.-7.	min přidání bezsérového média....	.....7 mí

Buněčná suspenze byla opět centrifugována, buněčný sediment byl resuspendován v selekčním HAT médiu (hypoxantin, aminopterin, thymidin, kompletní kultivační médium RPMI), Tato suspenze byla rozpipetována do mikrokultivačních destiček s předem připravenými podpůrnými buňkami. Čtrnáctý den po fúzi bylo HAT médium zaměněno za HT médium (hypoxantin, thymidin, kompletní kultivační médium RPMI) a za dalších sedm dní za kompletní kultivační médium,

Supematant z dobře narostlých jamek byl testován na produkci specifických protilátek. Od každého pozitivního klonu byly vybrány 1 až 2 subklony, které se nechaly narůst. Supematant od každého klonu pak byl podroben dalšímu testování pro stanovení specifíty daného klonu.

Příklad č. 5

Postupem uvedeným v příkladech 1 a 2 jsme kromě FoxP3CANC připravili také 4 další fúzní polypeptidy. Na N-konec CANC proteinu jsme připojili sekvenci 6 histidinů, sekvenci 18 histidinů, sekvenci Flag (sekvence id. č. 6) a sekvenci tří po sobě následujících Flag sekvencí, Jednot40 livé fúzní proteiny, které byly produkovány po expresi vektorů v buňkách E. coli BL21(DE3), byly dle příslušného fúzovaného peptidu označeny jako HisCANC (sekvence 6 histidinů), 3HisCANC (sekvence 18 histidinů), FlagCANC (sekvence Flag), 3FlagCANC (sekvence tří po sobě následujících Flag sekvencí) a FoxP3CANC (interní peptid FoxP3 proteinu). Už při izolaci jednotlivých fúzních proteinů z buněk, se projevily rozdílné vlastnosti jednotlivých proteinů, a proto byly některé podmínky purifikace a izolace nutně modifikovány. Přehled úspěšnosti izolace jednotlivých fúzních proteinů, jejich složení do viru podobných částic a úspěšnost imunizace těmito částicemi je uvedena v tabulce č. 1.

Λ

CZ 301144 Bé

Tabulka č. i Přehled úspěšnosti jednotlivých procesů, které jsou součástí přípravy monoklonálních protilátek.

+++ proces byl úspěšný vzhledem ke koncentraci a čistotě produktu

- proces byl neúspěšný

Fúznf protein s exponovaným peptidem	Vyizolovaný protein	Složené částice	Tvorba monoklonálních protilátek proti FoxP3
HisCANC	+++	-	-
3HÍSCANC	+++		-
FlagCANC	+++	+++	-
3FlagCANC	+++	-	-
FOXP3CANC	+++	+++	+++

I když izolace všech pěti fúzních proteinů byla úspěšná, viz Obr. č. 1, proces skládání proteinů do io viru podobných částic byl úspěšný jen u dvou fúzních proteinů, a to FoxP3CANC a FlagCANC, viz Obr. ě. 2. Úspěšnost skládání byla zřejmě ovlivněna samotnými vlastnostmi jednotlivých aminokyselin v sekvenci peptidu, jenž byl fúzován na N-konec CANC. Konkrétně u proteinů

HisCAŇC a 3HisCANC dochází k vysoké kumulaci bazických aminokyselin, což by mohlo mít za následek neschopnost jednotlivých molekul fúzních proteinů vzájemně intereagovat a skládat se do viru podobných částic. Jak je zřejmé z Obr. 2 (A, B), bylo pozorováno zanedbatelné množství vytvořených částic, které ještě byly i značně poškozené. U 3FlafgCANC byla důvodem neúspěšného skládání proteinu zřejmě příliš dlouhá sekvence fúzovaného peptidu, jednalo se o 24 aminokyselin. Není tedy vůbec pravidlem, že po připojení libovolného peptidu na N-konec fúzního proteinu CANC dojde ke složení fúzního proteinu do viru podobné částice.

