JP4323952B2 - 阻害オリゴヌクレオチド及び遺伝子を特異的に抑制するためのそれらの使用 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトの疾患、特にがん又は伝染病の遺伝子研究及び治療の分野に関する。特に、本発明は、細胞のプロセスに係わる遺伝子又は遺伝子ファミリーの機能を決定し、かつヒト又は動物の疾患の原因である有毒遺伝子を抑制する手段を提供することを目的とする。本発明は、これらの方法を実施するための活性作用物質、及びそれらを含む組成物に関係する。

先行技術において、哺乳動物の細胞内で遺伝子を特異的に阻害することを可能にするアンチセンスオリゴヌクレオチド技術が知られている。これらの技術は、標的遺伝子の相補的ＤＮＡの短いオリゴヌクレオチドの細胞内への導入に基づく。このオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子によって転写されたメッセンジャＲＮＡの分解を引き起こす。アンチセンスのもう一つの作用方法は、標的遺伝子によって三重らせん体を形成するＤＮＡのオリゴヌクレオチドを細胞内に導入することからなる。この三重らせん体の形成は、活性化タンパク質に対する接近をブロックして、又はより洗練されたアプローチにおいて遺伝子分解を引き起こして、遺伝子を抑制する。これらのアプローチのいずれも、哺乳動物細胞内に存在する細胞メカニズムを拠り所とするように見えず、かつそれらはほとんど有効でないことが明らかになった。実際、臨床医学でのアンチセンスの利用は、非常に稀な幾つかの場合に限られ、かつ三重らせん体を形成するオリゴヌクレオチドの可能な利用法は何もない。

本発明の方法は、「ＲＮＡ’ｉｎｈ」又は「ＲＮＡｉ」とも指し示されるＲＮＡ干渉、あるいは植物で明らかにされたコサプレッションに基づく。植物において、遺伝子に対応する長い二本鎖ＲＮＡの導入は、標的とされた遺伝子の特異的かつ有効な抑制を引き起こすことが観察された。この干渉のメカニズムは、２０から２２のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの短い二重鎖への二本鎖ＲＮＡの分解を含む。

今般発明者らは、この原理が、細胞運命の制御に重要な役割を果たす哺乳動物遺伝子に応用され得ることを証明した。

本発明により阻害オリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉとより一般的には呼ばれる「ＲＮＡ’ｉｎｈ」アプローチは、重要性が、その高い保存度によって強調される細胞メカニズムを拠り所とする。なぜならば、このメカニズムは、界及び種を通り抜けて保存され、かつ植物だけでなく線虫及び酵母並びに哺乳動物、ヒト及びマウスにおいても証明された。

本発明の枠内で行われた調査作業は、このアプローチが先行技術で検討された技術よりも、遺伝子を特異的に抑制するために遥かに有効であることを証明した。更に、それは、アンチセンス及び抗原の利点を潜在的に集める。実際、植物において、コサプレッションは、転写後のレベルで成熟ＲＮＡに対して行われるが、転写レベルでも、従って遺伝子自体に対しても行われる。実際、抑制は代々伝えられ、かつ従って遺伝子を、長く、更には最終的に抑制することを可能にするであろう。

従って本発明は、各々が、ハイブリッドからはみ出る単純鎖端を形成する１〜５つの非対合（non apparies）ヌクレオチドを、３’又は５’末端の一方に含む２つの相補的オリゴヌクレオチド配列からなり、前記オリゴヌクレオチド配列の一方は、特異的に抑制することを希望する標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に属する標的配列と実質的に相補的であることを特徴とする、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のプロセスに使用されるための二本鎖オリゴヌクレオチドを対象とする。このＤＮＡ又はＲＮＡは、あらゆる性質のものであり得、例えばメッセンジャ又はリボソームＲＮＡ、あるいは好ましくは遺伝子であり得る。

好適には、２つの相補的オリゴヌクレオチド配列の各々は、ハイブリッドからはみ出る単純鎖端を形成する１〜５つの非対合ヌクレオチドを、同一の３’又は５’末端に含む。

好適には、２つのオリゴヌクレオチド配列は、同一の大きさを有する。

塩基対合の法則のため、以下において、特異的に抑制することを希望する、かつ従って単純又は二本鎖でもあり得るＤＮＡ又はＲＮＡ分子に属する標的配列と相補的である本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド配列の一方又は他方を、本発明のオリゴヌクレオチドと、区別せずに同様に指し示す。

本発明のオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は混合性質を有し得る。しかしながら、アンチセンス鎖とも指し示される標的配列の相補的オリゴヌクレオチドが、大部分でリボヌクレオチド性質を有することが好まれる。センス鎖は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は混合性質を有し得る。ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡタイプの本発明のオリゴヌクレオチドの例は、以下の実験の部で示す。

実際、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドよりも安定しており、かつアンチセンス戦略において使用される単純鎖核酸よりも遥かに安定している。

同様にオリゴヌクレオチドとは、リボ、デオキシリボ又は混合タイプの、２〜１００、かつより一般的には５〜５０のヌクレオチドのポリヌクレオチドを意味する。

ハイブリダイズされ、かつ標的配列と相補的であるオリゴヌクレオチド配列の部分は、好ましくは１５〜２５のヌクレオチド、かつ非常に好ましくは２０〜２３のヌクレオチドの大きさを有する。

本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ハイブリッドからはみ出る１〜５つのヌクレオチド、好ましくは２〜３つ、かつ非常に好ましくは２つのヌクレオチドを、各鎖の３’末端に好ましくは含む。ハイブリッドからはみ出るこれらヌクレオチドは、標的配列と相補的であっても、なくても良い。例えば、本発明の特殊な実施形において、ハイブリッドからはみ出るヌクレオチドは、任意のヌクレオチド、例えばチミンである。

本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドを、次のように表すことができる。ここで、各ダッシュは、１つのヌクレオチドに対応し、かつ各鎖は、ハイブリッドからはみ出る２つのチミンを３’末端に含む：
５’−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−ＴＴ３’
３’ＴＴ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−５’

本発明のオリゴヌクレオチド配列は、特異的に抑制することを希望する遺伝子のメッセンジャＲＮＡ又はＤＮＡ分子に属する標的配列と実質的に相補的である。標的配列と完全に相補的であるオリゴヌクレオチドが好まれるが、実質的に相補的とは、目的とする遺伝子の抑制特性が変化しないのである以上、オリゴヌクレオチド配列が、標的配列に対して幾つかの突然変異ヌクレオチドを含み得ることを意味する。例えば、本発明のオリゴヌクレオチド配列は、１〜３つの突然変異ヌクレオチドを含み得る。

従ってこれらの突然変異ヌクレオチドは、ハイブリッドからはみ出るもの、又はオリゴヌクレオチド配列内部のヌクレオチドであり得る。

このように、本発明のオリゴヌクレオチドは、完全なハイブリッドであるか、又は二本鎖中に１つ又は幾つかのミスマッチを含み得る。しかしながら、ハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド配列の部分が、標的配列と完全に相補的であることが好まれ、他方でハイブリッドからはみ出るヌクレオチドは、任意であり、かつ特にチミンであり得る。このように、完全に相補的とは、本発明のオリゴヌクレオチドが、突然変異遺伝子のＤＮＡ又はＲＮＡに属する配列と相補的であることを同様に意味する。このように、本発明のオリゴヌクレオチドは、野生遺伝子と、突然変異遺伝子との配列を区別することを可能にし得るが、このことは、本発明のオリゴヌクレオチドの治療的使用においても、遺伝子分析においても特別な重要性を有し得る。

本発明のオリゴヌクレオチドは、一般的に自然ヌクレオチド塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）からなるが、オリゴヌクレオチドに相補的標的配列によって反応し得る挿入剤若しくは架橋剤、又は反応性基を有するヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチドも含み得る。

本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの従来の化学又は生物学的合成方法によって調製され得る。

本発明は、細胞内の浸透、ターゲティング、又はアドレッシングを促進又は可能にする物質に結合されるオリゴヌクレオチドも検討し、それは脂質、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド、又はその他のあらゆる天然又は合成物質であり得る。実際、本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞内、かつ好適には幾つかの場合に、細胞の核内まで内部移行されることが予定され、そこで、オリゴヌクレオチドの標的配列を有する核酸分子と相互に作用することになる。同様に、腫瘍、骨等のような特殊な組織内へのそれらの浸透を促進することは、興味深いかもしれない。

本発明のオリゴヌクレオチドは、遺伝子又は遺伝子集合を非常に有効に、かつ非常に特異的に抑制すること、及び従って多数のヒト疾患の治療に有用である。それらは、遺伝子機能の研究及び理解のための調査ツールともなる。従って本発明は、オリゴヌクレオチド又は異なるヌクレオチド集合を含む薬剤組成物、及びこれらのオリゴヌクレオチドを、単独で又は薬剤のような輸送物質と結合して使用することを対象とする。

本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば移植の際に生体外適用で利用され得る。このように、オリゴヌクレオチドは、その次に注射される特に腫瘍の細胞内にトランスフェクトされるか、場合によって必要なベクター化剤と共に、例えば局所的、全身的方法、又はエアロゾルによって、例えばすでに発達した腫瘍の組織内に注射され得る。

オリゴヌクレオチドは、適用、及び適切な薬剤賦形剤と使用される投与形状に応じて十分な濃度で使用される。オリゴヌクレオチドの性質（ＤＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡ）に応じて、異なる分量が、調査される生物学的効果を得るために使用され得る。

本発明のオリゴヌクレオチドは、患者の細胞試料から患者の遺伝子プロフィールを試験管内で作成することを可能にする診断ツールとしても同様に有用である。かかる分析方法で本発明のオリゴヌクレオチドを利用することにより、この患者のがん細胞の応答を知る又は予想すること、及び個人用の治療を定めること、又は患者の治療を調節することが可能になる。

本発明のオリゴヌクレオチドは、従来の化学療法剤に対して幾つかの利点を有する：
−ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドよりも安定しており、かつアンチセンス戦略において使用される単純鎖核酸よりも遥かに安定している。
−それらは、天然化合物を構成し、いかなる免疫反応、又は薬剤不耐性の恐れも先験的にない。
−本発明の枠内で行われたトランスフェクション実験は、プラスミドによって得られるものよりも、腫瘍細胞内への非常に良好なＲＮＡｉの浸透を示す。この点は、一般的にトランスフェクトすることが非常に困難である腫瘍細胞の場合に非常に重要である。
−ｓｉＲＮＡの生体内全身注射実験は、組織内へのこれら分子の非常に良好な浸透を示す。
−幾つかの細胞遺伝子を標的として同時に選ぶために、幾つかのＲＮＡｉを互いに混合することは容易である。

