CZ281415B6 - Způsob přípravy přenosového faktoru z buffy coatu savčí krve - Google Patents

Abstract

Řeší se příprava přenosového faktoru ze savčí krve zjednodušeným postupem, který spočívá v hemolyse erythrocytů přítomných v buffy coatu, odstředění buněčných stěn erythrocytů a neporušených leukocytů, promytí sedimentu a ultrazvukové desintegraci leukocytů. Vzniklá suspenze zbytků krevních buněk se přímo ultrafiltruje přes membránu s vylučovacím limitem 10 000. Ultrafiltrát obsahující směs nízkomolekulárních peptidů a nukleotidů se lyofilizuje. Takto připravený přenosový faktor neobsahuje balastní látky extrahované z rozrušených erythrocytů. Přenosový faktor je imunomodulátor používaný při léčení vrozených nebo získaných vad imunitního systému, bakteriálních i virových infekcí a nádorových onemocnění.ŕ

Description

Způsob přípravy přenosového faktoru z buffy coatu savčí krve

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy přenosového faktoru z buffy coatu savčí krve, a to z bílých krvinek - leukocytů, přítomných v buffy coatu spolu s erytrocyty.

Přenosový faktor nebo také transferfaktor, uváděno dále jako TF, je imunomodulační přípravek, který přenáší mimo jiné buňkami zprostředkovanou imunitu z dobře odpovídajícího dárce na nereagujícího příjemce. Klinicky se používá k léčení vrozených nebo získaných poruch imunitního systému, v léčbě různých mikrobiálních infekcí a při léčbě nádorových onemocnění. Podává se ve formě injekcí nebo perorálně.

Dosavadní stav techniky

Přenosný faktor je směs nízkomolekulárních peptidů a nukleotidů, získaná extrakcí leukocytů - dále uváděno jako Le - imunitních, nebo imunizovaných dárců. Kritériem koncentrace TF je 1 mezinárodní jednotka - MJ, definovaná jako extrakt obvykle z 5 x 10⁸Le. Připravuje se z lidské krve nebo i z krve jiných savců, popřípadě z jejich lymfatických uzlin.

Nejčastější způsob přípravy TF spočívá v tom, že se bílé krvinky, obsažené v buffy coatu, dále uvedeno jako BC, t.j. leukocyty obohacená frakce krevních buněk, získaná odstředěním krve, obsahující konzervační roztok, rozruší střídavým zmražováním a rozmražováním, jak se uvádí v Raymond, J.F. a spol., Vox Sang.- 29, 1975, str. 338, Brit. patent č. 144 39 48. Zbytky krevních buněk se budí odstředí při 20 000 G a supernatant se dialyzuje do destilované vody, nebo se k dialýze použije přímo dezintegrovaný BC. Dialýzu lze nahradit ultrafiltrací s použitím membrány s vylučovacím limitem 10 000 KD. Dialyzát nebo ultrafiltrát se lyofilizuje a před použitím se rozpouští ve fyziologickém roztoku nebo ve vodě pro injekce.

Příprava TF přes svoji jednoduchost skrývá některé technologické obtíže, které se zvýrazní při jejich převodu do produkčního měřítka. Největší z nich souvisí se složením výchozího biologického materiálu - buffy coatu. BC se sice dá získat za snadno realizovatelných centrifugačních podmínek, ale je vždy znečištěn velkým množstvím erytrocytů, dále uvedeno jako Ery. Při současné dezintegraci Ery a Le uvolňují Ery do roztoku velké množství hemoglobinu a dalších rozpustných bílkovin a nukleových kyselin, tedy látky, které by bylo možné z hlediska působení TF považovat za balasty. Navíc zatěžují ultrafiltrační membránu natolik, že přímá ultrafiltrace je i po odstředění při vysokých hodnotách zrychlení prakticky nemožná.

Problém se obvykle řeší zařazením dialýzy do schématu přípravy (ZN 51/87 KÚNZ Ústí nad Labem). Dialyzát BC se potom dá ultrafiltrovat bez potíží. Dialýza má však dvě podstatné nevýhody:

-1CZ 281415 B6

1. Mají-li zdialyzovat všechny nízkomolekulární látky ve větším výtěžku, je nutné použít relativně značného množství vody, takže výsledný TF je tvořen málo koncentrovaným roztokem.