Ale ani úspěšná příprava složených viru podobných částic ještě není zárukou úspěšné produkce protilátek imunizovaným organismem. Na povrchu viru podobné částici exponovaný peptid totiž nemusí být dostupný buňkám imunitního systému. Povrch částice je poměrně členitý a tak délka exponovaného peptidu nemusí být postačující pro požadovaný přesah nad povrchové nerovnosti částice. Taky může dojít k různým konformačním ohybům řetězce peptidu. Konkrétně naše dva úspěšně složené proteiny FlagCANC a FoxP3CANC byly poskytnuty pro imunizace za stejných podmínek. Ze zvířete imunizovaného částicemi FlagCANC se ale nepodařilo izolovat protilátky proti danému peptidu, tedy Flag sekvenci, ale jenom protilátky proti samotným proteinům virové částice.

Podstata úspěšné přípravy monoklonálních protilátek tímto způsobem tedy spočívá ve zvolení správné aminokyselinové sekvence s optimálním uspořádáním jednotlivých aminokyselin a taky ve správně zvolené délce této sekvence. Samotná technika je v porovnání s běžně užívanou technikou kovalentní vazby peptidu na adjuvans účinnější. V odborné literatuře z oblastí modelování a přípravy vakcín s použitím adjuvans se uvádějí problémy s velmi slabou nebo žádnou imunomodulační schopností použitého adjuvans a tedy velmi nízkým titrem požadovaných protilátek v organismu. Naopak u virových proteinů je imunomodulaění schopnost velmi vysoká. Adjuvans jsou většinou složena z různých komponent, a jejich aplikace je často doprovázena různými negativními reakcemi imunizovaného organismu. Adjuvans jsou různě chemicky a biologicky definována, ale i tak jsou často málo stabilní. Na sloučeniny, jenž mají být použity jako adjuvans, jsou kladeny vysoké nároky z hlediska jejich imunogenicity biodegradabilnosti a biokompatibility. Protože se jedná o chemické sloučeniny připravované synteticky, je nevyhnuté zmapovat také jejich dlouhodobé působení na organismus z hlediska toxikologického. U některých typů vakcín užívajících jako nosič cílového peptidu adjuvans byla v cílovém organismu sledovaná indukce různých autoimunitnich reakcí způsobených právě přítomností daného adjuvans [7]. Složené virům podobné částice určené pro imunizace jsou hodně dobře skladovatelné, jsou velmi stabilní, takže při dodržení sterilních podmínek při manipulaci s nimi je možné je skladovat při 4

-5CZ 301144 B6 až 10 °C i několik let, a protože se jedná o biologický materiál, nedochází k nežádoucí kumulaci v organismu.

Průmyslová využitelnost:

Modifikované viru podobné částice dle předloženého vynálezu jsou vhodné pro přípravu monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu, který je členem forkhead/winged-helix rodiny transkripčních regulátorů.

io

Reference:

1. Rawat S. S., Viard M., Gallo S., Rein A., Blumenthal R., Puri A.: Modulation of entry of enveloped viruses by cholesterol and sphingolipids, Mol. Membr. Biol, 2003, vol. 20, p. 243-254.

is 2. Kliková M., Rhee S,, Hunter E., Ruml T.; Efficient in vivo and in vitro assembly of retroviral capsids from Gag precursor proteins expressed in bakteria, Journal of Virology, 1995, vol. 69, p. 1093-1098.

3. Parker S. D., Hunter E.: A Cell-Line-Specific Defect in the Intracellular Transport and Release of Assembled Retroviral Capsids, Journal of Virology, 2000, vol. 74, p. 784-795.

4. Rhee S. S., Hunter E.: Amino acid substitutions within the matrix protein of type D retroviruses affect assembly, transport and membrane association of a capsid, EMBO J., 1991, vol. 10, p. 535-546.

5. Šakalian M., Parker S. D., Weldon, R. A., Hunter E.: Synthesis and assembly of retrovirus Gag precursors into immature capsids in vitro, Journal of Virology, 1996, vol, 70, p. 3706—

3715.

