CZ2008565A3 - Príprava monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu s použitím modifikovaných virum podobných cástic Masonova-Pfizerova opicího viru - Google Patents
Príprava monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu s použitím modifikovaných virum podobných cástic Masonova-Pfizerova opicího viru Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2008565A3 CZ2008565A3 CZ20080565A CZ2008565A CZ2008565A3 CZ 2008565 A3 CZ2008565 A3 CZ 2008565A3 CZ 20080565 A CZ20080565 A CZ 20080565A CZ 2008565 A CZ2008565 A CZ 2008565A CZ 2008565 A3 CZ2008565 A3 CZ 2008565A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protein
- virus
- particles
- fusion protein
- monoclonal antibodies
- Prior art date
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 14
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 14
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 abstract description 10
- 241000713821 Mason-Pfizer monkey virus Species 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 102100038535 Endogenous retrovirus group K member 10 Pro protein Human genes 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 3
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710170658 Endogenous retrovirus group K member 10 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710186314 Endogenous retrovirus group K member 21 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710162093 Endogenous retrovirus group K member 24 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710094596 Endogenous retrovirus group K member 8 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710177443 Endogenous retrovirus group K member 9 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 108700026758 Adenovirus hexon capsid Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 101710168592 Gag-Pol polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710111520 Gag-Pro polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710118026 Gag-Pro-Pol polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000893975 Homo sapiens Endogenous retrovirus group K member 10 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000974013 Homo sapiens Endogenous retrovirus group K member 10 Np9 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000956192 Homo sapiens Endogenous retrovirus group K member 10 Pro protein Proteins 0.000 description 1
- 101001066682 Homo sapiens Integrase Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101710146978 Inner membrane protein p12 Proteins 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710194278 Late genes activator p4 Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710084629 Major non-capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101710102575 Pre-neck appendage protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000011246 composite particle Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000001002 morphogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012858 packaging process Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Fúzní protein tvorený kapsidovým a nukleokapsidovým proteinem (CANC) Masonova-Pfizerova opicího viru (M-PMV) a interním peptidem FoxP3 proteinu, který je pripojen na N-konec CANC. Virum podobné cástice tvoren in vitro z takto modifikovaného proteinu. Použití modifikovaných cástic pro imunizaci zvírecích modelu a produkci monoklonálních protilátek.
Description
Oblast techniky:
Vynález se týká přípravy monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu pro laboratorní a vědecké účely. Monoklonální protilátky jsou izolovány z laboratorních zvířecích modelů po jejich imunizaci modifikovanými virům podobnými částicemi Masonova--Pfizerova opičího viru.
Použití modifikovaných virových částic pro přípravu monoklonálních protilátek je založeno na poznatku, že přítomnost virových proteinů při imunizaci a simulace tvaru virových částic zvyšují imunitní odpověď cílového organismu.
Dosavadní stav techniky:
Produkce samotných protilátek proti komerčně zajímavým peptidům je důležitým odvětvím farmaceutického průmyslu, a proto je na výzkum v této oblasti kladen velký důraz. Nároky na protilátky jsou zejména z hlediska jejich specifity, kvality a zároveň co nejlevnější produkce velmi vysoké, Nová generace imunizačních protokolů je založena na obecně přijímaném poznatku, že přítomnost virových proteinů při imunizaci a simulace tvaru virových částic zvyšují imunitní odpověď cílového organismu. Byly tedy navrženy a připraveny různé typy vakcín, které obsahují části virových proteinů, nebo celé viry zbavené patogenity a byly jimi imunizovány živočišné organismy. Nespornou výhodou takto produkovaných protilátek je jejich vysoký titr v séru imunizovaného organismu a taky jejich vysoká specifita. Kromě toho je možné ze séra izolovat také protilátky proti všem virovým proteinům, které byly pro imunizaci užity.
FoxP3 protein je členem forkhead/winged-helix rodiny transkripčních regulátorů. Je specificky exprimován v lidských CD4+ a CD25+ regulačních T-buňkách. Protilátky proti tomuto proteinu jsou žádoucí hlavně pro experimentální a detekční účely. Zejména proto bylo přistoupeno k řešení problematiky jejich přípravy.
Modifikace virových částic s cílem exponovat na jejich povrch různé typy peptidů je v posledních letech vědci často využívaná metoda. Jsou známé i patentované postupy, kde například na N-konec hlavního obalového proteinu papilomavirů je fúzován příslušný peptid
-2cit* > « » I· •* · * t í · · ·· l i * Μ I »'· · jako část sekvence proteinu viru (mezinárodní přihláška číslo WO 99/50424). Známé je též vázání peptidů, resp. ligandů, na C-konec tzv. fiber proteinu adenovirů, čím je docíleno expozice ligandů na povrchu virové částice (mezinárodní přihláška číslo WO 99/36545). Nejčastěji jsou modifikované částice, například retrovirové, užívané k cílení do vybraných typů buněk s využitím v genových terapiích (mezinárodní přihláška Číslo WO 99/28488).