2. Dialýza je i při protiproudovém uspořádání velmi pomalá a navíc se zvyšuje nebezpečí bakteriální kontaminace dialyzátu.

Jiné řešení produkční přípravy TF představují dva patenty. Patent NDR č. 24 46 07 popisuje izolaci čistých Le jako výchozího materiálu pro výrobu TF z lidské krve promývací technikou při čtyřnásobném odstředění. Promyté Le se rozruší pomalým zmrznutím a rychlým roztátím ve vodní suspenzi. Zbytky buněk se potom znovu odstředí a supernatant, obsahující TF, se ultrafiltruje. Nevýhodou tohoto postupu je nutnost použít celkem pěti odstředění a dále dochází k velkým ztrátám Le při promývání, jejichž důsledkem je nízký obsah peptidů a nukleotidů ve výsledném TF.

V japonském patentu č. 56115-720 se Ery prasečí krve srazí přídavkem roztoku dextranu a chloridu sodného, potom se Le, obsažené ve vrchní fázi, odstředí a dezintegrují se střídavým zmražováním a rozmrazováním. Extrakt z rozrušených Le se potom dialyzuje do destilované vody a dialyzát se lyofilizuje. Nevýhodou tohoto způsobu je nutnost používat směsi roztoku dextran-chlorid sodný k precipitaci Ery. Vzhledem k malým rozměrům molekuly může mimo to dextran procházet dialyzační membránou a kontaminovat hotový přípravek.

Řešení podle CS vynálezu AO 270 021 se týká přípravy nízkomolekulárních látek, obsahujících imunomodulační aktivitu z buněčných lyzátú lidských a zvířecích tkání za použití lýzy a speciální ultrafiltrace, avšak AO 270 021 neřeší dosažení preparátu pro peřorální použití.

Podstata vynálezu

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob přípravy TF z BC savčí krve podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se buffy coat podrobí působení hypotonického prostředí destilované vody, vzniklý gelovitý sediment zbytků erytrocytů a neporušených leukocytů se oddělí od hemolyzovaných erytrocytů odstředěním. Tento sediment se promyje od balastních látek, extrahovaných z Ery, dekantací destilovanou vodou. Le přítomné v sedimentu se dezintegrují ve vodné suspenzi při teplotě 4 °C ultrazvukem. Vzniklá suspenze stěn krevních buněk leukocytů se po centrifugaci ultrafiltruje membránou s vylučovacím limitem 10 000 KD a ultrafiltrát přenosového faktoru se lyofilizuje.

Prevencí před zanesením této membrány velkým množstvím vysokomolekulárních hmot je použití mezistupně membrány o vylučovacím limitu 20 000 KD.

Způsob podle vynálezu má tyto výhody:

1. Neporušené Le se dají izolovat ve vysokém výtěžku a značné čistotě jednoduchým postupem, to jest dvojitým odstředěním při nízkém zrychlení, aniž by bylo nutno vnášet do izolace další chemické látky.

-2CZ 281415 B6

2. Forma sedimentu Le a stěn Ery je kompaktní gel, neulpívající na stěně odstřeďovacích kyvet a umožňuje snadnou manipulaci při rozmývání dekantací.

3. Le v gelovitém sedimentu se při ultrazvukové dezintegraci homogenně rozptýlí v celém objemu extrakční kapaliny, čímž je umožněna jejich dokonalá extrakce. Přitom je možné používat velmi malého množství vody, takže výsledný TF je značně koncentrovaný a po ultrafiltraci se dá velmi snadno lyofilizovat.

4. Suspenzi rozrušených Le a Ery lze přímo bez dalších úprav ultrafiltrovat s použitím membrány s vylučovacím limitem 10 000 KD. Není tudíž nutná ani dialýza, ani filtrace stěn krevních buněk, ani jejich odstředění.

5. Před zanesením membrány velkým množstvím vysokomolekulárních hmot při ultrafiltraci chrání použití mezistupně membrány o vylučovacím limitu 20 000 KD.

