CZ285972B6 - Systémy s pozvolným uvolňováním a pozvolným dávkováním androgenů - Google Patents

Abstract

Farmaceutická látka pro léčení a prevence chorob mající vztah k estrogenu a řízení plodnosti, zahrnující pozvolné dávkování (např. koncentraci méně než 50 nanomolů v séru), podávání určitých ananbolických steroidů, progestinů a jiných, v podstatě nemaskulinizujících androgenních sloučenin. Dále je popsána formulace pozvolného uvolňování bez organického rozpouštědla a formulace pozvolného uvolňování pro udržení nízké hladiny androgenu v séru.ŕ

Description

Tento vynález se týká farmaceutického přípravku pro léčení nebo prevenci osteoporózy, rakoviny děložní sliznice, rakoviny prsu, endometriózy nebo pro antikoncepci, se zpožděným nebo diferencovaným uvolňováním androgenního steroidu, obsahujícího pozvolna uvolňující částice, jež obsahují androgenní steroid. Zároveň se vynález týká způsobu výroby takového farmaceutického přípravku.

Dosavadní stav techniky

Různí badatelé studovali hormonální terapii pro rakovinu děložní sliznice a prsu, jakož i prevenci a léčbu úbytku kostní hmoty a léčení endometriózy. Hlavní směry léčení již rozvinuté rakoviny prsu se týkají zamezení působení a/nebo tvorby estrogenu. Úloha estrogenu při podpoře růstu rakoviny prsu, citlivé na estrogen, je dobře známa (Lippman, Semin. Oncol. 10 (příloha. 4): 11-19, 1983; Sledge and McGuire, Cancer Res. 38: 61-75, 1984; Wittliff, Cancer 53: 630-643, 1984; Poulin and Labrie, Cancer Res. 46: 4933-4937, 1986).

Je rovněž známo, že estrogeny podporují růst normální děložní sliznice. Chronické vystavení estrogenům bez protiváhy progesteronu může vést ke vzniku hyperplazie děložní sliznice, která je předstupněm rakoviny děložní sliznice (Lucas, Obstet. Gynekol. Surv. 29: 507-528, 1974). Výskyt rakoviny děložní sliznice se zvyšuje po přechodu, zejména u žen, přijímajících estrogenní terapii bez současné léčby progestiny (Smith et al., N. Engl. J. Med. 293: 1164-1167, 1975; Mack et al., N. Engl. J. Med. 294: 1262-1267, 1976).

Různí badatelé zkoumali na hormonech závislou rakovinu prsu a děložní sliznice. Jeden známý způsob endokrinní terapie u žen před přechodem je kastrace, nejčastěji prováděná chirurgicky nebo ozářením, přičemž oba tyto postupy vytvářejí nevratnou neplodnost. Nedávno bylo dosaženo vratné formy kastrace použitím Luteinizačního hormonu - Uvolňující hormon agonista (LHRH agonisté), který po potlačení sekrece bioaktivního luteinizačního hormonu (LH) hypofyzou zredukují sérové estrogeny na kastrované hladiny (Nicholson et al., Brit. J. Cancer 39: 268-273, 1979).

Různé studie ukazují, že léčení rakoviny prsu u pacientek před přechodem pomocí LHRH agonistů vyvolává reakce srovnatelné s těmi, jichž lze dosáhnout jinými formami kastrace (Klijn et al., J. Stereoid Biochem. 20: 1381, 1984; Manni et. al., Endokr. Rev. 7: 89-94, 1986). Kladné účinky léčby pomocí LHRH agonistů byly pozorovány rovněž u žen po přechodu (Nicholson et al., Stereoid Biochem. 23: 843-848, 1985).

Patent US 4,071,622 se týká použití některých LHRH agonistů proti nádorům krys, vyvolaným DMBA.

Patent US 4,775,660₍ se týká léčení rakoviny ženského prsu použitím kombinované terapie, obsahující podávání antiandrogenu a antiestrogenu ženě poté, co výstup z jejích vaječníků byl zablokován chemickými nebo chirurgickými prostředky.

Patent US 4,775,661 se týká léčby rakoviny ženského prsu použitím terapie, při níž se ženě, poté co výstup hormonů z jejích vaječníků byl zablokován chemickými nebo chirurgickými prostředky, podává antiandrogen a volitelně některé inhibitory biosyntézy pohlavního steroidu.

- 1 CZ 285972 B6

Patent US 4,760,053 popisuje léčbu vybraných, na pohlavním steroidu závislých druhů rakoviny, která obsahuje různé specifikované kombinace sloučenin, zvolené zLHRH agonistů, antiandrogenů, antiestrogenů a některých inhibitorů biosyntézy pohlavního steroidu.

Patent US 4,472,382 se týká léčby adenokarcinomu prostaty, benigní (nezhoubné) hypertrofie prostaty a na hormonu závislých prsních nádorů určenými léky nebo kombinacemi. Pojednává o různých LHRH agonistech a antiandrogenech.

Mezinárodní zveřejněná přihláška WO 92105763 pojednává ojistých 16,16-d i substituovaných sloučeninách steroidu androstenu pro vzrůst vlasů a choroby kůže. Mezinárodní patentová přihláška PCT/WO 86/01105 popisuje způsob léčení na pohlavním steroidu závislých rakovin u teplokrevných živočichů, který obsahuje podávání konkrétních léků a kombinaci. Pojednává o antiandrogenech, antiestrogenech, některých inhibitorech biosyntézy pohlavního steroidu a blokování hormonálního výstupu.

Souběžná přihláška přihlašovatele čís. US 07/321926, podaná 10. března 1989, se týká způsobu léčeni rakoviny prsu a děložní sliznice teplokrevných živočichů, který může obsahovat zabránění hormonální sekreci zvaječníků chirurgickými prostředky (ovariectomii) nebo chemickými prostředky (použití LHRH agonistů, např. [D-Trp⁶, des-Gly-NH₂’°]LHRH etylamidu nebo antagonistů) jako součásti kombinované terapie. Pojednává o antiestrogenech, androgenech, progestinech, inhibitorech vytváření pohlavního steroidu (zejména vytváření pohlavních steroidů, které je katalýzo váno 17|3-hydroxysteroidem dehydrogenázou- nebo aromatázou), inhibitorech sekrece prolaktinů, sekrece hormonu růstu a sekrece ACTH.

Bylo poukázáno na to, že receptory androgenu jsou přítomny v normálních (Witliff, In: Bush, H. (Ed.), Methods in Cancer Res., Vol. 11, Acad. Press, New York, 1975, pp. 298-304; Allegra et al., Cancer Res. 39: 1447-1454, 1979), i neoplastických (Allegra et al., Cancer Res. 39: 14471454, 1979; Engelsman et al., Brit. J. Cancer 30: 177-181, 1975; Moss et al., J. Ster. Biochem. 6: 743-749, 1975; Miller et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 2: 539-542, 1985; Lippman et al., Cancer 38: 868-874, 1976; Allegra et al., Cancer Res. 39: 1447-1454, 1979; Miller et al., Eur. J. Clin. Oncol. 21: 539-542, 1985; Lea et al., Cancer Res. 49: 7162-7167, 1989), jakož i v různých vytvořených řadách buněk rakoviny prsu (Lippman et al., Cancer Res. 36: 4610-4618, 1976; Horwitz et al., Cancer Res. 38: 2434-2439, 1978; Poulin et al., Breast Cancer Res. Treatm. 12: 213-225, 1988). Receptory androgenu jsou přítomny rovněž v prsních nádorech krys, vyvolaných antracenem dimetylbenzenu (DMBA) (Asselin et al., Cancer Res. 40: 1612-1622, 1980).

Receptory androgenu byly popsány rovněž v lidské děložní sliznici (MacLaughlin and Richardson, J. Steroid Biochem. 10: 371-377, 1979; Muechler and Kohler, Gynekol. Invest. 8: 104, 1988). Účinky na potlačení růstu pomocí metyltrienolon androgenu (R1881) na rakovinu děložní sliznice in vitro byly rovněž popsány (Centola, Cancer Res. 45: 6264-6267, 1985).

Nedávné zprávy uvádějí, že receptory androgenu mohou zvýšit selektivní schopnost receptorů estrogenu nebo dokonce nahradit receptory estrogenu jako nejlepší reakce na endokrinní terapii (Teulings et al., Cancer Res. 40: 2557-2561; Bryan et al., Cancer 54: 2436-2440, 1984).

První androgen, úspěšně použitý při léčbě rozvinutého nádoru prsu, je testosteron propionát (Narthanso, Rec. Prog. Horm. Res. 1: 261-291, 1947). Mnoho studií následně potvrdilo kladný účinek androgenů na rakovinu prsu (Alan and Herrman, Ann. Surg. 123: 1023-1035; Adair, Surg. Gynekol. Obstet. 84: 719-722, 1947; Adair et al., JAMA 140: 1193-2000, 1949). Tyto počáteční výsledky podnítily kolektivní studie o účinku testosteron propionátu a DES, které oba byly shledány účinnými ve vytváření objektivních remisí. (Podvýbor pro steroidy a rakovinu výboru pro výzkum rady pro farmacii a chemii Americké lékařské společnosti, následovaný Cooperative Breast Cancer Group ve středisku Cancer Chemoterapy National Service Center NCI, který

-2CZ 285972 B6 shledal, že testosteron propionát zlepšil četnost i trvání remise, kvalitu života a přežití (Cooperative Breast Cancer Group, JAMA 188, 1069-1072, 1964).

Procento reakce 48 % (13 z 27 pacientek) bylo zaznamenáno u žen po přechodu, které přijímaly dlouhodobě působící androgen metonolon enantát (Kennedy et al., Cancer 21: 197-201, 1967). Průměrná doba přežití byla čtyřikrát delší u respondentů ve srovnání se skupinou nerespondentů (27 oproti 7,5 měsícům). Velký počet studii prokázal, že androgeny iniciují remisi u 20 až 40 % žen s metastatickou rakovinou prsu (Kennedy, Hormone Therapy in Cancer. Geriatrics 25: 106112, 1970; Goldenberg et al., JAMA 223: 1267-1268, 1973).

Reakce v rozsahu 39 % s průměrným trváním 11 měsíců byla nedávno pozorována u skupiny 33 žen po přechodu, které předtím nereagovaly na Tamoxifen (Manni et al., Cancer 48: 2507-2509, 1981) po léčení Fluoxymesteronem (Halostatin) (lOmg, b.i.d.). Z těchto se 17 rovněž podrobilo hypofysektomii. Nebyl žádný rozdíl v procentu reakce na Fluoxymesteron u pacientek, které předtím reagovaly na Tamoxifen, au těch, které nereagovaly. Z oněch 17 pacientek, u nichž selhal jak Tamoxifen, tak i hypofysektomie, reagovalo 7 na Fluoxymesteron v průměru na dobu 10 měsíců. Mezi nimi dvě nereagovaly ani na Tamoxifen ani na hypofysektomii.

Ukázalo se, že kombinace Fluoxymesteronu a Tamoxifenu je lepší, nežli jen samotný Tamoxifen. Ve skutečnosti byly kompletní reakce (KR) zaznamenány pouze ve skupině kombinované léčby, přičemž 32 % zaznamenalo dílčí reakci (DR) ve skupině kombinované léčby oproti pouhým 15 % monoterapeutické skupiny. Ve skupině kombinované léčby bylo pouze 25 % nereagujících pacientek oproti 50 % pacientek, které dostávaly pouze TAM (Tomey et al., Int. Med. 98: 139-144, 1983). Mimoto průměrná doba mezi nasazením terapie ajejím selháním byla delší u Fluoxymesteronu + Tamoxifenu (180 dní) oproti skupině, léčené jen Tamoxifenem (64 dnů). Ve skupině kombinované léčby byla tendence ke zlepšenému přežití (380 oproti 330 dnům).

Nezávislý kladný účinek androgenu, kombinovaného s antiestrogenem naznačuje údaj, že pacientky, které nereagovaly na Tamoxifen, dokázaly reagovat na Fluoxymesteron a naopak. Kromě toho pacientky, léčené Tamoxifenem a přecházející na Fluoxymesteron, přežily déle než ty, které byly léčeny opačným režimem (Tomey et al., Ann. Int. Med. 98: 139-144, 1983).

Protože testosteron propionát měl kladné účinky u žen před přechodem i po něm (Adair et al.,

J. Am. Med. Ass. 15: 1193-1200, 1949), nasvědčuje to tomu, že androgen nejen inhibuje sekreci gonadotropinu, nýbrž má i přímý inhibiční vliv na růst rakoviny.

Nedávné studie in vitro popisují relativní protirůstové účinky androgenu na růst nádoru prsu citlivého na estrogen, resp. buněk řady ZR-75-1 (Poulin et al. Androgens inhibit basal and estrogen-induced cell proliferation in the ZR-75-1 human breast cancer cell line, Breast Cancer Res. Treatm. 12: 213-225, 1989). Jak již bylo uvedeno výše. Poulin et al. (Breast Cancer Res. Treatm. 12: 213-225, 1989) zjistili, že bujení buněk ZR-75-1 nádoru prsu je inhibováno androgeny, přičemž inhibiční účinek androgenů se sčítá s inhibičním účinkem antiestrogenu. Inhibiční účinek androgenů na růst nádorových buněk prsu ZR-75-1 byl pozorován rovněž in vivo na myších (Dauvois a Labrie, Cancer Res. 51: 3131-3151, 1991).

Jako možný mechanismus působení androgenu na rakovinu prsu bylo nedávno ukázáno, že androgeny silně potlačují obsah receptoru estrogenu (ER) a progesteronu (PgR) v rakovinových buňkách ZR-75-1, měřeno podle radioligandní vazby a monoklonámími protilátkami proti ER. Podobné inhibiční účinky byly pozorovány na úrovních ER m RNA, měřených zkouškou ribonukleázové ochrany. Androgenní účinek je měřen jako subnanomolámí koncentrace nearomatizovatelného androgenu 5a- dihydrotestosteron bez ohledu na přítomnost estrogenů a je kompetitivně zvrácen antiandrogenem hydroxyflutamidem (Poulin et al., Endocrinology 125:

-3 CZ 285972 B6

392-399, 1989). Takové údaje o vytlačení receptorů estrogenu poskytují vysvětlení pro alespoň část antiestrogenových účinků androgenů na růst rakovinových buněk prsu a naznačují, že specifické inhibiční účinky androgenní léčby by se mohly připojit ke standardní léčbě, omezené na blokování estrogenů antiestrogeny.

Dauvois et al., (Breast Cancer Res. Treatm. 14: 299-306, 1989) ukázali, že neustálé uvolňování androgenu 5a- dihydrotestosteronu (DHT) v ovariektomizovaných krysách, majících nádor prsu způsobený DMBA, měly za následek výrazné blokování růstu nádoru, vyvolaného 17β— estradiolem (E₂). To, že DHT působí interakcí s receptorem androgenu, je podporováno zjištěním, že současná léčba antiandrogenem Flutamidem úplně zabránila působení DHT. Mohutný inhibiční účinek androgenu DHT na růst nádoru ilustruje zejména skutečnost, že počet pokračujících nádorů poklesl působením DHT z 69,2 % na 29,2 % u zvířat, léčených pomocí E₂, a zvýšení počtu kompletních reakcí (vymizení hmatných nádorů) působením androgenu z 11,5 % na 33,3% v téže skupině zvířat. Počet nových nádorů, které se objevily během 28 dnů pozorování u zvířat léčených pomocí E₂, se zmenšil z 1,5 ± 0,3 na 0,7 ± 0,2 na krysu během léčby androgenem DHT. Takový účinek byl rovněž dosažen antiandrogenem Flutamidem. Taková data demonstrují především to, že androgeny jsou mocné inhibitory růstu nádoru prsu, vyvolaného působením DMBA, nezávislým na inhibici sekrece gonadotropinu, a nasvědčují činnosti, probíhající přímo na úrovni nádoru, čímž dále potvrzují údaje in vitro, získané s rakovinovými buňkami ZR-75-1 nádoru lidského prsu (Poulin et al., Breast Cancer Res. Treatm. 12: 213-225, 1988).

Přírodní androgeny testosteron (TĚSTO) a dihydrotestosteron (DHT) se tvoří konverzí androstenedionu na TĚSTO pomocí dehydrogenázy 17P-hydroxysteroidu a pak TĚSTO na DHT působením enzymu 5a-reduktázy. Předchůdce adrenalinu 5-androst-5ene-3 β, 17β—diol lze rovněž přeměnit na TĚSTO působením enzymu 3P-hydroxysteroiddehydrogenáze/ Δ⁵ Δ⁴, izomerázy (3P-HSD).

Protože přírodní androgeny TĚSTO a DHT mají silné maskulinizující účinky, byly synteticky vyrobeny četné deriváty TĚSTO, jakož i progesteron, aby se získaly užitečné sloučeniny, mající méně nežádoucích maskulinizujících vedlejších účinků (růst chlupů na těle, ztráta vlasů na temeni hlavy, akné, seborea a silný hlas).

Medroxyprogesteronacetát (MPA) je jedna z nej rozšířenějších sloučenin v endokrinní léčbě rozvinuté rakoviny prsu u žen (Mattsson, Breast Cancer Res. Treatm. 3: 231-235, 1983; Blumenschein, Semin. Onkol. 10: 7-10, 1983; Hortobagyi et al., Breast Cancer Res. Treatm. 5: 321-326, 1985: Haller and Glick, Semin Oncol. 13: 2-8, 1986: Horwitz, J. Steroid Biochem. 27: 447-457, 1987). Celková klinická reakce na vysoké dávky tohoto syntetického progestinu je v průměru 40 % u nevýběrově vzatých pacientek (Horwitz, J. Steroid. Biochem. 27: 447-457, 1987), což je účinnost srovnatelná s nesteroidním antiestrogenem Tamoxifenem (Lippman, Semin. Oncol. 10 (Suppl.): 11-19, 1983). Všeobecněji se však používá pro recidivu rakoviny prsu po ostatních endokrinních terapeutických opatřeních. Maximální inhibiční působení medroxyprogesteronacetátu (MPA) na růst rakovinových buněk lidského prsu in vitro lze dosáhnout při koncentraci pouhého 1 nM, kdežto dávka přibližně tisíckrát silnější se často vyžaduje pro účinek glukokortikoidu (Poulin et al., Breast Cancer Res. Treatm. 13: 161-172, 1989).