Retroviry patří do čeledi Retroviridae, dle morfogenetické cesty tvorby nezralých částic jsou retro viry děleny do dvou hlavních skupin, a to retroviry typu C (členem této skupiny je i Human immunodeficiency virus - HIV) a typů A, B a D, kam se řadí také Masonův-Pfizerův opičí virus (Mason-Pfizer monkey virus, dále M-PMV). Nezralá částice M-PMV je složena z proteinových prekursorů Gag, Gag-Pro a Gag-Pro-Pol umístěných pod fosfolipidovou membránou, dále ze dvou kopií genomové RNA, tRNA a dalších nespecifických virových RNA, transmembránových a povrchových glykoproteinů, které jsou zakotveny ve fosfolipidové membráně [1], Polyproteinový prekursor Gag má následovně uspořádaní: MA (matrixový protein) - PP (fosfoprotein) - protein pl2 - CA (kapsidový protein) - NC (nukleoprotein) - protein p4. Procesem maturace vzniká z nezralé virové Částice zralá virová částice. Jedná se o proces proteolytického štěpení polyproteinů Gag, Gag-Pro a Gag-Pro-Pol aktivovanou virovou proteasou na jednotlivé proteiny. Produkty tohoto štěpení se pak reorganizují do struktury zralé virové částice. Matrixový protein vytváří vnější obalu virionu, zatímco kapsidový protein tvoří jádro virové částice tzv. „core“, které obklopuje komplex genomové RNA a nukleokapsidového proteinu.
Polyproteinový prekursor Gag má schopnost asociovat a tvořit tak nezralou částici i za nepřítomnosti ostatních částí viru. Předchozí studie ukázaly, že exprese samotného genu gag je dostatečná pro tvorbu virům podobných částic v živočišných buňkách i v bakteriích [2, 3,4, 5]. U těchto částic, na rozdíl od nezralých virů, nedochází k jejich zrání, neobsahují povrchové glykoproteíny a nejsou ani infekční. Pomocí elektronové mikroskopie bylo zjištěno, že jsou svou velikostí í strukturou nerozlišitelné od nezralých virů. Dle RumlováKliková a kol. je fuzní protein tvořen kapsidovým (CA) a nukleokapsidovým proteinem (NC), dále CANC, postačující pro skládaní do viru podobné částici. Tento fuzní protein může být dokonce zkrácen o jeden motiv zinkových prstu v NC doméně bez významného vlivu na tvorbu částic. N-terminální prolin kapsidového proteinu má ovšem rozhodující vliv, a to na tvar částic vznikajících z CANC proteinu. Jestliže je deletován nebo skryt připojením dalšího proteinu, např. MA nebo pl2, dochází k tvorbě sférických částic, zatímco exprese CANC s koncovým prolinem vede ke skládání planámích útvarů [6]. Označením CANC je v našem případě míněn fuzní kapsidový - nukleokapsidový protein včetně jeho mutantů, u kterých je zachovaná schopnost tvořit viru podobné částice, například mutantů s deletovanou koncovou aminokyselinou prolin, dále CANCPro-, Byl navržen a zkonstruován vektor pro expresi CANC se sekvencí interního peptidu FoxP3 (FoxPJCANC) na N-konci. Prostřednictvím transformovaných buněk E.coli B121 (DE3) byly produkovány molekuly FoxP3CANC fuzního proteinu, tj. každá molekula CANC měla na svém N-konci fúzován interní peptid FoxP3. Pro složení molekul proteinů do viru podobných Částic je nutná jejich vzájemná αϊ' interakce, což představuje vznik komplexu 1500 * 2000 molekul fuzního proteinu pro složení jediné částice. Tím je na povrchu částice exponován ekvivalentní počet molekul FoxP3, čím se zvyšuje efektivita procesu imunizace.
Podstata vynálezu:
Podstatou vynálezu je příprava fuzního proteinu FoxP3CANC tvořeného kapsidovým a nukleokapsídovým proteinem Masonova-Pfízerova opičího viru, na jehož N-konec je připojen interní peptid FoxP3 proteinu sekvence QLSTVDAHARTPVLQ. Tento protein je vhodný pro přípravu monoklonálních protilátek.
