CZ289780B6 - Famaceutický prostředek k léčení chorob vyvolaných tvorbou volných radikálů - Google Patents

Abstract

e en se t²k pou it 8,9-dehydroestronu pro v²robu farmaceutick ho prost°edku k l en chorob, vyvolan²ch tvorbou voln²ch radik l , zejm na zhoubn²ch n dor , poruch centr ln ho nervov ho syst mu, perifern ch c v, revmatoidn artritidy a virov hepatitidy.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká použití 8,9-dehydroestronu pro výrobu farmaceutického prostředku.

Dosavadní stav techniky

Bylo prokázáno, že biologicky vytvářené volné radikály se účastní velkého množství chorobných stavů. Přežití aerobních organismů v kyslíkovém prostředí zahrnuje složité vzájemné ovlivňování biologické tvorby těchto velmi reaktivních chemických sloučenin a schopnosti organismu je kontrolovat (Del Maestro R. F., Acta Phys. Scan. Suppl. 492, 153-68, 1980). Takové vzájemné ovlivňování hostitelského organismu a biologicky vytvářených volných radikálů má za následek hluboké biochemické změny, které vrcholí buněčným poškozením a smrtí organismu. Nahromaděné produkty reakcí volných radikálů vyvolávají někteiý z velkého množství chorobných stavů, o nichž se předpokládá, že působí, přinejmenším částečně, buněčné poškození, vyvolané zvýšeným tokem intrabuněčných volných radikálů.Takové chorobné stavy zahrnují, nikoli však výlučně, nádorové choroby, kardiovaskulární onemocnění, poruchy centrálního nervového systému, onemocnění kostí, stárnutí, Alzheimerovu chorobu, zánětlivá onemocnění, revmatoidní artritidu, autoimunitní onemocnění, dechovou nedostatečnost a rozedmu.

Souvislost mezi poškozením volnými radikály a velkým množstvím chorobných stavů je dobře doloženo a mezi možné cíle reaktivních volných radikálů patří mnoho buněčných složek, včetně enzymů, iontových kanálů, strukturních bílkovin a membránových lipidů (Rice-Evans C., Mol. Aspects of Med. 13(1), 1-111, 1992). Poškození bude vymezeno stavem antioxidantu a vhodnou polohou. Reakce volného radikálu s vedenými možnými cílovými strukturami může ohrozit řadu buněčných funkcí, což vede k patologické změně a nakonec k usmrcení buňky. Stav antioxidantu a možné reakční místo budou vymezovat poškození. Antioxidační látky hrají důležitou roli v ochraně DNA, bílkovin (včetně lipoproteinů) a membránových lipidů vůči oxidativnímu poškození.

Existují významné důkazy, že se poškození volnými radikály podílí na etiologii mnoha chronických zdravotních obtíží. U mnoha lidských onemocnění je tvorba oxidantu z endogenních (vnitřních) zdrojů druhotná vzhledem k prvotnímu procesu onemocnění, ovšem oxidativní poškození podráždí primární lézi. Například reperfúzní poškození může být definováno jako poškození, které nastává v orgánu během obnovení krevního toku po období ischemie. Obnovení přítomnosti kyslíku, jakkoli nezbytné, vyvolává v poškozené tkáni zvýšenou tvorbu oxidantu a dočasně zhoršuje poškození (Uraizee A., Circulation 75(6), 1237-1248, 1987). U hypoxické srdeční svaloviny bylo během reoxygenace (obnovení dostupnosti kyslíku) doloženo Guanierim (Biochim. Biophys. Acta 718(2), 157-164, 1982) snížení obrany dosažené za použití antioxidantu a následný nárůst peroxidace lipidů. U reperfúzního poškození zánětlivá odpověď v místě narušení endotelu (výstelky cév a dutin) ischemickým poškozením produkuje superoxid adhezí a aktivací neutrofilů. V mnoha odlišných klinických podmínkách je rovněž zvýšena tvorba volných kyslíkových radikálů v játrech. U virového zánětu jater (hepatitidě) a chronicky aktivního zánětu jater se v játrech shromažďuje velké množství stimulovaných makrofágů, které vytvářejí volné radikály. Množství toxických chemikálií vyvolává toxické poškození jater, způsobené zvýšenou tvorbou volných radikálů v játrech, často zprostředkovanou cytochromem P-450. Lze předpokládat, že tvorba hydroxylového radikálu, katalyzovaná železem, uvolňovaným z ferritinu, je mechanismem, spojeným s mnoha jatemími onemocněními (Lee W. M., New Engl. J. Med; Review P.l 118,1995).

Oxidace a použití antioxidantů je rovněž důležité pro léčbu mnoha zánětlivých chorobných stavů. Revmatoidní artritida (RA) je nejběžnějším chronickým zánětlivým onemocněním.

-1 CZ 289780 B6

I

Epidemiologické studie udávají rozsah rozšíření klasické a jednoznačné RA mezi 0,3 a 1,5 procenty. Kloubní choroba s chronicky přetrvávajícím zánětem je doprovázena tvorbou peroxidu vodíku v zánětlivém revmatickém kloubu. Během zánětu jsou rovněž vytvářeny volné kyslíkové radikály, a to zvláště polymorfonukleámími leukocyty a (PMN) a makrofágy. Při jakémkoli 5 chronickém či akutním zánětlivém onemocnění budou PMN a makrofágy produkovat jak O₂, tak i H₂O₂. Jako zánětlivá onemocnění s podílem oxidace mohou být uvedeny také tuberkulóza, Iupénka, systémový lupus erythematodes a jiná autoimunitní onemocnění, syndrom dechové nedostatečnosti dospělých, a tento seznam může zahrnovat i mnohá další onemocnění.

Vytváření kyslíkových radikálů a proces peroxidace lipidů se rovněž dostaly do středu pozornosti vědců, pracujících v oboru traumatu (poranění) a mrtvice centrálního nervového systému (CNS), například ischemie. Mnohé studie významně podpořily výskyt reakcí volných radikálů a peroxidace lipidů v poškozené nebo ischemické centrální nervové soustavě (Halí E. D., J. Neurotrauma 9(suppl. 1), S165-S172, 1992).

Antioxidanty byly uvažovány jako ochranné látky vůči rakovině prsu a jiným nádorovým onemocněním, včetně nádorových onemocnění mozku a jater, a rovněž jako ochranné látky vůči kardiovaskulárnímu onemocnění a osteoporóze (řídnutí kostí) (Wiseman H., Free Radical Res. 21(3), 187-94, 1994). Bylo prokázáno, že chrání modelové a buněčné membrány včetně jaderné 20 membrány proti případně karcinogenním meziproduktům volných radikálů a produktům peroxidace lipidů. Závažné komplikace, spojené s arterosklerózou a jejím běžným výskytem, zaměřily pozornost na prevenci a léčbu této cévní choroby, s možností využít schopnosti antioxidantů chránit lipoproteiny o nízké hustotě (LDL) vůči oxidačnímu poškození (Steinberg D., New Engl. J. Med. 14.915-924,1989).

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká použití 8,9-dehydroestronu pro výrobu farmaceutického prostředku, 30 využitelného k léčbě či potlačení chorob, vyvolaných volnými radikály, spočívající v podávání farmaceutického prostředku s antioxidačně působícím množstvím 8,9-dehydroestronu savcům, kteří to potřebují. Jako logický důsledek tento vynález poskytuje způsob ovlivnění reakcí volných radikálů s enzymy, iontovými kanály, strukturními bílkovinami a membránovými lipidy u savců, který zahrnuje podávání 8,9-dehydroestronu jako obětního substrátu, v množství, které dostačuje 35 k selektivní reakci s volnými radikály a inhibici reakce volných radikálů s pacientovými enzymy, iontovými kanály, strukturními bílkovinami a membránovými lipidy a k její inhibici. Specifickými příklady, kdy je léčba antioxidačními látkami označována za opodstatněnou, jsou rakovinná onemocnění, poruchy centrálního nervového systému, kostní onemocnění, stárnutí, zánětlivá onemocnění, periferní žilní onemocnění, revmatoidní artritida, autoimunitní onemocnění, 40 dechová nedostatečnost, rozedma, prevence reperfúzního poškození, virový zánět jater, chronicky aktivní zánět jater, tuberkulóza, Iupénka, systémový lupus erythematodes, syndrom dechové nedostatečností u dospělých a trauma (poškození) CNS a mozková mrtvice.

Při použití v souladu s tímto vynálezem se působení vzniklého farmaceutického prostředku týká 45 ovlivnění existujícího stavu, zlepšení stavu nebo zmírnění stavu nemocného a inhibování zahrnuje potlačení či prevenci postupu nebo vývoje stavu onemocnění.

Antioxidační látka může být ve farmaceutickém prostředku formována sama o sobě, anebo pro podávání společně s farmaceutickým nosičem, jehož podíl je určen rozpustností a chemickou 50 povahou sloučeniny, zvolenou cestou podávání a standardní farmakologickou praxí. Farmaceutický nosič může být pevnou nebo kapalnou látkou.

Pevný nosič může zahrnovat jednu či více látek, které mohou rovněž působit jako příchutě, lubrikační činidla, solubilizační činidla, suspenzní činidla, plniva, kluzné látky, činidla napomá55 hájící stlačení, pojivá nebo činidla, napomáhající rozpadu; může být rovněž materiálem

-2CZ 289780 B6 k zapouzdření (enkapsulaci). U prášků je nosič jemně dělenou pevnou látkou, která je smíšena s jemně dělenou aktivní složkou.U tablet je aktivní složka ve vhodném poměru smíšena s nosičem, majícím nezbytné vlastnosti pro stlačení (lisování) a slisována do požadovaného tvaru a velikosti. Prášky a tablety s výhodou obsahují až do 99 %aktivní složky. Ke vhodným pevným nosičům patří například fosforečnan vápenatý, stearát hořečnatý, talek, cukry, laktóza, dextrin, škrob, želatina, celulóza, methylcelulóza, sodná karboxymethylcelulóza, polyvinylpyrrolidon, nízkotající vosky a iontově výměnné pryskyřice.

Kapalné nosiče se používají v přípravě roztoků, suspenzí, emulzí, sirupů, tinktur a prostředků, uchovávaných pod tlakem. Aktivní složka může být rozpuštěna nebo suspendována ve farmaceuticky přijatelném kapalném nosiči, jako je voda, organické rozpouštědlo, směs obojího nebo ve farmaceuticky přijatelných olejích či tucích. Kapalný nosič může obsahovat další vhodné farmaceutické přídavné látky, jako solubilizátory, emulgační činidla, pufiy, konzervační látky, sladidla, příchutě, suspenzní činidla, zahušťovací činidla, barviva, regulátory viskozity, stabilizátory nebo regulátory osmotického tlaku. K vhodným příkladům kapalných nosičů pro perorální a parenterální podávání patří voda (částečně obsahující výše uvedené přídavné látky, např. deriváty celulózy, s výhodou roztok sodné karboxymethylcelulózy), alkoholy (včetně jednosytných a vícesytných, např. glykolů) a jejich deriváty, lecitiny a oleje (např. frakcionovaný olej z kokosových ořechů a podzemnicový olej). Pro parenterální podávání může být nosičem také olejovitý ester jako ethyloleát a isopropylmyristát. Sterilní kapalné nosiče se hodí pro přípravky ve sterilní tekuté formě pro parenterální podávání. Kapalným nosičem pro přípravky, uchovávané pod tlakem, může být halogenovaný uhlovodík nebo jiná farmaceuticky přijatelná hnací (propelantní) látka.

Kapalné farmaceutické prostředky, které jsou sterilními roztoky nebo suspenzemi, mohou být použity například k intramuskulámí (nitrosvalové), intraperitoneální (do břišní dutiny) nebo subkutánní (podkožní) injikaci. Sterilní roztoky mohou být podávány také intravenózně (do žíly). Prostředky podle tohoto vynálezu mohou být také podávány perorálně (ústy) ve formě kapalného nebo pevného prostředku.

Farmaceutický prostředek obsahující 8,9-dehydroestron může být podáván rektálně ve formě běžných čípků.Pro podávání intranasální nebo intrabronchiální inhalací (inhalování nosem či do krku) či insuflací může být prostředek obsahující 8,9-dehydroestron upraven do formy vodných nebo částečně vodných roztoků, které pak lze používat ve formě aerosolu. Farmaceutický prostředek obsahující 8,9-dehydroestron může být podáván také transdermálně (přes pokožku) za použití transdermální náplasti, obsahující aktivní sloučeninu a nosič, která je k aktivní složce inertní, nepůsobí toxicky na kůži a umožňuje přísun činidla pro systematickou absorpci do krve přes pokožku. Nosič může mít jakékoli množství forem, jako jsou krémy a mazání (masti), pasty, gely a okluzívní zařízení. Krémy a masti mohou být viskózní kapalné nebo polopevné emulze buď typu oleje ve vodě, nebo vody v oleji. Vhodné mohou být také pasty, zahrnující absorpční (vstřebatelné) prášky, rozptýlené ve vazelíně, nebo hydrofilní vazelínu s obsahem aktivní složky. K uvolňování aktivní složky do krevního řečiště může být použito mnoho okluzívních zařízení, jako polopropustná membrána, pokrývající zásobník s aktivní složkou a nosičem nebo bez něho, nebo matrice s obsahem aktivní složky. Další okluzní zařízení jsou uveden v literatuře.

Farmaceutický prostředek obsahující 8,9-dehydroestron může být kromě toho používán jako roztok, krém nebo emulze (lotion) po úpravě s farmaceuticky přijatelnými vehikuly (pojivý), obsahujícími 0,1 až 5 % a lépe 2 % aktivní složky, která může být nanášena na funkčně postižené místo.

Požadavky dávkování se liší podle jednotlivých použitých prostředků, způsobu aplikace, závažnosti vykazovaných příznaků a jednotlivého pacienta. Na základě výsledků, získaných standardními farmakologickými testy, by navrhované denní dávky aktivní sloučeniny měly být v rozmezí 0,02 až 500 pg/kg. Farmaceutický prostředek je s výhodou ve formě dávkovačích jednotek, např. tablet nebo kapslí. V takové formě je prostředek dále rozdělen do jednotek dávky,

-3CZ 289780 B6

I obsahujících vhodná množství aktivní složky; jednotnými dávkovacími formami mohou být celá balení prostředku, například balení prášku, lékovek, ampulí, předem plněných stříkaček nebo sáčků s obsahem tekutiny. Jednotkou dávkovači formy může být například samotná kapsle nebo tableta, nebo vhodný počet jakýchkoli takových prostředků ve formě celého balení.

Farmaceutické testy

Antioxidační působení 8,9-dehydroestronu bylo stanoveno standardním farmakologickým testem, měřícím schopnost inhibice tvorby oxidačně modifikovaných lipoproteinů o nízké hustotě 10 (LDL), indukovaných buď vystavením vlivu Cu⁺’ iontů, nebo kultivovaných endoteliálních buněk (Parthasarathy S., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 1046-1050, 1989), za využití metody TBARS (thiobarbituric acid reactive substances, tj. pomocí látek reagujících s kyselinou thiobarbiturovou) k analýze volných aldehydů (Yagi K., Biochem. Med. 15,212-216,1976).

Výsledky získané v tomto standardním farmakologickém testu ukazují, že 8,9-dehydroestron je účinným inhibitorem oxidace LDL, inhibujícím proces až na 100 %. U oxidací, zprostředkovaných Cu^{4 1}’ a endoteliálními buňkami prasečí aorty byly získány hodnoty IC₅o 0,22 μΜ a 0,12 pM. Pro srovnání, za použití estronu byla v testu oxidace, zprostředkované endoteliálními buňkami prasečí aorty, získána hodnota IC₅₀0,56 μΜ.

K dalšímu prokázání antioxidačního působení 8,9-dehydroestronu byly provedeny dva další standardní farmakologické testy za využití buněčné kultury. V prvním testu byl radioaktivně značený LDL (¹²⁵J-LDL), (McFarlane A. S., v: Mammalian Protein Metabolism, díl 1, New York: Academie Press 297-341,1964, ed. Munro Η. N. a Allison J. B.) modifikován vystavením 25 účinku Cu⁴^ v přítomnosti a v nepřítomnosti 8,9-dehydroestronu. Poté byly makrofágy J774, vykazující receptory pro čistící lipoproteiny (scavenger lipoprotein receptors), které vážou oxidačně modifikovaný LDL, vystavený působení ¹²⁵J-LDL. Výsledky tohoto pokusu ukázaly, že vazba LDL, oxidovaného v přítomnosti 8,9-dehydroestronu, byla snížena ze 72 % na 56 % (účinkem 2,5 a 0,25 μΜ dehydroestronu). Pro srovnání stejné koncentrace estronu redukovaly 30 vazbu LDL, kteiý byl oxidován, z 39 % a 0 %. Vzhledem k tomu, že vazba a metabolismus LDL oxidovaného makrofágy jsou považovány za značný příspěvek k vývoji pěnových buněk a tedy atherosklerotických plaků, je tento účinek, snižující oxidaci LDL a následné navázání na čistící receptoiy, považován za významný přínos.

V druhém testu byly endoteliální buňky prasečí aorty (PAEC) vystaveny vlivu LDL, modifikovaného stejně, jako bylo popsáno výše, účinkem Cu⁺ v přítomnosti a v nepřítomnosti

8.9- dehydroestronu. Oxidovaný LDL byl prokázán jako látka působící cytotoxicky vůči endoteliálním buňkám a tento mechanismus byl také zásadně zastoupen v atherogenním procesu. Po 24 hodinách inkubace buněk s upraveným LDL bylo provedeno stanovení MTT k určení cytotoxicity (Hansen Μ. B., J. Immun. Methods 119. 203-210, 1989). Tento testovací postup určuje procento živných buněk v daném stanovení. Ve stanovení zbývala po vystavení účinku 25 pg/ml LDL, oxidovaného v nepřítomnosti sloučeniny, pouze 2 % živých buněk. Naproti tomu procentní množství živých buněk po vystavení vlivu LDL, ovlivněného Cu⁺ v přítomnosti

8.9- dehydroestronu (2,5 μΜ), bylo 100 % či vyšší. Další sloučeniny, testované ve stejném 45 stanovení, vykazovaly minimální účinky na ochranu PAEC (17B-estradiol = 11% živých buněk,

Equilin = 4 % živ. buněk, Estrone = 37 % živ. buněk). Výsledky tohoto testu ukazují, že LDL, modifikovaný v přítomnosti 8,9-dehydroestronu, nebyl cytotoxický a že tedy údaj souhlasí s inhibicí oxidativní modifikace 8,9-dehydroestronem, jak bylo prokázáno metodou TBARS, uvedenou výše.

Na základě výsledků, získaných v těchto postupech, je tedy 8,9-dehydroestron jako antioxidační látka vhodný pro použití k výrobě farmaceutického prostředku, ovlivňujícího chorobné stavy, vyvolané volnými radikály.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití 8,9-dehydroestronu pro výrobu farmaceutického prostředku k léčení chorob, vyvolaných tvorbou volných radikálů.
2. 2. Použití 8,9-dehydroestronu pro výrobu farmaceutického prostředku kinhibici reakcí volných radikálů s enzymy, iontovými kanály, strukturními bílkovinami nebo lipidy v membránách.
3. 3. Použití 8,9-dehydroestronu pro výrobu farmaceutického prostředku k léčení chorob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pomáhá při léčení chorob, při jejichž vzniku se účastní endogenní volné radikály, například zhoubných nádorů, poruch centrálního nervového systému, kostních onemocnění, stárnutí, zánětlivých chorob, chorob periferních cév, revmatoidní artritidy, autoimunitních onemocnění, nedostatečnosti dýchacích cest, rozedmy, poruch při reperfuzi, virové hepatitidy, chronické aktivní hepatitidy, tuberkulózy, lupénky, systémového lupus erythematodes, nedostatečnosti dýchacích cest u dospělých, úrazů centrálního nervového systému a mozkové mrtvice a k prevenci poruch při reperfuzi.