本発明のオリゴヌクレオチド及びそれらを含む組成物は、伝染病又はウイルス病、特にエイズ、非従来型伝染病、特にＢＳＥ及びクロイツフェルト・ヤコブ病の治療又は予防に有用である。それらは、がんの原因であるウイルス病を治療するために特に示される。下記の表に、ヒトのがん疾患にかかわるウイルスの例を報告する。

本発明のオリゴヌクレオチド及びそれらを含む組成物は、加齢に関連する黄斑変性症、腫瘍血管形成、糖尿病性網膜症、乾癬、関節リウマチのような血管新生化過多に関連する疾病の治療又は予防にも有用である。

本発明の枠内で行われた調査作業により、これらのオリゴヌクレオチドが、がん化にかかわる有毒遺伝子を抑制することに特に適し、かつ従ってがん及びより一般的には腫瘍学的疾病の治療及び予防に特に有用であることを証明することが可能になった。

理想的な抗がん治療は、耐性現象を回避しながら、腫瘍細胞の死を引き起こすべきである。細胞死は以下のことによって得ることができる：
−細胞分裂の阻害、細胞周期のブロック、
−腫瘍細胞のアポトーシス誘導、
−老化誘導、
−壊死誘導、
−分化誘導。この場合、治療により、細胞が再び正常になるに至る。

このように、本発明は、抑制が腫瘍細胞のアポトーシス、又は老化、又は壊死、又は分化を誘導する、又はそれらの分割又はこれらの現象の幾つかを妨げる、遺伝子のメッセンジャＲＮＡ又はＤＮＡ分子に属する標的配列と相補的なオリゴヌクレオチド配列を各々が含む、オリゴヌクレオチド又は異なるオリゴヌクレオチド集合に特に関心を有する。

腫瘍細胞のアポトーシス誘導は、多数の細胞遺伝子（例えばＢＣＬ２、ＢＣＬ ＸＬファミリのメンバ）の機能が、細胞をアポトーシスから保護することであることに基づく。従って、ＲＮＡｉによって誘導されるこれらの遺伝子の発現喪失により、アポトーシスへの移行が可能になる。

細胞死は、細胞のマトリックスへの接着喪失によっても同様に引き起こされ得る（アノイキス）。この効果は、腫瘍及びその間質性環境内でプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害因子の間の平衡を摂動させて得ることができる。この摂動は、その上、健康な組織を冒し、かつ転移する腫瘍細胞の能力を減少させることを効果とする。従ってｓｉＲＮＡは、マトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）、膜マトリックス金属プロテアーゼ、それらの阻害因子（ＴＩＭＰｓ）ファミリのタンパク質合成、並びに活性化因子、例えばＰＡＩ−１のようなプロテアーゼの阻害因子及び例えばウロキナーゼのようなプロテアーゼ自体のタンパク質合成を妨げるために使用され得る。

老化誘導は、正常な細胞が、限られた回数しか分割され得ないことに基づく。この回数は、プログラムされ、例えば胚性線維芽細胞に関して約５０回の分割であり、かつ細胞分割に応じて短くなる末端小粒の長さによって「測定される」。ある大きさ以下で、末端小粒は、もはや機能的でなく、かつ分割することが不可能な細胞は、老化に入る。しかしながら胚細胞において、この長さは、酵素、テロメラーゼの作用によって一定に保持される。テロメラーゼは、多数のがん内で再発現され、このことにより腫瘍細胞が、無限に増大することが可能になる。テロメラーゼの発現をブロックするＲＮＡｉは、正常な体細胞に対しては、取るに足りないであろうし、かつ腫瘍細胞を老化に導くはずである。

細胞分割のブロックは、同様に細胞を老化に導く。このブロックは、必要不可欠な細胞受容体を阻害して得ることができる。これらの受容体は、細胞の性質に応じて、成長因子が突然変異であろうとなかろうと、成長因子（特にＥＧＦ、ＳＳＴ２、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ）の受容体のクラスか、ホルモン（特にアンドロゲン、エストロゲン、グルココルチコイド）の核内受容体のクラスに属し得る。

ホルモン受容体は、がん内で頻繁に突然変異し、かつ本発明は、この場合にこれらの受容体の突然変異した形状を認識し、かつ野生形状の合成を阻害しないオリゴヌクレオチドの使用に関する。このことにより、例えばアンドロゲン受容体の突然変異によって耐性になった前立腺がんの場合に、他の器官内で受容体の野生形状の阻害に関連した去勢効果を誘導することなく突然変異受容体の合成をブロックするｓｉＲＮＡによって患者を全身的に治療することが可能になる。受容体の突然変異した形状を認識するオリゴヌクレオチドの使用例が、示される。

細胞周期も同様に、例えばサイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、ＤＮＡ複製酵素、Ｅ２Ｆのような転写因子のような、その伸展に欠かせないタンパク質合成を阻害して停止され得る。

壊死誘導は、腫瘍細胞の、酸素及び直接栄養分の必要性から生じる。最初に腫瘍は、宿主の前存の血管から、その発達を確実に行う。直径１〜２ｍｍ以上で、腫瘍の中心に位置する細胞は、低酸素状態になる。この低酸素は、プロリンヒドロキシラーゼを介して、標的遺伝子の促進因子内のＨＲＥ配列に定着して低酸素反応を開始する、配列番号５９を添付書類に示す、Ｈｉｆ１α転写因子の安定化をもたらす。この反応は、特に嫌気性解糖方法、ストレス応答及び血管形成を活性化することを可能にする幾つかの遺伝子の活性化に至らせる。後者のメカニズムは、主要な腫瘍血管形成因子である、配列番号６０を添付書類に示す、ＶＥＧＦの遺伝子を特に活性化する。

このように、例えばＨｉｆ１α転写因子の発現、又は例えばＶＥＧＦのそれをブロックする本発明によるオリゴヌクレオチドは、腫瘍細胞を低酸素又は血管形成応答を準備することが不可能な状態にする。血管形成は、月経周期（子宮卵巣）を除き、成人において通常、抑制されるメカニズムである。従って、このメカニズムの阻害は、正常な組織に対してほとんど結果をもたらさない。

従って、本発明は、オリゴヌクレオチド配列の一方が：
−Ｈｉｆ１α転写因子；
−ＶＥＧＦ Ａ又はこの成長因子ファミリのメンバの１つ又は幾つかのイソ型、をコードする遺伝子のメッセンジャＲＮＡ又はＤＮＡ分子に属する標的配列と実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドに関係する。

幾つかのがんにおいて、腫瘍表現型は、正常な細胞の通常は不在であるタンパク質発現から生じるか、それによって保持される。このタンパク質は、パピローマウイルス、ＨＰＶ、又はＢ型肝炎ウイルスのような、細胞内のウイルスゲノムの現在又は以前の発現から生じ得る。このタンパク質は、正常な細胞遺伝子の（点状、欠失、挿入）突然変異から同様に生じ得る。この場合、このように生成された突然変異タンパク質が、正常なタンパク質に対してトランスドミナントネガティブ特性を有することがよく起こる。ｓｉＲＮＡの特異性により、野生タンパク質の合成をブロックすることなく突然変異タンパク質の合成を阻害することが可能になる。ｐ５３タンパク質及びアンドロゲン受容体の突然変異した形状に関する２つの例を、以下の実験の部で報告する。

本発明の枠内で行われた調査作業により、これらのオリゴヌクレオチドが、がん化にかかわる有毒遺伝子を抑圧すること、及び特にはＰＭＬ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質のような、がん細胞内で融合タンパク質形成に至らせる有毒遺伝子に特に適することを証明することが可能になった。

従って本発明は、配列が、染色体転座から生じる遺伝子に属する標的配列と、この遺伝子によって発現する融合タンパク質の効果を阻害するように、相補的である、オリゴヌクレオチドに特に関係する。このように、標的配列は、融合タンパク質の接合の配列に対応するものである。

本明細書末尾の添付書類Ａの表２は、本発明のオリゴヌクレオチドの治療又は診断標的を表す融合タンパク質の非網羅的な表である。

本発明のオリゴヌクレオチドにより、２つの遺伝子、例えば２つの遺伝子ｐｍｌ及びｒａｒαの間の接合を標的とすることは、第２の対立遺伝子によってコードされ得る天然タンパク質の生物学的役割に影響することなく融合タンパク質の特異的阻害を達成することを可能にする。従って、本発明のこの実施形は、発がん現象、特に白血病にかかわるあらゆる融合タンパク質を含める。存在する場合の相反形状、並びに添付書類に言及した融合タンパク質のあらゆる変異体は、本発明の標的を同様に構成する。従って、本発明は、特にがんにおいて、融合タンパク質の発現から生じた疾病の治療用の薬剤組成物を調製するための、以上に定義したようなオリゴヌクレオチドの使用に特に関する。

現在の抗がん治療は、単独、又は互いに組み合わせて選ばれる、様々なアプローチ（化学療法、外科、放射線療法、免疫療法）によってがん細胞を標的として選ぶ。治療上の失敗は、多くが、細胞に治療が達しなかったことか、又は、かつ大部分で、細胞が治療に応答して突然変異したことによる。この突然変異能力は、腫瘍細胞の遺伝子の不安定性によって大いに容易にされる。酸素及び直接栄養分を細胞から奪う腫瘍血管新生の阻害は、数年前からがん腫学に新しい治療展望を開いた。この戦略は、先行する戦略に補足的であり、遺伝的に安定した、かつ従って理論上、突然変異する可能性がほとんどない宿主の正常な内皮細胞を標的として選ぶ。様々なアプローチによって腫瘍血管形成を阻害することを目的とする多数の臨床試験が、世界中で進行中である。しかしながら、報告された初期の結果は、かなり期待外れに見える。

発明者らは、腫瘍が、高濃度の血管形成促進（pro angiogeniques）因子を分泌する細胞の過疎を選択して、血管形成阻害因子の効果を補うことが可能であることを証明した。

腫瘍は、その遺伝子発現に関して、均質な細胞から構成されない。このことは、免疫マーキングが、腫瘍内で非常に多様な抗原に対して行われた、非常に多数の研究によって証明されている。巨視的には、腫瘍は、壊死帯域に沿って伸びる高度血管新生化、又は逆に無血管領域から頻繁に構成される。