Podstatou vynálezu je dále příprava monoklonálních protilátek pomocí modifikovaných retrovirových kapsid M-PMV, kdy na N-konec fuzního kapsidového a nukleokapsidového proteinu byl připojen interní peptid FoxP3 proteinu. Pro produkci protilátek je třeba aby byl peptid exponován na povrchu částice. Proto je nutné umístit sekvenci pro FoxP3 peptid na Nkonec sekvence CANC, kde je, jak je uvedeno výše, buď deletovaný N-terminální prolin nebo je tento danou sekvenci skryt, pro dosažení tvorby sférických částic, /Popi# obrázků nafeHtežeftýeh/ výkresech:
Obr, 1:
Na obrázku č.l je SDS PAGE analýza úspěšnosti izolace jednotlivých fuzních proteinů. V sloupci označeném l, je fuzní protein HisCANC, jehož velikost je 36,2 kDa, v sloupci označeném 2, je fuzní protein 3HisCANC, jehož velikost je 37,88 kDa, v sloupci 3 je fuzní protein lFlagCANC, jehož velikost je 36,4 kDa, v sloupci 4 je fuzní protein 3FlagCANC, jehož velikost je 38,4 kDa a v sloupci 5 je fuzní protein FoxPSCANC, jehož velikost je 37,03 kDa.
-4I 4 » f < ♦ í · ·*· t * · · · ·· ii t · » *I *
Obr. 2:
Jedná se o elektronmikroskopické snímky sbalených viru podobných částic. Na obrázku 2A je možné vidět viru podobné částice složené z fuzního proteinu HisCANC, které jsou různých velikostí, jsou prasklé a jsou v zanedbatelně malé koncentraci, proces skládaní byl tedy neúspěšný. Na obrázku 2B je zřejmé, že proces sbalování fuzního proteinu 3HisCANC byl taky neúspěšný. Pozorovali jsme jenom pozadí tvořené nesloženým proteinem a zřídka proteinové agregáty, které ale neměly strukturu ani velikost odpovídající viru podobné částici. Na obrázku 2C jsou složeny částice z fuzního proteinu FlagCANC. Jsou v dostatečné koncentraci a mají strukturu odpovídající viru podobné částici. Tento proces skládaní byl úspěšný a tyto viru podobné částice byly poskytnuty pro imunizaci zvířecích modelů. Z obrázku 2D je zřejmé, že proces skládání fuzního proteinu 3FlagCANC nebyl úspěšný. Pozorovali jsme jenom pozadí tvořené nesloženým proteinem a proteinové agregáty různých velikostí a tvarů. Na obrázku 2E jsou úspěšně složené viru podobné částice, které byly připraveny skládáním fúzního proteinu FoxP3CANC. Na obrázku jsou částice ve více vrstvách, proto je jejich struktura hůř pozorovatelná, nicméně tyto částice byly poskytnuty pro imunizace.
Příklady provedení vynálezu:
Příklad Č.I.:
Z kompletní aminokyselinové sekvence proteinu FoxP3 (s označením NP 054728 v NCBI genové databázi) byla pro omezení velikosti peptidu exponovatelného na povrchu viru podobné částici použita sekvence interního peptidu (QLSTVDAHARTPVLQ). Na základě této sekvence byly navrženy oligonukleotidové sekvence s přesahy, viz sekvence id. č.5, které jsou komplementární k přesahům vzniklým restrikčním štěpením příslušnými endonukleasami expresního vektoru pET22b. Byla připravena sekvence pro kapsidový a nukleokapsidový protein (CANC), viz sekvence id. č.4. Obě sekvence byly tigovány do vektoru, jehož schéma je na Obr.3. Takto připraveným konstruktem byla transformována E. coli BL21(DE3).
Příklad Č.2:
Fúzní protein FoxP3CANC byl zE. coli BL21(DE3) izolován lýzí a po převedení do fosfátového pufru (50mM NaH2PO4 + Na2HPO4, 500mM NaCI, pH 7,5) byl purifikován pomocí chelatačního nosiče “HiTrap™ Chelating HP Column“. Byla využita přítomnost motivů 2 zinkových prstů v nukleoproteinu, které mají afinitu k zinečnatým iontům vázaným na koloně. Po eluci proteinu z kolony a převedení proteinu do pufru s obsahem Tris-HCl (50mM Tris-HCl, lOOmM NaCl, 0,07% merkaptoetanol, ΙμΜ ZnSCU) a do fosfátového pufru (50mM NaH2PO4 + NaiHPCú, 500mM NaCl, 0,07% merkaptoetanol, ΙμΜ ZnSO^ byl protein zahuštěn na koncentraci 1 mg/ml. V této koncentraci byl použit k přípravě viru podobných částic in vitro.