Podstata vynálezu je blíže objasněna příklady provedení, aniž by se jimi omezovala.

Příklad 1

K objemu 1 00 ml lidské krve od zdravých dárců se přidá 225 ml konzervačního roztoku ACD - roztok 42,67 g citronanu sodného, 14,93 g kyseliny citrónové, 40,00 g glukózy v redestilované vodě o výsledném objemu 1 000 ml - a směs se odstředí při zrychlení 1 500 G a teplotě 8 °C, po dobu 40 minut. Získá se 200 ml BC, který se suspenduje v 700 ml redestilované vody a za stejných podmínek se znovu odstředí. Supernatant se slije a gelovitý sediment se dvakrát promyje po 500 ml redestilované vody dekantací. Potom se převrství 380 ml redestilované vody a dezintegruje se ultrazvukem při 4 ’C tak dlouho, až suspenze při mikroskopické kontrole neobsahuje neporušené leukocyty. Suspenze, tvořená stěnami krevních buněk z extraktu z Le, se přímo bez dalších úprav ultrafiltruje membránou s vylučovacím limitem 10 000 KD v prostředí, zajištujícím sterilitu germicidním zářením. Získá se 375 ml sterilního ultrafiltrátu, který obsahuje celkem 85 mg polypeptidů a 58 mg nukleotidů. Ultrafiltát se lyofilizuje. Výtěžek : 25 MJ přenosového faktoru.

Příklad 2

Objem 160 ml BC, získaného odstředěním za podmínek příkladu 1 z 1 000 ml krve imunizovaných prasat za přídavku 150 ml konzervačního roztoku ACD, se suspenduje v 560 ml redestilované vody a za stejných podmínek se znovu odstředí. Supernatant se slije a gelovitý sediment se dvakrát dekantuje ve 400 ml redestilované vody. Promytý sediment se převrství 30 ml redestilované vody a dezintegruje ultrazvukem při teplotě 4 °C tak dlouho, až suspenze neobsahuje při kontrole mikroskopem žádné neporušené Le. Suspenze, tvořená stěnami krevních buněk v extraktu Le, se potom přímo bez dalších úprav ultrafiltruje membránou s vylučovacím limitem 10 000 KD při ozařování germicidní lampou. Získá se 27 ml sterilního ultrafiltrátu, který obsahuje celkem 121 mg pep-3CZ 281415 B6 tidů a 52 mg nukleotidů. Ultrafiltrát se lyofilizuje.

Výtěžek : 20 MJ přenosového faktoru.

Obsah peptidů a nukleotidů V TF se stanoví spektrofotometrií v UV oblasti v rozmezí 200 až 300 nm. Kvalitativní složení přípravku se kontroluje gelovou filtrací na dextranovém gelu, například typu Sephadex G 25.

Průmyslová využitelnost

Průmyslově se dá využít vynálezu, popsaného v přihlášce, ve farmaceutické výrobě k získání imunomodulačního perorálního prostředku, který se používá v humánní, případně veterinární medicíně.

Vynález řeší způsob přípravy perorální aplikace jinak obecně známého transferfaktoru.

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy přenosového faktoru z buffy coatu savčí krve dezintegrací stěn krevních buněk při teplotě 4 ’C a ultrafiltrací přenosového faktoru membránou s vylučovacím limitem 10 000 KD, vyznačující se tím, že se buffy coat podrobí působení hypotonického prostředí destilované vody, vzniklý gelovitý sediment zbytků erytrocytů a neporušených leukocytů se oddělí od hemolyzovaných erytrocytů odstředěním a podrobí se dekantací a dezintegraci ve vodě ultrazvukem při teplotě 4 °C, vzniklá suspenze stěn krevních buněk leukocytů se po centrifugaci ultrafiltruje membránou s vylučovacím limitem 10 000 KD a ultrafiltrát přenosového faktoru se lyofilizuje.
2. 2. Způsob přípravy podle nároku 1, vyznačující se tím, že se před ultrafiltrací s vylučovacím limitem

   10 000 KD provede ultrafiltrace s vylučovacím limitem

   20 000 KD.