この腫瘍の異質性は、その性質がどのようなものであれ、適用される治療から腫瘍が逃れることを助長する。腫瘍内の遺伝子発現の多様性が大きいほど、抗腫瘍剤に耐えることが可能な少なくとも１つの細胞が存在する確率が実際に高くなる。従って、腫瘍異質性を最初に減少させ、かつ逃れる現象を回避するために様々な戦略を結合することは、大変重要であるように見える。

本発明は、ｐ５３の不活性化の原因である遺伝子発現の阻害ｓｉＲＮＡ、及びがん治療におけるそれらの使用に特に興味を有する。ｐ５３は、ヒトの５０％を超える腫瘍において突然変異した、がん抑制遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子の生成物である。ｐ５３は、このようにして「ゲノムの番人」と考えられる。それは、遺伝毒性ストレスの場合に細胞内で活性化され、かつ種々のプロセスに関与し、その中にプログラム死のプロセス誘導がある。

単一対立遺伝子性突然変異の７４％の場合で、ｐ５３の不活性化は、正常な大きさであるが、突然変異したタンパク質発現に達する点状突然変異による。一般的に突然変異した形状は、「トランスドミナントネガティブ」として作用し、その活性をブロックする野生対立遺伝子生成物を有するヘテロマーを形成すると考える。突然変異形状は同様に、それ自体に発がん性活性を有するように見える。このように、ｐ５３の突然変異した形状は、がん細胞の化学療法に対する耐性を容易にする、ＭＤＲ遺伝子を活性化することが可能である。更に、ｐ５３の突然変異体の発現は、おそらくｐ５３の突然変異形状が、血管形成の最も強い抑制因子の１つであるトロンボスポンジンの遺伝子の転写をもはや刺激することができず、かつ血管形成の２つの強い活性化因子であるＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを活性化させることの理由で、より高度な腫瘍血管形成に関係する。その上、ｐ５３の突然変異形状が発現する細胞は、種々の調整レベルを喪失する。特にそれらは、腫瘍発生に対する主要な保護プロセスの１つを構成するプログラム死のプロセスを開始することがもはや可能でない。野生ｐ５３活性の修復は、培養中の腫瘍細胞において、この細胞応答の修復を引き起こす。このように、ｐ５３の突然変異した形状の発現阻害は、潜在的に抗がん治療での強力なツールとなる。

現時点で、ヒトがん細胞内でｐ５３活性を修復するいかなる有効な手段もない。２つの対立遺伝子が不活性化されるがんに関して、遺伝子治療によるｐ５３活性の修復の試みが、検討される。これらのアプローチは、ウイルスベクターの使用によって複雑であり、かつ今のところあまり有効でない様子を示している。

その上、子宮頚管細胞のＨＰＶウイルスによる感染に関連した子宮頚がんにおいて、ｐ５３が、ウイルスタンパク質の過剰発現によって不活性化され得ることが特に観察された。実際、このウイルスは、１つのタンパク質、Ｅ６タンパク質をコードし、Ｅ６タンパク質はｐ５３を不活性化する。このタイプのがんにおいて、野生ｐ５３活性を修復できるのは、Ｅ６タンパク質を阻害することである。

本発明は、ｐ５３の不活性化の原因となる遺伝子の発現を阻害して、ｐ５３を活性化させることを可能にする新規な手段を提供することを目的とする。本発明の枠内で行われた調査作業によって、ｐ５３の突然変異形状の発現を非常に有効に、かつ非常に特異的に抑圧することが可能であることを明らかにすることが可能になった。

本発明は、突然変異ｐ５３の遺伝子の特異的ポリヌクレオチド配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。従って、配列が、野生ｐ５３配列に対して突然変異を有するオリゴヌクレオチドが問題となる。ｐ５３の野生遺伝子配列を、配列番号１で、添付した配列表に示す。ｐ５３の配列に対して介在し得る様々な突然変異を、本明細書の末尾で添付書類Ｂの表３に示す。

がん疾患において最も頻繁に観察される突然変異を、次の表４に報告する。

このように、本発明によるオリゴヌクレオチドは、表３に示す突然変異の少なくとも１つ、及び特に上記表４の突然変異の少なくとも１つを有する突然変異ｐ５３遺伝子に属する標的配列と相補的である。

これらのオリゴヌクレオチドは、ｐ５３の野生形状と、突然変異した形状とを有効に区別することが可能である。実際、戦略は、野生形状を再活性化し、かつ野生形状が不可欠であるプログラム死のプロセスを細胞内で誘導するために突然変異した形状の発現をブロックすること、及び／又はｐ５３の突然変異した形状によって誘導される他のあらゆるプロセスをブロックすることである。更に、本発明のオリゴヌクレオチドのこの区別能力により、がん細胞にのみ触れること、及びｐ５３のこの突然変異した形状を発現しない正常な細胞の被害を免れさせることが可能になる。

従って本発明は、ｐ５３タンパク質の不活性化によって誘導される疾病、並びに特に突然変異ｐ５３タンパク質の発現から生じるがん及びｐ５３の阻害遺伝子の発現から生じるがんの治療又は予防も対象とする。本発明は、リー・フラウメニ症状群の場合のように、ｐ５３の突然変異した形状を発現する被験者においてがんの出現を予防することを更に対象とする。

Ｐ５３は、幾つかの異なるメカニズムを通じて不活性化され得る。特に、大多数の子宮頚がんにおいて、Ｐ５３は、ヒトパピローマウイルスによってコードされるタンパク質、Ｅ６タンパク質によって不活性化される。Ｅ６は、Ｐ５３のユビキチニル化（ubiquitinylation）を引き起こし、このことは、プロテアソームによる分解に至らせる。この場合、Ｐ５３発現は、Ｅ６タンパク質の発現阻害によって修復され得る。本発明は、ＨＰＶのＥ６タンパク質の遺伝子の特異的なポリヌクレオチド配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドにも同様に関する。ＨＰＶのＥ６タンパク質の遺伝子配列を、図６Ａ及び添付の配列表に配列番号２で示す。

以前に示したように、本発明による戦略は、がん内のアンドロゲン受容体の発現を、ＲＮＡｉを用いてブロックすることを目的とする。アンドロゲン受容体配列を、添付の配列表に配列番号７７で示す。がんが耐性を有する前に、そのがんを、又は突然変異なしに受容体の増加によって耐性を有するようになったがんを治療するために、（ＡＲ ｓｉＲＮＡと印を付けられた）アンドロゲン受容体の突然変異のデータバンク内にいかなる突然変異も記載されていなかった領域の相同ｓｉＲＮＡが、使用された。突然変異によってアンドロゲン耐性を有するようになった前立腺がんを特異的に治療するために、受容体をコードするｍＲＮＡの配列決定が、正常な細胞に関する影響なしに患者を治療することを可能にする、突然変異の特異的配列を設計するために、患者の細胞内で行われる。一例が、ＬＮＣａＰ細胞系統（ＬＮＣａＰ ｓｉＲＮＡ）内に存在するアンドロゲン受容体の突然変異を特異的に認識するｓｉＲＮＡの使用によって示される。

従って本発明は、突然変異した又は突然変異しないアンドロゲンへの受容体をコードするメッセンジャＲＮＡ又はＤＮＡ分子に属する標的配列と実質的に相補的なオリゴヌクレオチドに関係する。例えば添付書類Ｃの表５に示す突然変異の少なくとも１つを有するアンドロゲンへの受容体が問題となる。アンドロゲンへの受容体の特異的な、本発明のこれらのオリゴヌクレオチドは、例えば前立腺がんのような、アンドロゲン依存性疾病を治療又は予防するために有用である。

本発明のその他の利点及び特徴は、次の事項に関する、以下に続く実施例から現れるであろう：
−実施例１：急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）に関連したＰＭＬ−ＲＡＲαタンパク質の阻害。
−実施例２：ＶＥＧＦによって誘導される腫瘍血管形成の阻害。
−実施例３：ＨＩＦ１ αによって誘導される低酸素応答の阻害。
−実施例４：前立腺がん細胞内のアンドロゲン受容体の野生又は突然変異形状の阻害。
−実施例５：ｐ５３タンパク質の野生又は突然変異形状の阻害。
−実施例６：Ｅ６ウイルスタンパク質の阻害。
−実施例７：様々なタンパク質の発現を阻害するためのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの使用。
−実施例８：様々な方法によるｓｉＲＮＡの生体内投与。

実施例において、図面が参照される。

実施例１：急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）に関連したＰＭＬ−ＲＡＲαタンパク質の阻害。

Ｉ−序論。

急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）は、染色体１５上のｔ（１５；１７）転座による。罹患した患者において、ＲＡＲαレチノイン酸受容体（ＲＡＲα）は、このようにしてＰＭＬ−ＲＡＲα融合タンパク質を発生させるＰＭＬタンパク質（前骨髄球性白血病タンパク質）に融合される。今日までＲＡＲαを使用する５つの融合タンパク質が、識別された。これら全てのタイプの白血病は、ＲＡＲα受容体を伴い、かつ臨床的に類似しており、このことは、レチノイン酸の形質導入路の破裂が、ＡＰＬ白血病の疾患において重大であることを暗示している。

ＰＭＬ−ＲＡＲα融合タンパク質は、ＲＡＲαのレチノイン酸及びＤＮＡへの結合領域を保った。ＰＭＬ−ＲＡＲα融合タンパク質は、レチノイン酸の標的遺伝子の発現を抑制し、かつ前骨髄球性細胞の分化のブロックをこのように引き起こすことが証明された。レチノイン酸の薬理学的分量の投与のみが、ＰＭＬ−ＲＡＲαによって行われる転写抑制の除去、及び細胞分化の回復を可能にする。更に、融合タンパク質のＰＭＬタンパク質部分は、レチノイン酸による形質導入路のブロックメカニズムに同様に介入し得るであろう。ＰＭＬが成長阻害因子及びアポトーシス剤として機能しており、かつレチノイン酸によって誘導される幾つかの遺伝子の発現に必要である限りにおいて、ＰＭＬに対するＰＭＬ−ＲＡＲαのドミナントネガティブ効果により、細胞が、成長能力、アポトーシスへの耐性、及び分化停止を得ることが可能になり得るであろう。

ＰＭＬに対する細胞生物学調査により、このタンパク質が、核小体と呼ばれる特殊な構造内で、核内で特殊な局在化を有することが証明された。これらの構造の役割は、ＰＭＬのがん抑制遺伝子の役割と直接的な関係にあるように見える。ＡＰＬ悪性細胞において、ＰＭＬ−ＲＡＲαタンパク質は、染色質に対するＰＭＬ−ＲＡＲαの固着部位に対応し得る微小穿刺構造への核小体のＰＭＬ非局在化をＰＭＬとのヘテロ二量体化によって引き起こす。この非局在化は、ＰＭＬのアポトーシス促進（pro-apoptotique）機能、及び骨髄性分化でのその役割をブロックし得る。幾つかの作業班は、ＰＭＬ−ＲＡＲα融合タンパク質を発現する細胞系統に対するレチノイン酸及びＡＳ_２Ｏ_３に組み合わせた治療により、核小体に対するＰＭＬの再局在化と同時に融合タンパク質の分解が可能になることを証明した。核小体のこの再編成は、ＰＭＬ機能を修復し、かつ分化の回復に寄与する。

最後に、従ってＰＭＬ−ＲＡＲαキメラタンパク質は、細胞がアポトーシスを逃れること及びこのように形質転換された前骨髄球の分化をブロックすることを同時に可能にしながら、ＲＡＲα及びＰＭＬに対する、二重のドミナントネガティブ効果を有するであろう。

ＡＰＬ白血病に罹患した患者の９８％以上は、ＰＭＬ−ＲＡＲα及びＲＡＲα−ＰＭＬ融合遺伝子の形成に至らせる、ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）転座を有する。２つのサブタイプのＰＭＬ−ＲＡＲα融合タンパク質、Ｓ（短）及びＬ（長）融合が存在する。９５５のアミノ酸のタンパク質に対応するＰＭＬ−ＲＡＲα融合タンパク質の長い形状は、大部分が発現した形状を表し、かつ従ってこの研究においてモデルとして選ばれた（添付書類Ａ、Ｂ及びＣ）。このタンパク質は、レチノイン酸の受容体α（ＲＡＲα）のアミノ酸５９〜４６２によって融合されるＰＭＬタンパク質のアミノ酸１〜５５２を含む。

ＩＩ−オリゴヌクレオチドの調製及び投与。

融合タンパク質遺伝子の接合の配列に対応する相補的ＲＮＡオリゴヌクレオチド、すなわちＰＭＬ遺伝子の１０のヌクレオチド及びＲＡＲα遺伝子の１０のヌクレオチドは、３’で２つのデオキシチミジンの添加によって合成された（図１）。これらのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされ、かつ二本鎖オリゴヌクレオチドの取得は、アクリルアミドゲルに対して確認された。

使用される（５’−３’）ＰＭＬ−ＲＡＲ及び対照ｓｉＲＮＡの配列を、以下に示す。

対照：
正：
［ＣＡＵＧＵＣＡＵＧＵＧＵＣＡＣＡＵＣＵＣ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号３）
逆：
［ＧＡＧＡＵＧＵＧＡＣＡＣＡＵＧＡＣＡＵＧ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号４）
ＰＲ：
センス：
［ＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＵＵＧＡＧＡＣ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号５）
アンチセンス：
［ＧＵＣＵＣＡＡＵＧＧＣＵＧＣＣＵＣＣＣＣ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号６）

ＩＩＩ−結果。

ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞は、ＰＭＬ−ＲＡＲαタンパク質（１００ｎｇ）の発現ベクター及び５００ｎｇの対照（Ｃ）又はＰＭＬ−ＲＡＲα（ＰＲ）に向けられるｓｉＲＮＡによってリポフェクタミンと共に同時トランスフェクトされた。トランスフェクションの４８時間後、ウェスタンブロット（図１Ｂ）が、完全な又は融合タンパク質形状の、ＲＡＲαタンパク質を認識する抗体を使用して、全体細胞抽出物に対して行われた。

図１Ｂは、ＰＲ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションが、ＲＡＲαタンパク質の発現を修飾することなく対照ｓｉＲＮＡ（Ｃ）によってトランスフェクトされた細胞に対するＰＭＬ−ＲＡＲα融合タンパク質の発現を非常に強く阻害することを示す。

実施例２：ＶＥＧＦによる腫瘍血管形成の阻害。

Ｉ−序論。

ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）は、識別される最も強い血管形成因子の１つである。これらの因子は、病理学的血管新生化過多の多数の状況、及び特に腫瘍の発達において過剰発現する。この血管形成の阻害により、腫瘍の成長をブロックすることが可能になる。我々の方法は、これらの血管形成因子の１つ、かつこの実施例では、ＶＥＧＦのそれの発現を腫瘍細胞によってブロックして、腫瘍血管形成を阻害することを目的とする。

ＩＩ−オリゴヌクレオチドの調製及び投与。

ラット及びマウスに保存された、ヒトＶＥＧＦのコード配列の領域と相補的な２つのＲＮＡオリゴヌクレオチドが、合成された。２つのデオキシヌクレオチド（ＴＴ）が３’に加えられた
−ＲＮＡｉ ＶＥＧＦの配列
５’［ＡＵＧＵＧＡＡＵＧＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＡ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号７）
５’［ＵＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡＣＡＵ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号８）
−対照ＲＮＡｉの配列
５’［ＣＡＵＧＵＣＡＵＧＵＧＵＣＡＣＡＵＣＵＣ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号９）
５’［ＧＡＧＡＵＧＵＧＡＣＡＣＡＵＧＡＣＡＵｇ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号１０）

配列がデータベース内の一覧表に書き込まれた配列といかなる相同性も有さないこれらのオリゴヌクレオチド又は対照オリゴヌクレオチドは、ラットの線維肉腫細胞（ｃＪ４）又はＬＮＣａＰヒト前立腺がん細胞内でポリフェクト（polyfect）キット（Qiagen）を使用してハイブリダイズされ、かつトランスフェクトされた。

ＩＩＩ−結果。

トランスフェクションの４８時間後、間接免疫蛍光法が、細胞内でタンパク質の発現を検出するために実施された。図２Ａは、ＶＥＧＦの大量の発現阻害を示す。

この効果を数量化するために、対照ＲＮＡｉ又はＶＥＧＦ ＲＮＡｉと並行してトランスフェクトされたｃＪ４細胞内のＶＥＧＦの分量決定が、ＥＬＩＳＡ（quantikine、R&D）によって行われた。細胞は、１％の血清を含む培地内で分量決定前の４８時間、培養された。分量決定は、トランスフェクションの４日及び６日後に実施された。これらの条件で、図２Ｂは、対照ＲＮＡｉによってトランスフェクトされたものと比較して、ＶＥＧＦ ＲＮＡｉによってトランスフェクトされた細胞内で、４日で８５％、及び６日で７５％、及び１３日で６０％のＶＥＧＦの分泌阻害を示す（図２Ｂ）。

腫瘍細胞によるＶＥＧＦの発現阻害効果は、生体内でテストされた：トランスフェクションの３日後、生後４週間の４匹の雌ヌードマウスの３つのグループはマウス１匹につき、１００万の細胞の割合で皮下注射された：第１グループは、トランスフェクトされない細胞が注射され、第２は、対照ＲＮＡｉによってトランスフェクトされた細胞が注射され、第３は、ＶＥＧＦ ＲＮＡｉでトランスフェクトされた細胞によって注射された。注射前には、トランスフェクトされた細胞のいかなる選択も行われなかった。

腫瘍成長は、規則的な間隔で腫瘍体積を測定しながら、追跡した（図２Ｃ）。

図２Ｃ及び２Ｄは、Ａ及びＢグループの腫瘍の大きさの間に、いかなる著しい差も示さない。非常に高度な腫瘍体積の減少がＣグループで観察される。Ｃグループにおいて、遥かに白い腫瘍の様子（図２Ｄ）は、腫瘍血管新生の目立った減少を表す。注射の１２日後に動物を犠牲にした後、腫瘍は解剖され、固定され、かつＶＥＧＦの免疫検出がこれら腫瘍の切片に対して行われた。Ｂグループと比較してＣグループの腫瘍内では非常に高度なＶＥＧＦ発現の減少が観察された（図２Ｅ）。

もう１つの実験において、腫瘍は、ＬＮＣａＰ前立腺がん細胞の注射によって雄ヌードマウスで誘導された。注射の４０日後に、腫瘍体積は１〜１．５ｃｍ^３に達し、マウスは、２つのグループに分割された。第１グループ（４匹のマウス）は、１００μｌのＰＢＳ内の２マイクログラムの対照ｓｉＲＮＡの尻尾の静脈内への静脈内注射を受けた。第２グループは、同一の条件で等しい分量のＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡを受けた。対照ｓｉＲＮＡでなく、ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡは、腫瘍成長の一時的停止を誘導することが観察される（図４Ｄ）。

実施例３：低酸素応答の阻害。

Ｉ−序論。

幾つかの腫瘍は、高度な無酸素の条件で発達することが可能である。腫瘍内で非常に僅かに血管新生した領域が非常に頻繁に観察される。この低い低酸素感度は、２つの結果を有する：一方で抗血管形成治療は、これらの腫瘍又はこれらの腫瘍過疎に対して有効である可能性をほとんど有さない。他方で、この低い血管新生は、治療分子の放出を困難にする。ＨＩＦ１α転写因子は、低酸素応答を可能にする１００以上の遺伝子の活性を調整する。低酸素腫瘍内のこの転写因子の阻害は、その成長をブロックすることを目的とする。

ＩＩ−オリゴヌクレオチドの調製。

−Ｈｉｆ１α ＲＮＡｉ
５’［ＣＡＵＧＵＧＡＣＣＡＵＧＡＧＧＡＡＡＵＧＡ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号１１）
５’［ＵＣＡＵＵＵＣＣＵＣＡＵＧＧＵＣＡＣＡＵＧ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号１２）
−対照ＲＮＡｉ
５’［ＧＡＵＡＧＣＡＡＵＧＡＣＧＡＡＵＧＣＧＵＡ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号１３）
５’［ＵＡＣＧＣＡＵＵＣＧＵＣＡＵＵＧＣＵＡＵＣ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号１４）