Příklad č.3:
Viru podobné částice byly z fuzního proteinu FoxP3CANC připraveny dvě hodiny trvající dialýzou směsi sestávající z alikvotní části proteinu aalikvotního množství MS2 RNA (genomová RNA bakteriofága MS2, ale je možné použít i libovolnou jinou nukleovou kyselinu) proti pufru s obsahem 50mM Tris-HCl, lOOmM NaCl a ΙμΜ ZnSC>4 při pokojové teplotě za neustálého míchaní. Proces správného skládaní proteinu do viru podobných částic byl ověřován pomocí transmisní elektronové mikroskopie.
Příklad Č.4:
Připravenými viru podobnými částicemi byly imunizovány laboratorní myši kmene BALB/c (je možné použít i hybridní myši Ft (BALB/c x BIO.A)) třemi dávkami podávanými subkutánně ve čtrnáctidenních intervalech. Před zahájením imunizace a dále po druhé a třetí imunizační dávce byly odebírány vzorky krve. V séru připraveném z těchto vzorků byl stanoven titr protilátek u dané myši metodou detekce specifických protilátek v Terasakiho destičkách. Myším, jejichž sérum mělo nej silnější reakci, se aplikovala intraperitoneálně čtvrtá dávka antigenu (obvykle dvojnásobek předcházejících dávek). Imunizovaná myš byla usmrcena v souladu se zákonem 77/2004 Sb., v platném znění, na ochranu zvířat proti týrání. Z myší byla odebrána plná krev a slezina. Získané sérum se používá jako pozitivní kontrola při testu supematantů na obsah specifických protilátek. Část slezinných buněk byla resuspendovaná v kultivačním médiu, zcentriíugovaná a peleta byla resuspendováná v kultivačním médiu bez séra. Takto připraveny slezinné buňky byly smíchány s myelomovými buňkami, rovněž centrifugovanými a resuspendovanými v kultivačním médiu bez séra. Myelomové buňky byly připraveny týden před plánovanou fúzí, a to rozmražením a pasážovaním s cílem dosáhnout co největšího počtu rychle prolifcrujících buněk,
-6Mi · > * t r j · · · i » «· > · > · * zcentrifugováním a resuspendováním vbezsérovém médiu. Takto připravené myelomové buňky byly smíchávány se slezinnými buňkami v poměru 15x106 myelomových buněk k ať 6
10Qx200 x 10 slezinných buněk. Směs buněk byla následně centrifugovaná. Supematant byl odstraněn a buněčný sediment byl lehce roztřepán. Fúze byla provedena dle následujícího schématu:
0. - 1. min přidání 50% roztoku PEG (polyetylenglykol)...................I ml (pro vyvolání buněčných fúzí jsou používány roztoky polyetylenglykolů o molekulové w
hmotnosti 1000r6000 g/mol)
1. -2. min míchání
2. -3. min přidání bezsérového média.................1ml
3. -4, min přidání bezsérového média1 ml
4. - 7. min přidání bezsérového média.................7ml
Buněčná suspenze byla opět centrifugována, buněčný sediment byl resuspendován v selekčním HAT médiu (hypoxantin, aminopterin, thymidin, kompletní kultivační médium RPMI). Tato suspenze byla rozpipetována do mikrokultivačních destiček s předem připravenými podpůrnými buňkami. Čtrnáctý den po fúzi bylo HAT médium zaměněno za HT médium (hypoxantin, thymidin, kompletní kultivační médium RPMI) a za dalších sedm dní za kompletní kultivační médium. Supematant z dobře narostlých jamek byl testován na ar produkci specifických protilátek, Od každého pozitivního klonu byly vybrány 1 * 2 subklony, které se nechaly narůst. Supemanant od každého klonu pak byl podroben dalšímu testování pro stanovení specifity daného klonu.
Příklad č, 5
Postupem uvedeným v příkladech 1 a 2 jsme kromě FoxP3CANC připravili také 4 další fuzní polypeptidy. Na N-konec CANC proteinu jsme připojili sekvenci 6 histidinů, sekvenci 18 histidinů, sekvenci Flag (sekvence id. č.6) a sekvenci tří po sobě následujících Flag sekvencí. Jednotlivé fuzní proteiny, které byly produkovány po expresi vektorů v buňkách E. coli BL21(DE3), byly dle příslušného fúzovaného peptidu označeny jako HisCANC (sekvence 6 histidinů), 3HisCANC (sekvence 18 histidinů), FlagCANC (sekvence Flag), 3FlagCANC (sekvence tří po sobě následujících Flag sekvencí) a FoxP3CANC (interní peptid FoxP3 proteinu). Už při izolaci jednotlivých fůzních proteinů z buněk, se projevily rozdílné vlastnosti jednotlivých proteinů, a proto byly některé podmínky purifikace a izolace nutně modifikovány. Přehled úspěšnosti izolace jednotlivých fůzních proteinů, jejich složení do viru podobných částic a úspěšnost imunizace těmito částicemi je uvedena v tabulce č.1.