Až donedávna byly jen málo chápány mechanismy, na nichž spočívá protirakovinové působení MPA, a byly přisuzovány interakci s receptorem progesteronu. Tento steroid však vykazuje vysokou afinitu k receptorům progesteronu (PgR), jakož i androgenu (AR) a glukokortikoidu (GR) v různých živočišných tkáních (Perez-Palacios et al., J. Steroid Biochem. 19: 1729-1735, 1983; Janne and Bardin, Pharmacol. Rev. 36: 35S-42S, 1984; Pridjian et al., J. Steroid Biochem. 26: 313-319, 1987; Ojasso et al., J. Steroid Biochem. 27: 255-269, 1987) stejně jako v nádorech

-4CZ 285972 B6 lidského prsu (Young et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 137: 284-292, 1980), což je vlastnost, kterou sdílí s ostatními syntetickými deriváty progesteronu (Bulloc et al., Endocrinology 103: 1768-1782, 1978; Janne and Bardin, Pharmacol. Rev. 36: 35S-42S, 1984; Ojasso et al., J. Steroid Biochem. 27: 255-269, 1987). Je známo, že většina syntetických progestacionálních činidel vykazuje významnou afinitu nejen k receptorům progesteronu (PgR), nýbrž i androgenu (AR), jakož i glukokortikoidu, a vyvolává biologická působení specificky určovaná těmito individuálními receptorovými systémy (Labrie et al., Fertil. Steril. 28: 1104-1222, 1977; Engel et al., Cancer Res. 38: 3352-3364, 1978; Raynaud et al., In: Mechanismus of Steroid Action (G. P. Lewis, M. Grisburg, eds). MacMiland Press, London, pp. 145-158, 1981; Rochefort and Chalbos, Mol. Cell. Endocrinol. 36: 3-10, 1984; Janne and Bardin, Pharmacol. Rev. 36: 35S-42S, 1984; Poyet and Labrie, Mol. Cell. Endocrinol. 42: 283-288, 1985; Poulin et al., Breast Cancer Res. Treatm. 13: 161-172, 1989). Proto též u pacientek léčených MPA byly pozorovány různé vedlejší účinky odlišné od progestacionálních.

Inhibiční účinek MPA na sekreci gonadotropinu je zřejmě vykonáván jeho přímou interakcí shypofyzou AR u krysy iu člověka (Perez-Palacion et al., J. Steroid Biochem. 15: 125-130, 1981). Mimoto MPA vyvozuje androgenní činnost v ledvině myši (Janne a Bardin, Pharmacol. Rev. 36: 35S-42S, 1980) a ve ventrální prostatě krysy (Labrie, C. et al., J. Steroid Biochem. 28: 379-384, 1987; Labrie, C. et al., Mol. Cell. Endocrinol. 68: 169-179, 1990). Navzdory své vysoké afinitě vůči AR, MPA jen zřídka vyvolává významné virilizační symptomy (akné, chlupatost, atd.) (Haller a Glick, Semin. Oncol. 13, 2-8, 1986).

Nejsnáze vysvětlitelné nepříznivé vedlejší účinky MPA se vztahují kjeho působení glukokortikoidního typu s Cushingoidním syndromem, euforií a subjektivní úlevou bolesti (Mattsson, Breast Cancer Res. Treatm. 3: 231-235, 1983; Blossey et al., Cancer 54: 1208-1215, 1984; Hortobagyi et al., Breast Cancer Res. Treatm. 5: 321-326, 1985; Van Veelen et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 15: 167-170, 1985). Soudí se, že potlačení adrenální funkce působením MPA je způsobeno jak inhibičním působením na ACTH sekrecí na úrovni hypofýzy, tak i přímou inhibici tvorby steroidu na adrenální úrovni (Blossey et al., Cancer 54: 1208-1215, 1984; Van Veelen et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 15: 167-170, 1985; Van Veelen et al., Cancer Treat. Rep. 69: 977-983, 1985).

Navzdory své vysoké afinitě vůči AR způsobuje MPA jen zřídka virilizační symptomy (akné, chlupatost, atd.). Mimoto je jeho inhibiční účinek na sekreci gonadotropinu vykonáván zřejmě jeho přímou interakcí s hypofyzou AR u krysy (Labrie et al., Fertil. Steril. 28: 1104-1112, 1977; Perez- Palacios et al., J. Steroid Biochem. 19: 1729-1735, 1983) i u člověka (Perez-Palacios et al. J. Steroid Biochem. 15: 125-130, 1981). Kromě toho MPA vyvíjí androgenní činnost v ledvině myší (Janne and Bardin, Pharmacol. Rev. 36, 35S-42S, 1980) ave ventrální prostatě krys (Labrie, C. et al., Steroid Biochem. 28: 379-384, 1987; Labrie C. et al., Mol. Cell. Endocrinol. 68: 169-179,1990).

Poulin et al. Androgenní a glukokortikoidní receptor zprostředkující buněčné proliferace medroxyprogesteronacetátu v lidských rakovinových buňkách prsu ZR-75-1, (Breast Cancer Res. Treatm. 13: 161-172, 1989) nedávno zjistili, že inhibiční účinek medroxyprogesteronacetátu (MPA) na růst rakovinových buněk ZR-75-1 lidského prsu je způsoben hlavně androgenními vlastnostmi sloučeniny. Androgenní vlastnosti MPA byly demonstrovány v jiných systémech (Labrie C. et al., J. Steroid Biochem. 28: 379-384, 1987; Luthy et al., J. Steroid Biochem. 31: 845-852, 1988; Plaňte et al., J. Steroid Biochem 31: 61-64, 1988: Labrie C. et al., Mol. Cell. Endocrinol. 58: 169-179, 1990). Rovněž u jiných syntetických progestinů bylo zjištěno, že vedle svého účinku progesteronového typu mají i různé stupně androgenního účinku (Labrie et al., Fertil Steril. 31: 29-34, 1979, Poyet and Labrie, The Prostatě 9: 237-246, 1986; Labrie C. et al., J. Steroid Biochem. 28: 379-384, 1987; Luthy et al., J. Steroid Biochem. 31: 845-852, 1988; Plaňte et al., J. Steroid Biochem. 31: 61-64, 1989).

- 5 CZ 285972 B6

Vysokodávkované progestiny, zejména medroxyprogesteronacetát a megestrolacetát, byly rovněž s úspěchem použity pro léčbu rakoviny děložní sliznice (Tatman et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25: 1619-1621, 1989; Podratz et al., J. Obstet. Gynecol. 66: 106-110, 1985; Ehrlich et al. Am. J. Obstet. Gynecol. 158: 797-807, 1988). Bylo ukázáno, že metyltestosteron zmírňuje symptomy endometriózy. (Hamblen South Med. J. 50: 743, 1987; Preston, J. Obstet. Gynecol. 2: 152, 1965). Androgenální a maskulinizující vedlejší účinky (někdy nevratné) jsou však významné u silných androgenních sloučenin, jako je testosteron a jeho deriváty.

Vysokodávkovaný MPA jako první léčení rakoviny prsu projevil podobné účinky jako Tamoxifen (Van Vellen et al., Cancer 58: 7-13, 1986). Vysokodávkované progestiny, zejména medroxyprogesteronacetát a megestrolacetát byly rovněž s úspěchem použity pro léčení rakoviny děložní sliznice. (Tatman et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25: 1619-1621, 1989; Podratz et al., Obstet. Gynecol. 66: 106-110, 1985; Ehrlich etal., Am. J. Obstet. Gynecol. 158: 797-807, 1988). Vysokodávkovaný MPA se používá s úspěchem podobným jako Tamoxifen pro léčení nádoru děložní sliznice (Rendina et al., Europ. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 17: 285-291, 1984).

Při nevýběrovém klinickém testu se ukázalo, že vysokodávkovaný MPA, podávaný po dobu 6 měsíců, způsobuje zastavení choroby u 50% pacientů a částečné zastavení u 13% subjektů oproti 12 %, resp.6 % pacientů, kteří dostávali placebo (Telimaa et al., Gynecol. Endocrinol. 1:13, 1987).

Ukázalo se, že androgen metyltestosteron zmírňuje symptomy endometriózy (Hamblen, South Med. J.50: 743, 1987; Preston, Obstet. Gynecol. 2: 152, 1965). Androgenní a maskulinizující vedlejší účinky (někdy nevratné) jsou však důležité u silných androgenních sloučenin, jako je testosteron.

Analogicky se snížením receptorů estrogenu u rakovinových buněk lidského prsu ZR-75-1, vyvolávaným androgenem (Poulin et al., Endocrinology 125: 392-399, 1989), způsobilo orální podávání MPA ženám během folikulámí fáze snížení hladiny estrogenu, vázaného v děložní sliznici (Tseng a Gurpied, J. Clin. Endocrinol. Metab. 41, 402-404, 1975).

Pokusy na zvířatech ukázaly, že nedostatek androgenu vede k osteopenii (úbytek kostní tkáně), kdežto podávání testosteronu zvyšuje celkové množství kostní tkáně (Silberberg and Silberberg, 1971; viz Finkelstein et al., Ann. Int. Med. 106: 354-361, 1987). Orchiectomie u krys může způsobit osteoporózu, zjistitelnou během dvou měsíců (Winks and Felts. Calcif. Tissue Res. 32: 77-82, 1980; Verhas et al., Calif. Tissue Res. 39: 74-77, 1986).

Zatímco by se dalo čekat, že zmenšenou kostní tkáň budou mít ženy oligomenoreické a amenoreické s nízkými hladinami cirkulace E₂, tyto ženy s vysokými hladinami androgenu (avšak nízkými hladinami estrogenu) mají zmenšené riziko vzniku osteoporózy (Dixon et al., Clinical Endocrinology 30: 271-277, 1989).

Bylo zjištěno, že hladiny adrenálního androgenu se snižují při osteoporóze (Nordin et al., J. Clin. Endocr. Metab. 60: 651, 1985). Mimoto bylo zjištěno, že vysoké hladiny androgenu užeň po přechodu chrání proti zrychlenému úbytku kostní tkáně. (Deutsch et al., INT. J. Gynecol. Obstet. 25: 217-222, 1987; Aloia et al., Arch. Int. Med. 143: 1700-1704, 1983). V souladu s touto úlohou androgenů jsou hladiny metabolitů androgenu v moči nižší u postmenopauzální symptomatické menopauzy nežli u kontrolované skupiny a významné zmenšení konjugovaného dehydroepiandrostenu (DHEA) bylo zjištěno v plazmě osteoporotických pacientek (Hollo and Feher, Acta Med. Hung. 20: 133, 1964; Urist and Vincent, J. Clin. Orthop. 18: 199, 1961; Hollo et al., Acta Med. Hung. 27: 155, 1970). Byla dokonce vyslovena domněnka, že postmenopauzální osteoporóza vzniká jak z hypoestrogenismu, tak i z hypoandrogenismu (Hollo et al., Lancet: 1357, 1976).

-6CZ 285972 B6

Mechanismem výše naznačené role obou estrogenů a androgenů v osteoporóze, přítomnost estrogenních (Komm. et al., Science 241: 81-84, 1988; Eriksen et al., Science 241: 84-86, 1988) stejně jako androgenních (Colvard et al., Proč. Nati. aCat. Sci. 86: 854-857, 1989) receptorů v osteooblastech lze vysvětlit zvýšenou kostní resorpcí, pozorovanou při nedostatku estrogenů a androgenů.

U chlapců během puberty zvýšení sérové hladiny testosteronů způsobuje zvýšení alkalické fosfátové aktivity (znak osteoblastické aktivity), která sama způsobuje zvětšení kostní hustoty (Krabbe et al., Arch. Dis. Child. 54: 959-953, 1979; Krabbe et al. Arch. Pediat. Scand. 73: 750755, 1984; Riis et al., Calif. Tissue Res. 37: 213-217, 1985).

Zatímco u žen je rychlá kostní resorpce odstartována v menopauze, u mužů může být ztráta kostního materiálu rozpoznána až kolem 65. roku (Riggs et al., J. Clin. Invest. 67: 328-335, 1987). Podstatná kostní resorpce je viděna u mužů kolem 80 let věku aje spojena s výskytem zlomenin kyčle, páteře a zápěstí. Některé studie naznačují, že osteoporóza je klinickým projevem nedostatku androgenu u mužů (Baran et al., Calcif. Tissue Res. 26: 103-106, 1978; Oděli a Swerdloff, West. J. Med. 124: 446-475, 1976; Smith and Walker, Calif. Tissue Res. 22 (Suppl.): 225-228, 1976).

Ačkoliv méně frekventovaná než u žen může být osteoporóza u mužů významnou příčinou úmrtí. (Seeman et al., Am. J.Med. 75: 977-983, 1983). Vskutku nedostatek androgenů je hlavním rizikem páteřních kompresí u mužů (Seeman et al., Am. J.Med. 75: 977-983, 1983). Zhoršená radiální a páteřní kostní hustota provází hypogonadismus, spojený s hyperprolaktinémií (Greespan et al., Ann.Ind. Med. 104: 777-782, 1986) nebo anorexia nervosa (Rigotti et al., JAMA 256: 385-388, 1986). Nicméně v těchto případech úloha hyperprolaktinémie a ztráta tělesné hmotnosti je nejistá.

Hypogonadismus u mužů byl rozpoznán, protože byl příčinou osteoporotických zlomenin (Albright and Reifenstein, 1948; Saville, Clin. End. Metab. 2: 177-185, 1973). Hustota kosti je fakticky zeslabena jak u primárního, tak u sekundárního hypogonadismu (Velentzas and Karras. Noův. Presse. Médicale 10: 2520,1981).

Těžká osteopenie byla popsána u 23 mužů s hypogonadismem odhalením snížení kortikální atrabekulámí kostní hustoty (Finkelstein et al., Ann. Int. Med. 106: 354-361, 1987; Foresta et al., Horm. Metab. Res. 15: 56-57, 1983). Osteopenie byla také popsána u mužů s Klinefelterovým syndromem (Foresta et al., Hor. Metab. Res. 15: 204-207, 1983; Foresta et al., Horm. Metab. Res. 15: 56-57, 1983; Smith and Walker Calif. Tissue Res. 22: 225-228, 1977.

Vratně snížená androgenní citlivost na kalcitonin byla popsána u krys po kastraci (Ogata et al., Endocrinology 87: 421, 1970; Hollo et al., Lancet 1: 1205, 1971; Hollo et al., Lancet 1: 1357, 1976). Kromě toho snížení sérového kalcitoninu bylo nalezeno u mužů s hypogonadismem (Foresta et al., Horm. Metab. Res. 15: 206-207, 1983) a testosteronová terapie u vykastrovaných krys zvyšuje hypokalcemický efekt kalcitoninu (Mc Dermatt and Kidd, And. Rev. 8: 377-390, 1987).

Albright aRufenstein (1948) původně předpokládali, že androgeny zvyšují syntézu kostní matrice. Androgeny také ukázaly, že zvyšují kostní syntézu a mineralizaci u kuřat (Puche and Rosmano, Calif. Tissue Res. 4: 39-47, 1969). Androgenní terapie u mužů s hypogonadismem zvyšuje růst skeletu a dospívání (Webster and Hogkins, Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 45: 72-75, 1940). Navíc se ukázalo, že terapie testosteronem způsobuje pozitivní dusíkovou, kalciovou a fosfátovou bilanci (Albriht. F., Reifeinstein, E.C.In: Příštitné žlázy a metabolické kostní choroby. Williams and Williams Co.: Baltimore pp. 145-204, 1948). Studiem kostní hystomorfometrie se zjistilo, že terapie testosteronem u mužů s hypogonadismem měla za následek relativní

-7CZ 285972 B6 zvětšení kostního objemu, celkového kostního povrchu, lineární rozšíření kostní formace a kostní mineralizace (Barau et al., Calcif. Tissue Res. 26: 103-106, 1978).

Léčba testosteronem, jak se ukázalo, zvětšuje kostní povrchy a šíři trámčiny, bez změněných nebo snížených opačných procesů, je takto vhodnou léčbou a zvětšuje celkový kostní mineralizační proces (Peacock et. al., Bone 7: 261-268, 1986). Bylo zde také snížení hladiny plazmatického fosfátu, způsobené pravděpodobně efektem na renální tubulámí resorpci fosfátu (Selby et al., Clin. Sci. 69: 265-271, 1985).

Kortikální hustota kostí se zvětšuje u mužů s hyperprolaktinemií a hypogonadismem, jakmile je testikulámí funkce normalizována (Geenspan et al., Ann. Int. Med. 104: 777-782, 1986; Geenspan et al., Ann. Int. Med. 110: 526-531, 1989). Testosteronová terapie zvětšuje vytváření kostí u mužů s primárním hypogonadismem (Baron et al., Calcif. Tissue Res. 26: 103-106, 1978; Francis et al., Bone 7: 261-268, 1986).

U 21 mužů shypogonadismem as izolovaným nedostatkem GnRH normalizace sérového testosteronu na víc než 12 měsíců zvětšila kostní hustotu (Kinkelstein et al., J. Clin. Endocr. Metab. 69: 776-783, 1989). U mužů s již rozpuštěnou epifyzou, jakkoli zde bylo signifikantní zvětšení kortikální hustoty kostí, nebyly zatím pozorovány žádné podstatné změny na hustotě kostní trámčiny. Tímto je podporován předešlý návrh proměnné citlivosti kortikální a trabekulámí části kosti na steroidní terapii.