ＩＩＩ−結果。

ＶＥＧＦ促進因子は、ＨｉＦ１α転写因子への応答要素を含む。ＨｉＦ１αに向けられるＲＮＡｉの効果を試験管内でテストするために、我々はｃＪ４細胞を、単独の、又はＨｉＦ１α若しくは対照ＲＮＡｉと結合したＶＥＧＦ−ルシフェラーゼレポータベクターによってトランスフェクトした。

トランスフェクションの２４時間後、細胞は低酸素条件を生成するために塩化コバルト１００μＭを加えた、又は加えない、血清のない培地で１８時間培養され、次にルシフェラーゼ活性が測定された。

図３は、細胞が、ＨｉＦ１α ＲＮＡｉによって、但し対照ＲＮＡｉによってでなくトランスフェクトされる時に、低酸素へのＶＥＧＦ促進因子の応答誘導の完全な阻害が、観察されたことを示す。

実施例４：前立腺がん内のアンドロゲン受容体の野生又は突然変異形状の阻害。

Ｉ−序論。

前立腺がんは、工業国において、男性の第２のがんによる死亡原因である。フランスでは、それらは１年当り９５００以上の死因である。前立腺上皮細胞は、その成長に関してアンドロゲンに依存する。前立腺がんは、最初はアンドロゲン依存性である。化学的去勢により、第１段階ではがんの成長をブロックすることが可能になる。しかしながらあらゆる場合に、これらのがんはアンドロゲン非依存性になり、かつその予後は従って非常に悲観的である。このアンドロゲン非依存性は、多くの場合個人により、（例えばエストロゲン又はグルココルチコイドへの応答を与える）受容体の突然変異又は受容体の増加による。

ＩＩ−オリゴヌクレオチドの調製。

非突然変異ヒトアンドロゲン受容体（ＡＲ）のコード配列の領域と相補的な、２つのＲＮＡオリゴヌクレオチドが、合成された。２つのデオキシヌクレオチド（ＴＴ）が、３’で添加された。もう１つの実験で、ＬＮＣａＰヒト前立腺がん細胞内でアンドロゲン受容体（Ｔ８７７Ａ）の突然変異を特異的に認識するＬＮＣａＰと呼ばれるｓｉＲＮＡが、使用された。

−ＡＲ：
５’［ＧＡＣＵＣＡＧＣＵＧＣＣＣＣＡＵＣＣＡＣＧ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号１５）
５’［ＣＧＵＧＧＡＵＧＧＧＧＣＡＧＣＵＧＡＧＵＣ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号１６）
−対照：
５’［ＧＡＵＡＧＣＡＡＵＧＡＣＧＡＡＵＧＣＧＵＡ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号１７）
５’［ＵＡＣＧＣＡＵＵＣＧＵＣＡＵＵＧＣＵＡＵＣ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号１８）
−ＬＮＣａＰ：
５’［ＧＣＡＵＣＡＧＵＵＣＧＣＵＵＵＵＧＡＣ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号１９）
５’［ＧＵＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＣＵＧＡＵＧＣ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号２０）

幾つかのＬＮＣａＰヒト前立腺がん系統のサブクローンが、この研究で使用された。元の系統、ＬＮＣａＰは、アンドロゲン依存性である。試験管内でのＬＮＣａＰ系統の反復した移行によって得られたＬＮ７０細胞は、アンドロゲンへの応答の減少を有する。動物で、細胞の移行後に得られるＬＮＳ５クローンは、アンドロゲン耐性である。

ＩＩＩ−結果。

ＬＮＣａＰ細胞は、トランスフェクション剤ポリフェクト（polyfect）剤（qiagen）を使用して、ＡＲ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡによって試験管内でトランスフェクトされた。トランスフェクションの４８時間後、細胞は、その担体から離された。細胞の半分は、アンドロゲン受容体のウェスタンブロットによる検出を行うために使用され、他方の半分は、培養状態に戻した。アンドロゲン受容体（１１０ｋＤａの帯域）は、ＡＲ ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされた細胞内では、ウェスタンによってもはや検出できなかった（図４Ａ）。培養状態に戻された、ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされた細胞は、対照ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされた細胞とは逆に、その成長を追跡することが不可能であることが明らかになった。

アンドロゲンへの応答レベルが、アンドロゲンへの応答要素の４回の反復を伴う（４ｘＡＲＥ）最小促進因子の下流に、ルシフェラーゼのコード配列を置くレポータベクターによってＬＮＣａＰ系統の様々な細胞クローンをトランスフェクトして測定された。トランスフェクション後、細胞は、血清の不存在下、かつジヒドロテストステロン、Ｒ１８８１（ＮＥＮ）の代謝的に安定した類似物の存在下又は不存在下で１８時間培養された。これらの２つの条件でのルシフェラーゼ活性の割合により、レポータベクターのアンドロゲンへの応答レベルを測定することが可能になる。

我々は、ＬＮＣａＰ系統の様々なクローンのアンドロゲンへの応答に対する、対照ＲＮＡｉ又はＡＲ ＲＮＡｉのこれらの細胞内で同時トランスフェクションの効果を測定した。

図４Ｂは、アンドロゲンを感知できる２つのクローン：ＬＮＣａＰ及びＬＮＣａＰ ｐ７０内のアンドロゲンへの応答の完全な阻害を示す。この方法は、ＡＲ ＲＮＡｉによる治療への、アンドロゲン耐性のＬＮＳ５クローンの応答を測定することを可能にしない。

ＬＮＣａＰ系統内に存在するアンドロゲン受容体は、突然変異のキャリヤである。我々は、その合成を阻害するために２つの異なるｓｉＲＮＡ、以前使用したＡＲ ｓｉＲＮＡ及びＬＮＣａＰ突然変異を特異的に認識するＬＮＣａＰ ｓｉＲＮＡを使用した。アンドロゲンへの応答が、実験４Ｂでのように測定された（図４Ｃ）。

前立腺がん細胞の生体内での腫瘍成長に対するアンドロゲン受容体の発現阻害の効果を研究するために、対照ｓｉＲＮＡ（Ａグループ）又はＡＲ（Ｂグループ）によってトランスフェクトされたＬＮＣａＰがん細胞が、雄ヌードマウスに皮下注射された。腫瘍成長は、規則的な間隔で、追跡された。Ｂグループの動物の腫瘍は、Ａグループの腫瘍よりも遅く始まったこと、及び４８日目のＢグループの腫瘍の体積は、Ａグループの腫瘍の体積よりも明らかに小さいことが観察された（図４Ｄ）。

もう１つの実験では、ＬＮＣａＰ細胞が、雄ヌードマウスに注射された。３４日目に腫瘍が１．２〜１．５ｃｍ^３の体積に達した時、マウスは、１００μｌのＰＢＳ内の、２μｇの対照又はＡＲのｓｉＲＮＡの腹膜内注射を受けた。この注射は、４０日目に反復された。ＡＲ ｓｉＲＮＡの投与は、腫瘍成長の減速を引き起こすことが観察される（図４Ｅ）。

実施例５：ｐ５３タンパク質の野生又は突然変異形状の阻害。

Ｉ−オリゴヌクレオチドの調製。

配列を以下に示す３つのｓｉＲＮＡが、調製され、一方はｐ５３の野生形状に向けられ、かつ他方は、患者において発現する突然変異した形状に向けられ、かつ系統の作成を生じさせる。

この突然変異は、ヒト腫瘍内で最も頻繁に観察される３つの１つに相当する。

−野生ｐ５３：
センス：［ＧＣＡＵＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＵ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号２１）
アンチ：［ＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＧＧＵＵＣＡＵＧＣ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号２２）
−ｐ５３ ＭＴ１（ｒ２４８ｗ）：
センス：［ＧＣＡＵＧＡＡＣＵＧＧＡＧＧＣＣＣＡＵ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号２３）
アンチ：［ＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＡＧＵＵＣＡＵＧＣ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号２４）
−ｐ５３ ＭＴ２（ｒ２４８ｗ）：
センス：［ＵＣＡＵＧＡＡＣＵＧＧＡＧＧＣＣＣＡＵ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号２５）
アンチ：［ＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＡＧＵＵＣＡＵＧＡ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号２６）

野生ｐ５３で下線を引いたヌクレオチドは、突然変異形状で突然変異され、かつ突然変異ｐ５３（ＭＴ１及びＭＴ２ ｐ５３）の突然変異した形状の配列で斜字のものである。上記の太字の塩基は、特異性を増大させるために導入された突然変異である。

ＩＩ−結果。

図５Ｂに示すように、ｐ５３を発現しないＨ１２９９−ＮＣＩ細胞は、野生（ＷＴ）又は突然変異（ｍｔ）ｐ５３の発現ベクター（４００ｎｇ）によって（リポフェクタミンを使用して）トランスフェクトされた。野生形状（ＷＴ）、突然変異した形状（ＭＴ１及びＭＴ２）に向けられる（漸増分量：０、１２５ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇ及び１０００ｎｇの）ｓｉＲＮＡ、又は無関連ｓｉＲＮＡ（Ｃ）は、同時にトランスフェクトされた。細胞は、２４時間後に集められ、かつｐ５３に向けられる抗体で、ウェスタンブロットによって分析された。

図５Ｃに示すように、ｐ５３を発現しないＨ１２９９−ＮＣＩ細胞は、示すように野生（ＷＴ）、突然変異（ｍｔ）又は両者の混合物（ＷＴ＋ＭＴ）ｐ５３の発現ベクター（４００ｎｇ）によって（リポフェクタミンを使用して）トランスフェクトされた。野生形状（ＷＴ）、突然変異した形状（ＭＴ１）に向けられるｓｉＲＮＡ（４００ｎｇ）、又は無関連ｓｉＲＮＡ（Ｃ）は、同時にトランスフェクトされた。細胞は、２４時間後に集められ、かつｐ５３に向けられる抗体（ＤＯ１、Santa Cruz）、又はテストで使用されるタンパク質量を制御するための細胞アクチン（Sigma）で、ウェスタンブロット（ｉｂ：免疫ブロット）によって分析された。

図５Ｄに示すように、Ｕ２ＯＳ細胞（ｐ５３の野性形状を発現するヒト骨肉腫）が、Ｐ５３の突然変異形状を発現するベクター（Ｒ２４８Ｗ）か、対応する空ベクター（ｐＣＤＮＡ３）によって安定してトランスフェクトされた。これらの系統は、示されたｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされ、かつ示されたタンパク質の発現が、ウェスタンブロットによって検出された。

あらゆる場合において、タンパク質の突然変異した形状に向けられるｓｉＲＮＡは、突然変異した形状を阻害し、かつ野生形状に向けられるｓｉＲＮＡは、野生形状を阻害する。その上、野生形状に向けられるｓｉＲＮＡは、突然変異した形状に対して効果を有さず、その逆も同様なので、「交差反応」はない。突然変異体の発現は、野生たんぱく質が同時発現する時に野生タンパク質を安定させることに注目すべきである。従って、突然変異体の阻害は、この間接効果により、タンパク質発現の阻害なしに、野生形状をその塩基レベルに戻す。

図５Ｅに示すように、図５Ｄに使用された細胞は、示されたｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされた。次に細胞は、２４時間ドキソルビシン（２００ｎｇ／ｍｌ）での治療によって遺伝毒性ストレスを受けた。図５Ｅは、ヨウ化プロピジウムを加えることによるこれらの細胞の細胞周期分析及びＦＡＣＳでの分析を示す。突然変異形状でトランスフェクトされない、かつ従って野生形状を発現しない細胞（ＰＣＤＮＡ細胞）は、ドキソルビシン（dauxorubicine）の存在下でＧ１での高い停止率を示す。野生ｐ５３を減少させながらの野生ｓｉＲＮＡによるこれらの細胞の治療は、このＧ１での停止を減少させる。突然変異した及び野性形状を発現する細胞（Ｒ２４８Ｗ）は、ドキソルビシン（dauxorubicine）の存在下では、Ｇ１で僅かに停止し、突然変異した形状が、野生形状の活性を阻害することを示す。これらの細胞が、ｍｔ１ ｓｉＲＮＡによって治療される時、それらは、Ｇ１で停止する（治療されないＰＣＤＮＡ対照と比較すべき）正常な能力を回復し、これらの細胞内で野生ｐ５３活性の修復を示す。

図５Ｆ、Ｇ、Ｈに示すように、（リー・フラウメニ症候群に罹患した患者に由来し、かつＲ２４８Ｗ突然変異体を発現する）ＭＤＡ ０８７細胞は、ｐ５３の突然変異形状（ＭＴ１）に向けられるｓｉＲＮＡによって、又は無関連ｓｉＲＮＡ（Ｃ）（１．６μｇ）によってトランスフェクトされた。ｐ５３の発現は、ウェスタンブロットによってこれらの細胞内で検出され（図５Ｆ）、メッセンジャＲＮＡは、定量ＰＣＲ（Light cycler、Roche）（図５Ｇ）又は免疫蛍光法（図５Ｈ）によって測定された。

ＭＤＡ ０８７細胞は、ｐ５３の野生形状（ＷＴ）、若しくは突然変異した形状（ｍｔ１）を認識するｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされ、次に２４時間ドキソルビシン（２００ｎｇ／ｍｌ）での治療によって遺伝毒性ストレスを受けた。ｐ５３の突然変異形状の発現は、細胞内でウェスタンブロットによって検出された。ｍｔ１ ｓｉＲＮＡを受けた細胞は、ドキソルビシン（dauxorubicine）に応答してｐ５３を安定させることが可能でないことが観察される（図５Ｉ）。

図５Ｊは、ｐ５３の野生及び突然変異した形状を発現する細胞内のｍｔ１及びｍｔ２ ｓｉＲＮＡの効果を示す。ｐ５３を発現しないＨ１２９９−ＮＣＩ細胞は、示すように、ｐ５３への応答要素の制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータベクター、及び野生（ＷＴ）、突然変異（ＭＴ）又は両者の混合物（ＷＴ＋ＭＴ）のｐ５３の発現ベクター（４００ｎｇ）によって（リポフェクタミンを使用して）トランスフェクトされた。野生形状（ＷＴ）、突然変異した形状（ｍｔ１、ｍｔ２）に向けられるｓｉＲＮＡ（４００ｎｇ）、又は無関連ｓｉＲＮＡ（Ｃ）は、同時にトランスフェクトされた。細胞は、２４時間後に集められ、かつルシフェラーゼ発現に関して分析された。野性ｐ５３のみが、レポータベクターを活性化し、かつ突然変異形状の同時発現は、この活性を阻害する。野生ｓｉＲＮＡの同時トランスフェクションは、野生タンパク質の発現、及び従ってレポータ遺伝子の残留活性化を阻害する。ｍｔ１又はｍｔ２ ｓｉＲＮＡの同時トランスフェクションは、逆に突然変異した形状の発現を選択的にブロックし、かつ野性ｐ５３形状に及ぼすトランスドミナントネガティブな効果を妨げてこの活性を修復する。

図５Ｋは、図５Ｆでのように治療された細胞内での、細胞増殖の阻害タンパク質ｐ２１、ｐ５３の標的の一方の発現に対する類似した結果を示す。ウェスタンブロットによって検出されるｐ２１の発現は、野性ｐ５３によって活性化され、かつ突然変異体が同時発現される時に阻害される。この阻害は、ｍｔ ｓｉＲＮＡの存在下で解除される。

実施例６：Ｅ６ウイルスタンパク質の阻害。

Ｉ−オリゴヌクレオチドの調製

ＨＰＶのＥ６タンパク質に向けられるｓｉＲＮＡは、同様に調製された。それは、次の配列に応答する：
−ＨＰＶ−１６−Ｓ２
センス：５’［ＣＣＡＣＡＧＵＵＡＵＧＣＡＣＡＧＡＧＣ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号２７）
アンチ：５’［ＧＣＵＣＵＧＵＧＣＡＵＡＡＣＵＵＧＧ］ＲＮＡ［ＴＴ］］ＤＮＡ （配列番号２８）

ＩＩ−結果。

図６Ｂに示すように、両者ともＨＰＶのＥ６タンパク質を発現するＣａｓＫｉ及びＳｉＨＡ細胞は、示されたｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされ、ドキソルビシンによって示されるように治療され、又は治療されず、かつ示された抗体を使用してウェスタンブロットによって分析された。Ｅ６ ｓｉＲＮＡによる細胞治療は、Ｐ５３発現の増加を誘導する。このｐ５３発現は、ｐ２１タンパク質の発現増加によって現れる。

図６Ｃに示すように、図６Ｂのように治療されたＳｉＨＡ細胞の細胞周期は、ＦＡＣＳによって分析された。この図は、特徴を示す実験を表す。Ｅ６ ｓｉＲＮＡによって治療された細胞内でＧ１段階（図６Ｄ）で細胞増加が観察され、それはドキソルビシンによって治療されるときにこれらの細胞内で同様に観察される増加である。

実施例７：ＲＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの効果。

Ｉ−序論。

本発明は、遺伝子の発現を特異的に阻害するための、ＲＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドの代替案としてのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドの使用を検討する。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの場合、センス鎖は、好ましくはＤＮＡ性質を有し、かつアンチセンス鎖は、ＲＮＡ性質を有する。特にオリゴヌクレオチドの大きさ、３’末端の性質、及び合成方法に関するその他の局面は、ＲＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドに関してと同一である。これらのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの適用は、特に診断又は遺伝子確証目的での治療的適用に関して、ＲＮＡ／ＲＮＡ ｓｉＲＮＡに関して以前に記載したものと同一である。しかしながら、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡによる同一の効果を得るために用いられるオリゴヌクレオチド分量は、異なり得る。

ＩＩ−オリゴヌクレオチドの調製。

センス鎖は、メッセンジャＲＮＡと配列が同一なものである。アンチセンス鎖は、センス鎖と相補的な鎖である。慣例により、二重鎖内では、鎖の性質はセンス／アンチセンスの順で示される。このようにして例えば、Ｄ／Ｒと印を付けられるＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、センス鎖がＤＮＡ性質を有し、かつアンチセンス鎖がＲＮＡ性質、及びメッセンジャＲＮＡと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。

記載した実験において、配列を以下に示すオリゴヌクレオチドが使用された。

−ＧＦＰに関して：
ＧＦＰ：
センス：［ＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴ］ＤＮＡ （配列番号２９）
アンチセンス：［ＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＣＣＧ］ＲＮＡ （配列番号３０）
ＧＦＰ対照：
センス：［ＣＡＵＧＵＣＡＵＧＵＧＵＣＡＣＡＵＣＵＣ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号３１）
アンチセンス：［ＧＡＧＡＵＧＵＧＡＣＡＣＡＵＧＡＣＡＵＧ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号３２）
−ＬＮＣａＰに関して：以下で下線を引いた塩基は、ヒト前立腺がん細胞（ＬＮＣａＰ）内で発現したアンドロゲン受容体の突然変異体に対応する。
ＬＮＣａＰ：
センス：
［ＧＣＡＴＣＡＧＴＴＣＧＣＴＴＴＴＧＡＣＴＴ］ＤＮＡ （配列番号３３）
［ＧＣＡＵＣＡＧＵＵＣＧＣＵＵＵＵＧＡＣ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号３４）
アンチセンス：
［ＧＴＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＣＴＧＡＴＧＣＴＴ］ＤＮＡ （配列番号３５）
［ＧＵＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＣＵＧＡＵＧＣ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号３６）
ＬＮＣａＰ対照：
センス：
［ＧＵＵＣＧＧＵＣＵＧＣＵＵＡＣＡＣＵＡ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号３７）
アンチセンス：
［ＵＡＧＵＧＵＡＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＡＣ］ＲＮＡ−ＴＴ［ＤＮＡ］ （配列番号３８）
−Ｐ５３に関して：
Ｈ１と印を付けられたハイブリッドのＤＮＡ鎖は、ＲＮＡ塩基を含む（下線を引いたＵ）。

ＭＴ１オリゴヌクレオチド内に存在する突然変異は、斜字で示す。
ＷＴ：
センス：５’［ＧＣＡＵＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＵ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号３９）
アンチ：５’［ＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＧＧＵＵＣＡＵＧＣ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号４０）
ｗｔ Ｈ１ Ｄ／Ｒ：
センス：５’［ＧＣＡＵＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＵＴＴ］ＤＮＡ （配列番号４１）
アンチ：５’［ＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＧＧＵＵＣＡＵＧＣ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号４２）
ｗｔ Ｈ１ Ｒ／Ｄ：
センス：５’［ＧＣＡＵＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＵ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号４３）
アンチ：５’［ＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＧＧＵＵＣＡＵＧＣＴＴ］ＤＮＡ （配列番号４４）
ｗｔ Ｈ２ Ｄ／Ｒ：
センス：５’［ＧＣＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＴＴＴ］ＤＮＡ （配列番号４５）
アンチ：５’［ＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＧＧＵＵＣＡＵＧＣ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号４６）
ｗｔ Ｈ２ Ｒ／Ｄ：
センス：５’［ＧＣＡＵＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＵ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号４７）
アンチ：５’ＡＴＧＧＧＣＣＵＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴＧＣＴＴ］ＤＮＡ （配列番号４８）
Ｍｔ１ （ｒ２４８ｗ）＊＊：
センス：５’［ＧＣＡＵＧＡＡＣＵＧＧＡＧＧＣＣＣＡＵ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号４９）
アンチ：５’［ＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＡＧＵＵＣＡＵＧＣ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号５０）
Ｍｔ１ Ｈ１ Ｄ／Ｒ：
センス：５’［ＧＣＡＵＧＡＡＣＵＧＧＡＧＧＣＣＣＡＵＴＴ］ＤＮＡ （配列番号５１）
アンチ：５’［ＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＡＧＵＵＣＡＵＧＣ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号５２）
Ｍｔ１ Ｈ１ Ｒ／Ｄ：
センス：５’［ＧＣＡＵＧＡＡＣＵＧＧＡＧＧＣＣＣＡＵ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号５３）
アンチ：５’ＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＡＧＵＵＣＡＵＧＣＴＴ］ＤＮＡ （配列番号５４）
Ｍｔ１ Ｈ２ Ｄ／Ｒ：
センス：５’［ＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＡＴＴＴ］ＤＮＡ （配列番号５５）
アンチ：５’［ＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＡＧＵＵＣＡＵＧＣ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号５６）
Ｍｔ１ Ｈ２ Ｒ／Ｄ：
センス：５’［ＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＡＴ］ＲＮＡ［ＴＴ］ＤＮＡ （配列番号５７）
アンチ：５’［ＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＡＧＵＵＣＡＵＧＣＴＴ］ＤＮＡ （配列番号５８）

ＩＩ−結果。

１）ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドによるＧＦＰ（緑蛍光タンパク質）の阻害。

漸増分量の対照（Ｒ／Ｒ）又はＧＦＰ（Ｄ／Ｒ）ｓｉＲＮＡが、ＧＦＰの発現ベクターと同時にＣ２Ｃ１２マウスの筋芽細胞内にポリフェクトキットを使用してトランスフェクションによって導入された。ＧＦＰのレベルは、ウェスタンブロット（図７Ａ）及び蛍光計を用いてＧＦＰにより発せられる蛍光の直接測定（図７Ｂ）によって追跡された。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドｓｉＲＮＡによるＧＦＰの（８０％までの）高度な発現阻害が観察される。

２）ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドによるアンドロゲン受容体の阻害。

ＬＮＣａＰ細胞は、アンドロゲン受容体への４つの応答要素を含む促進因子の制御下にルシフェラーゼを置くレポータベクターによってトランスフェクトされた。２４時間後に、図に示すｓｉＲＮＡ Ｒ／Ｒ、Ｄ／Ｒ又はＲ／Ｄが、８００００の細胞に対して２５０ｎｇの各二本鎖の割合でトランスフェクション剤Transit-tKO（Mirus）によってトランスフェクトされた。細胞は、アンドロゲンを含む完全な培地で培養され、かつ各試料のタンパク質量に対して正常化されたルシフェラーゼ活性は、２４時間後に測定された（図７Ｃ）。Ｒ／Ｄハイブリッドは、この実験で阻害活性を示さなかった。ＬＮＣａＰ Ｄ／Ｒハイブリッドは、アンドロゲン受容体をＲ／Ｒ ｓｉＲＮＡと同じ位有効に阻害する。

３）ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドによるｐ５３の阻害。

図７Ｄは、Ｈ１ Ｄ／Ｒハイブリッドが、遺伝子発現を阻害するために、Ｒ／Ｒと同じ位有効であることを示す。ｐ５３を発現しないＨ１２９９−ＮＣＩ細胞は、示すように、野生（ＷＴ）、突然変異（ＭＴ）又は両者の混合物（ＷＴ＋ＭＴ）のｐ５３の発現ベクター（４００ｎｇ）によって（リポフェクタミンを使用して）トランスフェクトされた。ＣＭＶ−ＧＦＰベクターは、内部対照として同様にトランスフェクトされた。野生形状（ＷＴ）、突然変異した形状（ＭＴ）に向けられるｓｉＲＮＡ（４００ｎｇ）、又は無関連ｓｉＲＮＡ（ＣＴＲＬ）は、同時にトランスフェクトされた。細胞は、２４時間後に集められ、かつトランスフェクションの有効性を制御するためにＧＦＰ（Santa Cruz）、又はｐ５３に向けられる抗体（ＤＯ１、Santa Cruz）でウェスタンブロットによって分析された。注意：タンパク質の突然変異した形状の発現は、野性形状を安定させる。

図７Ｅは、Ｈ２ Ｄ／Ｒハイブリッドが、遺伝子発現を阻害するために、Ｒ／Ｒと同じ位有効であることを示す。ｐ５３を発現しないＨ１２９９−ＮＣＩ細胞は、示すように、野生（ＷＴ）、突然変異（ＭＴ）又は両者の混合物（ＷＴ＋ＭＴ）のｐ５３の発現ベクター（４００ｎｇ）によって（リポフェクタミンを使用して）トランスフェクトされた。野生形状（ＷＴ）、突然変異した形状（ＭＴ）に向けられるｓｉＲＮＡ（４００ｎｇ）、又は無関連ｓｉＲＮＡ（Ｃ）は、同時にトランスフェクトされた。細胞は、２４時間後に集められ、かつｐ５３に向けられる抗体（ＤＯ１、Santa Cruz）でウェスタンブロットによって分析された。

実施例８：様々な方法によるｓｉＲＮＡの生体内投与。

ルシフェラーゼを安定して発現する腫瘍細胞が、ヌードマウスに皮下注射された（右脇腹に１００万の細胞）。腫瘍成長の８日目に、２００ｍｍ^３の平均体積を有する腫瘍が、対照ｓｉＲＮＡ（ＨＩＦ１αの混合配列、実施例３参照）か、ルシフェラーゼに向けられるｓｉＲＮＡと共に注射された。対照ｓｉＲＮＡ（３μｇ／マウス）は、動物の脇腹に、５０μｌのＰＢＳの容量内で皮下注射された。

ルシフェラーゼｓｉＲＮＡは、３μｇ／マウス（各グループに３匹の動物）の割合で、５０μｌのＰＢＳ内で、皮下（ｓｃ）、又は腹膜内（ｉｐ）、又は静脈内（ｉｖ）（尻尾の静脈）、又は腫瘍内（ｉｔ）に注射された。後者の場合、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（３μｇ／マウス）は、２０μｌのＰＢＳのみの中で希釈された。

ｓｉＲＮＡ注射の３日後、動物は犠牲にされ、腫瘍は、採取され、ポリトロン粉砕機を用いて均質化された。ホモジェネートに対して、タンパク質の分量決定及び照度計内でルシフェラーゼ活性の測定が行われた。

図８に表した結果は、タンパク質の量で生じたルシフェラーゼ活性を示す。

ＲＡＲα、ＰＭＬタンパク質、及び関連するＰＭＬ−ＲＡＲα融合タンパク質の略図である。 ＰＭＬ−ＲＡＲαに向けられるｓｉＲＮＡによるトランスフェクションの結果を表す。 ＶＥＧＦの、このタンパク質に向けられるｓｉＲＮＡによる発現阻害、及びこの阻害の結果に関する。対照ｓｉＲＮＡ又はＶＥＧＦに向けられるｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされたｃＪ４又はＬＮＣａＰ細胞内のＶＥＧＦの免疫検出を表す。 ＶＥＧＦの、このタンパク質に向けられるｓｉＲＮＡによる発現阻害、及びこの阻害の結果に関する。トランスフェクション後の時間に応じた、対照ｓｉＲＮＡ又はＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされたｃｊ４細胞のならし培地内のＶＥＧＦのＥＬＩＳＡによる数量化を表す。 ＶＥＧＦの、このタンパク質に向けられるｓｉＲＮＡによる発現阻害、及びこの阻害の結果に関する。トランスフェクトされない、対照ｓｉＲＮＡ又はＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされた、１０^６のｃＪ４細胞の皮下注射に由来する腫瘍のヌードマウスでの成長曲線を表す。 ＶＥＧＦの、このタンパク質に向けられるｓｉＲＮＡによる発現阻害、及びこの阻害の結果に関する。細胞の注射後７日目の腫瘍の様子を表す。 ＶＥＧＦの、このタンパク質に向けられるｓｉＲＮＡによる発現阻害、及びこの阻害の結果に関する。１２日間の生体内の発達後の、対照ｓｉＲＮＡ又はＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされたｃｊ４細胞の注射に由来する腫瘍内のＶＥＧＦの細胞検出を示す。 低酸素への転写応答に対する転写因子、ＨＩＦ１アルファの発現の特異なｓｉＲＮＡによる阻害の効果に関する。この図は、トランスフェクトされない、対照ｓｉＲＮＡ又はＨＩＦ１アルファに向けられるｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされた、ｃＪ４細胞内の低酸素に応答したルシフェラーゼＶＥＧＦレポータの活性の測定を表す。 細胞中のアンドロゲン受容体の発現に特異なｓｉＲＮＡによる阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。対照ｓｉＲＮＡ、又はアンドロゲン受容体（ＡＲ）に向けられるｓｉＲＮＡによるＬＮＣａＰ細胞のトランスフェクション後４８時間の、アンドロゲン受容体の発現の免疫ブロットによる検出を表す。 細胞中のアンドロゲン受容体の発現に特異なｓｉＲＮＡによる阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。トランスフェクトされない、対照ｓｉＲＮＡ又はＡＲ ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされた、ＬＮＣａＰ系統の種々のクローン内のＲ１８８１へのルシフェラーゼ４ｘＡＲＥレポータの活性の測定を表す。 細胞中のアンドロゲン受容体の発現に特異なｓｉＲＮＡによる阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。トランスフェクトされない（１００％）ＬＮＣａＰ細胞、及び対照ｓｉＲＮＡ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）に向けられるｓｉＲＮＡ、又はＬＮＣａＰ系統のアンドロゲン受容体内に存在する点状突然変異を特異的に認識するｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされたＬＮＣａＰ細胞のＲ１８８１への応答の比較を表す。 細胞中のアンドロゲン受容体の発現に特異なｓｉＲＮＡによる阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。対照ｓｉＲＮＡ、又はアンドロゲン受容体に向けられるｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされたＬＮＣａＰ細胞の皮下注射から生じる腫瘍の、ヌードマウスでの成長を表す。 細胞中のアンドロゲン受容体の発現に特異なｓｉＲＮＡによる阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。ＶＥＧＦに向けられる２μｇのｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡの、尻尾の静脈内への静脈内注射を細胞移植後、４０日目に受けたマウスでのＬＮＣａＰ腫瘍の成長を表す。 細胞中のアンドロゲン受容体の発現に特異なｓｉＲＮＡによる阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。アンドロゲン受容体に向けられる２μｇのｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡの腹膜内注射を腫瘍細胞移植後、３４日目及び４０日目に受けたマウスでのＬＮＣａＰ腫瘍の成長を表す。 ｓｉＲＮＡによるｐ５３の突然変異又は野生形状の発現阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。ヒトｐ５３タンパク質の配列を表す。 ｓｉＲＮＡによるｐ５３の突然変異又は野生形状の発現阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。最初に発現しない細胞内でトランスフェクトされたｐ５３の突然変異又は野生形状の発現のｓｉＲＮＡによる分量に依存し、かつ特異的な阻害を表す。 ｓｉＲＮＡによるｐ５３の突然変異又は野生形状の発現阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。最初に発現しない細胞内でトランスフェクトされたｐ５３の突然変異又は野生形状の同時又は同時でない発現のｓｉＲＮＡによる特異的な阻害を表す。 ｓｉＲＮＡによるｐ５３の突然変異又は野生形状の発現阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。ｓｉＲＮＡによるｐ５３のトランスフェクトされた突然変異形状、又は野生内因性ｐ５３の発現阻害を表す。 ｓｉＲＮＡによるｐ５３の突然変異又は野生形状の発現阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。遺伝毒性ストレスへの耐性に対するｓｉＲＮＡによるｐ５３の阻害効果を表す。 ｓｉＲＮＡによるｐ５３の突然変異又は野生形状の発現阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。ｍＲＮＡのレベルに対するリー・フラウメニ症状群に罹患した患者の細胞内のｐ５３の突然変異形状の発現阻害（５Ｇ）、及び免疫ブロット（ＧＦ）又は間接免疫蛍光法によるタンパク質発現（５Ｈ）及び遺伝毒性ストレスへのこれらの細胞の耐性に関する結果を示す。 ｓｉＲＮＡによるｐ５３の突然変異又は野生形状の発現阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。ｍＲＮＡのレベルに対するリー・フラウメニ症状群に罹患した患者の細胞内のｐ５３の突然変異形状の発現阻害（５Ｇ）、及び免疫ブロット（ＧＦ）又は間接免疫蛍光法によるタンパク質発現（５Ｈ）及び遺伝毒性ストレスへのこれらの細胞の耐性に関する結果を示す。 ｓｉＲＮＡによるｐ５３の突然変異又は野生形状の発現阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。ｍＲＮＡのレベルに対するリー・フラウメニ症状群に罹患した患者の細胞内のｐ５３の突然変異形状の発現阻害（５Ｇ）、及び免疫ブロット（ＧＦ）又は間接免疫蛍光法によるタンパク質発現（５Ｈ）及び遺伝毒性ストレスへのこれらの細胞の耐性に関する結果を示す。 ｓｉＲＮＡによるｐ５３の突然変異又は野生形状の発現阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。ｍＲＮＡのレベルに対するリー・フラウメニ症状群に罹患した患者の細胞内のｐ５３の突然変異形状の発現阻害（５Ｇ）、及び免疫ブロット（ＧＦ）又は間接免疫蛍光法によるタンパク質発現（５Ｈ）及び遺伝毒性ストレスへのこれらの細胞の耐性に関する結果を示す。 ｓｉＲＮＡによるｐ５３の突然変異又は野生形状の発現阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。ｐ５３の突然変異又は野生形状のトランスフェクションによって発現する細胞内のｐ５３に依存する転写の特異的なｓｉＲＮＡによる阻害を示す。 ｓｉＲＮＡによるｐ５３の突然変異又は野生形状の発現阻害、及びこれらの阻害の機能結果に関する。ｐ５３の突然変異形状の同時発現による細胞増殖の阻害タンパク質、ｐ２１、ｐ５３の標的遺伝子の発現阻害、及びｐ５３の突然変異形状の合成を阻害するｓｉＲＮＡでの細胞治療によるこの発現の修復を示す。 特異的なｓｉＲＮＡによるヒトパピローマウイルスＨＰＶのＥ６タンパク質の発現阻害、及びこの阻害の結果に関する。ＨＰＶタンパク質の配列を表す。 特異的なｓｉＲＮＡによるヒトパピローマウイルスＨＰＶのＥ６タンパク質の発現阻害、及びこの阻害の結果に関する。ＨＰＶタンパク質の配列を表す。（図６Ａ−１の続き） 特異的なｓｉＲＮＡによるヒトパピローマウイルスＨＰＶのＥ６タンパク質の発現阻害、及びこの阻害の結果に関する。ｐ５３及びｐ２１の発現に対するＨＰＶを発現する細胞内のＨＰＶのＥ６タンパク質発現の特異的なｓｉＲＮＡによる阻害効果を表す。 特異的なｓｉＲＮＡによるヒトパピローマウイルスＨＰＶのＥ６タンパク質の発現阻害、及びこの阻害の結果に関する。細胞周期に対するＨＰＶのＥ６タンパク質の発現阻害効果を表す。 特異的なｓｉＲＮＡによるヒトパピローマウイルスＨＰＶのＥ６タンパク質の発現阻害、及びこの阻害の結果に関する。細胞周期に対するＨＰＶのＥ６タンパク質の発現阻害効果を表す。 ＤＮＡ塩基及びＲＮＡ塩基を含むハイブリッドｓｉＲＮＡの使用に関する。細胞内のトランスフェクションによって発現したＧＦＰの発現に対するＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドｓｉＲＮＡの効果を表す。 ＤＮＡ塩基及びＲＮＡ塩基を含むハイブリッドｓｉＲＮＡの使用に関する。細胞内のトランスフェクションによって発現したＧＦＰの発現に対するＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドｓｉＲＮＡの効果を表す。 ＤＮＡ塩基及びＲＮＡ塩基を含むハイブリッドｓｉＲＮＡの使用に関する。アンドロゲン受容体によって誘導される転写阻害に対する一定分量でのＲＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ ｓｉＲＮＡの効果を比較する。 ＤＮＡ塩基及びＲＮＡ塩基を含むハイブリッドｓｉＲＮＡの使用に関する。ｐ５３の合成を阻害するｓｉＲＮＡ配列内のＤＮＡ塩基によるＲＮＡ塩基の置換の効果を表す。 ＤＮＡ塩基及びＲＮＡ塩基を含むハイブリッドｓｉＲＮＡの使用に関する。ｐ５３の合成を阻害するｓｉＲＮＡ配列内のＤＮＡ塩基によるＲＮＡ塩基の置換の効果を表す。 皮下、又は腫瘍内、又は腹膜内、又は静脈内のｓｉＲＮＡの注射によってルシフェラーゼを発現する腫瘍内でのルシフェラーゼの阻害に関する。

（添付書類Ａ）

（添付書類Ｂ）

（添付書類Ｃ）

配列表

Claims (11)

1. 各々のオリゴヌクレオチド配列が、ハイブリッドからはみ出る一本鎖端を形成する１〜５つの非対合ヌクレオチドを、その３’又は５’末端の一方に含むハイブリッドを形成する２つの相補的オリゴヌクレオチド配列からなり、前記オリゴヌクレオチド配列の一方は、特異的に抑制するＤＮＡ又はＲＮＡ分子に属する標的配列と相補的であり、該オリゴヌクレオチド配列の一方は、配列番号７又は配列番号８で表され、該標的配列は、ＶＥＧＦ Ａをコードする遺伝子のＤＮＡ又はＲＮＡ分子に属することを特徴とする二本鎖オリゴヌクレオチド。
2. 標的配列は、１つ又は幾つかのイソ型のＶＥＧＦ Ａをコードする遺伝子のＤＮＡ又はメッセンジャＲＮＡ分子に属することを特徴とする請求項１に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
3. 標的配列は、配列番号６０で表される配列からなるＶＥＧＦをコードする遺伝子のＤＮＡ又はメッセンジャＲＮＡ分子に属することを特徴とする請求項２に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
4. 各々のオリゴヌクレオチド配列が、ハイブリッドからはみ出る一本鎖端を形成する１〜５つの非対合ヌクレオチドを、その３’又は５’末端の一方に含むハイブリッドを形成する２つの相補的オリゴヌクレオチド配列からなり、前記オリゴヌクレオチド配列の一方は、特異的に抑制するＤＮＡ又はＲＮＡ分子に属する標的配列と相補的であり、該オリゴヌクレオチド配列の一方は、配列番号１５又は配列番号１６で表され、前記標的配列は、突然変異した又は突然変異しないアンドロゲン受容体をコードする遺伝子のＤＮＡ又はメッセンジャＲＮＡ分子に属することを特徴とする二本鎖オリゴヌクレオチド。
5. オリゴヌクレオチド配列の一方は、配列番号７７で表される、突然変異した又は突然変異しないアンドロゲン受容体をコードする遺伝子のＤＮＡ又はメッセンジャＲＮＡ分子に属する標的配列と相補的であることを特徴とする請求項４に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
6. 細胞への浸透、ターゲティング又はアドレッシングを促進若しくは可能にする物質に結合されたことを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
7. 請求項１から６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチドを、活性作用物質として含むことを特徴とする、遺伝子機能の同定、又は治療若しくは診断目的で使用する薬剤組成物。
8. ＶＥＧＦ遺伝子の発現から生じる疾病の予防又は治療に有用な薬剤組成物を調製するための請求項１から３のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドの使用。
9. 血管新生化過多に関連する疾病の予防又は治療に有用な薬剤組成物を調製するための請求項１から３のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドの使用。
10. 腫瘍血管形成に関連する疾病の予防又は治療に有用な薬剤組成物を調製するための請求項１から３のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドの使用。
11. アンドロゲン依存性疾病の予防又は治療に有用な薬剤組成物を調製するための請求項４から６のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドの使用。

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