• « * t
· 4 ··««*· ’ » ’
7» a·· · a » a <
_ 4 a < a a a a · a a · < * «
Tabulka č.l Přehled úspěšnosti jednotlivých procesů, které jsou součástí přípravy monoklonálních protilátek.
+++ proces byl úspěšný vhledem ke koncentraci a čistotě produktu proces byl neúspěšný
| Fúznl protein s exponovaným peptidem | Vyizolovaný protein | Složené částice | Tvorba monoklonálních protilátek proti FoxP3 |
| HisCANC | +++ | - | - |
| 3HisCANC | +++ | - | - |
| FlagCANC | +++ | +++ | - |
| 3FlagCANC | +++ | - | - |
| FoxP3CANC | +++ | +++ | +++ |
I když izolace všech pěti fuzních proteinů byla úspěšná, viz Obr. č.l, proces skládaní proteinů do viru podobných částic byl úspěšný jen u dvou fuzních proteinů, a to FoxP3CANC a FlagCANC, viz Obr. č.2. Úspěšnost skládání byla zřejmě ovlivněna samotnými vlastnostmi jednotlivých aminokyselin v sekvenci peptidu, jenž byl fúzován na N-konec CANC. Konkrétně u proteinů HisCANC a 3HisCANC dochází k vysoké kumulaci bazických aminokyselin, což by mohlo mít za následek neschopnost jednotlivých molekul fuzních proteinů vzájemně intereagovat a skládat se do viru podobných částic. Jak je zřejmé z Obr.2 (A,B), bylo pozorováno zanedbatelné množství vytvořených částic, které ještě byly i značně poškozené. U 3 FlagCANC byla důvodem neúspěšného skládání proteinu zřejmě příliš dlouhá sekvence fúzovaného peptidu, jednalo se o 24 aminokyselin. Není tedy vůbec pravidlem, že po připojení libovolného peptidu na N-konec fuzního proteinu CANC dojde ke složení fuzního proteinu do viru podobné částice.
Ale ani úspěšná příprava složených viru podobných částic ještě není zárukou úspěšné produkce protilátek imunizovaným organismem. Na povrchu viru podobné částici exponovaný peptid totiž nemusí být dostupný buňkám imunitního systému. Povrch částice je poměrně členitý a tak délka exponovaného peptidu nemusí být postačující pro požadovaný přesah nad povrchové nerovnosti částice. Taky může dojít k různým konformačním ohybům řetězce peptidu. Konkrétně naše dva úspěšně složené proteiny FlagCANC a FoxP3CANC byly poskytnuty pro imunizace za stejných podmínek, Ze zvířete imunizovaného částicemi FlagCANC se ale nepodařilo izolovat protilátky proti danému peptidu, tedy Flag sekvenci, ale jenom protilátky proti samotným proteinům virové částice.
Podstata úspěšné přípravy monoklonálních protilátek tímto způsobem tedy spočívá ve zvolení správné aminokyselinové sekvence s optimálním uspořádáním jednotlivých aminokyselin a • ·
-8* · ·
taky ve správně zvolené délce této sekvence. Samotná technika je v porovnání s běžně užívanou technikou kovalentní vazby peptidu na adjuvans účinnější, V odborné literatuře z oblasti modelování a přípravy vakcín s použitím adjuvans se uvádějí problémy s velmi slabou nebo žádnou imunomodulační schopností použitého adjuvans a tedy velmi nízkým títrem požadovaných protilátek v organismu. Naopak u virových proteinů je imunomodulační schopnost velmi vysoká. Adjuvans jsou většinou složena z různých komponentů a jejich aplikace je Často doprovázena různými negativními reakcemi imunizovaného organismu. Adjuvans jsou různě chemicky a biologicky definována, ale i tak jsou často málo stabilní. Na sloučeniny, jenž mají být použity jako adjuvans, jsou kladeny vysoké nároky z hlediska jejich imunogenicity, biodegradabilnosti a biokompatibility. Protože se jedná o chemické sloučeniny připravované synteticky, je nevyhnutné zmapovat také jejich dlouhodobé působení na organismus z hlediska toxikologického. U některých typů vakcín užívajících jako nosič cílového peptidu adjuvans byla v cílovém organismu sledovaná indukce různých autoimunitních reakcí způsobených právě přítomností daného adjuvans [7], Složené virům podobné částice určené pro imunizace jsou hodně dobře skladovatelné, jsou velmi stabilní, l(Jf C i několik let, a protože se jedná o biologický materiál, nedochází k nežádoucí kumulaci n
v organismu.