Předešlé studie s anabolickými steroidy na malém počtu pacientů předpokládaly pasivní efekt na kost (Lafferty et al., Ann. J. Med. 36: 514-528, 1964; Riggs et al., J. Clin. Invest. 51: 2659-2663, 1972; Harrison et al., Metab. 20: 1107-1118, 1971). Mnohem později užitím měření celkového tělesného kalcia neutronovou aktivací jako parametru, byl ukázán pozitivní a relativně dlouhodobý efekt anabolického steroidu metandrostenolonu v opakované studii naslepo u postmenopauzální osteoporózy (Chessnut et al., Metab. 26: 267-277, 1977; Aloia et al., Metab. 30: 1076-1079, 1981).

Anabolický steroid nandrolon dekanoat snižoval kostní úbytek u žen s osteoporózou (Dequeker and Geusens, Acta Endocrinol. 271 (Suppl.): 45-52, 1985) v souhlase s výsledky, získanými během estrogenní terapie (Dequeker and Ferin, 1976; viz Dequeker and Geusens). Tyto podklady potvrzují experimentální údaje u králíků apsů, když nandrolon dekanoat snížil kostní úbytek (Ohem et al., Curr. Med. Res. Opin. 6: 606-613, 1980). Mimo to, anabolické steroidy u žen s osteoporózou nesnižují pouze kostní ztrátu, ale také zvětšují kostní hmotu. Na druhé straně léčba vitamínem D pouze snižuje kostní úbytek.

Terapie nandrolonem u žen v postmenopauze zvyšuje obsah kostních minerálů (Clin. Orthop. 224: 273-277). Nicméně vedlejší androgenní účinky byly zaznamenány u 50 % pacientek. Tyto podklady se staly zajímavé, když bylo nalezeno zvýšení kostní hmoty užitím anabolika nandrolonu, protože většina terapií byla omezována kostní ztrátou. Podrobná stimulace kostní tvorby androgeny byla předpokládána u mužů s hypogonadismem (Baran et al., Calcif. Tissue Res. 26: 103, 1978). Problém s dietou skalciem, kalcitriolem nebo hormony, která inhibuje kostní úbytek je ten, že téměř jistě vede k potlačení kostní tvorby (Need et al., Minerál. Electrolyte Metab. 11: 35, 1985). Ačkoliv Albright a Reiferstein (1948) (viz Need Clin. Orthop. 225: 273, 1987) předpokládali, že osteoporóza se týká snížení kostní tvorby a bude reagovat na terapii testosteronem, virilizující účinky androgenů udělaly tuto terapii nevhodnou pro léčbu žen v postmenopauze. Anabolické steroidy, sloučeniny mající menší virilizující účinky, byly postupně vyvíjeny. Ačkoliv někteří autoři popsali minimální účinky (Wilson and Griffin, Metab. 28: 1278, 1980), jiní popsali více pozitivních výsledků (Chessnut et al., Metab. 32: 571-580, 1983; Chessnut et al., Metab. 26: 267, 1980; Dequeker and Geusens Acta Endocrinol. (Suppl. 110) 271: 452, 1985). Náhodně provedená studie u žen v menopauze ukázala zvětšení

-8CZ 285972 B6 celkové kostní hmoty během léčby anabolickým steroidem stanazololem, třebaže vedlejší účinky byly zaznamenány u většiny pacientek (Chessnut et al., Metabolism 32: 571-580, 1983).

Jak bylo zmíněno již výše, dávky progestinů (např. medroxyprogesteronacetátu), použité pro běžnou terapii rakoviny prsu, jsou spojeny s důležitými nežádoucími účinky (tyto jsou zvláště způsobeny interakcí steroidu s glukokortikoidním receptorem, zvláště Cushingův syndrom, euforie) (Mattsson, Breast cancer Res-Treat. 3, 231-235, 1983; Blossey et al., Cancer 54: 12081215, 1984; Hortobagyi et al., Breast Cancer Res. Treatm. 5: 321 -326, 1985; Von Veelen et al,. Cancer Chemotherm. Pharmacol. 15: 167-170, 1985).

Výraz progestiny odkazuje na deriváty progesteronu a testosteronu. Tyto progestiny byly syntetizovány s cílem vyvinout sloučeniny, působící jako analogy progesteronu na progesteronové receptory, pro řízení plodnosti.

S dostupností nových a přesných testů se nicméně stává evidentní, že tyto sloučeniny, původně vytvořené pro interakci výlučně na progesteronovém receptoru, také obsazují často svoji vysokou afinitou receptor androgenní. (Labrie et al., Fertil. Steril. 28: 1104-1112, 1977; Labrie et al., Fertil. Steril. 31: 2934, 1979; Labrie, C.et al.,Steroid Biochem. 28: 379-384, 1987; Labrie C. et. al., Mol. Cell. Endocrinol. 68: 169-179, 1990). V nízkých koncentracích se androgenní aktivita těchto sloučenin stává důležitější než pravá aktivita progestinů. Je to případ například u medroxyprogesteronacetátu (Poulin et al., Breast Cancer Res. Treatm. 13: 161-172, 1989).

Problémem dřívější léčby rakoviny prsu aděložní sliznice syntetickými progestiny je ve vedlejších účincích, pozorovaných při terapii. Blokáda estrogenů při běžné terapii rakoviny prsu by měla nežádoucí škodlivé účinky na kostní hmotu u žen. Podobně blokáda estrogenů při běžné terapii endometriózy má podobné nežádoucí škodlivé účinky na kostní hmotu u žen.

Antikoncepční preparáty, které dovolují ochranu po delší dobu, byly vyvinuty v posledních 25 letech. Obsahují steroidy s dlouhodobým vnitřním působením po injekci (např. Depoprovera; nebo později přímé užití vnějších systémů-implantátů, mikrokuliček, vaginálních kroužků, I.U.Ds. (DANA) atd.). Nyní MPA a noretisteron (NET)-enantát jsou užívány v programech plánovaného rodičovství. V roce 1985 bylo odhadováno, že 4 miliony žen užívalo MPA a téměř 1 milion NET-enantát (Halí, P.E, Long-Acting injectable preparations. Fertility Regulation, Today and Tomorrow (Diczfalusy, E., Bydeman,M.,eds) Raven Press: New York, pp. 119-141, 1987). Kromě toho je odhadováno, že 0,5 mil, žen v Latinské Americe a 1 mil, žen v Číně berou různé jednoměsíční injekční preparáty, obsahující progesteron aestrogen (Halí, 1987, stejná citace jako výše).

Antikoncepční preparáty, které dovolují ochranu na delší dobu, byly vyvinuty za posledních 25 let.

Přehled dvou dlouhodobě působících steroidů je uveden v Contraception, květen 1977 svazek 15, číslo 5, pp. 513-533.

Depoprovera (25 mg) v kombinaci s 5 mg estradiol cypionátu byly podány k řízení plodnosti jedenkrát měsíčně (VHO, Sait et al., Contraception 37: 1-20, 1988). Drobné rozdíly v účinnosti a vedlejší účinky byly pozorovány ve srovnání s jednoměsíční injekcí 50 mg NET-enantátu a 5 mg estradiol valerátu. Více než 10 000 žen měsíčně bylo sledováno v každé skupině. Kombinace MPA - E₂ cypionátu byly vysoce účinné jako antikoncepce, protože žádné otěhotnění nebylo zaznamenáno u 10 969 žen v průběhu jednoho měsíce. Přerušení cyklu u žen, užívajících injekci lx měsíčně, bylo poměrně vysoké 35 % v roce (WHO, Said et al., Contraception, 37: 1120, 1988), zatímco nepravidelnosti v krvácení byly zaznamenány pouze u 6,1 % aamenorea u 2,1 % žen.

-9CZ 285972 B6

Pozdní příchod pro injekci, osobní důvody a ztráta pochopení činily 18,6% přerušení. Tyto informace ukazují potřebu mnohem jednoduššího a přijatelnějšího způsobu podávání.

DepoMPA (tak zvaný Depoprovera), užívaný osamoceně (150 mg, i.m. každé 3 měsíce) u20 498 žen, vykázal četnost otěhotnění 0,l±0,l % a 15,0±l % nepravidelností v krvácení a 11,9±1 % incidencí amenorey (WHO, Said et al., Contraception, 37: 1-20, 1988). V menší studii (5 434 žen DepoMPA ve stejné dávce vedlo k zástavě cyklů u 40,7±2 %, zatímco nepravidelné krvácení a amenorea se objevily u 14,7±1,5 %.

Předchozí užití MPA bylo aplikováno perorálně nebo intramuskulámě. Orální podání je limitováno problémem udržování a kolísání krevních hladin, zatímco uvolnění MPA z Depoprovera injekce je zpočátku rychlé, klesá v pozdějších časových intervalech velmi proměnlivě. Je proto potřeba řízeného uvolňování MPA, které dodává konstantní množství steroidu, pro definování délky časů, která zajistí pacientovu spolupráci a zvýšení účinnosti dodáváním konstantních krevních hladin léku do tkání, jak je potřeba pro léčbu. Podobné argumenty se týkají MGA.

Mikroenkapsulační lékové systémy byly široce vyvíjeny během posledních třiceti let křížení uvolňování léčivých činidel, zvláště inkorporaci aktivního činidla do biodegradačních polyesterů, takových jako poly(s-kaprolakton), poly(e-kaprolakton-CO-DL-kyselina mléčná), poly(DL-kyselina mléčná), poly(DL-kyselina mléčná-CO-kyselina glykolová) a poly(ekaprolakton-CO-kyselina glykolová). Viz například R. W. Baker (R.W.Baker, Controled Release of biologically active agents, John Wiley and Sons Ed., N.Y., 1987), F.Lim (F.Lim, Biomedical Aplication of Microencapsulation, Franklin Lim, Ed. CRC Press, BocaRaton, 1984).

V US patentu 3.773.919 G.A.Boswell a R.M.Scribner uveřejňují užití polymléčných léčebných směsí, zejména se steroidy jako MPA. pro pozvolné uvolňování léků.

V DE 3 503 679 Carli uveřejňuje formulaci o MPA, který v kombinaci s vodou vytváří ve vodě nerozpustný polymer.

Ve WO 8.807.816 R. J. Leonard uveřejňuje rozpuštění rekiystalizované steroidové pilulky, užitečné pro pozvolné uvolňování.

V US patentu 4.818.542 De Luca a spol. uveřejňuje vytvoření a užití porézních mikrokuliček pro léčebné podání.

V DE 2 010 115 Farbenfabriken Bayer A.G. uveřejňuje přípravu pevných mikrogranulí ve spreji pro pozvolné uvolňování.

V US patentu 4.166.800 F. W. Fong uveřejňuje výrobu mikrokuliček přidáním separovaného činidla při nízké teplotě.

V US Patentu 4.897.268 Tice a spol. uveřejňuje systém dodávky léků obsahující poly(DLlaktid-CO-glykolid) pro enkapsulaci.

V US patentu č. 4.107.071 R. G. Bayless uveřejňuje přípravu mikrokapslí částečně hydrolyzovaného kopolymeru etylenu a vinylacetátu.

V DE 2.051.580 Dupont a spol. uveřejňují přípravu pilulek a řízení uvolňování pro parenterální užití.

- 10CZ 285972 B6

V US patentu č. 4.622.244, Lapka a spol. uveřejňují enkapsulaci částic nebo materiálu sfází oddělování a odlučování mikrokapslí při nízké teplotě.

V US patentu č. 4.987.268, E.S.Nuwayser a W.A.Nucefora uveřejňují přípravu smíšeného jádra mikročástic.

Wise a spol. (D.L.Wise Lactic/Glycol Acid Polymers, Biology & Medicine, G. Gregotiadis Ed. New York Academia Press, pp. 237-270, 1979) popisují aplikaci (ko)polymeru kyseliny mléčné a glykolové v medicíně. Viz také Lewis, Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolide Polymers, Drog and Farmaceutical Sciences svazek 45, pp. 1-41, 1990.

Německý patent DE 4036425 zveřejňuje některé antiestrogeny nebo antiprogestomimetické steroidy.

Injekčně udržované uvolňování preparátu, obsahujícího NET, jako steroidní antikoncepce u krys ukázalo stálé uvolňování po dva měsíce (Anderson a spol. Contraception 13: 375-374, 1976). Kryogenní základní částice o velikosti 90-180 pm obsahovaly 20% NET, zabudovaného do biodegradační polymerové matrice, syntetizované z L(+) mléčné kyseliny v molekulové váze 200 000. Preparát (prášek o velikosti částic 90-180 pm), obsahující 20% NET v polymeru, tvořeném sloučením 90% L-laktidu z podílu hmotnosti a 10 % glykolidu na molekulovou hmotnost 200 000, uvolňoval sloučeniny u paviánů přibližně 2 měsíce (Gresser a spol., Contraception 17: 253-266, 1978). Nicméně nulová rychlost uvolňování, nalezená u krys, nebyla ověřena ve studii, provedené na primátech (Beck and Tice, In Long acting steroid contraception (D.R.Mishell, ed) Raven Press: New York, pp. 175-199, 1983). Injekční DL-PLA NET mikrokapslový systém je jedinou formou, která byla detailně sledována v podmínkách in vivo (Review by Beck and Tice. In Long acting steroid contraception (D.R.Mishell, ed) Raven Press: New York, pp. 175-199, 1983).

Většina technik, užívaných pro přípravu mikročástic, vyžaduje užití organických rozpouštědel, která zůstávají přítomna v nezanedbatelném procentu a mohou způsobit lokální nebo systémové nežádoucí toxické reakce. Jiné dřívější techniky musí použít vysokých teplot s možným nežádoucím tepelným rozložením steroidu a/nebo polymeru.

Problém s dřívější léčbou rakoviny prsu a děložní sliznice pomocí MPA a megestrol acetátu je ve vedlejších účincích, pozorovaných při této terapii. Problémem při užití derivátů 19-nortestosteronu jako je norgestrel, noretisteron a noretindron, je ten, že tyto sloučeniny mají estrogenní aktivitu (Vilchis a spol., J. Ster. Biochem. 24: 525-531, 1986; Larrea a spol., J. Ster. Biochem. 27: 657-663, 1987; Poulin a spol., Breast Cancer Res. Treatm. 17: 197-210, 1990). Tato estrogenní aktivita by se mohla negativně projevit při dlouhodobém užívání těchto léků u rakoviny prsu.

Je tedy potřeba při strategii léčby a prevence u onemocnění, závislých na estrogenech (jako je osteoporóza a antikoncepce), použít injekčních dlouhodobě působících systémů medroxyprogesteronacetátu a megestrolacetátu, které by mohly udržovat koncentraci těchto cirkulujících steroidů na nízké úrovni po dlouhou dobu (jeden měsíc a déle) a které obsahují zanedbatelná množství zbytkových toxických organických rozpouštědel a/nebo tepelných rozpadových nečistot, které vznikly vystavením terapeutika nadměrnému působení tepla.

Zvláště dlouhodobě působící uvolňovací systémy MPA, MGA nebo jiné androgenní sloučeniny se zanedbatelnou maskulinizační aktivitou, za účelem antikoncepce a prevence, by měly mít pozitivní vliv na cenu systému zdravotního zabezpečení.

-11 CZ 285972 B6

Podstata vynálezu

Jedním z účelů tohoto vynálezu je vytvořit farmaceutický přípravek pro léčení nebo prevenci osteoporózy, rakoviny děložní sliznice, rakoviny prsu, endometriózy nebo pro antikoncepci, se zpožděným nebo diferencovaným uvolňováním androgenního steroidu, obsahující pozvolna uvolňující částice, jež obsahují androgenní steroid, přičemž podstata vynálezu spočívá v tom, že androgenní steroid je zvolen ze souboru, který zahrnuje medroxyprogesteronacetát, a/nebo megestrolacetát, má konstantu inhibice Kj nižší než 2 x 10'⁸M pro androgenní receptor a hodnotu ED₅₀ menší než 3,0 nM pro buňky rakoviny prsu ZR-75-1 a je rozptýlený v pomalu uvolňujícím pojivu, které je biologicky kompatibilní s lidskou tkání a v těle je rozložitelné na biologicky snášitelné metaboíické produkty, přičemž pomalu uvolňující pojivo obsahuje polymerickou matrici, odvozenou z kopolymerických a homopolymerických polyesterů s hydrolyzovatelnými esterovými vazbami, přičemž je schopno při svém biologickém rozkladu uvolňovat androgenní steroid rychlostí, udržující koncentraci androgenního steroidu v séru mezi 1,0 a 50,0 nM/1 během doby, trvající od 48 hodin do 28 dnů po podání.

Uvedený farmaceutický přípravek je obzvlášť užitečný pro léčení rakoviny prsu nebo děložní sliznice, osteoporózy nebo endometriózy.

Je výhodné, jestliže pozvolna uvolňující částice jsou mikrokuličky o průměrném rozměru mezi 5 pm a 40 pm, přičemž zmíněné mikrokuličky obsahují maximálně 0,1 % hmotn. organického rozpouštědla.

Dále je výhodné, tvoří-li mikrokuličky 10 až 70 % hmotn. celkového farmaceutického přípravku, přičemž hmotnostní poměr zmíněného androgenního steroidu vůči zmíněnému pozvolna uvolňujícímu pojivu je v intervalu mezi 3:2 a 3:7.

Pozvolna uvolňující částice jsou schopny při svém biologickém odbourávání po dobu až 12 týdnů udržovat koncentraci androgenního steroidu v séru mezi 1,0 až 5,0 nM/1.

Standardní podmínky pro měření rychlosti uvolňování jsou popsány v části Podrobný popis, uvedené níže. Rychlost uvolňování je inherentní vlastností pozvolna uvolňujícího pojivá za definovaných podmínek a není to omezeni co do způsobu, jímž lze takového pojivá použít. Tak např. se rychlost uvolňování definuje při určitém dávkování. Farmaceutický přípravek takto definovaný však může být použit ve velkém počtu různých dávkování, jak je podrobně uvedeno níže, ajak to pokládá za vhodné ošetřující klinický lékař. Jiné parametry, jako např. způsob podávání přípravku, trvání pozvolného uvolňování a podobně, se rovněž mohou měnit v širokém rozsahu, jak je rozebráno níže.

Farmaceutický přípravek obsahuje organická rozpouštědla a/nebo nosiče v množství menším než 0,1 % hmotn.

Podstata způsobu výroby farmaceutického přípravku spočívá vtom, že androgenní steroid zvolený ze souboru, který zahrnuje medroxyprogesteronacetát a/nebo megestrolacetát, se rozpustí v organickém rozpouštědle spolu s pozvolna uvolňujícím pojivém, které obsahuje polymerickou matrici, odvozenou z kopolymerických a homopolymerických polyesterů s hydrolyzovatelnými esterovými vazbami, načež se výše zmíněná směs přidá do vody, která se míchá rychlostí postačující k vytvoření mikrokuliček o průměru 5 pm až 40 pm, načež se mikrokuličky vystaví tlaku menšímu než 133 Pa a teplotě o 7 až 20 °C nižší než je teplota skelného přechodu mikrokuliček po dobu, než se dosáhne snížení koncentrace zůstatkového organického rozpouštědla na hodnotu menší než 0,1 % hmot.

- 12 CZ 285972 B6

Tento způsob je zdokonalen tím, že před vystavení tlaku menšímu než 133 Pa se mikrokuličky vystaví vakuu alespoň 6650 Pa při teplotě maximálně 30 °C na dobu alespoň 24 hodin, přičemž následné vystavení tlaku menšímu než 133 Pa se provádí při teplotě o 7 až 12 °C nižší, nežli je teplota skelného přechodu mikrokuliček a po dobu postačující ke zmenšení zůstatkového organického rozpouštědla v mikrokuličkách na méně než 0,02 % hmotn.

Použité androgeny mají tu speciální vlastnost, že mají mohutný androgenní účinek při nízké koncentraci v krvi (tj. menší než 50 nM), přičemž při těchto koncentracích projevují velmi malou aktivitu receptorů glukokortikoidu. Jsou rovněž charakterizovány nepřítomností fyzického maskulinizujícího působení na ženy při rozmezí koncentrace, v němž jsou používány. To je třeba odlišovat od přírodních androgenů, vytvářených v gonádových nebo periferních tkáních, jako je testosteron nebo dihydrotestosteron, které vykazují značný maskulinizující účinek i při nízkých koncentracích v krvi. Syntetické progestiny, např. deriváty progesteronu, jsou užitečné pro tento vynález, stejně jako některé anabolické steroidy.

Androgeny podle vynálezu v průměru nezpůsobují fyzicky zjistitelné zvětšení maskulinizujících účinků, jako je zvýšený růst vlasů u žen, akné, seborea nebo vypadávání vlasů. Tyto maskulinizující účinky byly kvantifikovány v literatuře viz. například (Ferriman and Gallwey, J. P. Clin. Endocrinol. Metab. 21: 1440-1447, 1961 (týkající se růstu vlasů); Cremoncini et al., Acta. Eur. Fertil. 7: 248-314, 1976 (akné, seborea, a vypadávání vlasů). Viz také Cusan et al., J. Am. Acad. Dermatol. 23: 462-469, 1990.

Tabulky 1 a 2 uvedené níže udávají kvantifikaci.

Tabulka 1

Definice odstupňování vlasů na každém z 11 míst (stupeň 0 na všech místech vyznačuje nepřítomnost zakončení vlasů)

Místo	Stupeň
1. Horní ret	1 2 3 4
2. Brada	1 2 3+4
3. Prsa	1 2 3 4
4. Horní záda	1 2 3+4

Definice

Několik vousů na vnějším okraji

Malý knír na vnějším okraji

Knír do poloviny z vnějšího okraje

Knír vedoucí až ke středové linii

Několik roztroušených vousů

Roztroušené vousy s malými koncentracemi Kompletní krytí, lehké a těžké

Cirkumareolámí chlupy

Navíc s chlupy ve středové linii

Spojení těchto oblastí, s pokrytím ze 3/4

Kompletní pokrytí

Několik roztroušených chlupů

Poněkud více, ale stále ještě roztroušeně Kompletní pokrytí, lehké i těžké

- 13 CZ 285972 B6

5. Spodní záda	1 2 3 4
6. Homí břicho	1
	2
	3
7. Spodní břicho	1
	2
	3
	4
8. Paže	1
	2
	3+4
9. Předloktí	1,2,3,4,
10. Stehno	1,2,3,4,

11. Noha

Sakrální chomáč chlupů

S určitým rozšířením do stran

Pokrytí ze 3/4

Kompletní pokrytí

Několik chlupů ve střední linii

Poněkud více, stále ve střední linii Poloviční a úplné pokrytí

Několik chlupů ve střední linii

Proužek chlupů ve střední linii

Pás chlupů ve střední linii

Porost ve tvaru obráceného V

Řídký porost na nanejvýš 1/4 údu

Větší než (1), ale stále ještě neúplné pokrytí

Úplné pokrytí, lehké i těžké

Úplné pokrytí dorsálního povrchu; dva stupně lehkého a dva silného vzrůstu

Jako u paže

1,2,3,4. Jakou paže

Tabulka 2

Odstupňování akné, seborea a ztráty vlasů

Akné 1. 2. 3. 4.	Izolované pustuly, nanejvýš 10 Více než 10 izolovaných pustul Shluky pustul Splývající pustuly
Seborea 1. 2. 3.	Mírná Střední Silná
Úbytek vlasů 1. 2. 3. 4.	Mírný Zřejmé řídnutí Velmi zřejmé řídnutí Pleš

Podrobný popis výhodných provedení

Výhodné sloučeniny pro použití v tomto vynálezu obsahují syntetické progestiny, anabolické steroidy a jiné steroidní sloučeniny, které mají hodnotu Ki menší než 2 x ΙΟ'⁸ M pro receptor androgenu, přičemž receptorem androgenu zprostředkovaný inhibiční účinek na růst rakovino

- 14CZ 285972 B6 vých buněk ZR-75-1 lidského prsu dosahuje poloviny maximální hodnoty při koncentraci nižší než 3,0 nM najeden litr, a nemající maskulinizující účinek uváděný výše. Výhodné androgeny podle vynálezu by nezpůsobovaly žádné významné zvýšení průměrného maskulinizujícího účinku (tj. podstatné zvýšení kteréhokoliv z číselných stupňů uvedených výše v tabulce 1 nebo 2), pozorovaného u žen po tříměsíční léčbě při koncentraci androgenu v krvi, udržované na homí hranici nárokovaného rozsahu koncentrace (např. 50 nM na jeden litr). U většiny pacientek, u nichž před léčbou nebyly patrny žádné maskulinizující účinky, kde tedy celkový součet bodů všech 11 položek uvedených v tabulce 1 činil před léčbou 10 nebo méně, by byl tentýž součet normálně zachován při léčbě podle tohoto vynálezu. To znamená, že po tříměsíční léčbě by nebyly patrny žádné maskulinizující účinky. U pacientek, u nichž se již před léčbou projevovaly jisté maskulinizující účinky, by bylo očekáváno, že tyto účinky se léčbou nezvýší.

Pro zjištění, zda hodnoty Ki jsou nižší než 2 x 10'⁸M, lze hodnoty Ki zjišťovat následující metodou měření afinity různých sloučenin vůči receptoru androgenu.

Příprava prostatické tkáně: Ventrální prostaty jsou z krys Sprague-Dawley (Crl: CD (SD) Br) (získané od: Charles River, St.-Constanc, Quebek), vážících 200-250 g, kastrovaných 24 hodin před usmrcením. Ihned po vyjmutí se prostaty uloží k ledu a použijí se vzorky pojivá androgenu.

Příprava cytosolu: Tkáně prostaty se na jemno rozstříhají nůžkami (čerstvá tkáň) nebo pulverizují systémem Thermovac (zmrazená tkáň) před homogenizací v tlumicím roztoku A (Tris, 0,025 M; monotioglycerol, 20 mM; glycerol, 10% (v/v); EDTA 1,5 mM a molybden sodný, 10 mM, pH 7,4) v poměru 1:5 (hmotnost/objem) s použitím Polytronu PT-10 jako homogenizátoru. Tyto a všechny další úkony se provádějí při 0 - 4 °C. Homogenát se zpracuje v centrifúze při 105000x g po dobu jedné hodiny, aby se získala cytosolická frakce v kapalině nad usazeninou.

Vzorek cytosolického receptoru androgenu: Násobky 100 μΐ se inkubují při 0 - 4 °C 18 hodin s 100 μΐ 3 nM (³H) R1881 v přítomnosti nebo nepřítomnosti zvyšujících se koncentrací neoznačené androgenní sloučeniny, která má být testována. Na konci inkubace se volný a vázaný T nebo R1881 separuje přidáním 200 μΐ dextranem potaženého dřevěného uhlí (1 % dřevěného uhlí, 0,1 % dextranu T-70, 0,1 % želatiny, 1,5 mM EDTA a 50 mM Tris (pH 7,4)) na 15 minut před centrifugováním při 2300x g po dalších 15 minut při 0 - 4 °C. Násobky (350 μΐ) kapaliny nad usazeninou se převedou do scintilačních nádob slOml vodního výpočetního roztoku (Vzorec 963, New England Nuclear) před vypočtením v počítadle Beckman LS 330 (30%-ní účinnost pro tritium).

Výpočet Ki: Skutečné hodnoty inhibiční konstanty se vypočtou podle rovnice Ki=IC₅₀/(l+S/K) (Cheng aPrusoff, Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108, 1973). V této rovnici znamená S koncentraci (³H) T nebo (³H) R1881, K je disociační konstanta (K_D) zT nebo R1881 aICso je koncentrace neoznačených sloučenin, dávající 50% inhibici pojivá T nebo R1881. Pro četné sloučeniny jsou hodnoty Ki uvedeny v literatuře. Viz např. (Ojsso et al., J. Ster. Biochem. 57: 255-269, 1987; Asselin et al., Cancer Res. 40: 1612-1622, 1980; Toth and Zakar, J. Steroid Biochem. 17: 653-660, 1982). Metoda dávající podobné výsledky je popsána v (Poulin et al., Breast Cancer Res. Treatm. 12: 213-225, 1988). Pro určení koncentrace, při níž ta která sloučenina dosahuje polovinu maximálního, receptorem androgenu zprostředkovaného inhibičního účinku na rakovinové buňky ZR-75-1 ženského prsu, se používá následující technika, která je podrobně popsána v (Poulin et al., Breast Cancer Res. Treatm. 12: 213-225, 1988).

Udržování kmenových kultur.· Rakovinové buňky ZR-75-1 ženského prsu lze získat z Američan Type Culture Collection (Rockville, MD). Buňky se rutinně pěstují ve fenolovém červeně prostém médiu RPMI 1640, doplněném o 10nME₂, 15 mM Hepes, 2 mM L-glutaminu, 1 mM pyrohroznanu sodíku, 100 IU penicilínu na ml, 100 pg sulfátu streptomycinu na ml, 10%,

- 15 CZ 285972 B6 (objemových) zárodečného hovězího séra (FBS) ve vodou nasycené atmosféře 95 % vzduch: 5 % CO₂ při 37 °C.

Kmenové kultury jsou ve fázi logaritmického růstu vyživovány 0,05% trypsinem / 0,02% EDTA (hmotnost/objem) v Hankově vyváženém roztoku solí a resuspendovány v médiu E₂ a červeně prostém fenolu RPMI 1640, obsahujícím 5 % (objemových) dextranem potaženého živočišného uhlí (DCC), resp. jím upraveného FBS a 500 ng hovězího inzulínu na ml, avšak jinak doplněného, jak je uvedeno výše pro pěstování kmenových kultur. Buňky byly umístěny do 24jímkových destiček Linbro pro kultury (Flow Laboratories) s výslednou hustotou 0,5-4,0 x 10⁴ buněk na jímku. Čtyřicet osm hodin po umístění na desky se přidá čerstvé médium SD, obsahující patřičné koncentrace steroidů. Výsledná koncentrace etanolu, použitého pro přidání testovacích substancí, nepřekračuje 0,12 objemových procent a nemá žádný významný účinek na růst a morfologii buněk. Inkubační média se vyměňují vždy každý druhý den a buňky jsou vyživovány trypsinizací po 12 dnech léčby, není-li uvedeno jinak. Počet buněk lze určit Coulterovým počítačem.

Výpočty a statistické analýzy: Skutečné hodnoty IC₅₀ se vypočtou použitím iterativní regrese nejmenších čtverců (Rodbart, Endocrinology 94: 427-437, 1974), kdežto skutečné konstanty inhibice (hodnoty Ki) se vypočtou podle Chenga aPrusoffa (Biochem. Pharmacol. 22: 30993108, 1973).

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je srovnávací graf o počtu nádorů, pozorovaných u skupiny krys, chráněných způsobem podle tohoto vynálezu, tj. podáním 30 mg DepoProvera 1 týden předtím, nežli nádory byly indukovány podáním dimetylbenzantracenu (DMBA), ve srovnání s nechráněnou kontrolní skupinou.

Obr. 2 je srovnávací graf časového průběhu nádorů ovariektomováných krys (o-o) ve srovnání s neléčenou kontrolní skupinou (o-o). Nádory byly indukovány použitím dimetylbenzantracenu. Pro stimulaci růstu nádorů jak léčené, tak i kontrolní skupiny krys byl použit estradiol. Každé zvíře z léčené skupiny dostalo jedinou subkutánní dávku 30 mg DepoProvera. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento změn v celé nádorové oblasti v každé skupině.

Obr. 3 je spektrum ^]H mikročástic podle vynálezu, rozpouštěných v CDC1₃ při magnetické rezonanci, zaznamenané na spektrometru Brucker AC-F.300 FT NMR. Oblast pod vrcholy u δ=0,65 ppm pro MPA a u δ=5,20 ppm pro laktid jsou použity pro stanovení náplně jádra podle vzorce:

%MPA(náplně jádra)=0,28391+0,98720x[%oblast(b=0,65 ppm)], kde % oblast (δ=0,65 ppm) je definována jako:

% oblast (δ=0,65 ppm) = oblast(ó=0,65ppm)/[oblast(b=5,20ppm)+oblast(b=0,65ppm)].

Obr. 4 je standardní křivka pro stanovení zatížení jádra, odvozená od údaje NMR podobně jako u obr. 3 pro známé směsi polymeru a MPA.

Obr. 5 je chromatogram pozvolna uvolňujících mikrokuliček NPA, oddělených sterickou vylučovací chromatografíí (SEC) pro stanovení náplně jádra. Vrchol při retenční době 12 minut koresponduje s polymerovým stálým pojivém, kdežto vrchol při retenční době 15,6 min je MPA. Vsuvka na obr. 5 je kalibrační křivka, vytvořená ze standardních směsí PLG/MPA. Oblast vrcholu MPA je vyjádřena jako logaritmus procenta MPA ve známé směsi s 50:50 póly (DLlaktid-co-glyko lid).

-16CZ 285972 B6

Obr. 6 je fotografie mikrokuliček MPA, pořízená snímacím elektronovým mikroskopem (SEM) (A) při zvětšení 350x a (B) při zvětšení 2000x.

Obr. 7 je snímacím elektronovým mikroskopem (SEM) pořízená fotografie příčného řezu mikrokuličkami podle vynálezu (A) při zvětšení 1500x a (B) při zvětšení 5000x.

Obr. 8 ukazuje rozměrové rozložení mikrokuliček MPA, zjištěné snímacím elektronovým mikroskopem. Procento mikrokuliček v každé rozměrové skupině je vyjádřeno ve vztahu k rozměrové skupině (pm).

Obr. 9 je křivka diferenciální snímací kalorimetrie (DSC), kde je vyjádřen tepelný tok (rozdíl energie mezi vzorkem a referenčním vzorkem při definované teplotě; tepelný tok je přímo úměrný kalorické kapacitě vzorku). Tato křivka ukazuje teplotu (Tg) přechodu dávky MPA, enkapsulované do 65:35 poly(DL-laktid-co-glykolid) mikrokuličky podle vynálezu s 33% zatížením MPA.

Obr. 10 znázorňuje v (A) variaci různých parametrických charakteristik (M(n-l), Mn, Mw, Mz, M(z+1) molekulární hmoty 50:50 poly(DL—laktid-co—glykolid) po vystavení vyznačeným hladinám záření gama (Mrad); a v (B) variaci polydensity (Mw/Mn) ve vztahu k záření gama (Mrad).

Obr. 11 znázorňuje hladiny séra MPA v průběhu času u novozélandského bílého králíka po jediné subkutánní injekci 50 mg MPA, enkapsulovaného do mikrokuliček poly(DL-laktid-coglykolid).

Obr. 12 znázorňuje hladiny séra MPA v průběhu času u ovariektomovaných krys ženského pohlaví Sprague-Dawley po jediné subkutánní injekci vyznačeného množství MPA, enkapsulovaného do 50: 50 póly (DL-laktid-co-glykolid) mikrokuliček (1 nM = 0,386 ng/ml).

Obr. 13 je graf, znázorňující procento krys, majících dimetylbenzantracenem indukované nádory prsu v časovém průběhu, následujícím po jediné injekci mikrokuliček MPA (30 a 100 mg MPA nebo pojivo (řízené)) před podáním DMBA u krysy (1 nM=0,386 ng/ml).

Příklady provedení vynálezu

Lepší porozumění mnohočetné endokrinní aktivitě syntetického progestinu je požadováno nejenom pro jeho racionálnější využití v prevenci a terapii rakoviny prsu a děložní sliznice, stejně jako při endometrióze a ztrátě kostní hmoty, ale také odstranění vedlejších účinků, způsobených interakcí steroidních receptorů nezbytných pro požadovaný kladný účinek.

Přesná analýza biologických působení syntetických progestinů, majících afinitu vůči mnoha steroidním receptorům, by v ideálním případě vyžadovala selekci modelů in vitro, majících funkční receptory pro všechny hlavní třídy steroidů. Za tímto účelem jsme si zvolili rakovinové buňky ženského prsu řady ZR-75-1, které mají funkční receptory pro estrogeny, androgeny, progesteron a glukokortikoidy (Vignon et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 56: 1124-1130, 1983), abychom porovnávali relativní přínos různých systémů receptorů steroidů při ovlivňování množení buněk syntetickými progestiny. Zatímco estrogeny jsou v buňkách ZR-75-1 silně mitogenické (Poulin and Labrie, Cancer Res. 46: 4933-4937, 1986) a specificky regulují vyjádření a/nebo sekreci různých proteinů (Dickson and Lippman, Endocr. Rev. 8: 29-43, 1987), androgeny (Poulin et al., Breast Cancer Res. Treatm. 12: 213-225, 1988), glukokortikoidy

- 17 CZ 285972 B6 (Hatton, A. C., Labrie, F., nepublikované výsledky), jakož i progestiny potlačují jejich množení specifickými interakcemi s jejich příslušnými receptory.

Při léčbě rakoviny prsu bylo použito mnoha progestinů, včetně MPA (Blossey et al., Cancer 54: 1208-1215, 1984; Hortobagyi et al., Breast Cancer Res. Treatm. 5: 321-326, 1985), MGA (Jonson et al., Semin. Oncol. 13 (Suppl).: 15-19, 1986; Tchekmedyan et al., Semin. Oncol. 13 (Suppl.): 20-25, 1986) a noretindronu (Clavel et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18: 821-826, 1982; Earl et al., Clin. Oncol. 10: 103-109, 1984). Použitím systému in vitro na rakovinové buňky ZR-75-1 ženského prsu bylo nyní zjištěno, že syntetické progestiny nebo anabolické steroidy, Nor-testosteron, R1881, dromostanolon, fluoxymesteron, etisteron, metandrostanolon, oxandrolon, danazol, stanozol, calusteron, oxymetolon, cyproteron acetát, chlormadinonen acetát anorgestrel mají androgenní účinek při nízkých koncentracích. V návaznosti na potlačování růstu buněk, zejména cystické choroby, sekrece dvou glykoproteinů, tekutého proteinu - 15 (GCDFP-15) a GCDFP-24 je výrazně stimulováno androgeny (Simard et al., Mol. Endocrinol. 3: 694-702, 1989; Simard et al., Endocrinology 126: 3223-3231, 1990). Měření sekrece GCDFP-15 nebo sekrece GCDFP-24 lze takto použít jako citlivý parametr nebo indikátor působení androgenu v těchto buňkách. Změny v GCDFP-15 a GCDFP-24 jsou ve skutečnosti opačné než změny v růstu buněk při všech zkoušených experimentálních podmínkách. Všechny syntetické progestiny nebo anabolické steroidy, studované v souvislosti s tímto vynálezem, projevují androgenní účinek na růst rakoviny prsu ZR-75-1 a sekreci GCDFP-15 a GCDFP-24.

Identifikace receptorů (estrogen, androgen, progesteron a glukokortikoid), odpovědných za tento účinek sloučenin, je podstatná pro stanovení potenciálních účinků (včetně nepříznivých účinků) takových sloučenin. Je tudíž obzvlášť důležité stanovit specifickou interakci při nízkých koncentracích sreceptorem androgenu, protože takové nízké koncentrace nevyvíjejí interakci s receptorem glukokortikoidu, čímž vylučují nebo minimalizují sekundární vedlejší účinky.

Jedním ze způsobů potlačení růstu buněk prsu a děložní sliznice je aktivace receptorů androgenu účinnou sloučeninou, mající vůči místu receptorů takovou afinitu, že se váže na receptor androgenu při nízkých koncentracích a přitom nijak významně neaktivizuje jiné třídy receptorů steroidů, majících vztah k možným vedlejším účinkům. Je důležité zvolit sloučeniny, mající maximální afinitu vůči receptorů androgenu, které mají minimální nebo žádné virilizující účinky na ženy. Pro minimalizaci interakce takových sloučenin s receptory glukokortikoidu a estrogenu je důležité používat nízké dávky těchto sloučenin. Je rovněž důležité zvolit steroidy, mající androgenní účinek při nízkých koncentracích, které se metabolizují do estrogenů za podmínek in vivo, které při použitých nízkých koncentracích nepovedou k významnější aktivizaci jiných receptorů než receptorů androgenu.

Sloučeniny, použité u tohoto vynálezu, zejména anabolické steroidy a syntetické progestiny, vykazují při různých koncentracích pozoruhodné rozdíly ve své schopnosti aktivizovat různé třídy receptorů steroidů. Pečlivým hlídáním koncentrace podle tohoto vynálezu je možné selektivně aktivizovat požadované receptory, aniž by se tím vyvolala podstatnější aktivizace těch receptorů, jejichž aktivizace je nežádoucí. Tak např. při zde uvedených nízkých koncentracích lze MPA použít pro žádoucí aktivizaci receptorů androgenu a přitom se v podstatě uchránit vedlejších účinků, spojených s aktivizaci glukokortikoidu, které nežádoucně doprovázely léčbu podle dosavadního stavu techniky.

Vynález tedy vytváří nový způsob léčby a prevence rakoviny prsu a děložní sliznice, jakož i jiných chorob, reagujících na aktivizaci receptorů androgenu, např. úbytek kostní hmoty a endometriózu. U tohoto vynálezu je množství podávaných androgenních sloučenin mnohem nižší, nežli se podle dřívějšího stavu techniky používalo pro léčení rakoviny prsu a děložní sliznice.

- 18 CZ 285972 B6

Zjišťování koncentrace androgenů v krvi podle vynálezu:

Jako pomoc pro stanovení potenciálních účinků léčby lze měřit koncentrace sloučeniny v krvi. Tak např. měření hladin plazmy medroxyprogesteronacetátu (MPA) lze provést testem radioimunity po extrakci takto:

Příprava protilátky:

Protilátka 144A byla vypěstována v králících proti 17-hydroxyprogesteron-3-0-carboxymetyloxim-BSA. Označený steroid, použitý v testu radioimunity (RIA), byl metyl-17ahydroxyprogesteronacetát, 6α-[ 1,2-³H(N)]~ získaný z NEN (CAT NO: NET 480), kdežto referenčním preparátem byl medroxyprogesteronacetát (MPA), získaný ze steraloidů. Jako tlumicí roztok byl použit 0,1 % želatiny v 0,1 M fosforečnanu sodného, 0,15 M chloridu sodného, 0,1 % azidu sodného, pH 7,2. Rozpouštěcí směsí extraktu byl etyl eter-aceton (9:1, objemově) (EEA), kdežto rozpouštěcí směsí chromatografie LH-20 byl izooktan: toluen: metanol (90:5:5 objemově) (IOTH).

Postup při extrakci:

Jeden ml plazmy byl extrahován dvakrát s 5 ml EEA. Extrakty byly vypařením vysušeny dusíkem a zbytek byl rozpuštěn v jednom ml IOTH. Extrakty pak byly podrobeny chromatografií LH-20 na sloupcích 10 x 30 cm (Comig CAT NO: 05722A) naplněných 2 g LH-20 (Pharmacia). Gel byl omyt 30 ml IOTH před přidáním jednoho ml vzorku a vyluhování IOTHem. Prvních 6 ml bylo odloženo. Následujících 10, 16,5 a 27,5 ml eluentu představovaly frakci I (progesteron), II (MPA) a III 17-LH-progesteron) v tomto pořadí. Frakce II byla odpařením vysušena a rekonstituována v 1,5 ml testovacího tlumicího roztoku.

Test radioimunity:

Do každé zkumavky z borokřemičitého skla o rozměrech 12 x 75 mm bylo vloženo: 0,2 ml obsahující 25.000 DPM tritiovaného steroidu, 0,5 ml referenčního preparátu v rozmezí od 5 do 5000 pg na jednu zkumavku nebo 0,5 ml frakce II extrahovaného vzorku, 0,2 ml antiséra 144A, zředěného 1/5000 nebo 0,2 ml testovacího tlumicího roztoku, zastupujícího nespecifikované pojivo. Zkumavky pak byly přes noc inkubovány při 4 °C. Pak bylo přidáno 0,2 ml živočišného uhlí Norit-A, 0,2 % přípravku Dextran T-70 rozpuštěného ve vodě. Zkumavky pak byly mírně protřepány a po 10 minutách byly odstřeďovány při 2000xg po dobu 10 minut. Na povrchu plovoucí látka byla smíšena s 8 ml Formula-989 (NEN:NEF-989) a radioaktivita byla měřena v β-počítači.

Spodní a homí hranice zjištění MPA jsou 10 a 1000 pg/ml, kdežto strmost (LOGIT-LOG) je -2,2 a hodnota ED50 je 315 pg/ml. Nespecifické a čisté pojivo je ve vyjmenovaném pořadí 1,5 a 45 %. Protilátka 144A je vysoce specifická pro MPA, protože vzájemná reaktivita s progesteronem, 20a-OH-Prog, pregnenolem, 17-OG-pregnenolem. DHT, androstenedionem, testosteronem, 3a-diolem, estradiolem a kortisolem je menší než 0,1 %.

Kalkulace a statistika:

Údaje RIA byly analyzovány s použitím programu, založeného na modelu II Roadbarda aLewalda (V: 2nd Karolinska Symposium, Geneva, 1970; str. 79-103). Hodnoty plazmy MPA jsou obvykle uváděny jako průměr ± SEM (střední odchylka průměru) zdvojeného měření jednotlivých vzorků. Statistický význam se měří podle vícepásmového testu Duncan-Kramer (Kramer. C.Y., Biometrics 12: 307-310, 1956).

- 19CZ 285972 B6

Relativní účinek testovací sloučeniny na různé receptory:

Pro zjištění aktivity potenciálních sloučenin na různé receptory steroidu, androgenu, glukokortikoidu, progesteronu a estrogenu, zprostředkované působení syntetických progestinů 5 a anabolických steroidů lze měřit u rakovinových buněk ZR-75-1 lidského prsu použitím růstu buněk, jakož i uvolňování CGDFP-15 aCGDFP-24, jakožto parametrů reakce (Poulin and Labrie, Cancer Res. 46: 4933-4937, 1986; Poulin et al., Breast Cancer Res. Treatm. 12: 213-225, 1988; Poulin et al., Breast Cancer Res. Treatm. 13: 161-172, 1989; Poulin et al., Breast Cancer Res. Treatm. 13: 265-276, 1989; Simard et al., Mol Endocrinol. 3: 694-702, 1989; Simard et al., ío Endocrinology 126: 3223-3231, 1990).

Následující vlastnosti umožňují měření působení receptoru progesteronu (PgR): 1. Přidáním inzulínu se zcela zruší potlačení, způsobené interakcí progestinů R5020 s PgR v buňkách ZR-751: a 2. antiproliferační účinek R5020 je pozorován jen za podmínek stimulovaných Ep Tyto dvě 15 charakteristiky růstu buněk ZR-75-1 umožňují studovat rozsah, v němž účinky testované sloučeniny na buňky ZR-75-1 jsou přisuzovány její interakci s PgR vyhodnocením účinku přidání inzulínu a/nebo estrogenu na reakci růstu, měřenou na konci 15-denní inkubace buněk ZR-75-1 s testovanými sloučeninami.

Vliv receptoru estrogenu (ER) lze naproti tomu měřit přímo inkubací buněk ZR-75-1 jednak za přítomnosti, jednak za nepřítomnosti estrogenu v médiu.

Pro analýzu interakcí syntetických progestinů nebo anabolických steroidů s receptorem androgenu (AR) a receptorem glukokortikoidu (GR) v jejich potlačovacím účinku na růst buněk 25 lze s výhodou použít aditivitu antiproliferačních účinků androgenů a glukokortikoidů v této větvi buněk (Poulin et al., Breast Cancer Res. Treatm. 12: 213-225, 1988; Hatton and Labrie, F., neuveřejněné údaje). Lze takto saturovat AR 5a-dihydrotestosteronem (DHT) a pak měřit účinek na množení buněk, vyplývající z přidání glukokortikoidu. Na druhé straně lze účinek androgenu měřit podobně podle saturace GR dexametasonem (DEX). Specifičnost takto 30 pozorováním zjištěného potlačování růstu testovanou sloučeninou lze rovněž dále stanovit její reverzibilitou s použitím vhodné protilátky (např. antiglukokortikoidu nebo antiandrogenu).

Takto v přítomnosti nadbytku androgenu (1 pm DHT) za přítomnosti E₂ a inzulínu lze účinky glukokortikoidu zjišťovat přesně a bez interference s jinými receptory. Totéž platí pro studium úlohy AR, když jsou buňky inkubovány v přítomnosti nadbytku glukokortikoidu (3μ MDEX), 35 v přítomnosti E₂ a inzulínu. Jak prokazují podrobné kinetické studie, 1 μΜ DHT a 3 μΜ DEX mají maximální účinek na AR a GR ve vyjmenovaném pořadí.

Možné antagonické účinky progestinů, zprostředkované skrze AR a GR, lze mimoto zjistit saturováním obou receptorových systémů DHT a DEX, přičemž jeden činitel je zastoupen 40 mnohem více nežli druhý, aby bylo možno provést obrácení jediným zvoleným receptorem současně. Všechny experimenty se provádějí s buňkami ZR-75-1, vypěstovanými v médiu, doplněném o E₂, aby se zabránilo PgR-em zprostředkovanému účinku progestinů na růst buněk.

S použitím výše uvedených technik jsem zjistil, že četné androgenní sloučeniny, které aktivizují rovněž jiné receptory (např. receptory glukokortikoidu nebo progesteronu), mění své relativní účinky na různé receptory v závislosti na koncentraci. Zůstanou-li ve zde definovaném rozmezí koncentrace, mohou sloučeniny podle tohoto vynálezu kladně působit na receptory androgenu bez podstatných nežádoucích účinků na jiné receptory.

-20CL 285972 B6

Výběr pacientů, kteří mohou s prospěchem využít zde popsanou metodu:

Výskyt rakoviny prsu se obvykle zjistí pacientem samým a/nebo mammografií. Rakovina děložní sliznice je naproti tomu diagnostikována endometrickou biopsií. Obě rakoviny lze 5 diagnostikovat a vyhodnocovat standardními fyzikálními metodami, které jsou odborníkům dobře známy, např. zobrazení kosti, rentgen hrudníku, kontrola skeletu, ultrasonografie jater a zobrazení jater (je-li potřebné), zobrazení CAT, MRI a tělesná prohlídka. Endometriózu lze diagnostikovat podle bolestí nebo příznaků, spojených s menstruacemi žen, kdežto definitivní diagnózu lze získat laparoskopií a v některých případech biopsií.

Na druhé straně lze hustotu kostí měřit standardními metodami, dobře známými odborníkům, např. QDR (kvantitativní digitální radiografií, duální fotonovou absorpciometrií a počítačovou tomografií). Plazma a vápník v moči a hladina fosfátu, plazma alkalické fosfatázy, koncentrace kalcitoninu a parathormonu, jakož i močový hydroxyprolin a poměry kalcium/kreatinin.

Rakovinu prsu nebo děložní sliznice, osteoporózu nebo jinak nedostatečnou kostní hmotu i jiné nemoci, léčitelné aktivizací receptorů androgenu, lze podle tohoto vynálezu léčit nebo jim profylakticky předcházet.

Metodologii vhodnou pro zjištění antikoncepční účinnosti i vedlejší účinky lze nalézt v: Said et al., Contraception 37: 11-20, 1988.

Typicky vhodné androgenní sloučeniny obsahují 6-a-metyl, 17-a-acetoxy progesteron nebo medroxyprogesteron, který lze získat např. u firmy Upjohn and Farmitalia Carlo Erba, S.p.A pod 25 obchodními názvy Provera, DepoProvera nebo Farlutal, a pod zkratkou MPA.

Další vhodné androgenní sloučeniny obsahují ty, které jsou popsány v Labrie et al., (Fertil.

Steril. 31: 29-34, 1979), jakož i anabolické steroidy nebo progestiny (Raynaud and Ojasso, In: Innovatine Approches in Drug Research, Elsevier Sci. Publishers, Amsterdam, pp. 47-72, 1986;

Sanberg and Kirdoni, Pharmac. Ther. 36: 263-307, 1988; and Vincens, Simard and De Lingnieres, Les Androgenes. In: Pharmacologie Clinique, Base de Therapeutique, 2ieme Edition, Expansion Scientifíque (Paris), pp. 2139-2158), jakož iCalusterone (7p,17a-dimetyltestosteron), anabolické steroidy (Lam, Am. J. Sports Medicine 12, 31-38,1984; Hilf, R., Anabolic-androgenic steroid and exsperimental tumors. In: (Kochachian, C.D., eds).), Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 43, Anabolic-Androgenic Steroid, Springer-Verlag, Berlin,

725 pp, 1976), fluoxymesteron (9a-fluoro-l lp-hydroxy-17a-metyltesteron), testosteron173~cypionát, 17a-metyltestosteron, Pantestone (testosteron undekanoát), D'-testololakton a Andractim.

Jiné typicky vhodné androgenní sloučeniny jsou cyproterone acetát (Androcur), který dodává Schering AG, 6-a-metyl, 17-a-acetoxyprogesteron nebo medroxyprogesteronacetát (MPA), které dodává m. Upjohn and Farmitalia, Calbo ERba, Gestodene, který dodává Shering, megestrol acetát (17a-acetoxy-6-metyl-pregna-4,6-diene-3,20-dione), dodávaný firmou Mead Johnson and Co. Evansville, Ind., pod obchodním názvem Megace. K dalším syntetickým progestinům patří Levonorgestrel, Norgestimate, desogestrel, 3-ketodesogestrel, noretindron, noretisteron, 13a-etyl-l 7-hydroxy-l 8, 19-dinor-l 7-|3-pregna-4,9,11 -triene-20-yn-3-one (R2323), gestrinon), demegeston, norgestrienon, gastrinon a další, popsané v (Raynaud and Ojasso, J. Steroid Biochem. 25: 811-833, 1986; Raynaud et al., J. Steroid Biochem. 12: 143-157, 1980; Raynaud, Ojasso and Labrie, Steroid Hormones, Agonists and Antagonists, In:

Mechanismus of Steroid Action (G. P Lewis and M. Ginsburg, eds), McMillan Press, London pp. 145-158 (1981) Kterýkoliv jiný derivát progestinu, mající výše uvedené charakteristiky, by rovněž mohl být užitečný pro tento vynález.

-21 CZ 285972 B6

Androgenní sloučenina se podává s výhodou jako farmaceutická látka topicky, parenterálně nebo orálně. Sloučeninu lze podávat parenterálně, tj. intramuskulámě nebo subkutánně injekcí, nebo nosními kapkami, čípky nebo tam, kde je to možné, intravaginálně nebo transdermálně s použitím gelu, náplasti nebo jiného vhodného prostředku. Androgenní sloučenina může být vložena do mikropouzder nebo připojena k biologicky kompatibilnímu a biologicky rozložitelnému polymeru, např. póly (d,l-lactid-co-glycolid), a subkutánně nebo intramuskulámě injekční technikou, nazývanou subkutánní nebo intramuskulámí depot, pro poskytování kontinuálního, pomalého uvolňování po dobu 30 dnů nebo déle. Vedle orálního podávání je výhodným způsobem podávání sloučeniny subkutánní depot (injekce). DepoProvera se může uvolňovat relativně konstantní rychlostí po dobu přibližně tří měsíců po intramuskulámím podávání vodní disperze.

Množství každé podávané sloučeniny určuje ošetřující lékař s přihlédnutím ke stavu a věku pacientky, účinnosti každé složky a jiným faktorům. Při prevenci rakoviny prsu aděložní sliznice, jakož i úbytku kostní hmoty, podle tohoto vynálezu jsou vhodná dále uvedená rozmezí dávkování.

Androgenní látka se podává nejlépe denním dávkováním, které dodává méně než 25 mg aktivního androgenního steroidu na 50 kg tělesné hmotnosti.

Výhodné je dávkování 1-10 mg na 50 kg tělesné hmotnosti, zejména 3-7 mg (např. 5 mg). Zvolené dávkování s výhodou udržuje koncentraci séra pod 50 nM na litr, s výhodou mezi 1,0 nM na litr a 10, 15 nebo 25 nM na litr podle reakce pacientky. Dávkování potřebné pro udržování těchto hladin může od pacientky k pacientce kolísat. Lze doporučit, aby ošetřující klinický lékař monitoroval hladiny technikami zde popsanými a podle toho optimalizoval dávkování. Pro účely profylaxe se podávání androgenu s výhodou zahájí v perimenopauzálním období pro prevence rakoviny prsu a děložní sliznice a úbytku kostní hmoty u normálních žen. Androgen lze sdružit s přijímanou dávkou estrogenů, používanou pro prevenci jiných příznaků menopauzy. U těchto žen, u nichž tvorba a/nebo působení estrogenů bylo blokováno pro léčení endometriózy, leiomyomatózy, rakoviny prsu, rakoviny děložní sliznice, rakoviny vaječníků nebo jiné na estrogen citlivé choroby, lze podávání androgenu zahájit kdykoliv, s výhodou současně s blokádou estrogenů.

Androgen pro intramuskulámí nebo subkutánní depot injekci může být uložen v biologicky kompatibilním, biologicky rozložitelném polymeru, např. poly(d,l-lactid-co-glycolid), a to, vedle jiných technik, procesem separace fází, nebo vytvarováním do tabletek nebo tyčinek. Mikrokuličky pak mohou být suspendovány v nosiči pro vytvoření injektovatelného přípravku, nebo lze depot injikovat ve formě tabletky nebo tyčinky. Viz rovněž Evropskou patentovou přihlášku EPA čís. 58.481, uveřejněnou 25. srpna 1982 a týkající se pevných látek pro subdermální injekci nebo implantaci, nebo kapalné látky pro intramuskulámí nebo subkutánní injekce, obsahující biologicky kompatibilní, biologicky rozložitelné polymery, jako je např. kopolymer laktid-glykolid a aktivní sloučeniny. Tyto látky umožňují řízené uvolňování sloučeniny.

Androgeny užitečné v tomto vynálezu mohou být typicky vytvořeny se standardními farmaceutickými excipienty, např. rozprášením vysušené laktózy a stearanu hořečnatého, v tabletkách nebo kapslích pro orální podávání.

Aktivní substanci lze zpracovat na tablety nebo dražé smíšením s pevnými práškovými nosnými látkami, jako citran sodný, uhličitan vápenatý nebo dikalciumfosfát, a s pojivý jako je polyvinyl pyrolidin, želatina nebo deriváty celulózy, popř. též s přidáním lubrikantů, jako je stearan hořečnatý, lauryl síranu hořečnatého, Carbowax nebo polyetylenglykol. Samozřejmě lze pro případ orálního podávání přidat též látky zlepšující chuť.

-22 CZ 285972 B6

Jako další formy lze používat kapsle, např. tvrdou želatinu, jakož i uzavřená pouzdra z měkké želatiny, obsahující změkčovač nebo zvláčňovač, např. glycerin. Kapsle obsahují aktivní substanci s výhodou ve formě granulátu, tj. ve směsi s výplněmi, jako je laktóza, sacharóza, manit, škroby, jako např. bramborový škrob nebo amylopektin, deriváty celulózy nebo silně rozptýlené kyseliny křemičité. U kapslí z měkké želatiny je aktivní substance s výhodou rozpuštěna nebo suspendována ve vhodných kapalinách, jako jsou rostlinné oleje nebo tekuté polyetylenglykoly.

Namísto orálního podávání lze aktivní sloučeninu podávat parenterálně. V takovém případě lze použít roztok aktivní substance, např. vsezamovém oleji nebo v olivovém oleji. Aktivní substance může být obsažena nebo připojena k biokompatibilnímu, biologicky rozložitelnému polymeru, např. póly (d-l-laktid-co-glykolid) a subkutánně nebo intramuskulámě injikována technikou, nazývanou subkutánní nebo intramuskulámí depot, pro vytvoření kontinuálního pomalého uvolňování sloučeniny po dobu dvou týdnů nebo déle.

Vynález rovněž zahrnuje soupravy nebo jednotlivá balení, obsahující farmaceutickou látku, aktivní ingredience, nebo prostředky pro jejich podávání pro použití a léčení rakoviny prsu a děložní sliznice, jakož i úbytků kostní hmoty a léčení endometriózy, jak bylo uvedeno výše. Soupravy nebo balení mohou rovněž obsahovat návod k používání farmaceutických látek podle tohoto vynálezu.

Při použití výše uvedené terapie popsaným způsobem lze zmírnit růst nádoru prsu a děložní sliznice, jakož i úbytek kostní hmoty a endometriózy a přitom minimalizovat nepříznivé vedlejší účinky. Použití popsaného způsobu může rovněž zabránit vzniku těchto chorob.

Když jsou požadována složení látky, zaručující řízené uvolňování, řízená uvolňovací pojivá, vhodná pro použití podle tohoto vynálezu, zahrnují veškerý biologicky kompatibilní materiál s řízeným uvolňováním, kteiý je inertní vůči aktivní složce a je schopen aktivní složku do sebe pojmout. Odborníkům je známo mnoho takových materiálů. Výhodnými pojivý s řízeným uvolňováním jsou materiály, které se za fyziologických podmínek pomalu metabolizují po své subkutánní nebo intramuskulámí injekci u savců (tj. v přítomnosti tělesných tekutin, které tam existují). Pojivo může být takové, jehož rychlost biologického rozkladu je dostatečně pomalá tak, že samotné mikrokuličky pojivá (tj. bez steroidu nebo jiné aktivní složky), mající průměrný průměr nad 20 mikronů, nebudou biologicky zcela rozloženy alespoň jeden měsíc po subkutánní nebo intramuskulámí injekci. Vhodnými pojivý jsou mimo jiné biologicky kompatibilní polymery a kopolymery, dosud používané u látek s pozvolným uvolňováním. Takové biologicky kompatibilní sloučeniny jsou netoxické a inertní k okolní tkáni po subkutánní nebo intramuskulámí injekci a nevyvolávají významnější nepříznivé účinky, jako je imunitní reakce, zánět nebo pod., metabolizují se do metabolických produktů, které jsou rovněž biologicky kompatibilní a snadno se vylučují z těla.

Tak např. lze použít polymerickou matrici, odvozenou od kopolymerických a homopolymerických polyesterů, majících hydrolyzovatelné esterové vazby. O řadě z nich je odborníkům známo, že jsou biologicky rozložitelné a vytvářejí tak produkty buď netoxické nebo jen mírně toxické. Takovými polymery jsou typicky polyglykolové kyseliny (PGA) a polymléčné kyseliny (PLA), póly (DL-kyselina mléčná-co-kyselina glykolová) (DL PLGA), póly (D-kyselina mléčná-cokyselina glykolová) (D PLGA) a póly (L-kyselina mléčná-co kyselina glykolová) (L PLGA). Výhodný poměr mezi polymery kyseliny mléčné a kyseliny glykolové v póly (kyselina mléčnáco-kyselina glykolová) je v rozmezí od 100:0 (tj. čistý polylaktid) do 50:50. Dalšími užitečnými biologicky rozložitelnými nebo biologicky rozrušitelnými polymery jsou poly(s-kaprolakton) poly(e-kaprolakton-CO-kyselina mléčná), poly(8-kaprolakton-CO-kyselina glykolová), poly(β-hydroxy kyselina máselná), poly(alkyl-2 kyanoakrylát), hydrogely jako poly(hydroxyetyl metakrylát), polyamidy, poly(amino kyseliny) (i.e. L-leucin, kyselina glutamová, L-kyselina

-23 CZ 285972 B6 asparagová) apod.), poly(ester močoviny), poly(2-hydroxyetyl DL-aspartamid), (polymery polyacetalu, polyortoestery, polykarbonáty, polymaleamidy, polysacharidy) a jejich kopolymery. Četné vhodné materiály jsou dostupné v prodeji, např. polykyselina mléčná-co-glycolid (dodává Birmingham Polymer lne., Birmingham Al. nebo Dupont Company. Washington DC).

Pozvolna uvolňované částice podle tohoto vynálezu mají rychlost uvolňování aktivní složky vypočtenou tak, aby zajišťovaly v podstatě konstantní koncentrace séra. Když je podán nízkodávkovaný androgen podle tohoto vynálezu, je androgen uvolňován pojivém rychlostí, udržující hladiny séra tohoto androgenu mezi 1 a 50 nM na litr, typicky mezi 1 a 25, s výhodou mezi ίο 1 a 15 a nejlépe mezi 1 a 10 nM na litr, když je podáván za standardních podmínek uváděných níže. Standardní podmínky jsou definovány (pouze pro omezený účel měření zde diskutované vlastnosti rychlosti uvolňování pozvolna uvolňovaných částic) jako perkutánní injekce 10 mg částic (ve formě 20 mg farmaceutické látky, mající poměr 1: 1 (hmotnostně) částic vůči 2% vodného nosiče karboxymetyl celulózy (hmotnostně) do zadní části mladých krys Sprague15 Dawley ženského pohlaví. Pak se měří koncentrace androgenu tím, že se od krys periodicky odebírají vzorky séra, počínaje 48 hodin po podání a konče 28 dnů po podání, aby bylo zaručeno, že hladiny séra jsou po celé toto období udržovány v požadovaném rozmezí.

Rychlost uvolňování pozvolna uvolňujících částic lze měnit měněním kteréhokoliv zvíce 20 parametrů (nebo kombinace parametrů), o nichž je odborníkům známo, že mění rychlost uvolňování. K těmto parametrům patří mimo jiné složení pojivá, to znamená pozvolna uvolňujících částic, velikost částic a náplň jádra. Tak např. je známo, že polylaktidové pojivo se hydrolyzuje pomaleji a že tedy za jinak stejných poměrů uvolňuje aktivní složku pomaleji než kopolymery kyseliny mléčné a kyseliny glykolové. U takových kopolymerů rychlost uvolňování 25 vzrůstá se vzrůstajícím procentem glykolidu v molech. Při stejných hmotnostech částic vzrůstá rychlost uvolňování s klesajícím rozměrem, protože větší celková plocha povrchu (součet všech částic) je představována menšími částicemi. Rovněž i při zvyšování náplně jádra se zvyšuje rychlost uvolňování. Tyto parametry lze rovněž známými způsoby měnit pro řízení doby trvání uvolňování. Podrobné pojednání o přípravě léku s pozvolným uvolňováním podal F. Lim 30 (F. Lim, Biomedical Application of Microencapsulation, Franclin Lim, ed., CRC Press, Boča

Raton, 1984), jehož celý obsah se sem začleňuje odkazem namísto úplné citace.

Standardní podmínky a měření, uvedená výše, se týkají pouze inherentní vlastnosti rychlosti uvolňování částic ajsou pouze definiční. Částice, mající vhodnou rychlost uvolňování, lze, jak je 35 zde podrobně probíráno, připravovat a podávat mnoha různými způsoby. Používá se jich k různým účelům a podávají se v širokém rozmezí dávkování (viz níže). Tyto částice mohou poskytovat pozvolné uvolňování aktivní složky buď pouhých 28 dnů nebo po podstatné delší období, např. 2 měsíce, 3 měsíce, 6 měsíců nebo déle. Jinak řečeno, zatímco částice musí udržovat správné hladiny v krvi po 28 dnů, jsou žádoucím způsobem vytvořeny v takovém 40 složení, aby tyto hladiny v krvi udržovaly po dobu podstatně delší.

Ošetřující klinický lékař může dávkování měnit tak, aby udržoval hladiny séra na požadované úrovni, např. mezi 1 a 50 nM androgenu na litr. Dávkování u lidí, potřebné k dosažení hladin v séru na úrovni podobné, jaké bylo dosaženo u krysy za standardních podmínek, mají tendenci 45 být asi 30 krát větši než dávky pro krysu, ačkoliv to bude kolísat podle metabolismu jednotlivých pacientek. Tak např. by bylo možno očekávat, že pozvolna uvolňovaných částic MPA, které udržují koncentrace séra na 30 nM po injekcích lOmg u krysy, by u člověka vytvořily koncentraci 30 nanomolů injekcí 300 mg, 20 nanomolů injekcí 200 mg, koncentraci 15 nanomolú injekcí 150 mg atd. Předchozí dávkování je podle hmotnosti pozvolna uvolňovaných 50 částic a neobsahuje nosič. Dávkování finální farmaceutické látky musí být upraveno tak, aby bralo v úvahu nosič. Je-li např. požadována dávka 100 mg částic, pak u látky, jejíž poměr částic k nosiči je 1:1, musí být podána dávka 200 mg. Dávkování by rovněž mělo být upraveno podle rychlosti uvolňování pozvolna uvolňovaných částic za standardních podmínek. Tak např. pro dosažení stejné koncentrace séra je nutno u částic, jejichž rychlost uvolňování je 5 nM

-24CZ 285972 Β6 (za standardních podmínek), podávat v dávkách přibližně dvakrát větších nežli by bylo dávkování částic s rychlostí uvolňování 10 nM (za standardních podmínek).

V typickém případě ošetřující klinický lékař začne dávkou vypočtenou na udržování hladin séra aktivní složky mezi 1 a 10 nM, např. mezi 3 a 7 nM. V závislosti na reakci pacientky lze pak dávkování zvyšovat nebo snižovat. Je výhodné používat krátkodobě (např. 28 dnů) působící částice, dokud se nezjistí optimální dávkování. Pak lze podávat dlouhodoběji působící částice v dávkách udržujících optimální hladiny v krvi. Dávkování se ovšem přizpůsobí, jak je uvedeno výše, pro jakýkoliv rozdíl ve standardních rychlostech uvolňování mezi krátkodoběji a dlouhodoběji působícími částicemi.

Výhodné aktivní sloučeniny obsahují všechny zde probírané androgenní sloučeniny, např. medroxyprogesteronacetát (6-a-metyl, 17-a-acetoxyprogesteron) neboli MPA, který lze získat mimo jiné od firmy Upjohn and Farmittalia Carlo Erba, S.p.A., pod obchodním názvem Provera, Depoprovera nebo Farlutal; a megestrolacetát (17a-acetoxy-6-metyl-pregna-4,6diene-3,20-dione) neboli MGA, který lze získat mimo jiné od firmy Mead Johnson and Co pod obchodním názvem Megace.

Je výhodné, jestliže pozvolna uvolňující částice jsou v podstatě sférické (kulové). Toho lze dosáhnout např. rozpuštěním aktivní složky a pozvolna uvolňujícího pojivá v organickém rozpouštědle a pak vléváním rozpouštědla do vody za současného míchání. Malé kuličky mikropojiva, majícího v sobě dispergovanou aktivní složku, jsou takto vytvářeny v důsledku nedostatku rozpustnosti mikrokuliček ve vodě přidáním nadbytku vody. Mikrokuličky se zbavují značného množství organického rozpouštědla, dokud je organické rozpouštědlo mísitelné ve vodě. Lze přidat povrchově aktivní látku, aby se napomohlo separaci mikrokuliček z rozpouštědla během tvoření kuliček ve vodě. Průměrnou velikost mikrokuličky lze zvětšit méně intenzivním mícháním nebo zmenšit intenzivnějším mícháním. Pro účely snadné aplikace při podávání pacientům a rovněž pro usnadnění následujícího odstraňování nežádoucího zůstatkového organického rozpouštědla jsou výhodnější menší mikrokuličky. Typicky je průměrná velikost kuliček mezi 5 a 40 pm a s výhodou mezi 9 a 28 pm.

Dává se přednost postupu, kdy se provede uzavření MPA vytvořením vodní suspenze mikrokapiček, obsahujících směs MPA a polymeru v metylenchloridu. Polymerem může být např. kopolymer 50:50 kyseliny mléčné a glykolové. Tvoření mikrokuliček je řízeno detergentem, např. polyvinylalkoholem. Kapky se nechají ztvrdnout odstraněním metylenchloridu, extrahovaného s velkým množstvím vody, což je technika, která dává kapkám lepší tvar nežli obvyklé odpařování ve vakuu. Velikost mikrokuličky je řízena množstvím detergentu a rychlostí míšení směsi suspenze.

Úhrnné rozdělení rozměrů částic může kolísat, avšak doporučuje se úzké a jednotnější rozmezí. S výhodou je nejméně 90 % částic mezi 1 a 40 pm. Ještě lépe je, jestliže nejméně 90 % je mezi 9 a 28 pm. Rozměrem mikrokuliček se zde rozumí průměr jednotlivých kuliček, i když - což je nežádoucí - jsou ve shluku s jinými kuličkami. Rozměrem nepravidelných částic se rozumí nejdelší přímka mezi kterýmikoliv dvěma částmi částice. Rozměr lze měřit prohlédnutím reprezentativního vzorku částic elektronovým mikroskopem.

K reprezentativním organickým rozpouštědlům pro použití při přípravě mikrokuliček patří mimo jiné metylenchlorid, etylacetát, aceton, dietyleter, tetrahydrofuran, hexafluoroaceton, hexafluoroizopropanol, acetonitril a směsi těchto rozpouštědel. Reprezentativními detergenty, použitými v první části výroby mikrokuliček způsobem extrakce rozpouštědla mikroenkapsulace, jak je popsán v příkladu 3, jsou mimo jiné polyvinylalkohol, polyvinyl pyrolidin, karboxymetylcelulóza, želatina, škrob, mastek (steatit), síran hořečnatý, uhličitan vápenatý a ionická činidla. Detergent se přidává s výhodou v množství mezi 1 a 1 0 % vody (objemově).

-25 CZ 285972 B6

Poměr vody k rozpouštědlu (včetně rozpuštěného pojivá) se může měnit, avšak doporučuje se velký přebytek vody, např. poměr vody k rozpouštědlu 5 a 20 (objemově) nebo více.

Pojivo se s výhodou přidává k organickému rozpouštědlu s koncentrací mezi přibližně 1 % a 20 % (objemově) v závislosti na rozpustnosti. Množství rozpouštědla je s výhodou blízko minima, potřebného pro úplné rozpuštění pojivá a aktivní složky. Je-li rozpuštění neúplné, lze přidat další rozpouštědlo. Poměr aktivní složky k pojivu je určen požadovanou náplní jádra, která se pohybuje s výhodou mezi 1:4 a 7:3 (hmotnostně), a ještě lépe mezi 3:7 a 3:2. Stupeň náplně jádra lze zvolit pro ovlivňování rychlosti uvolňování pozvolna uvolňujících částic nebo doby trvání uvolňování, nebo jiných odborníkům známých parametrů.

Při výrobě mikrokuliček s použitím procesu mikroenkapsulace extrakcí rozpouštědla, jak je popsán v příkladu 3, je výhodným rozpouštědlem pro rozpuštění medroxyprogesteron acetátu a polymeru nebo kopolymeru metylenchlorid, avšak jiná rozpouštědla, částečně mísitelná s vodou a mající nízký stupeň toxicity pro člověka, jsou rovněž vhodná (např. etylacetát, aceton, dietyleter, tetrahydrofuran, hexafluoraceton, acetonitril a směsi těchto rozpouštědel). Mimoto toxicita rozpouštědla není významným faktorem, když je rozpouštědlo v podstatě odstraněno použitím zde popsaných technik odstraňování rozpouštědla. Výhodným detergentem je poly(vinylalkohol), avšak jiné detergenty jsou rovněž vhodné: polymerická disperzní činidla (tj. poly(vinylpyrolidin) karboxymetylcelulóza, želatina, škrob), mastek, síran hořečnatý, uhličitan vápenatý a iontová činidla.

Mikročástice lze rovněž vytvářet odléváním, při němž se odlévá roztok MPA a polymer nebo kopolymer ve vhodném rozpouštědle (např. v některém z rozpouštědel uvedených výše). Rozpouštědlo se pak odpaří při atmosférickém tlaku. Takto získaný film se zahřeje a extruduje přes drátěnou síť. Vzniklé tyčinky nebo úlomky se rozemelou na mikročástice. Vhodným molekulárním sítem lze mikročástice rozdělit do velikostních skupin. Průměrný rozměr je od 1 do 250 pm, s výhodou 5-100 pm, a ještě lépe 9 až 28 pm. Jak odstraňování rozpouštědla, tak i snadnost injikování jsou usnadněny použitím menších částic, s výhodou kde průměrná velikost (a 90 % částic) je menší než 40 pm.

Podle tohoto vynálezu má výhodná farmaceutická látka náplň jádra v rozmezí od 20 do 70 % MPA nebo MGA, zejména od 30 do 60 %. Poměr aktivní složky k pojivu je s výhodou 1:4 až 7:3, např. 3:7 - 3:2.

Informace o metodách všeobecného použití pro přípravu látek s řízeným uvolňováním jiných sloučenin lze nalézt (Kitchell and Wise, In Methods in Enzymology, Academie Press, vol. 112, pp. 436-448; Beck and Tice, In Long Acting Steroid Contraception (D.R. Mishell Jr., ed), Raven Press: New York, pp. 175-199, 1983 and Wise et al., In Biology and Medicine (G. Gregotiadis, ed), Academie Press: New York, pp. 237-270, 1979), jehož celý obsah se tímto zahrnuje do popisu odkazově namísto citace úplného textu.

Steroid se podává s výhodou denním dávkováním, jímž se dodává méně než 25 mg aktivního MPA nebo MGA na 50 kg tělesné hmotnosti, s výhodou 1-10 mg, a ještě lépe 3 - 7 mg (např. 5 mg). Takto zvolené dávkování s výhodou udržuje koncentrace séra pod 50 nM na litr, s výhodou mezi 1,0 nM na litr a 10,15 nebo 25 nM na litr, podle reakce pacientky.

Podle tohoto vynálezu obsahuje jedna parenterální injekce s výhodou méně než 2,0 g aktivní složky (např. medroxyprogesteronacetátu nebo megestrolacetátu), ještě lépe 0,15 až 1,0 g.

Je velmi žádoucí odstranit z pozvolna uvolňujících částic co možno nejvíce zůstatkového organického rozpouštědla. Ve skutečnosti jsou některá organická rozpouštědla tak toxická, že

-26CZ 285972 B6 jich nelze použít pro tvorbu pozvolna uvolňujících částic, jestliže neexistuje prostředek pro jejich účinné odstranění. Nezačleněné organické rozpouštědlo, které není zachyceno do fyzikální struktury částice, tj. je pouze ve styku s povrchem, lze snadno odstranit tradičními technikami (např. opakovaným oplachováním vodou, proudem vzduchu atd.). Organické rozpouštědlo, zachycené do fyzikální struktury částice, je problematičtější a v dalším je pojednáváno o novém způsobu odstraňování rozpouštědla.

Odstraňování rozpouštědla je usnadněno přípravou částic s malým rozměrem částice. Částice mají s výhodou průměrný rozměr menší než 40 mikronů, např. mezi 5 a 40 mikrony, a ještě lépe mezi 9 a 28 mikrony. Nejvýhodnější je takové rozdělení do rozměrových skupin, při němž 90 % částic je uvnitř výše uvedených rozmezí.

U výhodných provedení se po vytvoření částic odstraní nezačleněné rozpouštědlo tradičními technikami, jako např. opakovaným opláchnutím vodou a/nebo sušením.

Odstraňování rozpouštědla pak postupuje s výhodou tak, že se částice vystaví mírnému vakuu, v němž tlak není menší než 6650 Pa (50 torr) a teplota není vyšší než menší z (A) 30 °C a (B) 7 °C pod teplotou skelného přechodu částic.

Částice se v podstatě zbaví zůstatkového rozpouštědla, včetně rozpouštědla fyzikálně začleněného do částice, a to tím, že se částice vystaví silnému vakuu (menšímu než 133 Pa (1,0 torr) a s výhodou menšímu než 66 Pa (0,5 torr) při teplotě o 7 až 20 °C nižší, nežli je teplota (Tg°) skelného přechodu částic, s výhodou o 7 až 15 °C níže než Tg, a ještě lépe 7 až 12 °C níže než Tg. Tato fáze silného vakua pokračuje po dobu postačující zmenšit reziduální rozpouštědlo v částicích na koncentraci menší než 0,1% (hmotnostně vůči celkové hmotnosti zmíněných částic). Zbytkové rozpouštědlo se zredukuje s výhodou na méně než 0,05 %, a ještě lépe na méně než 0,02 %.

Teplotu skelného přechodu lze měřit nebo vypočítat mnohými odborníkům známými způsoby, mimo jiné měřením a grafickým znázorněním tepelného toku vůči teplotě při standardních technikách, jak je znázorněno na obr. 9. Maximální teplota ohřevu má být s výhodou nastavena ne výše nežli je konec lineárního úseku křivky pod přechodovou teplotou (jak je znázorněno na obr. 9). Vyšší teploty mohou nežádoucím způsobem způsobovat aglomeraci částic nebo vytváření produktů, podléhajících tepelnému rozkladu. Udržováním teploty v rozmezí tohoto vynálezu se dosáhne toho, že částice v podstatě volně plavou a jsou prosty produktů, podléhajících tepelnému rozkladu. Použití mírného tepla podle tohoto vynálezu však napomáhá značnému odstranění organického rozpouštědla.

U výhodných provedení předchází před fází silného vakua fáze mírného vakua nebo jiný způsob omezení zbytkového rozpouštědla na méně než 5 % a s výhodou na méně než 2 % (hmotnostně, vůči celkové hmotnosti částic). Vyšší hladiny rozpouštědla mohou nežádoucím způsobem způsobit rozbíjení částic při následné fázi silného vakua. Takové rozbití může mít nežádoucí účinky na charakteristiku rychlosti uvolňujících částic.

Když se použije fáze předchozího mírného vakua, jsou typické časové intervaly 1 až 10 dnů, s výhodou 2 až 4 dny. Typické intervaly pro fázi silného vakua jsou 1 až 20 dnů, s výhodou 2 až 15 dnů, a ještě lépe 3 až 10 dnů. Trvání fáze silného vakua však má pokračovat, dokud zbytkové organické rozpouštědlo není zredukováno pod požadovanou hladinu. Hladinu zbytkového rozpouštědla lze určit známými způsoby, jak je znázorněno v příkladu 6 níže. Způsobu podle vynálezu bylo s úspěchem použito pro redukci rozpouštědla na méně než 0,2 % (váhově), přičemž nejnižší množství zjistitelné analýzou GC je uvedeno v příkladu 6.

-27CZ 285972 B6

Pozvolna uvolňující částice, připravené podle vynálezu mohou být připraveny pro konečné použití mnoha známými způsoby. S výhodou se sterilizují známými technikami (např. jak je popsáno v příkladu 10). Pak je lze kombinovat s farmaceuticky přijatelnými rozpouštědly nebo nosiči. Rovněž lze přidat známé konzervační přísady. Koncentrace pozvolna uvolňujících částic (hmotnostně vůči celkové hmotnosti látky) je mezi přibližně 10 a 70 %. Nosič je s výhodou takový, u něhož je pojivo částic v podstatě nerozpustné, např. karboxymetylcelulóza ve vodě, destilované vodě nebo ve fyziologickém roztoku.

Podle tohoto vynálezu se výhodné mikrokuličky vyznačují nepřítomností nečistot, podléhajících tepelnému rozkladu. Toho se dosáhne použitím nízké teploty a vysokého vakua pro sušení mikrokuliček.

Výhodný nosič pro parenterální injekci mikročástic podle tohoto vynálezu je zvolen ze skupiny, sestávající z fyziologického roztoku karboxymetylcelulózy, vodného zředěného roztoku glycerinu, vodného zředěného roztoku glykolu, vodou zředěného etanolu. Konkrétním výhodným nosičem je 2 až 5%-ní vodný roztok karboxymetylcelulózy.

Výhodné způsoby podávání pozvolna uvolňujících látek zahrnující mimo jiné subkutánní nebo intramuskulámí injekci a orální podávání.

Vzhledem k nízkým dávkám, používaným podle tohoto vynálezu, jsou vedlejší účinky dostatečně omezeny, takže preventivní používání metod podle vynálezu je mnohem lépe praktikovatelné a má větší pravděpodobnost rozšířeného přijetí nežli metody, používající vysokých dávek. Protože léčebné dávky jsou již samy nízké, není nutno účinek preventivní léčby ohrožovat použitím sníženého dávkování.

Příklad 1

Prevence karcinomu prsu, vyvolaného u krys dimetylbenz(a)-antracenem (DMBA), nízkou dávkou medroxyprogesteronacetátu (MPA)

Pro doložení účinnosti tohoto vynálezu pro omezení výskytu nádoru prsu vyjadřuje obr. 1 účinek jediné subkutánní injekce Depo-Provera (medroxyprogesteronacetát (MPA) (30 mg)) jeden týden před vyvoláním nádoru dimetylbenz(a)antracenem. Obr. 1 znázorňuje období 30 až 85 dnů po podání DMBA. Jedna křivka na obr. 1 vyznačuje průměrný počet nádorů na jedno zvíře ve skupině, chráněné preparátem Depo-Provera, kdežto druhá křivka vyznačuje průměrný počet nádorů na jedno zvíře v nechráněné skupině. 30 mg injekce Depo-Provera uvolní přibližně 0,17 mg aktivního medroxyprogesteronacetátu zajeden den po dobu 6 měsíců. Jak je vidět ze srovnání obou grafu na obr. 1, skupina ošetřená preparátem Depo-Provera projevila mnohem větší odolnost vůči propuknutí nádoru nežli nechráněná skupina. Po 85 dnech byl pozorován výskyt průměrně 1, 89 nádorů na krysu v nechráněné skupině a pouze 0,30 nádorů na krysu ve skupině ošetřené přípravkem Depo-Provera. Počet a velikost nádorů měřený hmatadlem byl zjišťován týdně.

Příklad 2

Léčba nádoru prsu, vyvolaného u kiys dimetylbenz(a)-antracenem (DMBA), nízkou dávkou medroxyprogesteronacetátu (MPA)

Obr. 2 znázorňuje potlačení růstu nádoru prsu, jehož lze dosáhnout způsoby podle vynálezu. Nádory byly indukovány v ovariektomizovaných krysách použitím dimetylbenz(a)antracenu. Extradiol byl použit pro stimulaci růstu jak u ošetřené, tak i u kontrolní skupiny krys. Každé

-28CZ 285972 B6 zvíře v ošetřované skupině dostalo jedinou subkutánní dávku 30 mg Depo-Provera, (která uvolňuje odhadem přibližně 0,17 mg denně aktivního medroxyprogesteronacetátu po období asi 6 měsíců. Vyobrazení znázorňuje průměrnou estradiolem stimulovanou změnu celkové oblasti nádoru v každé zobou skupin po léčení. Jak je z obr. 2 patrno, ve skupině ošetřené preparátem Depo-Provera se projevil podstatně menší růst nádoru nežli v neošetřené skupině.

Příklad 3

Příprava mikrokuliček, obsahujících medroxyprogesteronacetát, procesem extrakce rozpouštědla

Úplného rozpuštění polymemího materiálu 50/50 poly(DL-laktid-co-glycolid) (dodává firma Birmingham Polymer lne. Birmingham, Al.) se dosáhne přes noc protřepáváním s rozpouštědlem s použitím šejkru KS-10 (od firmy BEA Enprotech Corp..), nastaveném na rychlost 150200 ot/min. Použitým rozpouštědlem je metylenchlorid (CH₂C1₂), získaný z BDH a destilovaný jednou těsně před použitím. Polymer (1,50 g) se přidává do skleněné láhve, obsahující již CH₂C1₂ (15,00 g) za nepřetržitého protřepávání. Pak se za nepřetržitého protřepávání přidá medroxyprogesteronacetát pro vytvoření roztoku PLG-MPA-CH₂C1₂.

Samostatně se v pryskyřičném kelímku na 250 ml (od firmy Kontes) smísí 94 ml vody a 6 ml detergentu [poly(vinylalkohol) (PVA) (Airvol ™ 205, který dodává Air Products and Chemicals)] a udržuje se v neustálém míchání teflonovým, turbínu připomínajícím oběžným kolem, nasazeným na těžký laboratorní míchač. Pak se přidá k roztoku detergentu 1,16 ml metylenchloridu pro saturaci vodného roztoku a zabránění extrakce metylenchloridu v této fázi, použitím 2,0 ml skleněné pipety, vsunuté jedním ze čtyř průchodů v homí části pryskyřicového kelímku. Pak se pokračuje v míchání po dobu 5 minut rychlostí 850 ot/min. Mikrokuličky se pak připraví přidáním předtím připravovaného roztoku PLG-MPA-CH₂C1₂ do míchaného CH₂C1₂ saturovaného roztoku PVA použitím celopolypropylenové stříkačky, opatřené 6 palců dlouhou jehlou čís. 16. Po přidání roztoku MPA se v míchání pokračuje dalších 5 minut.

Vytvrzení mikrokuliček

Postup při vytvrzení je tento:

1) Obsah pryskyřicového kelímku se rychle nalije do vytvrzovací lázně a pryskyřicový kelímek se vypláchne destilovanou vodou a obsah se znovu nalije do vytvrzovací lázně. Vytvrzovací lázeň tvoří velká, z nerezavějící oceli vyrobená kádinka (7 1), obsahující 5 1 destilované vody. Míchání je udržováno vysokou rychlostí (850 ot/min.) po 20 minut těžkým laboratorním míchačem, vybaveným 2,5- palcovým oběžným kolem SS.

2) Mikrokuličky jsou pak separovány od omývacího média použitím filtračního systému Millipore 142. Po vytvrzení se obsah lázně přenese do výdejové tlakové nádoby 20 1 Millipore. V této době je nutno dbát na to, aby důkladným vymytím vytvrzovací kádinky byly účinně zachyceny mikrokuličky, které se usazují, jakmile se přeruší míchání. Mikrokuličky se pak shromáždí na membráně 142 mm (velikost póru 8 pm) tím, že se obsah výdejové tlakové nádoby protlačí membránovou jednotkou pomocí stlačeného vzduchu (6900Pa(10 psi)).

3) Membrána se pak promyje destilovanou vodou a mikrokuličky se přitom smyjí z membrány do druhé vytvrzovací lázně, která je shodná s první. Pak se sběr mikrokuliček provede podruhé, jak je popsáno výše.

4) Konečné promytí a osušení mikrokuliček se pak provede ve filtračním systému Millipore 142. První sušicí úkon se provede proudem vzduchu, udržovaným jednu hodinu na 6900 Pa (10 psi).

-29CZ 285972 B6

Mikrokuličky se pak přemístí z membrány do sušičky, obsahující přibližně 1 palec přípravku Drierite, a vloží do mírného vakua (9300Pa (70 torr)) na dobu 2-3 dnů. Konečné usušení se provede ve vakuové peci při 35-40 °C a tlaku 54 Pa (0,4 torr), až se rozpouštědlo stane nezjistitelným plynovou chromatografií, jejíž mez citlivosti na zjištění CH2CI2 je 0,02% (hmotnostně, vůči celkové hmotnosti mikročástic). Touto technikou bylo tedy odstraněno v podstatě všechno reziduální organické rozpouštědlo, jehož zůstalo méně než 0,02 %.

Příklad 4

Příprava 60% medroxyprogesteronacetátu (MPA)/40% Medisorb™ 85:15 DL poly(kyselina mléčná-co-kyselina glykolová) (PLGA) mikročástic metodou lití

Medroxyprogesteronacetát (MPA) byl použit tak, jak byl získán ze steraloidů. Před použitím byla tato složka prošetřena UV spektroskopií a na svůj bod tavení. Medisorb™ 85: 15 DL kyselina byla získána od firmy DuPont a byla rovněž použita tak, jak byla získána. Metylenchlorid (nejvyšší dostupný stupeň) byl získán od firmy Fischer Scientific. Polymer (6,0022 g) byl rozpuštěn v 24 ml metylenchloridu jako 25%-ní roztok (0,25 g PLGA/ml metylenchloridu). K polymemímu roztoku byl přidán medroxyprogesteronacetát (9,0022 g) a v míchání bylo pokračováno, aby se zajistilo úplné promísení. Roztok pak byl nalit na čistou rovnou skleněnou desku s použitím seřiditelné destičky Boston-Bradley pro jeho rozetření do rovnoměrné tloušťky. Takto nalitý film byl ponechán sušit v klobouku na odvádění výparů několik hodin. Po odpaření většiny rozpouštědla byl výsledný film seškrabán ze skleněné desky a čtyři dny sušen ve vakuu při pokojové teplotě.

Film, vytvořený v operaci lití, měl velmi nízkou hustotu, protože operace odstraňování rozpouštědla zanechala velmi velký objem. Tento prázdný objem byl zmenšen, aby se snížilo prostupování kapalin do mikročástic, operací komprese s použitím tepla a hydraulického tlaku. Film byl extrudován do tyčinek lisem firmy Pasadena Hydraulics lne, při přibližně 125 °C.

Extrudované tyčinky byly rozemlety na malé částice běžně dostupnou bruskou s chlazenou brusnou komorou. Po rozbroušení byl prášek protažen řadou sít, odpovídajících normám USA, pro shromáždění mikročástic v rozměrových skupinách od 38 do 125 pm, 125 do 180 pm, 180 do 250 pm. Síty prošlé mikročástice byly shromážděny.

Příklad 5

Odpaření zbytkového rozpouštědla

a) Pro sušení byl použit skleněný přístroj Abderhalden (dodaný firmou Aldrich Chemicals Co.). Jeho nej důležitějším znakem je to, že umožňuje současné použití vysokého vakua a ohřevu v kombinaci s možností uložení vzorku pro sušení v přítomnosti sušicího činidla (molekulárního síta 3A). Při našem bádání je dosaženo vysokého vakua vývěvou Edwards E2M5. Zahřátí vzorku pro sušení se dosáhne refluxem směsi rozpouštědla: CH2CI2 + aceton v případě šarže MPA-MBV pro získání teploty 45 °C.

b) Šarže MPA-MB-VII až MPA-MB-XI, MPA-MFI-73, MPA-MLV-31, MPA-MLV-32, MPAMLV-34, MPA-MLV-35, MPA-MLV-39 a MPA-MLV-40 byly usušeny takto: u všech těchto šarží bylo použito vakuové pece pro dosažení dalšího sušení mikrokuliček. Vakua 54 Pa (0,4 torr) bylo dosaženo vývěvou Edvards E2M5. Teplota byla dobře řízena (44 až 46 °C) a všechny tyto dávky byly sušeny současně v systému.

-30CZ 285972 B6

Příklad 6

Určování zbytkového metylenchloridu

Koncentrace zbytkového metylenchloridu v mikrokuličkách se určí analýzou GC (plynové chromatografie) plynovým chromatografem Variant 3700, který je vybaven kapilárním sloupcem a detektorem FID. Teplotní program je: 7 minut při 40 °C před zahřátím rychlostí 10 °C/min až do dosažení 200 °C (1 min). Objemy injekce jsou 1,0 μΐ. Pro účely analýzy GC se mikrokuličky (přibližně 25 mg) rozpustí v CHC1₃ (stupeň HPLC), 1 ml, a pak se rozředí 5 ml izooktanu. Přesná koncentrace metylenchloridu se určí pomocí kalibrační křivky, vytvořené z pěti standardů. Tyto standardy se připravují z čistého metylenchloridu (CH2CI2) a chloroformu (CHC1₃) v koncentracích od 0,1 do 1,0 % (hmotnostně).

Následující tabulka uvádí výsledky, získané analýzou metylenchloridu:

Systém MPA % CH2CI2 (hmotnostně)

Licí proces: šarže: připravená jako v příkladu 4. 0,3 mikrokulička 50:50 DL-PLG menší než 0,02

Příklad 7

Určení náplně jádra MPA

a) Nukleární magnetická rezonance: Toto stanovení bylo provedeno spektroskopií NMR analýzou oblasti pod vrcholem skupiny 19-metyl MPA při δ= 0,65 ppm a při vrcholu atomů vodíku polymeru (multiplet při δ = 5,20 a při δ - 4,8). Byl použit spektrometr Bruker AC-F 300 FT NMR. Viz obr. 3, kde je uveden příklad spektra NMR, a obr. 4 jako příklad křivek standardů pro toto určení, které jsou odvozeny od spekter NMR známých směsí MPA a polymeru.

b) Chromatografie prostorového vyloučení: Měření náplně jádra prostorovou vylučovací chromatografií (chromatografií sterické exkluze) (SEC) bylo provedeno použitím systému SEC Perkin-Elmer 250 ISO/LC-30 se sloupcem PLgel 50 Á 5 pm a se smíšeným sloupcem PLgel s použitím chloroformu stupně HPLC jako zřeďovací látky. Tak např. na obr. 5 byla měření mikrokuliček 50:50 PLG prováděna při 40 °C a MPA a DL-PLG byly za těchto podmínek dobře separovány. Náplň jádra vzorku byla určena měřením oblasti pod vrcholem MPA se vztahem ke kalibrační křivce, vytvořené podle standardních koncentrací směsí PLG/MPA (insert).

Příklad 8

Fyzikální charakteristiky mikrokuliček, zjištěné elektronovou rozkladovou mikroskopií (SEM)

Pro analýzu morfologie svého povrchu byly mikrokuličky zkoumány elektronovou rozkladovou mikroskopií (SEM) s použitím přístroje JEOL JSM T330A. Vzorky byly připraveny položením kuliček na dvoustranný pásek papírového chromatogramu před nanesením vrstvy zlata o tloušťce 500-600 Á. Těchto analýz bylo použito rovněž pro zjišťování středního průměru (φ) mikrokuliček. Tato zjištění se provádějí ručním počítáním a měřením všech mikrokuliček, které jsou vidět na vyobrazení, provedeném s mírným zvětšením 350x (obr. 6a). Větší zvětšení, až 2000x, dovoluje podrobnější analýzu povrchu mikrokuliček (obr. 6b).

-31 CZ 285972 B6

Tak např. přesné určení rozložení velikosti mikrokuliček šarže MPA-MB-V bylo provedeno přímým měřením průměru mikrokuliček podle fotografií SEM. Jak je patrno na obr. 8, více než 95 % z 680 mikrokuliček takto spočítaných má velikost menší než 40 pm při středním průměru 18,6 ± 9,7 (S.D.) pm. Takto malý rozměr mikrokuliček usnadňuje injekci látky a zkracuje dobu uvolňování.

Příčný řez mikrokuličkami na obr. 7 ukazuje, že MPA je soustředěn v ostrůvcích, rozptýlených v polymeru.

Příklad 9

Charakterizace mikrokuliček diferenciální rozkladovou kalorimetrií

Tepelná analýza vzorků byla provedena přístrojem Perkin-Elmer DSC-7. Přístroj byl kalibrován indiem a pracoval s rychlostí rozkladu 10 °C/min. Na obr. 9 ukazuje křivka DSC mikrokuliček, že maximální teplotu sušení lze snadno zjistit.

Příklad 10

Sterilizace mikrokuliček

Před injekcí byly mikrokuličky sterilizovány vystavením 2,2 megaradům záření gama, generovaného zdrojem Cobalt-60 (Gammacell 200). Stabilita MPA byla kontrolována prostorovou vylučovací chromatografií (SEC), kdežto stabilita polymeru byla analyzována SEC s použitím polystyrénových standardů pro kalibrování a modifikací relativní viskozity s použitím kapilárního viskozimetru Ubbelohde.

Vystavení záření gama (2,2 megaradů) se MPA nepoškozuje, avšak snížená specifická viskozita mikrokuliček v roztoku CH2CI2 je snížena z0,301±0,008 na 0,262±0,003 dL/g, čímž je signalizováno, že některé řetězce polymeru byly přerušeny.

Vzorky dávky MPA-MB-V byly vystaveny různým množstvím záření gama (0, 1,1, 2,2 megaradů) a byly měřeny parametry rozložení hmoty [M(n-l), Mn, Mw, Mz, M(z+1)] (viz obr. 10A), stejně jako jejich polydisperzita (Mw/Mn) (obr. 10B)

Tato data ukazují, že dominantním procesem je náhodné štěpení polymerických řetězců. Ozářené mikrokuličky tedy budou biologicky rozkládány rychleji nežli neozářené mikrokuličky, a účinky ozáření je třeba vzít v úvahu, když jsou mikrokuličky připravovány, tj. při nastavení preradiační rychlosti uvolňování nepatrně níže, nežli je požadováno pro finální výrobek.

Příklad 11

Hladiny séra MPA s mikrokuličkami, obsahující MPA při subkutánní injekci králíkům

Novozélandští bílí králíci (asi 2,7 kg) byli umístěni po jednom v klecích při režimu 10 hodin světla a 14 hodin tmy (světla se rozsvítila v 7: 00 hodin) a dostávali 16% Tabletky pro králíky, získané od Moulées Kiloplus (Quebec, Kanada) a vodu z kohoutku neomezeně.

-32CZ 285972 B6 mg mikrokuliček obsahujících MPA (šarže MPA-MB-V) v suspenzi v roztoku 2% karboxylmetylcelulózy a 1% Tween 80 byly injikovány subkutánně skupině 10 králíků. V různých časových intervalech byly odebírány vzorky krve a pomocí R1A byly měřeny koncentrace MPA. Hladiny séra MPA jsou uvedeny na obr. 11.

Příklad 12

Hladiny séra MPA u krys, kterým byly subkutánně injikovány mikrokuličky podle vynálezu, obsahující MPA

Mladé krysy ženského pohlaví Sprague- Dawley [Crl: CD(SD)Br] byly získány od firmy Charles River Canada lne. (St-Constant, Quebec) a umístěny po dvou v klecích při režimu 14 hodin světla a 10 hodin tmy (světlo se rozsvítilo vždy v 5:00 hod.). Zvířata dostávala potravu pro krysy a vodu z kohoutku bez omezení.

Zvyšující se dávky (5, 10 a 20 mg) mikrokuliček, obsahujících MPA v suspenzi v roztoku 2% karboxymetylcelulózy a 1% Tween-80 byly injikovány subkutánně skupině 10 krys (SpragueDawley) ženského pohlaví. V různých časových intervalech pak byly odebírány vzorky krve a pomocí RIA byly měřeny koncentrace MPA. Výsledky jsou znázorněny na obr. 12.

Příklad 13

Prevence rakovinového nádoru prsu, indukovaného dimetylbenz(a)antracenem (DMBA) u krysy, s nízkou dávkou MPA (mikrokuliček)

Materiály a metody

Zvířata a indukce karcinomu prsu:

Karcinom prsu byl indukován u krys Sprague-Dawley ženského pohlaví (Crl:CD(SD)Br) (získaných od Charles River Canada lne., St. Constant, Quebec), ve věku 50 až 52 dnů jediným intragastrickým podáním 20 mg dimetylbenz(a)antracenu (DMBA) (Sigma Chemicals co., St. Louis, Mo) v 1 ml kukuřičného oleje.

Léčba:

Jeden týden před podáním DMBA byla zvířata rozdělena do tří skupin (intaktní, intaktní + 30 mg MPA, a intaktní + 100 mg MPA) a dostala jedinou subkutánní dávku mikrokuliček, obsahující 30 mg, resp. 100 mg MPA.

Výsledky:

Jak je znázorněno na obr. 13, 85 dnů po podání DMBA z intaktních (neošetřených) zvířat mělo 63 % zvířat zjistitelné nádory prsu, kdežto u zvířat ošetřených 30 mg MPA (mikrokuličkami) jen 7,4 %, resp. 6,3 % zvířat mělo zjistitelné nádory prsu. Tyto údaje jasně prokazují, že preventivní léčba mikrokuličkami MPA potlačuje vývoj nádoru prsu, indukovaného DMBA u krysy, a takto nasvědčuje možnému použití mikrokapsle MPA pro prevenci rakoviny prsu u žen.

Podmínky a popisy zde použité představují výhodná provedení, uvedená pouze pro ilustraci, a nejsou míněna jako omezení mnoha obměn, které odborníci tohoto oboru uznají za možné při provádění tohoto vynálezu, jak je definován patentovými nároky.

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický přípravek pro léčení nebo prevenci osteoporózy, rakoviny děložní sliznice, rakoviny prsu, endometriózy nebo pro antikoncepci, se zpožděným nebo diferencovaným uvolňováním androgenního steroidu, obsahující pozvolna uvolňující částice, jež obsahují androgenní steroid, vyznačující se tím, že androgenní steroid je zvolen ze souboru, který’ zahrnuje medroxyprogesteronacetát, a/nebo megestrolacetát, má konstantu inhibice Kj nižší než 2 x 10'⁸M pro androgenní receptor a hodnotu ED₅₀ menší než 3,0 nM pro buňky rakoviny prsu ZR-75-1 aje rozptýlený v pomalu uvolňujícím pojivu, které je biologicky kompatibilní s lidskou tkání a v těle je rozložitelné na biologicky snášitelné metabolické produkty, přičemž pomalu uvolňující pojivo obsahuje polymerickou matrici, odvozenou z kopolymerických a homopolymerických polyesterů s hydrolyzovatelnými esterovými vazbami, přičemž je schopno při svém biologickém rozkladu uvolňovat androgenní steroid rychlostí, udržující koncentraci androgenního steroidu v séru mezi 1,0 a 50,0 nM/1 během doby, trvající, od 48 hodin do 28 dnů po podání.
2. 2. Farmaceutický přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že pozvolna uvolňující částice jsou mikrokuličky o průměrném rozměru mezi 5 pm a 40 pm, přičemž zmíněné mikrokuličky obsahují maximálně 0,1 % hmotn. organického rozpouštědla.
3. 3. Farmaceutický přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že mikrokuličky tvoří 10 až 70% hmotn. celkového farmaceutického přípravku, přičemž hmotnostní poměr zmíněného androgenního steroidu vůči zmíněnému pozvolna uvolňujícímu pojivu je v intervalu mezi 3:2 a 3:7.
4. 4. Farmaceutický přípravek podle nároků laž3, vyznačující se tím , že pozvolna uvolňující částice jsou schopny při svém biologickém odbourávání po dobu až 12 týdnů udržovat koncentraci androgenního steroidu v séru mezi 1,0 až 5,0 nM/1.
5. 5. Farmaceutický přípravek podle nároků laž4, vyznačující se tím, že obsahuje organická rozpouštědla a/nebo nosiče v množství menším než 0,1 % hmotn.
6. 6. Způsob výroby farmaceutického přípravku podle nároků laž5, vyznačující se tím, že androgenní steroid zvolený ze souboru, který zahrnuje medroxyprogesteronacetát a/nebo megestrolacetát, se rozpustí v organickém rozpouštědle spolu s pozvolna uvolňujícím pojivém, které obsahuje polymerickou matrici, odvozenou z kopolymerických a homopolymerických polyesterů s hydrolyzovatelnými esterovými vazbami, načež se výše zmíněná směs přidá do vody, která se míchá rychlostí, postačující k vytvoření mikrokuliček o průměru 5 pm až 40 pm, načež se mikrokuličky vystaví tlaku menšímu než 133 Pa a teplotě o 7 až 20 °C nižší než je teplota skelného přechodu mikrokuliček po dobu, než se dosáhne snížení koncentrace zůstatkového organického rozpouštědla na hodnotu menší než 0,1 % hmotn.
7. 7. Způsob výroby farmaceutického přípravku podle nároku 6, vyznačující se tím, že před vystavení tlaku menšímu než 133 Pa se mikrokuličky vystaví vakuu alespoň 6650 Pa při teplotě maximálně 30 °C na dobu alespoň 24 hodin, přičemž následné vystavení tlaku menšímu než 133 Pa se provádí při teplotě o 7 až 12 °C nižší, nežli je teplota skelného přechodu mikrokuliček a po dobu postačující ke zmenšení zůstatkového organického rozpouštědla v mikrokuličkách na méně než 0,02 % hmot.