6. Kliková-Rumlová M., Hunter E., Nermut Μ. V., Pichová I., Ruml T.: Analysis of MasonPfizer moneky virus Gag domains required for capsid assembly in bacteria: Role of N-terminal proline residue of CA in directing particle shape, Journal of Virology, 2000, vol. 74, p.8452-8459.

7. Guy B., The perfect mix: recent progress in adjutant research, Nátuře Reviews, Mikrobiology, 2007, vol. 5, p.505-515.

Přehled sekvencí:

Identifikační číslo: 1

Charakteristika: aminokyselinová sekvence modifikovaného fúzního kapsidového a nukleokapsidového proteinu s aminokyselinovou sekvencí peptidu FoxP3 (vyznačeno tlustým písmem) na N-konci.

MQLSTVDAHARTPVLQGSVTETVDGQGQAWRHHNGFDFAVIKELKTAASQYGAT

APYTLAFVESVADNWLTPTDWNTLVRAVLSGGDHLLWKSEFFENCRDTAKRNQQAG

NGWDFDMLTGSGNYSSTDAQMQYDPGLFAQIQAAATKAWRKLPVKGDPGASLTGV

KQGPDEPFADFVHRLITTAGRIFGSAEAGVDYVKQLAYENANPACQAAIRPYRKKTD

LTGYIRLCSDÍGPSYQQGLAMAAAFSGQTVKDFLNNKNKEKGGCCFKCGKKGHFAK

NCHEHAHNNAEPKVPGLCPRCKRGKHWANECKSKTDNQGNPIPPHQGNGWRGQPQ

APKQAY

CZ 401144 Bó

Identifikační čislo: 2

Charakteristika: aminokyselinová sekvence FoxP3 s vyznačeným interním peptidem (vyznačeno tlustým písmem), který byl použit pro N-teiminální fůzi s CANC.

s

MPNPRPGKPSAPSLALGPSPGASPSWRAAPKASDLLGARGPGGTFQGRDLRGGAHAS

SSSLNPMPPSQLQLPTLPLVMVAPSGARLGPLPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHAR

TPVLQVHPLESPAMISLTPPTTATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPN

PSAPRKDSTLSAVPQSSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEDFLKHCQADHLLDEKGRA

QCLLQREMVQSLEQQLVLEKEKLSAMQAHLAGKMALTKASSVASSDKGSCCIVAAG

SQGPWPAWSGPREAPDSLFAVRRHLWGSHGNSTFPEFLHNMDYFKFHNMRPPFTY

ATLIRWAILEAPEKQRTLNEIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVE

SEKGAVWTVDELEFRKKRSQRPSRCSNPTPGP

Identifikační číslo: 3 10

Charakteristika: aminokyselinová sekvence fuzního kapsidového a nukleokapsidového proteinu s naznačenou delecí terminální aminokyseliny prolin (vyznačeno tlustým písmem), která vede ke vzniku mutanta CANCPro-.

PVTETVDGQGQAWRHHNGFDFAVIKELKTAASQYGATAPYTLAIVESVADNWLTPT

DWNTLVRAVLSGGDHLLWKSEFFENCRDTAKRNQQAGNGWDFDMLTGSGNYSSTD

AQMQYDPGLFAQIQAAATKAWRKLPVKGDPGASLTGVKQGPDEPFADFVHRLITTA

GRIFGSAEAGVDYVKQLAYENANPACQAAIRPYRKKTDLTGYIRLCSDIGPSYQQGL

AMAAAFSGQTVKDFLNNKNKEKGGCCFKCGKKGHFAKNCHEHAHNNAEPKVPGLC , _s PRCKRGKHWANECKSKTDNQGNPIPPHQGNGWRGQPQAPKQA Y

Identifikační číslo: 4

Charakteristika: DNA sekvence fúzního kapsidového a nukleokapsidového proteinu s naznače20 nou delecí kodonu pro koncovou aminokyselinu prolin (vyznačeno tlustým písmem), která vede ke vzniku mutanta CANCPro-.