Průmyslová využitelnost:
Modifikované viru podobné částice dle předloženého vynálezu jsou vhodné pro přípravu monoklonálnich protilátek proti FoxP3 proteinu, který je členem forkhead/winged-helix rodiny transkripčních regulátorů.
Reference:
1. Rawat S.S., Viard M., Gallo S., Rein A., Blumenthal R., Puri A.: Modulation of entry of enveloped viruses by cholesterol and sphingolipids, Mol.Membr Biol, 2003, vol. 20, p. 243254.
2. Kliková M., Rhee S., Hunter E., Ruml T.: Efficient in vivo and in vitro assembly of retroviral capsíds from Gag precursor proteins expressed in bakteria, Joumal of Virology, 1995, vol.69, p.1093-1098.
3. Parker S.D., Hunter E.: A Cell-Line-Specific Defect in the Intracellular Transport and Release of Assembled Retroviral Capsids, Joumal of Virology, 2000, vol.74, p.784-795.
• i t ♦ « 1 · · • · li
4. Rhee S.S., Hunter E.: Amino acid substitutions within the matrix protein of type D retroviruses affect assembly, transport and membrane association of a capsid, EMBO J., 1991, vol. 10, p.535-546.
5. Sakalian M., Parker S.D., Weldon R.A., Hunter E.: Synthesis and assembly of retrovirus Gag precursors into immature capsids in vitro, Joumal of Virology, 1996, vol.70, p.37063715.
6. Kliková-Rumlová M., Hunter E., Nermut M.V., Pichová I., Ruml T.: Analysis of MasonPfizer moneky virus Gag domains required for capsid assembly in bacteria: Role of Nterminal proline residue of CA in directing particle shape, Joumal of Virology, 2000, vol. 74, p.8452-8459.
7. Guy B., The perfect mix: recent progress in adjutant research, Nátuře Reviews, Mikrobiology, 2007, vol.5, p.505-515.
Přehled sekvencí:
Identifikační číslo: 1
Charakteristika: aminokyselinová sekvence modifikovaného fuzního kapsidového a nukleokapsídového proteinu s aminokyselinovou sekvencí peptidu FoxP3 (vyznačeno tlustým písmem) na N-konci.
MQLSTVDAHARTPVLQGSVTETVDGQGQAWRHHNGFDFAVIKELKTAASQYGAT APYTLAIVESVADNWLTPTDWNTLVRAVLSGGDHLLWKSEFFENCRDTAKRNQQAG NGWDFDMLTGSGNYSSTDAQMQYDPGLFAQIQAAATKAWRKLPVKGDPGASLTGV KQGPDEPFADFVHRLITTAGRIFGSAEAGVDYVKQLAYENANPACQAAIRPYRKKTD LTGYIRLCSDIGPSYQQGLAMAAAFSGQTVKDFLNNKNKEKGGCCFKCGKKGHFAK NCHEHAHNNAEPKVPGLCPRCKRGKHWANECKSKTDNQGNPIPPHQGNGWRGQPQ APKQAY
Identifikační číslo: 2
Charakteristika: aminokyselinová sekvence proteinu FoxP3 s vyznačeným interním peptidem (vyznačeno tlustým písmem), který byl použit pro N-terminální fúzí s CANC.
MPNPRPGKPSAPSLALGPSPGASPSWRAAPKASDLLGARGPGGTFQGRDLRGGAHAS SSSLNPMPPSQLQLPTLPLVMVAPSGARLGPLPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHAR » « 1Λ . .......
-10 - ·· *· *·
TPVLQVHPLESPAMISLTPPTTATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPN PSAPRKDSTLSAVPQSSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEDFLKHCQADHLLDEKGRA QCLLQREMVQSLEQQLVLEKEKLSAMQAHLAGKMALTKASSVASSDKGSCCIVAAG SQGPVVPAWSGPREAPDSLFAVRRHLWGSHGNSTFPEFLHNMDYFKFHNMRPPFTY ATLIRWAILEAPEKQRTLNEIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVE SEKGAVWTVDELEFRKKRSQRPSRCSNPTPGP
Identifikační číslo: 3
Charakteristika: aminokyselinová sekvence fuzního kapsidového a nukleokapsidového proteinu s naznačenou delecí terminální aminokyseliny prolin (vyznačeno tlustým písmem), která vede ke vzniku mutanta CANCPro-.
PVTETVDGQGQAWRHHNGFDFAVIKELKTAASQYGATAPYTLAIVESVADNWLTPT DWNTLVRAVLSGGDHLLWKSEFFENCRDTAKRNQQAGNGWDFDMLTGSGNYSSTD AQMQYDPGLFAQIQAAATKAWRKLPVKGDPGASLTGVKQGPDEPFADFVHRLITTA GRIFGSAEAGVDYVKQLAYENANPACQAAIRPYRKKTDLTGYIRLCSDIGPSYQQGL AMAAAFSGQTVKDFLNNKNKEKGGCCFKCGKKGHFAKNCHEHAHNNAEPKVPGLC PRCKRGKHWANECKSKTDNQGNPIPPHQGNGWRGQPQAPKQAY
Identifikační číslo: 4
Charakteristika: DNA sekvence fuzního kapsidového a nukleokapsidového proteinu s naznačenou delecí kodonu pro koncovou aminokyselinu prolin (vyznačeno tlustým písmem), která vede k vzniku mutanta CANCPro-,
CCAGTGACTGAAACCGTTGATGGGCAAGGTCAAGCCTGGAGACACCATAATGGT TTTGATTTTGCCGTCATAAAAGAATTAAAAACAGCTGCTTCCCAATATGGGGCTA CTGCCCCATACACATTAGCCATAGTGGAATCTGTAGCGGACAATTGGCTTACCCC TACAGATTGGAATACGCTTGTTAGGGCAGTCCTCTCAGGAGGAGATCACTTACTG TGGAAATCTGAGTTTTTTGAAAATTGCAGAGATACGGCTAAAAGAAACCAACAA GCCGGTAATGGCTGGGATTTTGACATGTTAACAGGTTCGGGTAATTATTCCAGCA CCGATGCACAAATGCAGTATGATCCAGGATTGTTTGCTCAAATTCAAGCGGCTGC TACAAAAGCCTGGAGAAAACTTCCCGTTAAGGGAGACCCAGGAGCCTCCCTTAC AGGAGTCAAACAAGGACCCGATGAGCCATTTGCAGATTTCGTACACAGACTTATA
I · g 4*1 II···» · · <
♦ .«*»*·* 4
-]]- ····· I* * · ♦· “
ACAACTGCTGGGAGAATCTTTGGAAGTGCTGAGGCCGGTGTAGACTATGTAAAAC
AACTAGCATATGAAAATGCTAATCCAGCTTGTCAGGCAGCCATTCGCCCCTATAG
AAAGAAGACAGATTTAACTGGCTATATCCGTCTTTGCTCGGATATTGGGCCCTCTT ATCAGCAAGGCCTGGCCATGGCCGCCGCCTTTAGCGGGCAGACTGTAAAAGATTT TCTTAACAACAAAAATAAAGAGAAAGGAGGGTGTTGCTTTAAATGCGGTAAAAA AGGACACTTTGCAAAAAATTGTCATGAACATGCACATAACAATGCTGAACCAAA AGTTCCCGGACTCTGCCCTAGATGTAAAAGAGGGAAACATTGGGCCAATGAATG CAAATCCAAAACTGATAATCAAGGAAACCCAATACCACCCCATCAGGGAAACGG GTGGAGGGGCCAGCCCCAGGCCCCGAAACAAGCTTAT
AGTTCCCGGACTCTGCCCTAGATGTAAAAGAGGGAAACATTGGGCCAATGAATG CAAATCCAAAACTGATAATCAAGGAAACCCAATACCACCCCATCAGGGAAACGG GTGGAGGGGCCAGCCCCAGGCCCCGAAACAAGCTTATTAAC
Identifikační číslo: 5
Charakteristika: DNA sekvence interního peptidu FoxP3 proteinu.
TATGCAACTCTCAACGGTAGATGCCCACGCCCGAACCCCTGTGCTTCAGG
Identifikační číslo: 6
Charakteristika: aminokyselinová sekvence peptidu Flag, který byl použit pro N-terminální fúzi s CANC.
DYKDDDDK
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Fúzní protein FoxP3CANC tvořený kapsidovým a nukleokapsidovým proteinemMasonova-Pfizerova opičího viru, na jehož N-konec je připojen peptid sekvence QLSTVDAHARTPVLQ.
- 2. Fúzní protein dle nároku 1, který má sekvenci id. č. 1.
- 3. Viru podobné částice tvořené fiizním proteinem dle nároků 1 nebo 2.
- 4. Molekula nukleové kyseliny kódující fuzní protein dle nároku 1 nebo 2.
- 5. Expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny dle nároku 4.
- 6. Hostitelská buňka obsahující vektor dle nároku 5.
- 7. Hostitelská buňka dle nároku 6, kterou je E. coli B121 (DE3).
- 8. Použití fůzního proteinu FoxP3CANC dle kteréhokoli z nároků 1 a 2 pro přípravu monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20080565A CZ2008565A3 (cs) | 2008-09-15 | 2008-09-15 | Príprava monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu s použitím modifikovaných virum podobných cástic Masonova-Pfizerova opicího viru |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20080565A CZ2008565A3 (cs) | 2008-09-15 | 2008-09-15 | Príprava monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu s použitím modifikovaných virum podobných cástic Masonova-Pfizerova opicího viru |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ301144B6 CZ301144B6 (cs) | 2009-11-18 |
| CZ2008565A3 true CZ2008565A3 (cs) | 2009-11-18 |
Family
ID=41297127
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20080565A CZ2008565A3 (cs) | 2008-09-15 | 2008-09-15 | Príprava monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu s použitím modifikovaných virum podobných cástic Masonova-Pfizerova opicího viru |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2008565A3 (cs) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1044274A2 (en) * | 1998-01-16 | 2000-10-18 | Genzyme Corporation | Adenoviral vectors with modified capsid proteins |
| GB9806666D0 (en) * | 1998-03-27 | 1998-05-27 | Stanley Margaret | Antigen preparation and use |
| TWI441648B (zh) * | 2007-01-03 | 2014-06-21 | Oncotherapy Science Inc | Ｆｏｘｐ３胜肽疫苗 |
-
2008
- 2008-09-15 CZ CZ20080565A patent/CZ2008565A3/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ301144B6 (cs) | 2009-11-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020200303B9 (en) | Novel multivalent nanoparticle-based vaccines | |
| TWI227242B (en) | Peptide composition for prevention and treatment of HIV infection and immune disorders | |
| US9109011B2 (en) | Dendritic cell-specific antibody conjugate comprising anti-CD40 monoclonal antibodies conjugated to HIV-1 Gag/Nef | |
| US5747334A (en) | Random peptide library | |
| Adamson et al. | The molecular basis of HIV capsid assembly—five years of progress | |
| Taylor et al. | Influence of three‐dimensional structure on the immunogenicity of a peptide expressed on the surface of a plant virus | |
| US7628987B2 (en) | Vectors derived from antibodies for transferring substances into cells | |
| RU2677799C2 (ru) | Модифицированные суперспиральные белки с улучшенными свойствами | |
| JPH06303987A (ja) | 細胞への核酸運搬方法 | |
| Sharifzadeh et al. | A review of virus-like particle-based SARS-CoV-2 vaccines in clinical trial phases | |
| JPH06504907A (ja) | 抗原発現キメラタンパク質 | |
| CN106255699A (zh) | 细胞穿透肽和使用其输送生物活性物质的方法 | |
| CN112089831A (zh) | 重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法 | |
| CN114703204A (zh) | 猫细小病毒vp2蛋白及所得自主组装病毒样颗粒 | |
| US20160000901A1 (en) | Compositions and Methods for the Production of Virus-Like Particles | |
| Tan et al. | Recombinant turnip yellow mosaic virus coat protein as a potential nanocarrier | |
| JP7062595B2 (ja) | 複合ポリペプチド単量体、細胞浸透機能を有する当該複合ポリペプチドの単量体の会合体、及び、当該会合体を有効成分とする皮下、皮内、経皮又は筋肉内投与用ノロウイルスコンポーネントワクチン | |
| CA2077277A1 (en) | Cellular immunity vaccines from bacterial toxin-antigen conjugates | |
| CZ2008565A3 (cs) | Príprava monoklonálních protilátek proti FoxP3 proteinu s použitím modifikovaných virum podobných cástic Masonova-Pfizerova opicího viru | |
| Ogrina et al. | Bacterial expression systems based on Tymovirus-like particles for the presentation of vaccine antigens | |
| KR20140135771A (ko) | Hiv-1 gp41 프리-헤어핀 중간체의 안정한 펩티드 모방체 | |
| Yang et al. | Convenient auto-processing vector based on bamboo mosaic virus for presentation of antigens through enzymatic coupling | |
| WO2024130671A1 (zh) | 一种细胞穿膜肽及其应用 | |
| JP7651129B2 (ja) | ウイルスの非構造タンパク質が担持された複合タンパク質単量体、当該単量体の会合体、及び当該会合体を有効成分とするコンポーネントワクチン | |
| CN120441714A (zh) | 一种广谱性冠状病毒蛋白嵌合型纳米颗粒疫苗及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20150915 |