CZ301144B6 - Príprava monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu s použitím modifikovaných virum podobných cástic Masonova-Pfizerova opicího viru - Google Patents
Príprava monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu s použitím modifikovaných virum podobných cástic Masonova-Pfizerova opicího viru Download PDFInfo
- Publication number
- CZ301144B6 CZ301144B6 CZ20080565A CZ2008565A CZ301144B6 CZ 301144 B6 CZ301144 B6 CZ 301144B6 CZ 20080565 A CZ20080565 A CZ 20080565A CZ 2008565 A CZ2008565 A CZ 2008565A CZ 301144 B6 CZ301144 B6 CZ 301144B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protein
- virus
- particles
- fusion protein
- sequence
- Prior art date
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 35
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims 1
- 241000009298 Trigla lyra Species 0.000 claims 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 14
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 4
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036948 DNA polymerase epsilon subunit 4 Human genes 0.000 description 2
- 101710170658 Endogenous retrovirus group K member 10 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710186314 Endogenous retrovirus group K member 21 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710162093 Endogenous retrovirus group K member 24 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710094596 Endogenous retrovirus group K member 8 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710177443 Endogenous retrovirus group K member 9 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical group [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700010759 gag-pro-pol Proteins 0.000 description 2
- 101150061559 gag-pro-pol gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 101800002729 p12 Proteins 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 108700026758 Adenovirus hexon capsid Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 description 1
- 101100481524 Escherichia phage N15 gene 20 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710168592 Gag-Pol polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710111520 Gag-Pro polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710118026 Gag-Pro-Pol polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000011246 composite particle Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000001002 morphogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012858 packaging process Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Fúzní protein tvorený kapsidovým a nukleokapsidovým proteinem (CANC) Masonova-Pfizerova opicího viru (M-PMV) a interním peptidem FoxP3 proteinu, který je pripojen na N-konec CANC. Virum podobné cástice tvorené in vitro z takto modifikovaného proteinu. Použití modifikovaných cástic pro imunizaci zvírecích modelu a produkci monoklonálních protilátek.
Description
Oblast techniky:
Vynález se týká přípravy monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu pro laboratorní a vědecké účely. Monoklonální protilátky jsou izolovány z laboratorních zvířecích modelů po jejich imunizaci modifikovanými virům podobnými částicemi Masonova-Pfizerova opičího viru.
Použití modifikovaných virových Částic pro přípravu monoklonálních protilátek je založeno na poznatku, že přítomnost virových proteinů při imunizaci a simulace tvaru virových částic zvyšují imunitní odpověď cílového organismu.
Dosavadní stav techniky:
Produkce samotných protilátek proti komerčně zajímavým peptidům je důležitým odvětvím farmaceutického průmyslu, a proto je na výzkum v této oblasti kladem velký důraz. Nároky na pro20 tilátky jsou zejména z hlediska jejich specifity, kvality a zároveň co nejlevnější produkce velmi vysoké. Nová generace imunizačních protokolů je založena na obecně přijímaném poznatku, že přítomnost virových proteinů při imunizaci a simulace tvaru virových částic zvyšují imunitní odpověď cílového organismu. Byly tedy navrženy a připraveny různé typy vakcín, které obsahují částí virových proteinů, nebo celé viry zbavené patogenity a byly jimi imunizovány živočišné organismy. Nespornou výhodou takto produkovaných protilátek je jejich vysoký titr v séru imunizovaného organismu a taky jejich vysoká specifita. Kromě toho je možné ze séra izolovat také protilátky proti všem virovým proteinům, které byly pro imunizaci užity.
FoxP3 protein je členem forkhead/winged-helix rodiny transkripčních regulátorů. Je specificky exprimován v lidských CD4+ a CD25+ regulačních T-buňkách. Protilátky proti tomuto proteinu jsou žádoucí hlavně pro experimentální a detekční účely. Zejména proto bylo přistoupeno k řešení problematiky jejich přípravy.
Modifikace virových částic s cílem exponovat na jejich povrch různé typy peptidů je v posledních letech vědci často využívaná metoda. Jsou známé i patentované postupy, kde například naN-konec hlavního obalového proteinu papilomavirů je fúzován příslušný peptid jako část sekvence proteinu viru (mezinárodní přihláška Číslo WO 99/50425). Známé je též vázání peptidů, resp. ligandů, na C-konec tzv. fiber proteinu adenovirů, čím je docíleno expozice ligandů na povrchu virové částice (mezinárodní přihláška číslo WO 99/36545). Nejčastěji jsou modifiko40 váné částice, například retrovirové, užívané k cílení do vybraných typů buněk s využitím v genových terapiích (mezinárodní přihláška číslo WO 99/28488). Retroviry patří do čeledi Retroviridae, dle morfogenetické cesty tvorby nezralých částic jsou retroviry děleny do dvou hlavních skupin, a to retroviry typu C (členem této skupiny je i Human immunodeficiency virus HIV) a typů A, B a D, kam se řadí také Masonův-Pfizerův opičí virus (Mason-Pfízer monkey virus, dále M-PMV). Nezralá částice M-PMV je složena z proteinových prekurzoru Gag, GagPro a Gag-Pro-Pol umístěných pod fosfolipidovou membránou, dále ze dvou kopií genomové RNA, tRNA a dalších nespecifických virových RNA, transmembránových a povrchových glykoproteinů, které jsou zakotveny ve fosfolipidové membráně [1]. Polyproteinový prekurzor Gag má následované uspořádání : MA (matrixový protein) - PP (fosfoprotein) - protein pl2 - CA so (kapsidový protein) - NC (nukleoprotein) - protein p4. Procesem maturace vzniká z nezralé virové částice zralá virová částice. Jedná se o proces proteolytického štěpení polyproteinů Gag, Gag-Pro a Gag-Pro-Pol aktivovanou virovou proteázou na jednotlivé proteiny. Produkty tohoto štěpení se pak reorganizují do struktury zralé virové částice. Matrixový protein vytváří vnější obalu virionu, zatímco kapsidový protein tvoří jádro virové částice tzv. „core“ které obklopuje komplex genomové RNA a nukleokapsidového proteinu.
Polyproteinový prekurzor Gag má schopnost asociovat a tvořit tak nezralou částici i za nepřítomnosti ostatních částí viru. Předchozí studie ukázaly, že exprese samotného genu gag je dostatečná pro tvorbu vírům podobných Částic v živočišných buňkách i v bakteriích [2, 3, 4, 5]. U těchto částic, na rozdíl od nezralých virů, nedochází kjejich zrání, neobsahují povrchové glykoproteiny a nejsou ani infekční. Pomocí elektronové mikroskopie bylo zjištěno, že jsou svou velikostí i strukturou nerozlišitelné od nezralých virů. Dle Rumlová-K Uková a kol. je fúzní protein tvořen kapsidovým (CA) a nukleokapsídovým proteinem (NC), dále CANC, postačující pro skládání do viru podobné částici. Tento fúzní protein může být dokonce zkrácen o jeden motiv zinkových io prstu vNC doméně bez významného vlivu na tvorbu částic. N-terminální prolin kapsidového proteinu má ovšem rozhodující vliv, a to na tvar částic vznikajících z CANC proteinu. Jestliže je deletován nebo skryt připojením dalšího proteinu, např, MA nebo p 12, dochází k tvorbě sférických částic, zatímco exprese CANC s koncovým prolinem vede ke skládání planámích útvarů [6]. Označením CANC je v našem případě míněn fúzní kapsidový - nukleokapsídový protein is včetně jeho mutantů, u kterých je zachovává schopnost tvořit viru podobné částice, například mutantů s deletovanou koncovou aminokyselinou prolin, dále CANCPro-. Byl navržen a zkonstruován vektor pro expresi CANC se sekvencí interního peptidu FoxP3 (FoxP3CANC) na Nkonci. Prostřednictvím transformovaných buněk £. coli B121 (DE3) byly produkovány molekuly FoxP3CANC fúzního proteinu, tj. každá molekula CANC měla na svém N-konci íuzován interní peptid FoxP3. Pro složení molekul proteinů do viru podobných částic je nutná jejich vzájemná interakce, což představuje vznik komplexu 1500 až 2000 molekul fúzního proteinu pro složení jediné částice. Tím je na povrchu částice exponován ekvivalentní počet molekul FoxP3, čím se zvyšuje efektivita procesu imunizace.
Podstata vynálezu:
Podstatou vynálezu je příprava fúzního proteinu FoxP3CANC tvořeného kapsidovým a nukleokapsidovým proteinem Masonova-Pfizerova opičího viru, na jehož N-konec je připojen interní
3o peptid FoxP3 proteinu sekvence QLSTVDAHARTPVLQ. Tento protein je vhodný pro přípravu monoklonálních protilátek.
Podstatou vynálezu je dále příprava monoklonálních protilátek pomocí modifikovaných retrovirových kapsid M-PMV, kdy na N-konec fázního kapsidového a nukleokapsidového proteinu byl připojen interní peptid FoxP3 proteinu. Pro produkci protilátek je třeba aby byl peptid exponován na povrchu částice. Proto je nutné umístit sekvenci pro FoxP3 peptid na N-konec sekvence CANC, kde je, jak je uvedeno výše, buď deletovaný N-terminální prolin neboje tento danou sekvencí skryt, pro dosažení tvorby sférických částic,
Přehled obrázků na výkresech:
Obr. 1:
Na obrázku č.l je SDS PAGE analýza úspěšnosti izolace jednotlivých fuzních proteinů. V sloupci označeném 1, je fúzní protein HisCANC, jehož velikost je 36,2 kDa, v sloupci označeném 2, je fúzní protein 3HisCACN, jehož velikosti je 37,88 kDa, v sloupci 3 je fúzní protein lFlagCANC, jehož velikost je 36,4 kDa, v sloupci 4 je fúzní protein 3FlagCANC, jehož velikost je 38,4 kDa a v sloupci 5 je fúzní protein FoxP3CANC, jehož velikost je 37,03 kDa.
Obr. 2:
Jedná se o elektronmikroskopické snímky sbalených viru podobných částic. Na obrázku 2A je možné vidět viru podobné částice složené z fúzního proteinu HisCANC, které jsou různých veli55 kostí, jsou prasklé a jsou v zanedbatelně malé koncentraci, proces skládání byl tedy neúspěšný.
CZ 3U1144 B6
Na obrázku 2B je zřejmé, že proces sbalování fúzního proteinu 3HisCANC byl taky neúspěšný.
Pozorovali jsme jenom pozadí tvořené nesloženým proteinem a zřídka proteinové agregáty , ktcrc ale neměly strukturu ani velikost odpovídající viru podobné částici. Na obrázku 2C jsou složeny částice z íuzního proteinu FlagCANC. Jsou v dostatečné koncentraci a mají strukturu odpovídají5 cí viru podobné částici. Tento proces skládání byl úspěšný a tyto viru podobné částice byly poskytnuty pro imunizaci zvířecích modelů. Z obrázku 2D je zřejmé, že proces skládání fúzního proteinu 3FlagCANC nebyl úspěšný. Pozorovali jsme jenom pozadí tvořené nesloženým proteinem a proteinové agregáty různých velikostí a tvarů. Na obrázku 2E jsou úspěšně složené viru podobné částice, které byly připraveny skládáním fúzního proteinu FoxP3CANC. Na obrázku ío jsou částice ve více vrstvách, proto je jejich struktura hůř pozorovatelná, nicméně tyto částice byly poskytnuty pro imunizace.
Příklady provedení vynálezu:
Příklad č.l:
Z kompletní aminokyselinové sekvence proteinu FoxP3 (s označením NP 054728 v NCBI geno20 vé databázi) byla pro omezení velikosti peptidů exponovatelného na povrchu viru podobné částici použita sekvence interního peptidů (QLSTVDAHARTPVLQ). Na základě této sekvence byly navrženy oligonukleotidové sekvence s přesahy, viz sekvence id. č. 5, které jsou komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými endonukleázami expresního vektoru pET22b. Byla připravena sekvence pro kapsidový a nukleokapsidový protein (CANC), viz sek25 vence id. č.4. Obě sekvence byly ligovány do vektoru, jehož schéma je na Obr. 3. Takto připraveným konstruktem byla transformována E. coli BL21(DE3).
Příklad ě. 2:
Fúzní protein FoxP3CANC byl z E. coli BL21(DE3) izolován lýzí a po převedení do fosfátového pufru (50mM NaH2PO4 + Na2HPO4, 500mM NaCl, pH 7,5) byl purifikován pomocí chelataěního nosiče „HiTrap™ Chelating HP Column“. Byla využita přítomnost motivů 2 zinkových prstů v nukleoproteinu, které mají afinitu k zinečnatým iontům vázaným na koloně. Po eluci proteinu z kolony a převedení proteinu do pufru s obsahem Tris-HCl (50mM Tris-HCl, lOOmM NaCl, 0,07% merkaptoetanol, ΙμΜ ZnSO4) a do fosfátového pufru (50mM NaH2PO4 + Na2HPO4, 500mM NaCl, 0,07% merkaptoetanol, 1 μΜ ZnSO4) byl protein zahuštěn na koncentraci 1 mg/ml. V této koncentraci byl použit k přípravě viru podobných částic in vitro.
Příklad č. 3:
Viru podobné částice byly z fúzního proteinu FoxP3CANC připraveny dvě hodiny trvající dialýzou směsi sestávající z alikvotní části proteinu a alikvotního množství MS2 RNA (genomová
RNA bakteriofága MS2, ale je možné použít i libovolnou jinou nukleovou kyselinu) proti pufru s obsahem 50mM Tris-HCl, lOOmM NaCl a ΙμΜ ZnSO4 při pokojové teplotě za neustálého míchání. Proces správného skládání proteinu do viru podobných částic byl ověřován pomocí transmisní elektronové mikroskopie.
Příkladě. 4:
Připravenými viru podobnými částicemi byly imunizovány laboratorní myši kmene BALB/c (je možné použít i hybridní myši F| (BALB/c x BIO.A)) třemi dávkami podávanými subkutánně ve čtrnáctidenních intervalech. Před zahájením imunizace a dále po druhé a třetí imunizační dávce
-3CZ 301144 B6 byly odebírány vzorky krve. V séru připraveném z těchto vzorků byl stanoven titr protilátek u dané myši metodou detekce specifických protilátek v Terasakiho destičkách. Myším, jejichž sérum mělo nejsilnější reakci, se aplikovala intraperitoneálně Čtvrtá dávka antigenu (obvykle dvojnásobek předcházejících dávek). Imunizovaná myš byla usmrcena v souladu se zákonem
77/2004 Sb., v platném znění, na ochranu zvířat proti týrání. Z myší byla odebrána plná krev a slezina. Získané sérum se používá jako pozitivní kontrola při testu supematantu na obsah specifických protilátek. Část slezinných buněk byla resuspendovaná v kultivačním médiu, zcentrifugovaná a peleta byla resuspendovaná v kultivačním médiu bez séra. Takto připraveny slezinné buňky byly smíchány s myelomovými buňkami, rovněž centrifugovanými a resuspendovanými io v kultivačním médiu bez séra. Myelomové buňky byly připraveny týden před plánovanou fúzí, a to rozmražením a pasážováním s cílem dosáhnout co největšího počtu rychle proliferujících buněk, zcentrifugováním a resuspendováním v bezsérovém médiu. Takto připravené myelomové buňky byly smíchávány se slezinnými buňkami v poměru 15x106 myelomových buněk k 100 až 200 x 10ó slezinných buněk. Směs buněk byla následně centrifugovaná. Supematant byl odstra15 něn a buněčný sediment byl lehce roztřepán. Fúze byla provedena dle následujícího schématu:
| 0.-1. | min přidání 50% roztoku PEG (polyethylenglykol)..... | .....1 ml | |
| 1.-2. | (pro vyvolání buněčných fúzí jsou hmotnosti 1000 až 6000 g/mol) min míchání | používány roztoky polyethylenglykolů o molekulové | |
| 2.-3. | min přidání bezsérového média .... | .....Iml | |
| 3.-4. | min přidání bezsérového média .... | .....1 ml | |
| 4.-7. | min přidání bezsérového média.... | .....7 mí |
Buněčná suspenze byla opět centrifugována, buněčný sediment byl resuspendován v selekčním HAT médiu (hypoxantin, aminopterin, thymidin, kompletní kultivační médium RPMI), Tato suspenze byla rozpipetována do mikrokultivačních destiček s předem připravenými podpůrnými buňkami. Čtrnáctý den po fúzi bylo HAT médium zaměněno za HT médium (hypoxantin, thymidin, kompletní kultivační médium RPMI) a za dalších sedm dní za kompletní kultivační médium,
Supematant z dobře narostlých jamek byl testován na produkci specifických protilátek. Od každého pozitivního klonu byly vybrány 1 až 2 subklony, které se nechaly narůst. Supematant od každého klonu pak byl podroben dalšímu testování pro stanovení specifíty daného klonu.
Příklad č. 5
Postupem uvedeným v příkladech 1 a 2 jsme kromě FoxP3CANC připravili také 4 další fúzní polypeptidy. Na N-konec CANC proteinu jsme připojili sekvenci 6 histidinů, sekvenci 18 histidinů, sekvenci Flag (sekvence id. č. 6) a sekvenci tří po sobě následujících Flag sekvencí, Jednot40 livé fúzní proteiny, které byly produkovány po expresi vektorů v buňkách E. coli BL21(DE3), byly dle příslušného fúzovaného peptidu označeny jako HisCANC (sekvence 6 histidinů), 3HisCANC (sekvence 18 histidinů), FlagCANC (sekvence Flag), 3FlagCANC (sekvence tří po sobě následujících Flag sekvencí) a FoxP3CANC (interní peptid FoxP3 proteinu). Už při izolaci jednotlivých fúzních proteinů z buněk, se projevily rozdílné vlastnosti jednotlivých proteinů, a proto byly některé podmínky purifikace a izolace nutně modifikovány. Přehled úspěšnosti izolace jednotlivých fúzních proteinů, jejich složení do viru podobných částic a úspěšnost imunizace těmito částicemi je uvedena v tabulce č. 1.
Λ
CZ 301144 Bé
Tabulka č. i Přehled úspěšnosti jednotlivých procesů, které jsou součástí přípravy monoklonálních protilátek.
+++ proces byl úspěšný vzhledem ke koncentraci a čistotě produktu
- proces byl neúspěšný
| Fúznf protein s exponovaným peptidem | Vyizolovaný protein | Složené částice | Tvorba monoklonálních protilátek proti FoxP3 |
| HisCANC | +++ | - | - |
| 3HÍSCANC | +++ | - | |
| FlagCANC | +++ | +++ | - |
| 3FlagCANC | +++ | - | - |
| FOXP3CANC | +++ | +++ | +++ |
I když izolace všech pěti fúzních proteinů byla úspěšná, viz Obr. č. 1, proces skládání proteinů do io viru podobných částic byl úspěšný jen u dvou fúzních proteinů, a to FoxP3CANC a FlagCANC, viz Obr. ě. 2. Úspěšnost skládání byla zřejmě ovlivněna samotnými vlastnostmi jednotlivých aminokyselin v sekvenci peptidu, jenž byl fúzován na N-konec CANC. Konkrétně u proteinů
HisCAŇC a 3HisCANC dochází k vysoké kumulaci bazických aminokyselin, což by mohlo mít za následek neschopnost jednotlivých molekul fúzních proteinů vzájemně intereagovat a skládat se do viru podobných částic. Jak je zřejmé z Obr. 2 (A, B), bylo pozorováno zanedbatelné množství vytvořených částic, které ještě byly i značně poškozené. U 3FlafgCANC byla důvodem neúspěšného skládání proteinu zřejmě příliš dlouhá sekvence fúzovaného peptidu, jednalo se o 24 aminokyselin. Není tedy vůbec pravidlem, že po připojení libovolného peptidu na N-konec fúzního proteinu CANC dojde ke složení fúzního proteinu do viru podobné částice.
Ale ani úspěšná příprava složených viru podobných částic ještě není zárukou úspěšné produkce protilátek imunizovaným organismem. Na povrchu viru podobné částici exponovaný peptid totiž nemusí být dostupný buňkám imunitního systému. Povrch částice je poměrně členitý a tak délka exponovaného peptidu nemusí být postačující pro požadovaný přesah nad povrchové nerovnosti částice. Taky může dojít k různým konformačním ohybům řetězce peptidu. Konkrétně naše dva úspěšně složené proteiny FlagCANC a FoxP3CANC byly poskytnuty pro imunizace za stejných podmínek. Ze zvířete imunizovaného částicemi FlagCANC se ale nepodařilo izolovat protilátky proti danému peptidu, tedy Flag sekvenci, ale jenom protilátky proti samotným proteinům virové částice.
Podstata úspěšné přípravy monoklonálních protilátek tímto způsobem tedy spočívá ve zvolení správné aminokyselinové sekvence s optimálním uspořádáním jednotlivých aminokyselin a taky ve správně zvolené délce této sekvence. Samotná technika je v porovnání s běžně užívanou technikou kovalentní vazby peptidu na adjuvans účinnější. V odborné literatuře z oblastí modelování a přípravy vakcín s použitím adjuvans se uvádějí problémy s velmi slabou nebo žádnou imunomodulační schopností použitého adjuvans a tedy velmi nízkým titrem požadovaných protilátek v organismu. Naopak u virových proteinů je imunomodulaění schopnost velmi vysoká. Adjuvans jsou většinou složena z různých komponent, a jejich aplikace je často doprovázena různými negativními reakcemi imunizovaného organismu. Adjuvans jsou různě chemicky a biologicky definována, ale i tak jsou často málo stabilní. Na sloučeniny, jenž mají být použity jako adjuvans, jsou kladeny vysoké nároky z hlediska jejich imunogenicity biodegradabilnosti a biokompatibility. Protože se jedná o chemické sloučeniny připravované synteticky, je nevyhnuté zmapovat také jejich dlouhodobé působení na organismus z hlediska toxikologického. U některých typů vakcín užívajících jako nosič cílového peptidu adjuvans byla v cílovém organismu sledovaná indukce různých autoimunitnich reakcí způsobených právě přítomností daného adjuvans [7]. Složené virům podobné částice určené pro imunizace jsou hodně dobře skladovatelné, jsou velmi stabilní, takže při dodržení sterilních podmínek při manipulaci s nimi je možné je skladovat při 4
-5CZ 301144 B6 až 10 °C i několik let, a protože se jedná o biologický materiál, nedochází k nežádoucí kumulaci v organismu.
Průmyslová využitelnost:
Modifikované viru podobné částice dle předloženého vynálezu jsou vhodné pro přípravu monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu, který je členem forkhead/winged-helix rodiny transkripčních regulátorů.
io
Reference:
1. Rawat S. S., Viard M., Gallo S., Rein A., Blumenthal R., Puri A.: Modulation of entry of enveloped viruses by cholesterol and sphingolipids, Mol. Membr. Biol, 2003, vol. 20, p. 243-254.
is 2. Kliková M., Rhee S,, Hunter E., Ruml T.; Efficient in vivo and in vitro assembly of retroviral capsids from Gag precursor proteins expressed in bakteria, Journal of Virology, 1995, vol. 69, p. 1093-1098.
3. Parker S. D., Hunter E.: A Cell-Line-Specific Defect in the Intracellular Transport and Release of Assembled Retroviral Capsids, Journal of Virology, 2000, vol. 74, p. 784-795.
4. Rhee S. S., Hunter E.: Amino acid substitutions within the matrix protein of type D retroviruses affect assembly, transport and membrane association of a capsid, EMBO J., 1991, vol. 10, p. 535-546.
5. Šakalian M., Parker S. D., Weldon, R. A., Hunter E.: Synthesis and assembly of retrovirus Gag precursors into immature capsids in vitro, Journal of Virology, 1996, vol, 70, p. 3706—
3715.
6. Kliková-Rumlová M., Hunter E., Nermut Μ. V., Pichová I., Ruml T.: Analysis of MasonPfizer moneky virus Gag domains required for capsid assembly in bacteria: Role of N-terminal proline residue of CA in directing particle shape, Journal of Virology, 2000, vol. 74, p.8452-8459.
7. Guy B., The perfect mix: recent progress in adjutant research, Nátuře Reviews, Mikrobiology, 2007, vol. 5, p.505-515.
Přehled sekvencí:
Identifikační číslo: 1
Charakteristika: aminokyselinová sekvence modifikovaného fúzního kapsidového a nukleokapsidového proteinu s aminokyselinovou sekvencí peptidu FoxP3 (vyznačeno tlustým písmem) na N-konci.
MQLSTVDAHARTPVLQGSVTETVDGQGQAWRHHNGFDFAVIKELKTAASQYGAT
APYTLAFVESVADNWLTPTDWNTLVRAVLSGGDHLLWKSEFFENCRDTAKRNQQAG
NGWDFDMLTGSGNYSSTDAQMQYDPGLFAQIQAAATKAWRKLPVKGDPGASLTGV
KQGPDEPFADFVHRLITTAGRIFGSAEAGVDYVKQLAYENANPACQAAIRPYRKKTD
LTGYIRLCSDÍGPSYQQGLAMAAAFSGQTVKDFLNNKNKEKGGCCFKCGKKGHFAK
NCHEHAHNNAEPKVPGLCPRCKRGKHWANECKSKTDNQGNPIPPHQGNGWRGQPQ
APKQAY
CZ 401144 Bó
Identifikační čislo: 2
Charakteristika: aminokyselinová sekvence FoxP3 s vyznačeným interním peptidem (vyznačeno tlustým písmem), který byl použit pro N-teiminální fůzi s CANC.
s
MPNPRPGKPSAPSLALGPSPGASPSWRAAPKASDLLGARGPGGTFQGRDLRGGAHAS
SSSLNPMPPSQLQLPTLPLVMVAPSGARLGPLPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHAR
TPVLQVHPLESPAMISLTPPTTATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPN
PSAPRKDSTLSAVPQSSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEDFLKHCQADHLLDEKGRA
QCLLQREMVQSLEQQLVLEKEKLSAMQAHLAGKMALTKASSVASSDKGSCCIVAAG
SQGPWPAWSGPREAPDSLFAVRRHLWGSHGNSTFPEFLHNMDYFKFHNMRPPFTY
ATLIRWAILEAPEKQRTLNEIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVE
SEKGAVWTVDELEFRKKRSQRPSRCSNPTPGP
Identifikační číslo: 3 10
Charakteristika: aminokyselinová sekvence fuzního kapsidového a nukleokapsidového proteinu s naznačenou delecí terminální aminokyseliny prolin (vyznačeno tlustým písmem), která vede ke vzniku mutanta CANCPro-.
PVTETVDGQGQAWRHHNGFDFAVIKELKTAASQYGATAPYTLAIVESVADNWLTPT
DWNTLVRAVLSGGDHLLWKSEFFENCRDTAKRNQQAGNGWDFDMLTGSGNYSSTD
AQMQYDPGLFAQIQAAATKAWRKLPVKGDPGASLTGVKQGPDEPFADFVHRLITTA
GRIFGSAEAGVDYVKQLAYENANPACQAAIRPYRKKTDLTGYIRLCSDIGPSYQQGL
AMAAAFSGQTVKDFLNNKNKEKGGCCFKCGKKGHFAKNCHEHAHNNAEPKVPGLC , s PRCKRGKHWANECKSKTDNQGNPIPPHQGNGWRGQPQAPKQA Y
Identifikační číslo: 4
Charakteristika: DNA sekvence fúzního kapsidového a nukleokapsidového proteinu s naznače20 nou delecí kodonu pro koncovou aminokyselinu prolin (vyznačeno tlustým písmem), která vede ke vzniku mutanta CANCPro-.
CCAGTGACTGAAACCGTTGATGGGCAAGGTCAAGCCTGGAGACACCATAATGGT
TTTGATTTTGCCGTCATAAAAGAATTAAAAACAGCTGCTTCCCAATATGGGGCTA
CTGCCCCATACACATTAGCCATAGTGGAATCTGTAGCGGACAATTGGCTTACCCC
TACAGATTGGAATACGCTTGTTAGGGCAGTCCTCTCAGGAGGAGATCACTTACTG
TGGAAATCTGAGTTTTTTGAAAATTGCAGAGATACGGCTAAAAGAAACCAACAA
GCCGGTAATGGCTGGGATTTTGACATGTTAACAGGTTCGGGTAATTATTCCAGCA
CCGATGCACAAATGCAGTATGATCCAGGATTGTTTGCTCAAATTCAAGCGGCTGC
TACAAAAGCCTGGAGAAAACTTCCCGTTAAGGGAGACCCAGGAGCCTCCCTTAC
AGGAGTCAAACAAGGACCCGATGAGCCATTTGCAGATTTCGTACACAGACTTATA
-7CZ 301144 B6
ACAACTGCTGGGAGAATCTTTOGAAGTGCTGAGGCCGGTGTAOACTATGTAAAAC
AACTAGCATATGAAAATGCTAATCCAGCTTGTCAGGCAGCCATTCGCCCCTATAG
AAAGAAGACAGATTTAACTGGCTATATCCGTCTTTGCTCGGATATTGGGCCCTCTT
ATCAGCAAGGCCTGGCCATGGCCGCCGCCTTTAGCGGGCAGACTGTAAAAGATTT
TCTTAACAACAAAAATAAAGAGAAAGGAGGGTGTTGCTTTAAATGCGGTAAAAA
AGGACACTTTGCAAAAAATTGTCATGAACATGCACATAACAATGCTGAACCAAA
AGTTCCCGGACTCTGCCCTAGATGTAAAAGAGGGAAACATTGGGCCAATGAATG
CAAATCCAAAACTGATAATCAAGGAAACCCAATACCACCCCATCAGGGAAACGG
GTGGAGGGGCCAGCCCCAGGCCCCGAAACAAGCTTAT
AGTTCCCGGACTCTGCCCTAGATGTAAAAGAGGGAAACATTGGGCCAATGAATG
CAAATCCAAAACTGATAATCAAGGAAACCCAATACCACCCCATCAGGGAAACGG
GTGGAGGGGCCAGCCCCAGGCCCCGAAACAAGCTTATTAAC
Identifikační číslo: 5
Charakteristika: DNA sekvence interního peptidu FoxP3 proteinu.
TATGCAACTCTCAACGGTAGATGCCCACGCCCGAACCCCTGTGCTTCAGG
Identifikační čislo: 6
Charakteristika: aminokyselinová sekvence peptidu Flag, který byl použit pro N-terminální fúzi io s CANC.
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY15 L Fúzní protein FoxP3CANC tvořený kapsidovým a nukleokapsidovým proteinem MasonovaPfízerova opičího viru, na jehož N-konec je připojen peptid sekvence QLSTVDAHARTPVLQ.
- 2. Fúzní protein dle nároku 1, který má sekvenci id. č. 1.20
- 3. Viru podobné částice tvořené fúzním proteinem dle nároku 1 nebo 2.
- 4. Molekula nukleové kyseliny kódující fúzní protein dle nároku I nebo 2.
- 5. Expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny dle nároku 4.
- 6. Hostitelská buňka obsahující vektor dle nároku 5.
- 7. Hostitelská buňka dle nároku 6, kterou je E. coli Β121 (DE3).30 8. Použití fůzního proteinu FoxP3CANC dle kteréhokoli z nároků 1 a 2 pro přípravu monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20080565A CZ2008565A3 (cs) | 2008-09-15 | 2008-09-15 | Príprava monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu s použitím modifikovaných virum podobných cástic Masonova-Pfizerova opicího viru |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20080565A CZ2008565A3 (cs) | 2008-09-15 | 2008-09-15 | Príprava monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu s použitím modifikovaných virum podobných cástic Masonova-Pfizerova opicího viru |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ301144B6 true CZ301144B6 (cs) | 2009-11-18 |
| CZ2008565A3 CZ2008565A3 (cs) | 2009-11-18 |
Family
ID=41297127
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20080565A CZ2008565A3 (cs) | 2008-09-15 | 2008-09-15 | Príprava monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu s použitím modifikovaných virum podobných cástic Masonova-Pfizerova opicího viru |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2008565A3 (cs) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999036545A2 (en) * | 1998-01-16 | 1999-07-22 | Genzyme Corporation | Adenoviral vectors with modified capsid proteins |
| WO1999050424A2 (en) * | 1998-03-27 | 1999-10-07 | Margaret Anne Stanley | Fusion protein comprising a sequence from a major coat protein of a papovavirus |
| WO2008081581A1 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-10 | Oncotherapy Science, Inc. | Foxp3 peptide vaccine |
-
2008
- 2008-09-15 CZ CZ20080565A patent/CZ2008565A3/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999036545A2 (en) * | 1998-01-16 | 1999-07-22 | Genzyme Corporation | Adenoviral vectors with modified capsid proteins |
| WO1999050424A2 (en) * | 1998-03-27 | 1999-10-07 | Margaret Anne Stanley | Fusion protein comprising a sequence from a major coat protein of a papovavirus |
| WO2008081581A1 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-10 | Oncotherapy Science, Inc. | Foxp3 peptide vaccine |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Grznarova P. et al.: "Modifikace virovych castic M-PMV pro imunizace", 24.kongres CeskoslovenskÚ spolecnosti mikrobiologickÚ, Liberec 2.-5.10.2007, Bulletin Cs. spol. mikorbiol., rocnik XXXXVIII, sekce virologie, str. 264, 2007 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2008565A3 (cs) | 2009-11-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| von Schwedler et al. | Proteolytic refolding of the HIV‐1 capsid protein amino‐terminus facilitates viral core assembly | |
| KR100395420B1 (ko) | 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 방법 | |
| Adamson et al. | The molecular basis of HIV capsid assembly—five years of progress | |
| JP5932647B2 (ja) | エキソソームに結合した目的のポリペプチドの分泌を可能にする新規キメラポリヌクレオチド及びポリペプチド、並びにその使用 | |
| KR100506570B1 (ko) | 바이러스-매개된 ｄｎａ 전이를 향상시키는 방법, 이러한 방법으로 형질도입된 세포 집단 및 이러한 세포 집단을 함유하는 조성물 | |
| US6090388A (en) | Peptide composition for prevention and treatment of HIV infection and immune disorders | |
| FI110613B (fi) | Kapsidia muodostava ja kysteiini-modifioitu kimeerinen MS2-vaippaproteiini | |
| EP1404819B1 (en) | Synthetic viruses and uses thereof | |
| JPH06303987A (ja) | 細胞への核酸運搬方法 | |
| CN107427571A (zh) | 基于纳米颗粒的新型多价疫苗 | |
| AU6143990A (en) | Stabilized protein or peptide conjugates | |
| Sharifzadeh et al. | A review of virus-like particle-based SARS-CoV-2 vaccines in clinical trial phases | |
| KR20100098597A (ko) | Ｈｉｖ 특이적 항체에 기반한 ｈｉｖ 예방 백신 | |
| CN114703204A (zh) | 猫细小病毒vp2蛋白及所得自主组装病毒样颗粒 | |
| CN112552413B (zh) | 新型冠状病毒重组蛋白亚单位疫苗 | |
| US8754015B2 (en) | Modified phage for displaying post-translationally modified proteins and uses thereof | |
| JPH05505616A (ja) | 天然のコンホメーションを保持している精製ｇｐ１２０組成物 | |
| CZ301144B6 (cs) | Príprava monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu s použitím modifikovaných virum podobných cástic Masonova-Pfizerova opicího viru | |
| Ogrina et al. | Bacterial expression systems based on Tymovirus-like particles for the presentation of vaccine antigens | |
| WO2024130671A1 (zh) | 一种细胞穿膜肽及其应用 | |
| Yang et al. | Convenient auto-processing vector based on bamboo mosaic virus for presentation of antigens through enzymatic coupling | |
| Wizemann et al. | Polyhistidine-tagged hepatitis B core particles as carriers of HIV-1/gp120 epitopes of different HIV-1 subtypes | |
| CN113292639B (zh) | 新城疫病毒疫苗 | |
| EP0541335A1 (en) | Recombinant DNA sequences and plasmids for cellular immunity vaccines from bacterial toxinantigen conjugates | |
| RU2217162C2 (ru) | Вакцина против вирусных инфекций |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20150915 |