CCAGTGACTGAAACCGTTGATGGGCAAGGTCAAGCCTGGAGACACCATAATGGT

TTTGATTTTGCCGTCATAAAAGAATTAAAAACAGCTGCTTCCCAATATGGGGCTA

CTGCCCCATACACATTAGCCATAGTGGAATCTGTAGCGGACAATTGGCTTACCCC

TACAGATTGGAATACGCTTGTTAGGGCAGTCCTCTCAGGAGGAGATCACTTACTG

TGGAAATCTGAGTTTTTTGAAAATTGCAGAGATACGGCTAAAAGAAACCAACAA

GCCGGTAATGGCTGGGATTTTGACATGTTAACAGGTTCGGGTAATTATTCCAGCA

CCGATGCACAAATGCAGTATGATCCAGGATTGTTTGCTCAAATTCAAGCGGCTGC

TACAAAAGCCTGGAGAAAACTTCCCGTTAAGGGAGACCCAGGAGCCTCCCTTAC

AGGAGTCAAACAAGGACCCGATGAGCCATTTGCAGATTTCGTACACAGACTTATA

-7CZ 301144 B6

ACAACTGCTGGGAGAATCTTTOGAAGTGCTGAGGCCGGTGTAOACTATGTAAAAC

AACTAGCATATGAAAATGCTAATCCAGCTTGTCAGGCAGCCATTCGCCCCTATAG

AAAGAAGACAGATTTAACTGGCTATATCCGTCTTTGCTCGGATATTGGGCCCTCTT

ATCAGCAAGGCCTGGCCATGGCCGCCGCCTTTAGCGGGCAGACTGTAAAAGATTT

TCTTAACAACAAAAATAAAGAGAAAGGAGGGTGTTGCTTTAAATGCGGTAAAAA

AGGACACTTTGCAAAAAATTGTCATGAACATGCACATAACAATGCTGAACCAAA

AGTTCCCGGACTCTGCCCTAGATGTAAAAGAGGGAAACATTGGGCCAATGAATG

CAAATCCAAAACTGATAATCAAGGAAACCCAATACCACCCCATCAGGGAAACGG

GTGGAGGGGCCAGCCCCAGGCCCCGAAACAAGCTTAT

AGTTCCCGGACTCTGCCCTAGATGTAAAAGAGGGAAACATTGGGCCAATGAATG

CAAATCCAAAACTGATAATCAAGGAAACCCAATACCACCCCATCAGGGAAACGG

GTGGAGGGGCCAGCCCCAGGCCCCGAAACAAGCTTATTAAC

Identifikační číslo: 5

Charakteristika: DNA sekvence interního peptidu FoxP3 proteinu.

TATGCAACTCTCAACGGTAGATGCCCACGCCCGAACCCCTGTGCTTCAGG

Identifikační čislo: 6

Charakteristika: aminokyselinová sekvence peptidu Flag, který byl použit pro N-terminální fúzi io s CANC.

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   15 L Fúzní protein FoxP3CANC tvořený kapsidovým a nukleokapsidovým proteinem MasonovaPfízerova opičího viru, na jehož N-konec je připojen peptid sekvence QLSTVDAHARTPVLQ.
2. 2. Fúzní protein dle nároku 1, který má sekvenci id. č. 1.

   20
3. 3. Viru podobné částice tvořené fúzním proteinem dle nároku 1 nebo 2.
4. 4. Molekula nukleové kyseliny kódující fúzní protein dle nároku I nebo 2.
5. 5. Expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny dle nároku 4.
6. 6. Hostitelská buňka obsahující vektor dle nároku 5.
7. 7. Hostitelská buňka dle nároku 6, kterou je E. coli Β121 (DE3).

   30 8. Použití fůzního proteinu FoxP3CANC dle kteréhokoli z nároků 1 a 2 pro přípravu monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu.