CZ289227B6 - Promotor lidského endoglinového genu a jeho pouľití pro přípravu léčiva - Google Patents
Promotor lidského endoglinového genu a jeho pouľití pro přípravu léčiva Download PDFInfo
- Publication number
- CZ289227B6 CZ289227B6 CZ1998332A CZ33298A CZ289227B6 CZ 289227 B6 CZ289227 B6 CZ 289227B6 CZ 1998332 A CZ1998332 A CZ 1998332A CZ 33298 A CZ33298 A CZ 33298A CZ 289227 B6 CZ289227 B6 CZ 289227B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- promoter
- gene
- nucleic acid
- acid construct
- sequence
- Prior art date
Links
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 27
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 39
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 6
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 claims description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 2
- 208000014912 Central Nervous System Infections Diseases 0.000 claims description 2
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 2
- 239000003130 blood coagulation factor inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 claims 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 claims 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 abstract description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 abstract 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 abstract 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 31
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 31
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 26
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 description 20
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 14
- 102000012085 Endoglin Human genes 0.000 description 13
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 13
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 13
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 4
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 108050009340 Endothelin Proteins 0.000 description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 108091023043 Alu Element Proteins 0.000 description 2
- 102000002045 Endothelin Human genes 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N endothelin-1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]2CSSC[C@@H](C(N[C@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)=O)NC(=O)[C@@H](CO)NC(=O)[C@H](N)CSSC1)C1=CNC=N1 ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 102000048896 human ENG Human genes 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100481404 Danio rerio tie1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010090549 Endothelin A Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000010180 Endothelin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050001739 Endothelin receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100033902 Endothelin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800004490 Endothelin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100040630 Endothelin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000011852 GATA2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010075641 GATA2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000019218 Mannose-6-phosphate receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050006616 Mannose-6-phosphate receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000881680 Mus musculus Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 description 1
- 101100481406 Mus musculus Tie1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 101000852966 Rattus norvegicus Interleukin-1 receptor-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091006296 SLC2A1 Proteins 0.000 description 1
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 101150045640 VWF gene Proteins 0.000 description 1
- 102000016548 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010053096 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000000430 cytokine receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
Abstract
e en se t²k promotoru lidsk ho endoglinov ho genu, nebo jak²chkoliv jeho funk n ch st nebo variant, kter maj promotorovou aktivitu, a jeho/jejich pou it pro p° pravu l iva k l en n dorov²ch onemocn n , leukemi , autoimunitn ch onemocn n , alergi , artritid, z n t , odhojen org nov ho t pu, reakce t pu proti p° jemci, poruchy koagulace, kardiovaskul rn ch nemoc , an mi , infekc a po kozen CNS.\
Description
Promotor lidského endoglinového genu a jeho použití pro přípravu léčiva
Oblast techniky
Vynález se týká promotoru lidského endoglinového genu, nebo jeho funkčních skupin a jeho použití pro přípravu léčiva.
Dosavadní stav techniky
Jedním z důležitých problémů genové terapie je řízení transkripce a translace efektorového genu, který je vložen do buňky. Toto řízení je na úrovni transkripce umožněno připojením sekvence promotoru nebo zesilovače před kódující sekvenci efektorového genu („upstream“ od 15 efektorového genu).
Pod pojmem „promotorové sekvence“ rozumíme úsek genu, ke kterému jsou schopny se vázat regulační proteiny, tzv. transkripční faktory, které aktivují transkripci efektorového genu, ležícího za promotorovou sekvencí („downstream“ od promotoru). Sekvence ležící po směru transkripce 20 se označují jako „dowstream“ sekvence, sekvence položené v opačném směru jako „upstream“ sekvence. „Efektorovým genem“ se všeobecně rozumí strukturní gen, jehož genový produkt má např. požadovaný účinek ve smyslu genové terapie.
Promotorové sekvence mohou být specifické pro buňku, buněčně nespecifické, virově specifické, 25 metabolicky specifické nebo specifické pro buněčný cyklus. Příklady takových promotorových sekvencí a jejich použití, např. pro genovou terapii různých nemocí, jsou uvedeny v patentových přihláškách WO 96/06940, WO 96/06938, WO 96/06941 a WO 96/06939. Kromě toho tyto patentové přihlášky předkládají způsoby a příklady kombinování těchto promotorových sekvencí, např. pro účely řízení efektorového genu způsobem specifickým pro buňku nebo pro buněčný 30 cyklus.
Promotory, v závislosti na jejich výběru a kombinaci, způsobí více či méně omezenou a více či méně silnou transkripci efektorového genu, který je na nich závislý. Endotelové buňky jsou příkladem výhodných cílových buněk pro genovou terapii, na jedné straně proto, že endotelové 35 buňky jsou přímo přístupné genovým konstruktům, které se injikují do oběhového systému, a na druhé straně proto, že se přímo účastní rozvinutí a postupu mnohých poruch, jako jsou např. nádorová onemocnění, záněty, alergie, autoimunitní nemoci, reakce odhojení orgánu, oběhové a koagulační poruchy, a také se účastní procesu uzdravování, anebo jsou v přímém sousedství s místem takových poruch.
Cílové promotory specifické pro buňku jsou zpravidla promotory genů kódující takové proteiny, které se tvoří zvláště silně anebo výlučně, v příslušné cílové buňce. V případě endotelových buněk je jedním takovým proteinem endoglin.
Endoglin je receptor TGFp, který nepřenáší signál (Gougos et al., J. Biol. Chem. 265: 8 361, 1990, Cheifetz, J. Biol. Chem. 267, 19 027, 1992, Mořen et al., BBRC 189, 356, 1992). zatímco v normálním endotelu se vyskytuje v malém množství, v proliferujícím endotelu se exprimuje ve zvýšeném rozsahu (Westphal et al., J. Invest. Der. 100, 27, 1993, Burrows et al., Pharmac. Ther. 65, 155, 1994). Nic dalšího není známo o síle promotoru a jeho buněčné specifičnosti. Přestože 50 gen endoglinu je znám už 4 roky (Bellon et al., 1993), nebylo dosud možné izolovat endoglinový promotor.
Sekvence cDNA lidského endoglinu byla popsána Bellonem et al. (Eur. J. Immunol. 23, 2 340, 1993), zatímco sekvenci myšího endoglinu popsal Ge et al. (Gene 138, 201, 1994). Přestože je
-1 CZ 289227 B6 dostupná sekvenční informace pro část netranslatovaného úseku na 5‘konci endoglinového genu, nic se neví o funkci tohoto úseku ani o promotorovém úseku.
Receptor VEGF je jiný endotelový buněčně specifický protein. V tomto případě se rozlišují dva receptory (Plate et al., Int. J. Cancer 59, 520, 1994): Receptor VEGF 1 (fit—1) (deVries et al., Science 255, 989, 1992), jehož cytoplazmatická část obsahuje tyrosinkinázu podobnou fms, a receptor VEGF 2 (flk 2, KDR) (Terman et al., BBRC 187, 1 579, 1992), jehož cytoplazmatická část obsahuje tyrosinkinázu. Oba receptoiy se nacházejí téměř výlučně na endotelových buňkách (Senger et al., Cancer Metast. Rev. 12,303,1993).
Další endotelové buněčné specifické receptorové tyrosinkinázy jsou tie— 1, tie-2 (Partanen et al., Mol. Cell Biol. 12,1 698,1992, Schnuerch a Risau, Development 119, 957,1993, Dumont et al., Oncogene 7, 1 471, 1992) a B61 receptory (Eck) (Bartley et al., Nátuře 368, 558, 1994, Panddey et al., Science 268, 567,1995, van der Geer et al., Ann. Rev. Cell Biol. 10,251,1994).
Jiným endotelovým buněčně specifickým proteinem je molekula B61, což je ligand receptoru B61 (Holzman et al., J. Aminokyselin. Soc. Nephrol. 4, 466, 1993, Bartley et al., Nátuře 368, 558, 1994), endothelin a zvláště endothelin B (O‘Reilly et al., J. Cardiovasc. Pharm. 22, 18, 1993, Benatti et al., J. Clin. Invest. 91: 1 149,1993,0‘Reilly et al., BBRC 193, 834,1993), jehož promotorovou sekvenci popsal Benatti et al. (J. Clin. Invest. 91: 1 149, 1993), endothelin 1 (Yanasigawa et al., Nátuře 332, 411, 1988), jehož promotorovou sekvenci popsal Wilson et al. (Mol. Cell Biol. 10, 4 656, 1990), receptoiy endothelinu, zejména receptory endothelinu 1 (Webb et al., Mol. Pharmacol. 47, 730, 1195, Haendler et al., J. Cardiovasc. Pharm. 20, 1, 1992), receptory manózo-6-fosfátu (Perales et al., Eur. J.Biochem. 226, 225, 1994), jejichž promotorovou sekvenci popsal Ludwig et al. (Gene 142, 311, 1994), Oshima et al. (J. Biol. Chem. 263, 2 553, 1988) a Pohlman et al. (PNAS USA 84, 5 575, 1987), von Willebrandův faktor (vWF), jehož promotorovou sekvenci popsali Jahroudi a Lynch (Mol. Cell. Biol. 14, 999, 1994), Ferreira et al. (Biochem. J. 293, 641,1993) a Aird et al. (PNAS USA 92,4 567,1995).
Dalšími endotelovými buněčně specifickými proteiny jsou IL-1, např. formy IL-1 a a IL-Ιβ, které jsou produkovány aktivovanými endotelovými buňkami (Wamer et al., J. Immunol. 139,
911, 1987), jejichž promotorové sekvence popsali Hangen et al. (mol. Carcinog. 2, 68, 1986), Turner et al. (J. Immunol. 143, 3 556, 1989), Fenton et al. (J. Immunol. 138, 3 972, 1987), Bensi et al. (Cell Growth Diff. 1, 491, 1990), Hiscott et al., Mol. Cell Biol. 13, 6 231, 1993) a Moři et al. (Blood 84, 1 688, 1994), receptor IL-1, jehož promotorovou sekvenci popsal Ye et al. (PNAS USA 90, 2 295, 1993), a adhezivní molekula cévní buňky (VCAM-1), jejíž exprese je v endotelových buňkách aktivována lipopolysacharidy, TNF-a (Neish et al., Mol. Cell Biol. 15,
558,1995), IL-4 (Iademarco et al., J. Clin. Invest. 95, 264, 1995), a IL-5 (Mami et al., J. Clin. Invest. 92, 1 866, 1993). Promotorovou sekvenci VCAM-1 popsali Neish et al. (Mol. Cell Biol. 15,2 558, 1995), Ahmad et al. (J. Biol. Chem. 270, 8 976, 1995), Neish et al. (J. Exp. Med. 176, 1 583, 1992), Iademarco et al. (J. Biol. 267, 16 323, 1992) a Cybulski et al. (PNAS USA 88, 7 859,1991).
Další endotelové buněčné specifické promotory jsou syntetické aktivátorové sekvence, a to takové syntetické aktivátorové sekvence, které jsou složeny z oligomerizovaných vazebných míst pro transkripční faktory přednostně nebo selektivně aktivní v endotelových buňkách, jako je např., transkripční faktor GATA-2, jehož vazebné místo v endotelinovém genu 1 je 5‘TTATCT-3‘ (Lee et al., Biol. Chem. 266, 16 188, 1991, Dorfomann et al., J. Biol. Chem. 267, 1 279, 1992, Wilson et al., Mol. Cell Biol. 10, 4 854, 1990), a mohou se použít jako alternativa k přirozeným promotorům specifickým pro endotel, a také endotelový glukózový přenašeč 1 specifický pro mozek, neboť mozkové endotelové buňky exprimují tento přenašeč velmi silně kvůli transendotelovému přenosu D-glukózy v mozku (Gerhart et al., J. Neurose. Res. 22, 464, 1989). Promotorovou sekvenci popsal Murakami et al. (J. Biol. Chem. 267, 9 300,1992).
-2CZ 289227 B6
Avšak některé z těchto promotorů, přestože jsou dostatečně specifické pro endotelové buňky, jako např. promotor genu von Willebrandova faktoru nebo gen receptoru VEGF (flk-1), mají relativně nízkou aktivitu. Aktivita takových „slabých“ promotorů může být zvýšena jejich kombinací s bazálním promotorem (např. SV40) nebo zesilovačem, ale to je obvykle doprovázeno snížením specifičnosti.
Podstata vynálezu
Cílem předkládaného vynálezu proto bylo najít promotor, který by byl jak specifický pro endotel tak i dostatečně silný.
Překvapivě se zjistilo, že právě gen endoglinu má, kromě jiných vlastnost i obě tyto vlastnosti.
Vynález se proto týká promotoru lidského endoglinového genu a jeho funkčních částí nebo variant. Zjistilo se, že tento promotor zaujímá délku nejvýše 2 415 párů bází (tab. 1, sekvence s identifikačním číslem 1) a výhodně obsahuje nukleotidovou sekvenci 1 až 2 378, a to včetně iniciační sekvence.
Aby bylo možné promotor podle tohoto vynálezu charakterizovat, promotorová sekvence endoglinového genu, nebo její části, byla spojena s reportérovým genem (tj. např. gen kódující enzym luciferázu) vplazmidu pGL3 (Promega), a tímto konstruktem byly transfekovány endotelové buňky (buněčná linie ECV-340) a pro srovnání také cervikální karcinomové buňky (buněčná linie HeLa). Překvapivě se zjistilo, že endoglinový promotor je 80x silnější než vWF promotor. To je tak překvapivé proto, neboť vWF se exprimuje endotelové specifickým způsobem a dalo by se tedy očekávat, že síla endoglinového promotoru bude podobná promotoru vWF. Zjistilo se také, že endoglinový promotor je 30x aktivnější v endotelových buňkách než v buňkách cervikálního karcinomu. To je opět překvapivé, neboť promotor vWF, který je také endotelové specifický, má podobnou sílu jak v endotelových buňkách, tak i v buňkách cervikálního karcinomu. Tudíž genový promotor vWF je výrazně překonán endoglinovým promotorem podle vynálezu, a to jak z hlediska síly promotoru, tak i z hlediska specifičnosti promotoru.
Dále se zjistilo, že části promotorových sekvencí podle vynálezu projevují silnou endotelové specifickou aktivitu.
V následující tabulce jsou uvedeny relativní aktivity (vztažené k aktivitě promotoru SV40 jako standardu) konstruktů promotoru endoglinového genu, který má odstraněnou (detelovanou) oblastí 5‘konce, v endotelové buňce.
| Nukleotidová sekvence | Relativní aktivita |
| promotor SV40 | 1 |
| endoglinový promotor (tab. 1, sekvence ident. č. 1), sekvence: 1 - 2415 | |
| částečná sekvence: 36 - 2415 | 10,2 |
| částečná sekvence: 470 - 2415 | 13,0 |
| částečná sekvence: 948 - 2415 | 10,0 |
| částečná sekvence: 1310-2415 | 2,0 |
| částečná sekvence: 1847 - 2415 | 3,3 |
| částečná sekvence: 2339 - 2415 | 0,2 |
Termín „Funkční část promotoru“ označuje podle vynálezu všechny částečné sekvence promotoru podle vynálezu, které mají promotorovou aktivitu, zvláště pak částečné sekvence od nukleotidu 1 k nukleotidu 2378, od nukleotidu 36 k nukleotidu 2378, od nukleotidu 470 k nukleotidu 2378 a od nukleotidu 948 k nukleotidu 2378, a také od nukleotidu 36 k nukleotidu
-3CZ 289227 B6
2415, od nukleotidu 470 k nukleotidu 2 415, od nukleotidu 948 k nukleotidu 2415, výhodně částečné sekvence od nukleotidu 470 k nukleotidu 2 415 a od nukleotidu 470 k nukleotidu 2378. Částečné sekvence s promotorovou aktivitou zasahují také např. od nukleotidu 1310 k nukleotidu 2415, od nukleotidu 1310 k nukleotidu 2378, od nukleotidu 1847 k nukleotidu 2415 a od nukleotidu 1847 k nukleotidu 2378.
Avšak předpokládaný vynález se neomezuje na promotor popsaný sekvencí identifikačního čísla 1 a jeho funkční skupiny, ale zahrnuje také jeho varianty, které projevují promotorovou aktivitu. Varianty této povahy obsahují např. delece, adice, inzerce a/nebo substituce jedné nebo více bází, výhodně 1 až 50, zvláště 1 až 25 a zejména 1 až 5 bází. Promotorová aktivita se dá snadno měřit, např. popsaným luciferázovým testem.
Předkládaný vynález se dále týká konstruktu nukleové kyseliny, který obsahuje:
a) alespoň jednu nukleotidovou sekvenci (sekvenci nukleové kyseliny) promotoru podle vynálezu (složka a) a dále, kde je to vhodné
b) alespoň jeden efektorový gen (složka b), jehož transkripce je aktivována složkou a. Přitom složka a je výhodně lokalizována proti směru čtení („upstream“) od složky b.
Předkládaný vynález se dále týká konstruktu nukleové kyseliny, ve kterém se promotorová sekvence endoglinového genu podle vynálezu kombinuje s promotorovou sekvencí, která je specifická pro jinou cílovou buňku, neboje virově, či metabolicky specifická, neboje specifická pro buněčný cyklus, a alespoň s jedním efektorovým genem, a to tak, že tato kombinace promotorových sekvencí řídí aktivaci transkripce alespoň jednoho efektorového genu.
Nukleotidový konstrukt podle vynálezu je výhodně tvořen deoxyribonukleovou kyselinou DNA. Termín „konstrukt nukleové kyseliny“ nebo „nukleotidový konsktrukt“ znamená umělou strukturu, která je tvořena nukleovou kyselinou a která je v cílové buňce přepisována. Konstrukt je výhodně vložen do vektoru (nosiče), např. do virového vektoru, nebo do nevirového vektoru, jako je např. plazmid. Odborníkovi jsou známy způsoby přípravy jak virových, tak i nevirových vektorů.
Předkládaný vynález se dále týká buněk, které obsahují konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu.
Všeobecně platí, že výběr efektorového genu závisí na nemoci, která bude genovým konstruktem léčena.
Příklady efektorových genů pro léčení nádorových onemocnění, leukémií, autoimunitních nemocí, alergií, artritid, zánětů, odhojení orgánu a reakce hostitele proti štěpu, poruchy systému krevní koagulace, kardiovaskulární nemoci, anémie, infekce nebo poškození CNS, jsou popsány v patentových přihláškách WO 96/06940, WO 96/06938, WO 96/06941 a WO 96/06939.
Tak např. efektorové geny vyhovující předkládanému vynálezu kódují cytokin, chemokin, růstový faktor, cytokinový receptor, chemokinový receptor nebo receptor pro růstový faktor, a dále také antagonistu cytokinu, protein indukující cytostázi, cytotoxicitu nebo apoptózu, a také protilátku nebo fragment protilátky, inhibitor angiogeneze, koagulační faktor, inhibitor koagulace, fibrinolytický protein, enzym štěpící prekurzor léku a tak tvořící lék, protein s účinkem na krevní oběh, nebo antigen infekčního patogenu, který vyvolá imunitní reakci.
Konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu může dále obsahovat dva nebo více shodných nebo odlišných efektorových genů, které jsou navzájem spojeny buď promotorovými sekvencemi, nebo sekvencí vnitřního ribizomálního vstupního místa (IRES). Příklady jsou též uvedeny ve výše zmíněných patentových přihláškách.
-4CZ 289227 B6
Konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu se může použít např. pro expresi genu specifickou výhradně pro endotelové buňky, expresi specifickou pro endotelové buňky a současně metabolicky specifickou, pro expresi specifickou pro endotelové buňky a současně specifickou pro buněčný cyklus a/nebo specifickou pro endotelové buňky a současně virově specifickou, přičemž gen je výhodně gen kódující farmakologicky aktivní sloučeninu nebo enzym, který štěpí neaktivní prekurzor léku, a tím vytváří aktivní lék.
Konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu se výhodně použije pro přípravu léčiva pro léčení výše uvedených nemocí, přičemž příprava léčiva obecně zahrnuje klonování konstruktu nukleové kyseliny do vhodného vektoru, který je pak podáván pacientovi. Odborníkovi jsou známy další způsoby použití promotoru podle vynálezu nebo konstruktu nukleové kyseliny podle vynálezu.
Následující příklady společně s tabulkou a obrázky popisují podrobněji vynález, aniž by ho jakkoliv omezovaly.
Tabulka 1. Sekvence lidského endoglinového promotoru. Báze č. 1 odpovídá úseku sekvence nejblíže 5' konci, vysoce konzervativní sekvenční Alu oblast leží mezi bázemi 1 360 až 1 666, zatímco dokumentovaná homologická oblast s cDNA z M. musculus začíná v oblasti blíže 3‘konci od báze 2 300 a dokumentovaná část cDNA zH. sapiens (netranslatovaný 5‘úsek) začíná od báze 2 379.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1. Klonování promotoru lidského endoglinového genu. A. Fragment promotoru lidského endoglinového genu, připravený metodou PCR, byl klonován do klonovacího místa TA ve vektoru pCR 2.1 (Invitrogen). B: Fragment obsahující promotor lidského endoglinového genu byl vystřižen z konstruktu pCR 2.1 Endo restrikčními enzymy Mlul a Xhol a klonován do reportérového vektoru pGL3 s luciferázou (Promega).
Obr. 2. Luciferázová aktivita různých promotorů specifických pro endotelové buňky. Všechny promotory byly klonovány do vektoru pGL3 a hodnoty jsou standardizovány vzhledem k bazálnímu promotoru SV40. SV40 je bazální SV40 promotor bez zesilovače. pGL3Endo je endoglinový promotor (viz. obr. 1B). Zesilovač vWF+SV40 znamená promotor von Willebrandova faktoru zesílený zesilovačem SV40 umístěným proti směru čtení („upstream“). flk-1 je promotor VEGF receptoru flk-1 (-224/startovní kodon). vWF je promotor von Willebrandova faktoru (-487/+247) bez dodatečných zesilovačů.
Obr. 3. Luciferázová aktivita promotoru lidského endoglinového genu v endotelových a jiných buňkách.- Konstrukty jsou stejné jako na obr. 2. Aktivita endoglinového promotoru v endotelových buňkách linie ECV40 byla srovnána s aktivitou téhož promotoru v buňkách HeLa z buněčné linie cervikálního karcinomu. Výsledky jsou standardizovány vzhledem k bazálnímu promotoru SV40. V tomto testu byla aktivita v buňkách ECV304 29x vyšší než v HeLa buňkách.
Obr. 4. Předpokládaná vazebná místa pro transkripční faktory v endoglinovém promotoru. Je ukázán pouze úsek mezi Alu sekvencí a začátkem cDNA. Všechna vazebná místa jsou umístěna na (+) řetězec.
-5CZ 289227 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Pro klonování promotoru byla užita klonovací souprava „Promoter-Finder DNA Walking“ (Clontech). Pomocí této soupravy byl namnožen (amplifikován) fragment velikosti 2,4 kb ležící ve směru 5‘ od dokumentované sekvence. Amplifikace proběhla ve dvou bězích PCR, a sice z 5‘natranslatovaného úseku cDNA lidského endoglinového genu pomocí dvou genově specifických oligonukleotidových příměrů:
El: GCTGGGCTGGAGTTGCTGTCCGAAGGATG (sekvence identifik. č. 2) E2: AATGGATGGCAGTGACAGCAGCAGTCCTG (sekvence identifik. č. 3)
Podmínky pro PCR byly následující:
1. PCR: Oligonukleotidový primer El, 25 s při 94 °C, 39 cyklů: 25 s při 94 °C, 20 s při 60 °C, min při 68 °C, a 4 min při 68 °C.
2. PCR (hnízdové, „nested“): Oligonukleotidový primer E2, 25 s při 94 °C, 26 cyklů: 25 s při °C, 20 s při 61 °C, 4 min při 68 °C, a 4 min při 68 °C.
Polymeráze: DNA polymeráza pro amplifikaci dlouhých templátů (Boehringer Mannheim).
Fragmenty amplifikované v PCR byly přečištěny pomocí odstředivkových minikolon QIAquick (Qiagen), a pak vloženy do klonovacího vektoru (pomocí klonovací soupravy „Originál TA Clonong“, Invitrogen). Takto vzniklý konstrukt pCR2.1Endo (viz obr. la) byl sekvenován a klonovaná oblast byla rozpoznána jako 2 415 bází dlouhý úsek 5‘koncové oblasti lidského endoglinového genu (sekvence viz. tab. 1).
Klonovaný úsek z tohoto vektoru byl klonován do luciferázového reportérového vektoru pGL3 (Promega) a aktivita promotoru byla testována jako u konstruktu pGL3Endo (viz obr. lb) v buňkách HeLa a buňkách ECV304.
Buňky byly transfekovány buď způsobem který používá DEAE/dextran (upraveno podle Sompayrac et al., PNAS 78, 7 575, 1981), nebo použitím prostředku LipofectAMINE (Gibco BRL). Tak byl transfekován konstrukt pGL3Endo stejně jako bazální promotor SV40 caby standard. Promotor flk-1-(VEGF) (-225/startovní kodon ATG) a promotor Willebrandova faktoru (vWF) (-487/+247), buď s, nebo bez zesilovače SV40, byly také transfekovány. Konstrukt obsahující zesilovač SV40 je odlišný tím, že jeho aktivita je výrazně vyšší než aktivita promotoru divokého typu, zatímco jeho specifičnost, i když je snížená, není odstraněna. Všechny konstrukty byly klonovány do pGL3 a luciferázový test byl proveden tak, jak jej popisuje Herber et al. (Oncogene 9,1 295,1994) a Lucibello et al. (EMBO J. 14, 132, 1995).
Luciferázová aktivita různých promotorů v buňkách ECV304 (obr. 2) ukazuje, že klonované fragmenty 5‘koncového úseku endoglinového genu projevují promotorovou aktivitu. Tato aktivita je velmi vysoká v porovnání s aktivitou jiných promotorů specifických pro endotelové buňky, Je 4x vyšší než aktivita promotoru flk—1 a více než 80x vyšší než aktivita promotoru vWF. Aktivita konstruktu pGL3Endo je dokonce vyšší než aktivita promotoru vWF zesíleného sekvencí zesilovače SV40. Tyto údaje potvrzují, že klonovaný úsek je promotor lidského endoglinového genu.
Obr. 3. ukazuje srovnání aktivity endoglinového promotoru v buňkách linie ECV340 a HeLa buňkách linie cervikálního karcinomu. Když jsou hodnoty standardizovány vzhledem k bazálnímu promotoru SV40, aktivita v ECV340 buňkách je 29x vyšší než v HeLa buňkách. To ukazuje, že klonovaný promotor je nejen aktivní v endotelových buňkách, ale je současně specifický (selektivní) pro tyto buňky.
-6CZ 289227 B6
Obr. 4. znázorňuje pravděpodobná vazebná místa pro transkripční faktory v sekvenci endoglinového promotoru. Několik silně homologních potenciálních vazebných míst, který mohou zodpovídat za specifičnost (selektivitu) a aktivitu promotoru a která zahrnují několik konzervativních NF-κΒ vazebných míst, leží v úseku mezi konzervativní Alu sekvencí a 5 dokumentovanou cDNA sekvencí.
Průmyslová využitelnost
Vynález se týká promotoru lidského genu endoglinu, jeho funkčních skupin a jeho použití pro přípravu léčiva. Léčivo připravené na základě promotoru dle vynálezu je vhodné pro genovou terapii různých nemocí, jako např. nádorových onemocnění, leukémií, autoimunitních nemocí, alergií, artritid, zánětů, odhojení orgánu a reakce hostitele proti štěpu, poruch systému krevní koagulace, kardiovaskulárních nemocí, anémie, infekce nebo poškození CNS.
Claims (13)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Promotor lidského endoglinového genu, obsahující sekvenci uvedenou vtab. 1, nebo jakékoliv jeho funkční části nebo varianty, které mají promotorovou aktivitu.
- 2. Promotor podle nároku 1, kde funkční části obsahují sekvence nukleotidů 1 až 2 378, 36 až 2 378,470 až 2 378, 948 až 2 378, 1 310 až 2 378, 1 847 až 2 378,36 až 2 415,470 až 2 415,948 až 2 415,1 310 až 2 415 nebo 1 847 až 2 415.
- 3. Konstrukt nukleové kyseliny, obsahující alespoň jednu promotorovou sekvenci lidského endoglinového genu podle nároků 1 nebo 2.
- 4. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 3, který navíc obsahuje efektorový gen s promotorovou sekvencí lidského endoglinového genu aktivující transkripci efektorového genu.
- 5. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 4, kde promotorová sekvence lidského endoglinového genu leží proti směru transkripce od efektorového genu.
- 6. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 3 až 5, kde promotorová sekvence lidského endoglinového genu se kombinuje s alespoň jednou další aktivační sekvencí, a tato-12CZ 289227 B6 aktivační sekvence je vybrána ze skupiny obsahující virově specifickou, metabolicky specifickou, buněčně specifickou nebo pro buněčný cyklus specifickou aktivační sekvenci.
- 7. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 3 až 6, kde nukleová kyselina je DNA.
- 8. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 3 až 7, který je vložen do vektoru.
- 9. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 8, kde vektor je plazmidový nebo virový vektor.
- 10. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 4 až 9, kde efektorový gen je gen kódující aktivní sloučeninu, která je vybrána ze skupiny obsahující cytokiny, chemokiny, růstové faktory, cytokinové receptory, chemokinové receptory, receptory pro různé faktory, a také antagonisty cytokinů, proteiny s antiproliferačním, cytostatickým nebo apoptickým účinkem, protilátky, fragmenty protilátek, inhibitory angiogeneze, koagulační faktory, inhibitory koagulace, fibrinolytické proteiny, enzym štěpící prekurzor léku, a tím tvořící lék, protein s účinkem na krevní oběh, nebo antigen infekčního patogenu, který vyvolá imunitní reakci.
- 11. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 3 až 10, který obsahuje několik efektorových genů, které jsou spojeny navzájem buď promotorovými sekvencemi, nebo sekvencemi vnitřního ribozomálního vstupního místa, IRES.
- 12. Buňka obsahující konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 3 až 11.
- 13. Použití konstruktu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 3 až 10, nebo buňky podle nároku 12, pro přípravu léčiva pro léčení nemoci, která je vybrána ze skupiny obsahující nádorové nemoci, leukemie, autoimunitní nemoci, alergie, artritidy, záněty, odhojení orgánu, reakce hostitele proti štěpu, poruchy krevní koagulace, kardiovaskulární nemoci, anémii, infekce nebo poškození CNS.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19704301A DE19704301C1 (de) | 1997-02-06 | 1997-02-06 | Der Promotor des humanen Endoglingens und seine Verwendung für die Gentherapie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ33298A3 CZ33298A3 (cs) | 1998-08-12 |
| CZ289227B6 true CZ289227B6 (cs) | 2001-12-12 |
Family
ID=7819364
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1998332A CZ289227B6 (cs) | 1997-02-06 | 1998-02-04 | Promotor lidského endoglinového genu a jeho pouľití pro přípravu léčiva |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6103527A (cs) |
| EP (1) | EP0857781A3 (cs) |
| JP (1) | JPH11178A (cs) |
| KR (1) | KR19980071084A (cs) |
| CN (1) | CN1196784C (cs) |
| AR (1) | AR011110A1 (cs) |
| AU (1) | AU736724B2 (cs) |
| BR (1) | BR9800563A (cs) |
| CA (1) | CA2222981A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ289227B6 (cs) |
| DE (1) | DE19704301C1 (cs) |
| HU (1) | HUP9800247A3 (cs) |
| PL (1) | PL324688A1 (cs) |
| RU (1) | RU2230115C2 (cs) |
| TR (1) | TR199800168A2 (cs) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19704301C1 (de) * | 1997-02-06 | 1998-03-26 | Hoechst Ag | Der Promotor des humanen Endoglingens und seine Verwendung für die Gentherapie |
| HUP9900956A2 (hu) | 1998-04-09 | 2002-04-29 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh. | Egyláncú, több antigéntkötőhely kialakítására képes molekulák, előállításuk és alkalmazásuk |
| US6815430B1 (en) | 1999-04-02 | 2004-11-09 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Gene expression base sequences for therapeutic use and drugs for gene therapy |
| BRPI0817233A2 (pt) | 2007-09-28 | 2012-11-06 | Intrexon Corp | construções terapêuticas de gene de trca e bireatores para a expressão de moléculas bioterapêuticas, e usos das mesmas |
| WO2010005850A1 (en) | 2008-07-08 | 2010-01-14 | The J. David Gladstone Institutes | Methods and compositions for modulating angiogenesis |
| CN105102623A (zh) | 2013-01-30 | 2015-11-25 | 内布拉斯加大学董事会 | 用于治疗糖尿病相关并发症的组合物和方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5466596A (en) * | 1992-08-25 | 1995-11-14 | Mount Sinai Hospital Corporation | Tissue specific transcriptional regulatory element |
| GB9506466D0 (en) * | 1994-08-26 | 1995-05-17 | Prolifix Ltd | Cell cycle regulated repressor and dna element |
| DE19704301C1 (de) * | 1997-02-06 | 1998-03-26 | Hoechst Ag | Der Promotor des humanen Endoglingens und seine Verwendung für die Gentherapie |
-
1997
- 1997-02-06 DE DE19704301A patent/DE19704301C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-02-04 CA CA002222981A patent/CA2222981A1/en not_active Abandoned
- 1998-02-04 TR TR1998/00168A patent/TR199800168A2/xx unknown
- 1998-02-04 CZ CZ1998332A patent/CZ289227B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-02-04 AR ARP980100497A patent/AR011110A1/es unknown
- 1998-02-05 CN CNB981063500A patent/CN1196784C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-05 KR KR1019980003185A patent/KR19980071084A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-02-05 BR BR9800563A patent/BR9800563A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-02-05 HU HU9800247A patent/HUP9800247A3/hu not_active Application Discontinuation
- 1998-02-05 EP EP98102014A patent/EP0857781A3/de not_active Withdrawn
- 1998-02-05 JP JP10024524A patent/JPH11178A/ja not_active Withdrawn
- 1998-02-05 RU RU98101849/13A patent/RU2230115C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-02-05 AU AU52931/98A patent/AU736724B2/en not_active Ceased
- 1998-02-06 US US09/019,689 patent/US6103527A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-06 PL PL98324688A patent/PL324688A1/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP9800247A3 (en) | 2002-11-28 |
| AU736724B2 (en) | 2001-08-02 |
| BR9800563A (pt) | 1999-06-29 |
| CN1203948A (zh) | 1999-01-06 |
| EP0857781A2 (de) | 1998-08-12 |
| PL324688A1 (en) | 1998-08-17 |
| KR19980071084A (ko) | 1998-10-26 |
| JPH11178A (ja) | 1999-01-06 |
| TR199800168A2 (xx) | 1998-08-21 |
| RU2230115C2 (ru) | 2004-06-10 |
| MX9800981A (es) | 1998-08-30 |
| AU5293198A (en) | 1998-08-13 |
| HUP9800247A2 (hu) | 1998-10-28 |
| CA2222981A1 (en) | 1998-08-06 |
| US6103527A (en) | 2000-08-15 |
| HU9800247D0 (en) | 1998-03-30 |
| DE19704301C1 (de) | 1998-03-26 |
| AR011110A1 (es) | 2000-08-02 |
| EP0857781A3 (de) | 2001-05-16 |
| CN1196784C (zh) | 2005-04-13 |
| CZ33298A3 (cs) | 1998-08-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU723325B2 (en) | Transcriptional regulation of genes encoding vascular endothelial growth factor receptors | |
| JP4323952B2 (ja) | 阻害オリゴヌクレオチド及び遺伝子を特異的に抑制するためのそれらの使用 | |
| CA2978171A1 (en) | T-cell receptors directed against the preferentially expressed antigen of melanoma and uses thereof | |
| Ranganathan et al. | Cloning of murine tissue factor and regulation of gene expression by transforming growth factor type beta 1. | |
| JP2010029207A (ja) | ＨＭＧ蛋白質（ｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の核酸配列およびそれらの使用 | |
| JP2002512030A (ja) | がん免疫療法に有用な、ｈｓｐ７０から誘導された変異ペプチド化合物 | |
| CZ41897A3 (en) | Structures of nucleic acids for controlled expression of genes, cells containing such structures and their use for preparing medicaments | |
| US7790454B2 (en) | Method for tissue regeneration | |
| CZ289227B6 (cs) | Promotor lidského endoglinového genu a jeho pouľití pro přípravu léčiva | |
| JP2017500316A (ja) | ストロマ細胞由来因子−１のプロテアーゼ耐性変異体を用いた、組織損傷を修復する方法 | |
| AU5318299A (en) | Anti-angiogenesis plasmids and delivery systems, and methods of making and using the same | |
| US20050063948A1 (en) | Methods for targeting interleukin-12 to malignant endothelium | |
| JPH10511542A (ja) | 標的化ｔリンパ球 | |
| Eades et al. | The IFN-gamma response of the murine invariant chain gene is mediated by a complex enhancer that includes several MHC class II consensus elements. | |
| EP1108046B1 (en) | Guanylate binding protein (gbp-1) as inhibitor of cell proliferation | |
| US6231850B1 (en) | Canine interleukin 12 | |
| RU2651048C1 (ru) | Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена il-11 и/или уменьшением количества белка интерлейкина-11 на основе генно-терапевтических субстанций с геном il-11, способ получения и использования | |
| Lee et al. | Molecular analysis of HLA-DR gene expression induced by IFN-gamma in malignant melanoma cell lines | |
| JP4579688B2 (ja) | Ｉｌ−１８ｂｐのプロモーター、その製造および使用 | |
| JP2002535372A (ja) | プラスミノーゲンクリングル４領域フラグメントおよび利用法 | |
| MXPA98000981A (en) | Promoter of human endoglin gene and his | |
| Zhang et al. | Extracellular domain of kinase domain region mediated by adeno-associated virus inhibits growth and angiogenesis of bladder cancer in Balb-c mice | |
| KR100419972B1 (ko) | 링커 염기서열로 연결된 인간 ｖｅｇｆ의 돌연변이형동형이합체 유전자, 이를 포함하는 발현벡터, 이의형질전환체 및 단백질 | |
| US20030077818A1 (en) | Compositions and methods for targeting interleukin-12 to malignant endothelium | |
| Ghelardi et al. | Cloning of an unidentified T-cell receptor α chain gene from a vesicular stomatitis virus-specific helper T-cell clone |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20060204 |